Fithria Lathifatul B (1041611175)

Putri Nur Fathimah (1041611186)

REKAYASA GENETIKA GEN PENISILIN V ASILASE DARI Bacillus Sp
Kloning merupakan se-jumlah proses yang dapat digunakan untuk
menghasilkan salinan suatu kesatuan biolo-gik yang secara genetik identik tanpa
mela-lui reproduksi seksual. Bahan salinan ini di-sebut klon (clone) dan
mempunyai genetik yang sama dengan asalnya ( Wangko, 2010). Gen adalah
fragmen sekuen dari DNA yang menyandi sintesis protein yang bersifat
fungsional pada organisme hidup, diekspresikan dalam bentuk fenotipe atau
karakteristik yang data dilihat dengan mata telanjang ataupun dibawah mikroskop.
Fragmen DNA yang membentuk gen kebanyakan terdiri dari 1000-4000
nukleotida. Misalnya sifat dapat menghidrolilis gula menjadi alcohol pada
Saccharomyces cerevisiae yang disebabkan oleh enzim amylase yang dimilikinya
(Suriasih. 2015).
Bakteri Gram positif Baciluus megaterium mempunyai beberapa kelebihan
dibandingkan dengan sel inang lain untuk produksi protein rekombinan. Bakteri
ini mampu mengekspresikan beberapa DNA heterologus, tidak menghasilkan
protease alkalin, dikenal stabil dalam melakukan replikasi dan memelihara
plasmid, serta tidak ditemukan adanya endotoksin pada dinding selnya. Beberapa
vektor ekspresi dan galur Baciluus megaterium telah dikembangkan dan
digunakan untuk produksi berbagai protein, misalnya glukosiltransferase
levansucrase, dextransucrase dan penisilin amidase dan fragmen antibodi scFv
(Jordan dkk, 2007).
Bakteri Escherichia colli digunakan dalam cloning sebagai organisme
inang untuk rekombinan molekul DNA. Salah satu langkah dalam cloning adalah
pemulihan vector. Vector adalah tempat dimana DNA asing dipindahkan ke
organisme inang baru dan dapat diekspresikan dari DNA asing di dalam inang
baru. Molekul DNA sel E. colli hampir 1000 kali lebih panjang dari selnya sendiri
dan dapat masuk ke dalam badan inti yang biasanya berukuran 1m. Dinding luar

sel E. Colli dilapisi oleh kapsul yang terbentuk dari senyawa berlendir (Mahayani,
2013).
Antibiotik penisilin pada awalnya digunakan untuk mengobati penyakit
infeksi yang banyak terjadi. Namun beberapa tahun kemudian, pengobatan
penyakit infeksi dengan antibiotic ini tidak efisien lagi, karena banyak
mikroorganisme telah menjadi resisten. Oleh karena itu, dengan perkembangan
ilmu pengetahuan, dikembangkan antibiotik-antibiotik baru melalui modifikasi
struktur penisilin agar efektifitas antibiotik ini dapat diperoleh kembali. Berbagai
turunan penisilin telah dibuat dan digunakan. Dalam proses pembuatan turunan
antibiotik, banyak dilibatkan gen pengkode enzimenzim tertentu, contohnya gen
penisilin V asilase (PVA) yang banyak ditemukan pada bakteri dan jamur
(Susanti, 2004).
Cara Kerja
Penentuan aktivitas enzim PVA. Uji pendahuluan dilakukan dengan
mengukur aktivitas enzim PVA dalam Bacillus sp. BAC4 menggunakan metode
Konferld (1978). Aktivitas PVA diukur berdasarkan jumlah 6-APA yang
dibebaskan. Satu unit aktivitas didefinisikan sebagai jumlah enzim yang
dibutuhkan untuk menghasilkan 1 mol 6-APA permenit pada suhu 37 0C.
Isolasi DNA kromosom Bacillus sp. BAC4. Isolasi DNA kromosom
Bacillus sp. BAC4 dilakukan dengan metode Wang (Doi dan McGloughlin, 1992).
Tingkat kemurnian DNA ditentukan dengan spektrofotometer sinar UV pada
panjang gelombang 260 dan 280 nm. Karakterisasi DNA dilakukan menggunakan
elektroforesis gel agarosa dengan konsentrasi gel 0,8%. Konsentrasi larutan DNA
kromosom hasil isolasi dapat diperkirakan dengan membandingkan intensitas
warna pitanya dalam gel agarosa dengan intensitas pita standar yang telah
diketahui ukuran dan konsentrasinya.
Isolasi DNA plasmid pHB201 dari E. coli. Isolasi ini dilakukan dengan
metode lisis alkali. Lisis sel bakteri dilakukan secara kimia menggunakan
kombinasi larutan EDTA dan lisozim, suatu senyawa yang merusak protein tanpa
merusak molekul DNA maupun RNA. Proses lisis sel ini dipercepat dengan
penambahan SDS, yang akan menghilangkan molekul lipid sehingga membran sel

dapat terbuka secara perlahan. Pada metode ini, sebagian besar protein dan RNA
tidak larut. Penambahan fenol:kloroform: isoamilalkohol (25:24:1) diharapkan
dapat mengekstrak protein, sedangkan molekul RNA didegradasi dengan
menggunakan

RNase.

Tingkat

kemurnian

DNA

diukur

menggunakan

spektrofotometer sinar UV pada panjang gelombang 260 dan 280 nm.

Karakterisasi DNA plasmid dilakukan dengan elektroforesis gel agarosa dengan
konsentrasi gel 0,8%. Konsentrasi larutan DNA plasmid hasil isolasi dapat
diperkirakan dengan membandingkan intensitas warna pitanya dalam gel agarosa
dengan intensitas pita standar yang telah diketahui ukuran dan konsentrasinya.
Pemotongan DNA kromosom dan DNA plasmid. Pemotongan DNA
plasmid, DNA asing, dan DNA rekombinan dilakukan menggunakan enzim
restriksi tertentu dengan kondisi tertentu Enzim restriksi yang dipergunakan
adalah enzim HindIII untuk memotong DNA plasmid dan DNA asing. Hasil
pemotongan DNA dengan enzim restriksi diamati dengan elektroforesis gel
agarosa.
Ligasi DNA kromosom ke dalam DNA vector (pHB201). Ligasi
fragmen DNA asing ke dalam vector plasmid PHB201 dilakukan menggunakan
enzim T4 ligase. Hasil ligasi ini merupakan DNA plasmid rekombinan yang siap
untuk ditransformasikan ke dalam E coli JM 109.
Transformasi ke E.coli JM109 dengan DNA rekombinan. Terdapat dua
tahap penting dalam prosedur transformasi, yaitu penyiapan sel kompeten dan
pemasukkan DNA ke dalam sel inangnya. Pembuatan sel kompeten E.coli JM 109
dilakukan menurut metode Mendel dan Higa yang telah dimodifikasi (Susanti,
2004).

DAFTAR PUSTAKA
Jordan E, M Hust,ARoth,R iedendieck,T. Schirrmann, D. Jahn, and S. Dubel,
2007. Production of recombinant antibody fragments in Bacillus
megaterium, Microbial Cell factories, 6(2): 111.
Mahayani, P.S. 2013. Analisis ekspresi klon gen cvpd dalam sel Escherichia
colli.Jurnal Agroknow Vol. 1. Surabaya: UNTAG.
Susanti, E.V. 2004. Kloning Gen Penisilin V Asilase dari Bacillus sp
BAC4Melalui Pembuatan Pustaka Genom. Biodiversitas vol. 5. Surakarta:
Universitas Sebelas Maret.
Suriasih, K. 2015. Pemotongan Dan Menyambung DNA Dalam Cloning Gen,
Studi Pada Kloning Gen Prolidase Dari Bakteri Asam Laktat. Denpasar:
Universitas Udayana.
Wangko, S., Kristanto, E. 2010. Kloning Manfaat Versus Masalah. Jurnal
Biomedik Vol. 2. Manado : FK Universitas Sam Ratulangi.