INMUNOGLOBULINA E (IGE)

PRINCIPIO
Anlisis secuencial Inmunoenzimomtrico (TIPO 4)
Los reactivos esenciales requeridos para un anlisis inmunoenzimometrico incluyen
anticuerpos de alta afinidad y especificidad (enzima e inmovilizados), con diferentes y
distintos reconocimientos de epitopes, en exceso y antgeno nativo. En este
procedimiento, la inmovilizacin toma lugar durante el anlisis en la superficie de los
pozos de la microplaca a travs de la interaccin de estreptavidina que cubre el pozo con
el anticuerpo monoclonal anti-IgE marcado con biotina agregado exgenamente.
Despus de mezclar del anticuerpo monoclonal marcado con biotina y el suero que
contiene antgeno nativo, la reaccin resultante entre el antgeno nativo y el anticuerpo es
la formacin de un complejo antgeno-anticuerpo. La interaccin es ilustrada por la
siguiente ecuacin:

Simultneamente, el complejo es depositado en el pozo a travs una reaccin de alta

afinidad de la estreptavidina y el anticuerpo marcado con biotina. Esta reaccin es
ilustrada a continuacin:

Luego de un periodo de incubacin adecuado, la fraccin unida de anticuerpo-antgeno es

separada del antgeno no unido por decantacin o aspiracin. Otro anticuerpo (dirigido
contra un epitope diferente) marcado con una enzima es adicionado. Otra interaccin
ocurre para formar un complejo anticuerpo-antgeno marcado con biotina- en la superficie
del pozo. El exceso de enzima es extrado mediante lavado. Se adiciona un sustrato
adecuado para producir color medible con el uso de un espectrofotometro de microplacas.

La actividad enzimatica en los pozos es directamente proporcional a la concentracin de

antgenos nativos. Mediante el uso de diversas referencias de sueros de concentracion
antignica conocida, se puede generar una curva de dosis respuesta, de la cual se puede
deducir la concentracin desconocida del antgeno.

RECOLECCION Y PREPARACIN DE LA MUESTRA

Las muestras sern sangre, tipo suero y tendrn que ser manejadas con las precauciones
de recoleccin en muestras por venopuncion. Para la comparacin exacta de los valores
normales establecidos, una muestra de suero por la maana en ayunas ser obtenida. La
sangre ser recogida en un tubo de puncin venosa de tapa roja, sin aditivos o
anticoagulantes.
Dejar que la sangre coagule. Centrifugar la muestra para separar el suero de las celulas.
Las muestras pueden ser refrigeradas a 2-8oC por un periodo mximo de 5 das. Si la
muestra no puede ser procesada dentro de este tiempo, la muestra ser almacenada a
temperatura de -20oC hasta por 30 das. Evitar el congelamiento y el descongelamiento
repetitivo. Se requiere de 0.050 ml de muestra cuando se realicen pruebas por duplicado.
PREPARACION DE LOS REACTIVOS
1. Solucin de Lavado
Diluir los contenidos del Concentrado de Lavado a 1000 ml con agua destilada o
desionizada en un contenedor de almacenaje adecuado. Almacenar a temperatura
ambiente de (20-27oC) hasta por 60 das.
2. Solucin de Substrato de trabajo
Vierta los contenidos del vial de solucin marcada con A en el vial de solucin marcada
con B. Coloque la tapa amarilla en el vial que contiene la mezcla para una fcil
identificacin. Mezclar y marcar respectivamente. Almacenar de 2-8oC.
Nota: No usar el substrato de trabajo si se ve azul.
PROCEDIMIENTO DE PRUEBA
Antes de comenzar con la prueba, lleve todos los reactivos, sueros de referencia y
controles a temperatura ambiente (20-27C).
1. Marcar los pozos de la microplaca para cada calibrador, control y paciente para ser
procesadas por duplicado.

Guardar cualquier tira de micropozos no usados dentro de la bolsa de aluminio,

sellarla y almacenarla de 2-8C.
2. Pipetear 0.025 ml (25l) de suero de referencia, control o muestra dentro del pozo
asignado.
3. Adicionar 0.100ml (100l) de Reactivo de IgE Biotina a cada pozo.
Es muy importante dispensar todos los reactivos cerca del fondo del pozo
recubierto.
4. Agitar ligeramente la microplaca durante 20-30 segundos para mezclar y cubrir.
5. Incubar 30 minutos a temperatura ambiente
6. Descartar los contenidos de la microplaca por decantacin o aspiracin. Si decanta,
seque la placa con papel absorbente.
7. Adicionar 300l de buffer de lavado, decantar (con un golpe o secado) o aspirar.
Repetir 2 veces ms para un total de 3 lavados.
Puede usarse un lavador de placa automtico o manual. Siga las instrucciones del
fabricante para el uso apropiado. Si se usa un frasco lavador, llene cada pozo
descomprimiendo el contenedor (evitar las burbujas de aire) para dispensar el
lavado. Decantar el lavado y repetir 2 veces adicionales.
8. Adicionar 0.100 ml (100l) del anticuerpo IgE marcado con enzima a cada pozo.
NO AGITAR LA MICROPLACA DESPUES DE LA ADICIN DE LA ENZIMA
9. Cubrir e incubar a temperatura ambiente por 30 minutos.
10. Desechar el contenido de la microplaca por medio de decantacin o aspiracin. Si se
realiza decantacin, seque la placa con papel absorbente.
11. Adicionar 350l de buffer de lavado, decantar (con golpe o con secado) o aspirar.
Repetir 2 veces adicionales para un total de 3 lavados.
Puede usarse un lavador de placa automtico o manual. Siga las instrucciones del
fabricante para el uso apropiado. Si se usa un frasco lavador, llene cada pozo
descomprimiendo los contenedores (evitar las burbujas de aire) para dispensar el
lavado. Decantar el lavado y repetir 2 veces adicionales.
12. Adicionar 0.100ml (100l) de solucin de sustrato de trabajo en todos los pozos.
Siempre adicione reactivos en el mismo orden para minimizar las diferencias del
tiempo de reaccin en los pozos.
NO AGITAR LA PLACA DESPUES DE LA ADICIN DEL SUSTRATO
13. Incubar a temperatura ambiente por 15 minutos.

14. Adicionar 0.050 ml (50l) de solucin stop a cada pozo y mezclar ligeramente (por 1520 segundos).
15. Leer la absorbancia en cada pozo a 450nm (usando una referencia de longitud de
onda de 620-630nm para minimizar las imperfecciones de los pozos) en un lector de
microplacas.
Los resultados deben ser ledos dentro de los treinta (30) minutos despus de la
adicin la solucin de parada.
CALCULO DE RESULTADOS
Una curva de dosis respuesta es usada para asegurar la concentracin de
Inmunoglobulina E en muestras desconocidas.
1. Registrar la absorbancia obtenida de la impresin del lector de microplacas como se
delineo en el Ejemplo.
2. Graficar la absorbancia para cada suero de referencia por duplicado versus la
concentracin de IgE correspondiente en IU/ml sobre el papel de grafica lineal (no
promediar los duplicados de los sueros antes de graficar).
3. Trazar la mejor curva fija a travs de los puntos de la grfica.
4. Para determinar la concentracin de IgE de una muestra desconocida, localizar la
absorbancia promedio de los duplicados desconocidos en el eje vertical del grfico,
encontrar el punto de interseccin sobre la curva y leer la concentracin (en IU/ml) del eje
horizontal del grafico (los duplicados desconocidos pueden ser promediados como se
indica). En el siguiente ejemplo, la absorbancia promedio (1.323) intersecta la curva de
dosis respuesta en una concentracin de IgE de 142 IU/ml.

* Los datos presentados en el Ejemplo 1 y Figura 1 son nicamente para ilustracin y no

deben ser usados en busca de una curva de dosis respuesta que se debe procesar para
cada ensayo.