UNIVERSIDAD NACIONAL

SANTIAGO ANTUNEZ DE MAYOLO

FACULTAD DE INGENIERIA DE INDUSTRIAS ALIMENTARIAS

IDENTIFICACIN Y SELECCIN DE CEPAS DE LEVADURAS

AISLADAS DE CHICHA DE JORA ARTESANAL

SEMINARIO DE TESIS

RESPONSABLE
RAMIREZ LUCIANO ISAAC
IDENTIFICACIN Y SELECCIN DE CEPAS DE LEVADURAS
AISLADAS DE CHICHA DE JORA ARTESANAL

NDICE
I.

VI.

EL PROBLEMA
I.1 Seleccin del Problema
I.2 Justificacin del Estudio
I.3 Objetivos de la Investigacin
I.3.1 Objetivo General
I.3.2 Objetivos Especficos
BASES TERICAS
II.1Antecedentes del Problema
II.2Planteamientos Tericos Atingentes
II.2.1 La Fermentacin y las Levaduras
A. La Fermentacin Alcohlica
B. Biologa de las Fermentaciones con Levaduras
C. Las Levaduras
D. Limitaciones del Proceso
II.2.2 Identificacin de Levaduras
A. Por Criterios Macrooscpicos
B. Por Mtodos Moleculares
HIPTESIS
METODOLOGA
IV.1
Materiales y Lugar de Ejecucin
IV.1.1 Lugar
IV.1.2 Muestra
IV.1.3 Reactivos
IV.1.4 Equipos
IV.1.5 Otros
IV.2
Mtodos
IV.2.1 Tcnicas de Recoleccin de Datos
IV.2.2 Diseo Experimental
IV.2.3 Diseo Estadstico
IV.2.4 Anlisis e Interpretacin de Datos
IV.2.4.1 Anlisis Estadstico
IV.2.4.2 Anlisis Documental
IV.2.4.3 Contrastacin de la Hiptesis
ADMINISTRACIN DEL PLAN DE INVESTIGACIN
V.1 Cronograma
V.2 Responsable
V.3 Presupuesto
BIBLIOGRAFA

I.

EL PROBLEMA

II.

III.
IV.

V.

La chicha de Jora, es una bebida ancestral de la zona andina del Per,

que se viene elaborando desde pocas anteriores a la de los Incas, se obtiene
habitualmente del maz germinado, el cual es molido y cocido para luego ser
puesto en incubacin en cntaros de barro, en ellos se produce una
fermentacin natural por microorganismos, los cuales no han sido
identificados pero se sospecha de la presencia de levaduras en su mayora,
adems de esto el proceso se realiza de una manera artesanal, sin tener
controles especficos sobre los parmetros involucrados, y es por ello que se
menciona que el hacer chicha es un arte que slo pasa de una generacin a
otra; sin embargo todo proceso tecnolgico es posible llevarlo a su mxima
expresin optimizando su rendimiento as como la calidad del producto
final.
I.1 Seleccin del Problema
La optimizacin de la produccin de Chicha de Jora es resultado
del proceso tecnolgico aplicado, as tambin que por tratarse de un
proceso fermentativo est involucrado el microorganismo causante de
esta transformacin, el cual es de mucha importancia, ya que estos
pueden ser especficos para este producto, pudiendo otorgarle
caractersticas especiales, es por ello que este estudio desarrollar la
identificacin de este microorganismo o grupo de microorganismos
participantes, as como la purificacin hasta convertirlo en una cepa de
uso industrial.
I.2 Justificacin del Estudio
La industrializacin de la produccin de Chicha de Jora es la
razn del estudio, es por ello que los resultados obtenidos sern de
inters para aquellos que buscan este propsito lo que conllevar
asimismo que la Chicha de Jora suba un peldao en la produccin de
bebidas ya que lo acercara a los niveles de produccin de otras bebidas
ms difundidas como son la cerveza y el vino, los cuales ya estn
estudiados en casi todos sus aspectos.
I.3 Objetivos de la Investigacin
I.3.1

Objetivo General

I.3.2

Desarrollar un cultivo puro a partir de la Chicha de

Jora elaborada artesanalmente del Callejn de
Huaylas.

Objetivos Especficos

II.

Aislar los microorganismos presentes de modo natural

en la Chicha de Jora elaborada artesanalmente.
Lograr la identificacin de los microorganismos
aislados.
Realizar la purificacin de estos microorganismos,
identificando a aquellos que tienen participacin en el
proceso de fermentativo.

BASES TERICAS
II.1

Antecedentes del Problema

Existen estudios realizados por Garca D y Mamani G., sobre seleccin

de levaduras nativas Saccharomyces cerevisiae aisladas de Chicha de
Jora del Valle del Mantaro; en la Universidad del Centro del Per
Huancayo, en el cual el objetivo de la investigacin fue seleccionar cepas
de levadura Saccharomyces cerevisiae las cuales trabajan a esas
condiciones climatolgicas (ms de 3500 m.s.n.m.); en este estudio lo
que se consigui fue la obtencin de dos cepas de naturaleza killer, las
cuales tienen una tolerancia al etanol de 12.5% (v/v), tolerancia al azcar
de 30% (p/v) y temperatura de fermentacin de 15 25C.
Estudios realizados por Manrique de Saenz Isabel (1979), reporta la
presencia de las siguientes especies microbiolgicas presentes en la
Chicha de Jora:
Especies:
Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces carlbergensis
Saccharomyces tropicalis
Saccharomyces exigenes
Brettanomyces anomalus
Torulopsis famata
Saccharomyces fructicum
Saccharomyces heterogenus
Saccharomyces pastorianus
Saccharomyces hanseii
Candida solari
Adems tambin hubo presencia de bacterias del gnero Lactobacillus,
Bacillus y Enterobacterias.
Cabe mencionar que estas especies fueron aisladas de diferentes chichas
de jora.

En estas chichas, el grado alcohlico vari de 0,8-13.2% en volumen,

encontrndose el 80% de estas por debajo de 5,8%, y una acidez por
debajo del 3,97%.
II.2

Planteamientos Tericos Atingentes

II.2.1 LA FERMENTACIN
Owen (1991), seala en trminos generales, la fermentacin
implica el empleo de microorganismos para llevar a cabo
transformaciones de la materia orgnica catalizadas por enzimas.
La fermentacin ha sido realizada como un arte durante muchos
siglos; por ejemplo, la elaboracin del vino se cree que se
practicaba ya al menos 10000 aos a.C. mientras que los
historiadores creen que los egipcios produjeron la cerveza en los
aos 5000 6000 a.C.
www.biologa.edu.ar (2005); el trmino fermentacin, en su
acepcin estricta, se refiere a la obtencin de energa en
ausencia de oxgeno y generalmente lleva agregado el nombre
del producto final de la reaccin.
Pasteur la denomin "la vie sans l'air" o "la vida sin aire".
El piruvato (o molculas derivadas del piruvato) se encuentra
disponible luego del proceso de gliclisis. Muchas clulas los
usan como aceptor terminal, creando productos de desecho que
se excretan de la clula.
A. La Fermentacin Alcohlica
La fermentacin alcohlica (denominada tambin como
fermentacin del etanol o incluso fermentacin etlica) es un
proceso biolgico de fermentacin en plena ausencia de aire
(oxgeno O2), originado por la actividad de algunos
microorganismos que procesan los hidratos de carbono (por
regla general azcares: como pueden ser por ejemplo la
glucosa, fructuosa, sacarosa, almidn, etc.) para obtener
como productos finales: un alcohol en forma de etanol (cuya
frmula qumica es: CH3-CH2-OH), dixido de carbono
(CO2) en forma de gas y unas molculas de ATP que
consumen los propios microorganismos en su metabolismo
celular energtico anaerbico. El etanol resultante se emplea
en la elaboracin de algunas bebidas alcohlicas, tales como
el vino, cerveza, sidra, etc. Aunque en la actualidad se
empieza a sintetizar tambin etanol mediante la

fermentacin a nivel industrial a gran escala para ser

empleado como biocombustible
.
La fermentacin alcohlica tiene como finalidad biolgica
proporcionar energa anaerbica a los microorganismos
unicelulares (levaduras) en ausencia de oxgeno para ello
disocian las molculas de glucosa y obtienen la energa
necesaria para sobrevivir, produciendo el alcohol y CO2
como desechos consecuencia de la fermentacin. Las
levaduras y bacterias causantes de este fenmeno son
microorganismos muy habituales en las frutas y cereales y
contribuyen en gran medida al sabor de los productos
fermentados Una de las principales caractersticas de estos
microorganismos es que viven en ambientes completamente
carentes de oxgeno (O2), mxime durante la reaccin
qumica, por esta razn se dice que la fermentacin
alcohlica es un proceso anaerbico. (www.wikipedia.com)
B. Biologa de las Fermentaciones con Levaduras
Owen (1991); Aproximadamente el 96% de la fermentacin
del etanol se lleva a cabo mediante cepas de Saccharomyces
cerevisiae o especies relacionadas, particularmente S.
uvarum. El etanol se produce en la ruta de EmbdenMeyerhof-Parnes (EMP), en la que el piruvato producido
durante la glicosilacin se convierte en acetaldehdo y
etanol.
FIG. 1: Ciclo de Embden-Meyerhof-Parnes

Fuente: www.biologa.edu.ar

La reaccin global es la siguiente:

Glucosa + 2ADP

2Etanol + 2CO2 + 2ATP

El rendimiento terico de 1g. de glucosa es de 0,51g. de

etanol y 0,49g. de CO2. Sin embargo, en la practica,
aproximadamente el 10% de la glucosa se transforma en
biomasa y el rendimiento en etanol y CO 2 alcanzan el 90%
del valor terico. El ATP formado se utiliza para las
necesidades energticas de la clula.
La gluclisis es la primera etapa de la fermentacin, al igual
que la respiracin celular, y al igual que sta necesita de
enzimas para su completo funcionamiento. A pesar de la
complejidad de los procesos bioqumicos una forma
esquemtica de la reaccin qumica de la fermentacin
alcohlica puede describirse como una gliclisis (en la
denominada va Embden-Meyerhof-Parnes) de tal forma que
puede verse como participa inicialmente una molcula de
hexosa:
C6H12O6 + 2 Pi + 2 ADP 2 CH3-CH2OH + 2 CO2 + 2 ATP + 25.5 kcal

Se puede ver que la fermentacin alcohlica es desde el

punto de vista energtico una exotrmica, se libera una cierta
cantidad de energa. La fermentacin alcohlica produce
gran cantidad de CO2, que es la que provoca que el cava (al
igual que el Champagne y algunos vinos) tengan burbujas.
Este CO2 (denominado en la edad media como gas vinorum)
pesa ms que el aire, y puede llegar a crear bolsas que
desplazan el oxgeno de los recipientes donde se produce la
fermentacin. Por ello es necesario ventilar bien los espacios
dedicados a tal fin. En las bodegas de vino, por ejemplo, se
suele ir con una vela encendida y colocada a la altura de la
cintura, para que en el caso de que la vela se apague, se
pueda salir inmediatamente de la bodega. La liberacin del
dixido de carbono es a veces "tumultuosa" y da la
sensacin de hervir, de ah proviene el nombre de
fermentacin, palabra que en castellano tiene por etimologa
del latn fervere.
Un clculo realizado sobre la reaccin qumica muestra que
el etanol resultante es casi un 51% del peso, los rendimientos
obtenidos en la industria alcanzan el 7%. Se puede ver
igualmente que la presencia de fsforo (en forma de fosfatos
es importante para la evolucin del proceso de fermentacin.
La fermentacin alcohlica se produce por regla general
antes que la fermentacin malolctica, aunque existen
procesos de fermentacin especficos en los que ambas
fermentaciones tienen lugar al mismo tiempo. La presencia

de azcares asimilables superiores a una concentracin

superior s 0.16 gr/litro produce invariablemente la formacin
de alcohol etlico en proceso de crecimiento de levadura
(Saccharomyces cerevisiae) incluso en presencia de exceso
de oxgeno (aerbico), este es el denominado efecto Crabtre.
Este efecto es tenido en cuenta a la hora de estudiar y tratar
de modificar la produccin de etanol durante la
fermentacin.
C. Las Levaduras
Owen (1991), las levaduras sin microhongos que se
encuentran generalmente en forma de clulas nicas y que se
reproducen mediante gemacin. Algunas levaduras estn
formadas nicamente por clulas individuales y a veces
cadenas cortas, mientras que otras se encuentran con cierto
rango de formas celulares, incluyendo diversos tipos de
filamentos.
D. Limitaciones del Proceso
La determinacin de los factores que limitan la gliclisis
fermentativa del etanol son complejos debido a la
interrelacin existente y a la naturaleza de los parmetros
intervinientes durante el proceso de fermentacin. Algunos
de ellos se deben tener en cuenta en la fermentacin
alcohlica industrial. En las limitaciones que surgen durante
el proceso se pueden enumerar algunos de los ms
importantes como son:

Concentracin de Etanol Resultante - Una de las

principales limitaciones del proceso, es la resistencia de
las levaduras a las concentraciones de etanol (alcohol)
que se llegan a producir durante la fermentacin, algunos
microorganismos como el saccharomyces cerevisiae
pueden llegar a soportar hasta el 20% de concentracin
en volumen. En ingeniera bioqumica estos crecimientos
se definen y se modelizan con las ecuaciones de
crecimiento celular dadas por las ecuaciones de Tessier,
Moser y de la ecuacin de Monod.

Acidez del Substrato - El pH es un factor limitante en el

proceso de la fermentacin ya que las levaduras se
encuentran afectadas claramente por el ambiente, bien
sea alcalino o cido. Por regla general el funcionamiento
de las levaduras est en un rango que va
aproximadamente desde 3.5 a 5.5 pH. Los procesos
industriales procuran mantener los niveles ptimos de

acidez en durante la fermentacin a veces mediante el

empleo de disoluciones tampn. Los cidos de algunas
frutas (cido tartrico, mlico) limitan a veces este
proceso.

Concentracin de Azcares - La concentracin excesiva

de hidratos de carbono en forma de monosacridos y
disacridos puede frenar la actividad bacteriana. De la
misma forma la baja concentracin puede frenar el
proceso. Las concentraciones lmite dependen del tipo de
azcar as como de la levadura responsable de la
fermentacin. Las concentraciones de azcares afectan a
los procesos de osmosis dentro de la membrana celular.

Contacto con el Aire - Una intervencin de oxgeno (por

mnima que sea) en el proceso lo detiene por completo
(es el denominado Efecto Pasteur). Esta es la razn por
la que los recipientes fermentadores se cierren
hermticamente.

La Temperatura - El proceso de fermentacin es

exotrmico, y las levaduras tienen un rgimen de
funcionamiento en unos rangos de temperatura ptimos,
se debe entender adems que las levaduras son seres
mesfilo. Si se expone cualquier levadura a una
temperatura cercana o superior a 55 C por un tiempo de
5 minutos se produce su muerte. La mayora cumple su
misin a temperaturas de 30C.

Ritmo de Crecimiento de las Cepas - Durante la

fermentacin las cepas crecen en nmero debido a las
condiciones favorables que se presentan en el medio,
esto hace que se incremente la concentracin de
levaduras.

II.2.2 IDENTIFICACIN DE LEVADURAS

A. Por Criterios Morfolgicos Macrooscpicos
Linares, Solis (2001); estos criterios tienen en cuenta el
aspecto de las colonias de levaduras al crecer en los
diferentes medios de cultivo. La mayora de los
organismos levaduriformes crecen fcilmente en un gran
nmero de medios de cultivo usados rutinariamente en el
laboratorio de Microbiologa (agar sangre, agar chocolate,
agar Cled, etc.). Sin embargo, el agar glucosado de
Sabouraud (SDA), con o sin antibiticos aadidos, es el

medio de aislamiento por excelencia para la identificacin

de levaduras.
En el medio SDA las colonias de levaduras suelen ser
completas, ligeramente abombadas o planas, de
consistencia mantecosa, lisa o rugosa, con olor dulzn
agradable, volvindose ms pastosas a medida que
envejecen.
Por lo general las colonias de levaduras no desarrollan
micelio areo, aunque en ocasiones pueden aparecer
prolongaciones aracneiformes en la
periferia de las colonias. Si se observa un micelio areo
definido, debe considerarse la posibilidad de que se trate
de un hongo dimrfico o de ciertas especies de levaduras
que pueden formar micelio verdadero como Geotrichum,
Trichosporon o Blastoschizomyces.
Una colonia de aspecto y consistencia mucoide sugiere la
formacin de cpsulas y puede ser el paso inicial para la
identificacin de Cryptococcus neoformans.
Las colonias de color rojo-anaranjado o naranja, de
aspecto cremoso o rugoso, son caractersticas de las
especies del gnero Rhodotorula (del gr. rhodo, rojo),
color que manifiesta esta levadura por su riqueza en
carotenoides.
Pero no todas las colonias blancas y cremosas son
levaduras; las especies de algas acloroflicas del gnero
Prototheca, tras incubacin a 28 C durante 3-4 das,
desarrollan unas colonias blancas cremosas muy parecidas
a las producidas por el gnero Candida.
Leonor Carrillo, Las caractersticas macro y
micromorfolgicas son importantes para la identificacin
(fig.2) y si la formacin de las ascosporas no puede ser
observada en Malta-Glucosa a 25-30C, se inocula el
medio Acetato. Las cepas productoras de cido
desarrollan en Malta-Actico y las levaduras xerfilas
crecen sobre Malta-Sal-Glucosa o Malta-50%Glucosa.
Con estos datos y el resultado de la incubacin a 37C, se
puede acceder a la identificacin de las 14 especies ms
comunes de levaduras observadas en el 42,3% de los
alimentos, usando la clave de Pitt & Hocking.

Fig. 02: Principales Levaduras Presentes en Alimentos

Fuente: Los Hongos de los Alimentos y Forrajes

B. Mtodos Moleculares
Teresa Orber (2004), Los mtodos moleculares de
identificacin de levaduras y microorganismos en general,
se basan en el estudio de las molculas de DNA y RNA.
En levaduras se iniciaron con el estudio de
complementariedad del DNA nuclear, determinndose la
existencia de relaciones coespecficas entre cepas cuyos
caracteres fisiolgicos y morfolgicos considerados
determinantes para discernir entre especies eran diferentes
(ej. el gnero Torulopsis, que carece de pseudohifas, es
coespecfico con Candida que s las forma; Hansenula,
que asimila el nitrato, es coespecfico de Pichia, que no lo
asimila).

Polimorfismo longitudinal de los cromosomas.

Electroforesis de cariotipo. Cariotipificacin.
Mediante este mtodo, la molcula de DNA previamente
digerida con endonucleasas de restriccin de corte poco
frecuente, es sometida a un campo elctrico a velocidad
constante en un gel de electroforesis, de forma tal que
debido a la carga negativa que posee a pH fisiolgico,
migre hacia el polo positivo; la migracin se realiza a una
velocidad que depende del tamao y la carga de las
molculas, de tal manera que en el gel de electroforesis se
visualiza un patrn de bandas. Este patrn en levaduras es
especfico de especie, debido a fenmenos genticos y
evolutivos que han tenido lugar en los cromosomas
(inserciones, deleciones y translocaciones). Esta tcnica
ha constituido una herramienta til en la diferenciacin de
especies de Candida, Saccharomyces, Kluyveromyces y
Zygosaccharomyces, para el estudio de relaciones
anamorfo-teleomorfas entre especies de Candida, Pichia,
Kluyveromyces y Saccharomyces, as como para
verificacin de sinonimia. La tcnica de electroforesis en
gel de campo pulsado (PFGE), es la de mayor poder
discriminatorio.

Polimorfismo del DNA mitocondrial (mtDNA).

Las levaduras son organismos con un amplio grado de
variabilidad en el tamao del mtDNA, el cual puede
variar entre los 6 y los 25m. En la mayora de las
especies es de forma circular. Entre las ventajas del uso
del mtDNA en taxonoma se encuentran su pequeo
tamao, elevado nmero de copias, en cada aislamiento
de un fenotipo salvaje dicaritico se recupera un solo
halotipo y que la electroforesis del DNA total digerido
con endonucleasas de restriccin, permite la visualizacin
en gel de fragmentos de hasta 2kb.
La elevada variabilidad del mtDNA lo hizo atractivo para
su uso en la identificacin de especies por electroforesis,
pero posea la limitante de que se requera el aislamiento
de las mitocondrias y del mtDNA, lo cual lo haca
impracticable para su uso en la identificacin de gran
cantidad de muestras. Esta dificultad fue superada por el
mtodo diseado por Querol et al. 1992 para el anlisis de
restriccin del mtDNA, sin necesidad de aislamiento ni
purificacin previa. La tcnica fue desarrollada en S.
cerevisiae y se basa en las diferencias existentes en el
contenido de G+C existentes entre el DNA nuclear
(nDNA) y el mtDNA, de tal forma que en el nDNA es de
un 40%, mientras que en el mtDNA es solo de un 20%.
Esto permite que si a un aislamiento de DNA total se le
hace un anlisis de restriccin utilizando enzimas

especficas para reconocer regiones ricas en G+C, tales

como SacII y SstII cuya secuencia blanco es CCGCGG, el
nDNA sufre una sobredigestin generndose numerosos
fragmentos de muy pequeo tamao, indetectables en un
gel de agarosa. De esta manera, en una electroforesis de
DNA total digerido con estas endonucleasas solo se
observan los fragmentos correspondientes al mtDNA
ubicados segn su tamao y mostrando un perfil
especfico de especie. Recientemente, los autores
introdujeron una variante que reduce el tiempo de
duracin del mtodo original en 52,5 h, por disminucin
del tiempo de incubacin para la digestin del DNA de 12
h a 33 min en un horno de microondas, y del crecimiento
celular a 36 h. La comparacin de ambos mtodos
utilizando las mismas endonucleasas revel iguales
perfiles en la electroforesis. Este mtodo ha sido utilizado
para la caracterizacin de Candida zeylanoides,
Debaryomyces hansenii, Brettanomyces/Dekkera y
Zygosaccharomyces. Otras especies de inters industrial
como Kluyveromyces lactis han demostrado poseer
potencialidades para la aplicacin de la tcnica.

Anlisis de microsatlites.
Esta tcnica se basa en el uso de la Reaccin en Cadena
de la Polimerasa (PCR) y consiste en la amplificacin de
fragmentos con cebadores de oligonucletidos especficos
para secuencias simples repetitivas presentes en el DNA,
denominadas microsatlites. Entre los ms utilizados se
encuentran (GTC)5, (GACA)4, Fago DNA M13 y la
secuencia del M13 GAGGGTGGCGGTTCT. Esta tcnica
difiere del RAPD, en que la temperatura de hibridacin
del cebador es mayor (55 C), en lugar de la de 37 C, por
lo que estos hibridan en zonas especficas del genoma, de
ah que la reproducibilidad es mayor. Se ha empleado en
la
identificacin
de
especies
del
gnero
Zygosaccharomyces, contaminantes de salsas mayonesas
y otros aderezos para ensaladas.
Mtodos basados en el uso del genoma ribosomal

Polimorfismo de longitud en los fragmentos de

restriccin del rDNA/rRNA (RFLP).
La determinacin del polimorfismo de longitud de los
fragmentos de restriccin, consiste en la diferenciacin de
los organismos por el anlisis de los patrones de ruptura
que se generan en un sitio especfico del genoma, cuando
es cortado por enzimas de restriccin. De esta forma, en
un gel de electroforesis aparece un patrn de bandas
polimrficas correspondientes a los fragmentos de
diferentes tamaos, que se generan con el corte de cada

endonucleasa. Estos fragmentos polimrficos aparecen

debido a que los organismos de diferentes especies, e
incluso cepas, difieren en la distancia de los sitios de
clivaje para cada enzima de restriccin. La similitud de
los patrones generados permite establecer correlaciones
entre especies y cepas, y la existencia de patrones nicos
permite la identificacin. Este mtodo se ha empleado
para diferenciar entre las especies de los gneros
Candida, Cryptococcus y otras, as como para estudios
ecolgicos utilizando el rRNA 16S, en determinacin de
posicin taxonmica utilizando el rDNA 18S, as como el
dominio D1/D2 del rDNA 26S, una regin de elevada
variabilidad.
El ms amplio uso que se le ha dado a la tcnica de RFLP
ha sido en estudios de identificacin y filogenia de
levaduras de inters industrial, utilizando la regin del
rDNA 5,8S y los espaciadores transcritos internos ITS 1 e
ITS 2 (5,8S ITS) [5,11]. La regin 5.8S es codificadora
y conservada y muestra una baja variabilidad
intraespecfica que no permite la delimitacin entre cepas
de una misma especie, sin embargo la zona de los ITS,
que es una regin no codificadora e hipervariable, permite
el reconocimiento a nivel interespecfico. sta ha sido
empleada para la identificacin de especies del gnero
Kluyveromyces. En estos estudios se ha utilizado una
variante de la tcnica conocida como RFLP-PCR. Para
ella, se amplifican fragmentos especficos del DNA por
PCR y luego son tratados con endonucleasas de
restriccin para obtener los patrones especficos. Las
diferencias en las secuencias nucleotdicas de las
diferentes especies darn lugar a fragmentos de distintos
tamaos que son examinados por electroforesis. Los
productos de la PCR del rDNA muestran elevada
variacin longitudinal para las diferentes especies. En la
Tabla 1 se observa que el tamao de los productos de la
PCR y el anlisis de restriccin de esta regin con las
endonucleasas HinfI, CfoI y HaeIII que genera un patrn
especie - especfico, excepto para los pares
anamorfo/teleomorfo y las especies muy similares como
las del grupo Saccharomyces sensu stricto, no presentan
diferencias.

Tabla 01: Tamao en pares de bases (pb) de los productos

de la PCR y los fragmentos de restriccin de la fase
levaduriforme de ascomicetes y basidiomicetes.
Fragmentos de Restirccin
Especies

(pb)
Cfol

Haelll

Hinfl

Candida tropicalis

550

280+250

450+90

270+270

Candida albidus

630

330+300

500+70+60

350+160+120

740

285+190+165+90

655+80

290+180+120+80+65

740

285+185+140+100

655+80

240+185+120+80+65+50

740

285+190+165+90

665+80

240+185+120+80+65+50

380

360

380

250+130

880

385+365

500+220+145

365++155

880

385+365

320+230+180+150

365+155

880

385+365

700

450+225

Rhodotorula acuta

880

385+365

650

250+190+185

Rhodotorula glutinis

640

320+240+80

430+210

340+225+75

610

320+250

600

280+120+105+105

500

230+130+180

375+105

265+215

485

255+140+190

375+95

270+215

Kluyveromyces
lactis
Kluyveromyces
marxianus
K. marxianus var.
drosophilarum
Pichia pastoris
Saccharomyces
bayanus
Saccharomyces
cerevisiae
Saccharomyces
pastorianus

Sporobolomyces
roseus
Brettanomyces
bruxelensis
Debaryomyces
bruxelensis

Fuente: Revista Iberoamericana de Micologa

Polimorfismo del DNA aleatoriamente amplificado

(RAPD). Arbitrarily Primed PCR (AP-PCR). DNA
Amplification Fingerprinting (DAF).
Se basa en la amplificacin por PCR simultnea del
DNA genmico en presencia de un nico cebador de
pocos oligonucletidos. Debido a la baja temperatura de
hibridacin (35-39 C) el cebador se une a sitios
inespecficos, distribuidos en regiones aleatorias en todo
el genoma, permitiendo la amplificacin de fragmentos
polimrficos de DNA. Los productos amplificados se
visualizan por electroforesis. El uso de RAPD permite
obtener las llamadas huellas digitales que no son ms
que las diferencias de nmero y tamao en los fragmentos

del DNA amplificado, las cuales son especficas de

especies e incluso cepas [19]. En 1993, Fell aplic la
denominada Tcnica de los Tres Cebadores; para lo cual
utiliz dos cebadores externos especficos de la regin
correspondiente al dominio D1/D2 de la subunidad mayor
(LSU) del rRNA (rRNA 26S) y uno interno especfico de
cada especie a analizar. Los cebadores externos permiten
la amplificacin de un fragmento de 600 pb comn a
todas las especies de levaduras, mientras que el interno
permite la amplificacin de una secuencia menor,
especfica de especie. El RAPD posee potencialidades
para ser empleado en estudios de control de calidad de
inculos para fabricacin de cerveza y otras bebidas, pues
la comparacin del cultivo original con el de las lneas
subcultivadas, permite que cualquier contaminante sea
identificado. La tcnica ha sido utilizada para
estudios de identificacin de cepas a partir del
anlisis del dominio D1/D2 del rRNA 26S, una regin
altamente variable, con diferencias entre especies de
hasta una nica base. Esta regin ha permitido
separar todas las especies de ascomicetes de fase
levaduriforme
existentes,
incluso
las altamente
relacionadas. En la misma lnea, est el diseo de
mtodos especficos para la identificacin de especies
de un mismo gnero, como el Mtodo de los Cuatro
Cebadores de Kurtzman y Mannarelli en 1998, el cual se
basa en el uso de dos cebadores universales empleados
como control positivo y dos internos especficos de
especie derivados de la regin D1/D2. La amplificacin
genera dos fragmentos de 1200-1300 pb que aparecen
siempre y uno pequeo de 114-336 pb presente solo
cuando est la especie buscada. El RAPD-PCR se
emple recientemente en el anlisis de la variabilidad
gentica de los miembros del grupo Saccharomyces
sensu stricto (S. bayanus, S. cerevisiae, S. paradoxus y S.
pastorianus).
Este estudio permiti delimitar entre estas especies
estrechamente
relacionadas,
as
como
grupos
intraespecficos como los dos existentes en la especie S.
bayanus. En el trabajo se determin tambin el origen
hbrido de la especie S. pastorianus, a partir del anlisis
de la fraccin de bandas mostradas por cada hbrido y las
cepas parentales.

III.

HIPTESIS

Es posible utilizar como cultivo iniciador, a un grupo de cepas las cuales

han sido aisladas de la Chicha de Jora que se elabora de modo artesanal en el
Callejn de Huaylas.
IV.

METODOLOGA
IV.1

Materiales y Lugar de Ejecucin

IV.1.1 Lugar

Universidad Nacional Santiago Antnez de Mayolo,

Facultad de Ingeniera de Industrias Alimentarias, en sus
laboratorios de Microbiologa de Alimentos, Tecnologa de
Alimentos y Anlisis de Alimentos.

IV.1.2 Muestra

La muestra ser representativa de un lote para su procedente

anlisis, y extraccin del inculo.

IV.1.3 Reactivos

Agua destilada.
Energa elctrica.
NaOH 0,1N
Fenolftlena.
Agar Sabouraud.
Toxinas killer.
Disacridos y polisacridos.
Cultivos patrn.

IV.1.4 Equipos

Incubadora.
Refrigeradora.
Autoclave.
pHmetro.
Equipo de titulacin.
Equipo de destilacin.
Fermentador

IV.1.5 Otros

Recipientes para muestras.

Matraces de Erlenmeyer.
Tubos de ensayo.

IV.2

Placas Petri.
Pipetas.
Lmina portaobjetos.
Alcoholmetro.
Pipeteador.
Gradilla de tubos.
Mechero de Bunsen.
Asa de siembra.

MTODOS
IV.2.1 Tcnica de Recoleccin de Datos
Las tcnicas de recoleccin de datos del problema en el estudio
de investigacin y de las hiptesis sern:

Datos Primarios: Estos datos

se obtendrn de los
resultados experimentales en forma directa por nuestro
estudio en los laboratorios u otros lugares en la ejecucin del
trabajo de investigacin.

Datos Secundarios: Estos datos se obtendrn de

informacin documental de material bibliogrfico (tesis,
libros, proyectos, trabajos de investigacin, etc.), como
tambin de hemeroteca (revistas, peridicos) y posiblemente
videoteca, como tambin de Internet.

IV.2.2 Diseo Experimental:

Para la ejecucin del proyecto de investigacin se seguir el
siguiente Cuadro, que explica las etapas de la investigacin, as
como las acciones realizadas en cada etapa.

ETAPA I

DISEO EXPERIMENTAL
ETAPA II

Caracterizacin de la
materia prima de la cual
proviene la muestra
inculo.

Aislamiento de las
levaduras presentes en la
muestra.
Identificacin de las
levaduras por mtodos
macroscpicos y de
diferenciacin
bioqumica.
Seleccin de aquellas de
inters para el proceso
fermentativo.
Pruebas de tolerancia al
etanol.
Pruebas de tolerancia al
azcar.
Evaluacin del fenotipo
killer.
Identificacin por
mtodos de biologa
molecular.

ETAPA III

Prueba de campo.
Caracterizacin del
producto obtenido.

DESCRIPCCIN DE LAS ETAPAS DEL TRABAJO DE

INVESTIGACIN
ETAPA I
Para la caracterizacin de la materia prima se realizarn los
siguientes anlisis:

Acidez inica.
Acidez titulable: fija y voltil.
Determinacin del grado alcohlico.

ETAPA II
En esta etapa se realizaran las siguientes acciones:
Aislamiento de las levaduras mediante la siembra en agar
sabouraud.
Aplicacin de microcultivos para su identificacin
macrooscpica.
Identificacin por diferenciacin bioqumica, mediante la
fermentacin y/o asimilacin de diferentes carbohidratos.
Ensayos de tolerancia al etanol a diferentes
concentraciones.
Ensayos de tolerancia al azcar a diferentes
concentraciones.
Ensayo de sensibilidad a toxinas killer.
Identificacin o caracterizacin por tcnicas de biologa
molecular RFLP.
ETAPA III
En esta etapa se realizar lo siguiente:
Aplicacin de las cepas obtenidas en la produccin de
chicha de jora.
Caracterizacin del producto obtenido.
IV.2.3 Diseo Estadstico:
IV.2.3.1 Factor A: Concentracin de etanol.
IV.2.3.1.1 Variable A1
IV.2.3.1.2 Variable A2
IV.2.3.1.3 Variable A3
IV.2.3.1.4 Variable A4
IV.2.3.1.5 Variable A5
IV.2.3.1.6 Variable A6
IV.2.3.2

Factor B: Concentracin de sacarosa.

IV.2.3.2.1
IV.2.3.2.2
IV.2.3.2.3
IV.2.3.2.4
IV.2.3.2.5
IV.2.3.2.6

Variable B1
Variable B2
Variable B3
Variable B4
Variable B5
Variable B6

Definicin de las Variables:

Variable A1: 2% etanol.
Variable A2: 4% etanol.
Variable A3: 6% etanol.
Variable A4: 8% etanol.
Variable A5: 10% etanol.
Variable A6: 12% etanol.
Variable B1: 10% sacarosa.
Variable B2: 15% sacarosa.
Variable B3: 20% sacarosa.
Variable B4: 25% sacarosa.
Variable B5: 30% sacarosa.
Variable B6: 35% sacarosa.
DIAGRAMA DEL DISEO ESTADSTICO

Arreglo factorial: 6 + 6 = 12 tratamientos con 3 repeticiones.

IV.2.4 Anlisis e Interpretacin de Resultados:
IV.2.4.1 Anlisis Estadstico:
Se realizaran pruebas de anlisis de varianza y de
significancia en caso de ser necesario, entre los
tratamientos aplicados.
IV.2.4.2 Anlisis Documental:
Para realizar el anlisis documental primero se tendr
que realizar la parte experimental de la investigacin

para poder contrastar los resultados obtenidos con las

referencias bibliogrficas.
IV.2.4.3 Contrastacin de la Hiptesis:
La Contrastacin de hiptesis se realizar luego de
obtener los resultados de la parte experimental.
V.

ADMINISTRACIN DEL PLAN DE INVESTIGACIN

V.1 Cronograma

ACTIVIDADE
S
Revisin
Bibliogrfica
Ejecucin del
Experimento
Procesamiento
de Datos
Anlisis e
Interpretacin
Elaboracin del
Primer Borrador
del Informe
Reajuste del
Informe y
Presentacin
Sustentacin y
Empastado

Meses
1

V.2 Presupuesto:

UNIDAD

MONTO /
Unidad
(mes)

RECURSOS HUMANOS

MONTO
TOTAL
(Nuevos
Soles)

Alumnos

01

Asesor

01

200.00

1200.00

Sub. Total

1200.00

RECURSOS MATERIALES
Papeles

01 millar

24.00

24.00

Tipeos

01 ejemplar

30.00

30.00

Anillados

01 ejemplar

3.00

3.00

10.00

70.00

Sub. Total

127.00

Internet

INSUMOS Y EQUIPOS
Cultivos patrn
Toxinas killer
Etanol
Disacridos y polisacridos
Agar sabouraud
Incubadora.

Refrigeradora.

Autoclave.

pHmetro.

Equipo de titulacin.

Equipo de destilacin.

Fermentador

Recipientes para muestras.

Matraces de Erlenmeyer.
Tubos de ensayo.
Placas Petri.

117

Pipetas 1ml

Pipetas 10 ml

Lmina portaobjetos.
Alcoholmetro

Pipeteador.

Gradilla de tubos.

Mechero de Bunsen.

Asa de siembra.

1
INVERSIN TOTAL :

VI.

BILBIOGRAFA
OWEN P. WARD Biotecnologa de la Fermentacin 1991
Editorial Acribia.
C.H. COLLINS ET AL. Mtodos Microbiolgicos 1989
Editorial Acribia.
TERESA ORBER RATN Mtodos Moleculares de
Identificacin de Levaduras de Inters Biotecnolgico - Revista
Iberoamericana de Micologa 21 2004.
LEONOR CARRILLO Los Hongos de los Alimentos y Forrajes
Artculo de Internet.
GARCA D., MAMANI G. Seleccin de Levaduras Nativas
Saccharomyces cerevisiae Aisladas de Chicha de Jora del Valle del
Mantaro Universidad Nacional del Centro del Per.
MARA JOS LINARES Identificacin de Levaduras - Revista
Iberoamericana de Micologa 2001
www.biologa.edu.ar