ANTAGONISMO DE CEPAS DE Pseudomonas fluorescens Y

Burkholderia cepacia CONTRA HONGOS FITOPATGENOS DEL

ARROZ Y EL MAZ
Araque Rivas Hariana Magdalena
Instituto Universitario Politcnico Santiago Mario, Escuela de Ingeniera
Agronmica
RESUMEN
Las rizobacterias tienen la capacidad de producir metabolitos de inters agrcola,
que no solo influyen en el crecimiento de la planta, sino tambin en el
antagonismo de otros microorganismos. El presente trabajo, tiene como finalidad
analizar dos investigaciones que citan a Pseudomonas fluorescens y Burkholderia
cepacia, como antagonistas y como productoras de metabolitos del tipo AIA,
siderforos y cido saliclico, en ambos trabajos se desarrollaron bioensayos, los
cuales para fines de anlisis se dejan planteados tal cual como aparecen en los
dichos trabajos de investigacin, denotndolas como experiencia 1 para el trabajo
de antagonismo, y experiencia 2 para el de produccin de metabolitos. Los
resultados fueron analizados, concluyendo que la produccin de metabolitos, tal
como lo es el siderforo tiene un efecto antagonista sobre otros microorganismos,
lo cual evidencia que estas cepas pueden ser utilizadas en la promocin del
crecimiento vegetal en cultivos de importancia econmica, e igualmente para el
control biolgico de patgenos de las plantas.
INTRODUCCIN
En estos ltimos aos y con ayuda de la ciencia se ha venido prestando
atencin al estudio de los microorganismos asociados a las races de las plantas y
sus beneficios en la agricultura. Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal
(PGBP), se encuentran entre los principales grupos microbianos estudiados,
destacndose por sus efectos efectos beneficiosos tanto para las plantas como para
los ecosistemas.
Pseudomonas fluorescens y Burkholderia cepacia se destacan por su alta
frecuencia de aparicin en la rizosfera. Entre sus mecanismos de accin se
encuentran el aumento de la toma de agua y nutrientes por la planta, la produccin
de reguladores del crecimiento vegetal y el control biolgico de patgenos, dado

fundamentalmente por la produccin de siderforos, la antibiosis y la induccin de

resistencia a la planta.
Entre los mecanismos de control biolgico mediados por rizobacterias
ampliamente reconocidos se encuentran: la competencia por un nicho ecolgico o
sustrato, la sntesis de compuestos inhibitorios como, siderforos, antibiticos,
enzimas lticas y detoxificadoras, as como la induccin de resistencia sistmica en
la planta. Las bacterias de los gneros Pseudomonas y Burkholderia, son de los
grupos ms estudiados porque tienen la capacidad de producir reguladores del
crecimiento vegetal y otros metabolitos con efecto antagnico y represivo del
crecimiento de patgenos en la rizosfera, por lo que resulta de gran importancia la
caracterizacin y seleccin de cepas autctonas de estos gneros, los cuales
muestran efecto antagnico ante patgenos que atacan a cultivos de importancia
econmica, de forma tal que se puedan aprovechar sus potencialidades como
agentes de control biolgico.
El presente anlisis trata de enfocar la influencia de la produccin de
metabolitos con relacin a la accin antagnica de dichas cepas de rizobacterias,
en el cual se incluye la metodologa para determinar la actividad antagnica y el
efecto inhibitorio de los metabolitos activos producidos por rizobacterias ante
fitopatgenos que afectan a los cultivos del maz y el arroz; y el mtodo para
caracterizar rizobacterias asociadas al cultivo del maz en cuanto a la produccin
de AIA, siderforos y cido saliclico, dejando ambas metodologas plasmadas tal
cual como fueron realizadas para obtener los resultados. Los resultados se
figuraron en cuanto a la cepa de ms influencia y la de menos efecto, en las
conclusiones se comparan ambos efectos y la influencia de uno sobre el otro.
MATERIALES Y MTODOS (Experiencia 1)
Cultivos microbianos: Se utilizaron nueve cepas autctonas de las especies
Pseudomonas fluorescens (MPf2, MPf3, MPf4, MPf5, MPf6 y MPf19) y
Burkholderia cepacia (MPp8, MPp16, MPp20), previamente aisladas de la
rizosfera del cultivo del maz variedad Francisco mejorado en el ao 2002. Como
controles fueron utilizadas las cepas de referencia de B. cepacia 0057 y P.

fluorescens J-143, pertenecientes a la Coleccin de Cultivos de la Facultad de

Biologa de la Universidad de La Habana. Todas las cepas se encontraban
conservadas en Caldo LB (DUCHEFA BIOCHEME) con glicerol al 40%, a -200C.
Se utilizaron cepas de los hongos fitopatgenos Curvularia sp. A1, Fusarium sp.
A2, Fusarium oxysporum M1 y Alternaria alternata M2, todas gentilmente donadas
por el Instituto de Investigaciones de Sanidad Vegetal (INISAV) y conservadas en
tubos de cultivo con medio Papa Dextrosa Agar (PDA) (DIFCO), a 4oC.
Determinacin del efecto antagnico de las rizobacterias ante fitopatgenos
de los cultivos del maz y el arroz: Se desarrollaron bioensayos in vitro para
determinar el efecto antagnico de las cepas bacterianas ante cepas de hongos
fitopatgenos de los cultivos del arroz (Curvularia sp. A1, Fusarium sp. A2) y el
maz (Fusarium oxysporum M1, Alternaria alternata M2). En todos los casos se
sigui la metodologa descrita por Bashan et al. (3).
Para este estudio fue utilizado el medio King B, compuesto por: 8.7 mL de
glicerol, 1.5 g de peptona, 1.5 g de K 2HPO4 y 1.5 g de MgSO4 (todo por L de H2O
mili Q). Para ello los hongos se sembraron previamente en el medio de cultivo
seleccionado y se incubaron a 30 C 2 C durante 7 das. Posteriormente, se
realizaron perforaciones en las placas previamente sembradas con el hongo, en la
parte central de la colonia, utilizando un obturador con dimetro de 5 mm. Los
parches fueron colocados en el centro de las placas sembradas con la bacteria,
utilizndose un parche para cada placa.
Se sembraron ambos microorganismos al mismo tiempo y se realiz la
incubacin a 30 C durante 7 das. El efecto antagnico de las bacterias fue
determinado a travs de mediciones del dimetro de crecimiento del hongo (mm)
en comparacin con un tratamiento control donde no se aplic el antagonista
bacteriano. Las placas Petri utilizadas tenan un dimetro de 90mm.
Determinacin del efecto inhibitorio de metabolitos producidos por las
rizobacterias ante fitopatgenos de los cultivos del maz y el arroz: Para
determinar el efecto inhibitorio de los metabolitos producidos por las cepas se

realizaron bioensayos in vitro. Para ello primeramente las placas Petri con el
medio de cultivo King B se sembraron con las diferentes cepas de rizobacterias
por diseminacin con esptula de Drigalsky y se incubaron durante 48 horas a 30
C 2 C y 37 C2 C, en dependencia de la especie bacteriana. Una vez
crecidas las bacterias, las placas se sometieron a vapores de cloroformo durante
30 minutos. Posteriormente fueron colados discos de 5 mm de dimetro que
contenan los hongos patgenos en el centro de las placas libres de clulas. Los
discos de hongos fueron previamente obtenidos como se describe en el acpite
anterior. El porcentaje de inhibicin se determin a travs del dimetro de
crecimiento del hongo (mm) en comparacin con el control. En ambos casos se
estableci un diseo Completamente Aleatorizado establecindose 10 rplicas por
tratamiento. Los bioensayos fueron repetidos 3 veces cada uno.
Anlisis biomtricos: Como punto de partida a los porcentajes de inhibicin se
les realiz la prueba de normalidad de Shapiro y Wilk, haciendo uso de la versin
simplificado, y la prueba de homogeneidad de varianza, a partir de las cuales se
decidi realizar anlisis no paramtricos. Los datos fueron analizados utilizando la
prueba no paramtrica de comparacin mltiple de Kruskal Wallis seguido de la
prueba de comparacin mltiple de medias no paramtrica de Student-NewmanKeuls (SNK), con el paquete estadstico STATISTIC versin 6.0.
MATERIALES Y MTODOS (Experiencia 2)
Cultivos microbianos: Para la realizacin de este trabajo se utiliz un conjunto
de cepas previamente aisladas de la rizosfera del maz y cepas patrones y de
referencia procedentes del Cepario Nacional de Biofertilizantes de la Facultad de
Biologa de la Universidad de la Habana y de la Coleccin de Cultivos de la
Universidad de Gent en Blgica.
Produccin de fitohormonas del tipo AIA (cido 3 indol actico): Se utiliz el
medio lquido descrito por Grapelli y Rossi (1981). Como inductor se emple el DLTriptfano en una concentracin de 0,1 g/L (Tien et al., 1979). Los cultivos
bacterianos fueron cultivados en zaranda a 150 rpm y 30C durante 48 horas,
posteriormente se centrifugaron 15 000 rpm durante 20 minutos. Se tomaron 5 mL

de los caldos libres de clulas para la extraccin de auxinas segn metodologa

descrita por Tien et al. (1979). Para la cuantificacin se utiliz el reactivo de
Salkowski (Send y Leopold, 1954). La concentracin se calcul utilizando una curva
patrn con diferentes concentraciones de AIA preparado a partir de 1mg/mL de AIA
sinttico en metanol.
Produccin de siderforos: Para la determinacin cuantitativa de siderforos se
utiliz el medio Caldo Casimino cido (CAS) (5g de cido casimino, 1g de K2HPO4,
5g de hierro y 0.25 g de MgSO4 por litro), los cultivos fueron incubados durante 48
horas a 200 rpm y 30 C. Se determin la absorbancia a 595 nm (concentracin
celular) y se centrifug a 5000 rpm durante 10 minutos para eliminar las clulas.
En el sobrenadante se determin la absorbancia a 405 nm en espectrofotmetro.
La concentracin fue expresada en ^M de siderforos por 108 UFC/mL de bacteria
(De Meyer, 1999), correspondiente a una turbidez del 0.5 de la escala de
MacFarland (Rodrguez, 2003).
Produccin de cido saliclico: Se inocularon erlenmeyers que contenan 25 mL
de Caldo Casimino cido (CAS) con 100 ^L de los cultivos, y se incubaron durante
48 horas a 200 rpm y 30 C. Posteriormente se centrifugaron a 5000 rpm durante
10 minutos para eliminar las clulas. La extraccin y cuantificacin de cido
saliclico se realiz segn metodologa descrita por Buysens et al. (1996). Se
realiz una curva patrn en salicilato de sodio en concentraciones de 0.5-5 mg/mL
en metanol. Para el anlisis cualitativo se aplicaron lO^Ldecada muestra de las
cepas seleccionadas a placas de cromatografa con Slica Gel G. Como sistema
de solventes se utiliz cloroformo-cido actico-etanol en una relacin 90-5-2.5.
Anlisis biomtricos: Para el estudio de la produccin de cada uno de los
metabolitos por las diferentes cepas se realiz un anlisis de varianza de
clasificacin simple segn un diseo aleatorio, y las medias se compararon a travs
de la prueba de Rangos Mltiples de Duncan para p<0.05.
La seleccin de las mejores cepas se realiz a travs de un anlisis multivariado
de conglomerado jerrquico y ligamiento completo mediante el procesador
estadstico "STADISTIC" versin 5.0. Se cre un patrn positivo (concentraciones

ptimas de metabolitos) y un patrn negativo (bajas concentraciones de

metabolitos) para comparar las cepas.
RESULTADOS Y DISCUSIN
Para cada una de las experiencias se obtienen los siguientes resultados:
Experiencia 1:
Efecto antagnico de las cepas bacterianas en estudio
Los resultados demostraron que las cepas de rizobacterias tienen un efecto
antagnico ante los patgenos estudiados. Al establecerse la interaccin entre los
antagonistas bacterianos y las cepas Fusarium sp. A2 y Curvularia sp. A1 se
observaron diferentes niveles en los porcentajes de inhibicin.
Por otro lado el enfrentamiento de Fusarium sp. A2, las cepas de P.
fluorescens MPf3 y J-143 lograron ser las que mas destacaron su poder de
inhibicin en contraste con otras cepas. Igualmente todas las cepas estudiadas
mostraron efecto antagnico frente a la cepa de Curvularia sp. A1. En este caso,
las cepas P. fluorescens MPf2, MPf3 y J-143 se logr obtener una inhibicin total
del hongo, pero no mostrando una diferencia significativa con la cepa MPp8.
En cuanto al hongo F. oxysporium M1 y A. alternata M2, tambin hubo un
resultado bastante positivo en la inhibicin de crecimiento de dichos hongos,
mostrando que las cepas que presentaron los mayores ndices de inhibicin fueron
las de P. fluorescens J-143, MPf4, B. cepacia 0057 y MPp8.
Dentro de esta investigacin se obtuvo que las cepas mas destacadas
fueron las de P. fluorescens MPf2, MPf6 y B. cepacia MPp8, mostrando
porcentajes de inhibicin superiores al 97%.
Efecto inhibitorio de los metabolitos producidos por las rizobacterias en
estudio
Los resultados fueron similares al apartado anterior, demostrando que:

Los metabolitos producidos por las cepas MPf2, MPf3 y MPp8 lograron
inhibir totalmente el crecimiento del hongo Fusarium sp. A2, mostrando diferencias
significativas con el resto de los tratamientos. Los metabolitos que menor
inhibicin del crecimiento fngico evidenciaron fueron los producidos por P.
fluorescens MPf5 y MPf19, con diferencias significativas entre s.
Los metabolitos producidos por las cepas bacterianas tambin inhibieron el
crecimiento de Curvularia sp. A1, al igual que las cepas MPf2, MPf3 y MPp8
inhibieron un 100% del crecimiento del hongo. En este caso las cepas que menor
efecto inhibitorio mostraron fueron las de B. cepacia 0057 y P. fluorescens MPf19.
Al enfrentar los metabolitos producidos por las rizobacterias a los hongos
fitopatgenos A. alternata M2 y F. oxysporum M1 tambin observaron diferentes
niveles de inhibicin. Las cepas que mostraron mayores porcentajes de inhibicin
frente a Fusarium oxysporum M1 fueron MPf2, MPf3, MPp8 y MPp16.
En todos los tratamientos se hallaron porcentajes de inhibicin del
desarrollo fngico con valores superiores al 94%, sin diferencias significativas
entre los tratamientos. De este modo se confirma la sensibilidad del hongo ante
los productos del metabolismo de las rizobacterias en estudio.
Experiencia 2:
En cuanto a este trabajo de investigacin, los resultados obtenidos, fueron:
Produccin de AIA: De acuerdo con las determinaciones realizadas, las cepas
estudiadas producen entre 5.30 y 21.53 ng/mL de AIA. Los mayores niveles en la
produccin de esta auxina se obtienen con las cepas de Burkholderia cepacia
0057, MBf20, MBf21, MBp1, MBp2, MBp3 y de Pseudomonas fluorescens MPf 17,
destacndose las cepas 0057 y MBf21 por los mayores incrementos.
Produccin de siderforos: En este trabajo se demuestra que todas las cepas
de Pseudomonas fluorescens y Burkholderia cepacia aisladas de la rizosfera del
maz y utilizadas en este estudio tienen la capacidad de producir siderforos bajo
condiciones limitantes de hierro. De modo general, los mayores niveles de
produccin de este metabolito se obtienen en las cepas de Pseudomonas

fluorescens MPf1, MPf14, MPf17, MPp4, MPp11, MPp18 y MPp20, destacndose

las cepas MPf14 y MPp20 por las mayores producciones. Los resultados
corroboraron que la cepa de Pseudomonas fluorescens J-143 produce siderforos
(31.55nM).
Produccin de Acido Saliclico: La produccin de AS in vitro por las cepas de
Pseudomonas fluorescens, Burkholderia cepacia y Pseudomonas aeruginosa
(controles) fue analizada cuantitativamente por espectrofotmetro mediante la
deteccin del complejo prpura formado por la unin del hierro y el AS (tabla 2).
Los resultados demostraron diferentes niveles en la produccin de AS para las
cepas estudiadas con diferencias significativas entre ellas para un p<0.05. La
cepa de Pseudomonas aeruginosa KMPCH, utilizada como control positivo,
mostr niveles altos de produccin de este metabolito, lo que corrobora los
buenos resultados obtenidos con esta cepa en la induccin de resistencia en frijol
ante el ataque de Botrytis cinerea y Colletotrichum lindemuthianum. No se
detect produccin de AS por la cepa de Pseudomonas aeruginosa 7NSK2-562
utilizada como control negativo. Esto confirma que esta cepa no tiene la capacidad
de producir AS.
CONCLUSIONES
De acuerdo a los dos trabajos citados, en los cuales se hablan de los
microorganismos Pseudomonas fluorescens Y Burkholderia cepacia, ambos para
efectos de antagonismo y como promotoras de crecimiento vegetal, se puede
decir que, estos microorganismos son importantes en la utilizacin para la
agricultura, estas bacterias se encuentran en la rizosfera de las gramneas y
principalmente en el maz. Dentro del trabajo de antagonismo se destaca la
influencia de los metabolitos del tipo AIA, siderforos y cido saliclico, en el cual
se seala que cepas de las especies B. cepacia y P. fluorescens producan
diferentes tipos de siderforos, los que podran estar involucrados en el
antagonismo microbiano y en la resistencia sistmica inducida (RSI) en diferentes
sistemas planta-patgeno.

Estos resultados evidencian que los metabolitos activos de origen

bacteriano desempean una funcin vital en las interacciones microbianas. Sin
embargo, se ha sealado que los antagonistas microbianos no poseen un nico
modo de accin, y que no es fcil determinar con precisin los mecanismos que
intervienen en las interacciones entre los antagonistas y los fitopatgenos. As
mismo se destacaron de forma integral por las mayores producciones de los
metabolitos de inters, demostrndose que las mismas son eficientes en la
promocin del crecimiento vegetal en cultivos de importancia econmica, por lo
que constituyen fuentes de reserva para la produccin de inoculantes microbianos
factibles desde el punto de vista ecolgico.
Hasta el momento la mayor cantidad de reportes de aplicacin de
siderforos para combatir enfermedades que afectan a cultivos de inters econmico

ha

estado

relacionada

con

productos

obtenidos a partir de

Pseudomonas fluorescentes. Sin embargo, varios autores han demostrado la efectividad de cepas de Burkholderia cepacia en el biocontrol, cuestin que podra
estar relacionada con los diferentes tipos de siderforos que esta especie produce.
En este orden de ideas, es importante acotar una vez ms que el metabolito
siderforos, finalmente, teniendo en cuenta todo lo planteado, el importante papel
que desempea en el control de patgenos de plantas, la bsqueda de nuevas
cepas productoras y medios donde la produccin de los mismos sea ptima,
resulta de gran inters.

REFERENCIAS
- Hernndez A., Rives N., Caballero A., Hernndez A. & Heydrich M. (2004)
Caracterizacin de rizobacterias asociadas al cultivo del maz en la
produccin de metabolitos del tipo AIA, siderforos y cido saliclico
Disponible
http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/536

en: