Manual de Biologia Celular PDF

Prcticas de Biologa Celular
ndice
Abreviaciones
Prlogo del Texto......................................................................................................................I

ndice .......................................................................................................................................II
Abs
A. dest.
Absorbancia
Aqua destillatum (agua destilada)
Abreviaciones ........................................................................................................................ III

Reglamento del Laboratorio ................................................................................................... IV
BSL
DNA
Biosafety Level (nivel de bioseguridad)

Deoxyribonucleic acid (cido desoxirribonucleico)
Bioseguridad ............................................................................................................................ 1
Preparacin de soluciones y uso del espectrofotmetro............................................................. 9
DPX
EM
Di-n-butyl-Phthalate in Xylene (di-n-butil-ftalato en xileno)

Erlenmeyer
Microscopio: componentes y observacin .............................................................................. 15

Fijacin y tincin de clulas eucariotas y procariotas.............................................................. 22
GLP
GMO
Good Laboratory Practice (buenas prcticas del laboratorio)

Genetically Modified Organism (organismo genticamente modificado)
Comportamiento de las clulas eucariotas frente a soluciones con diferente osmolaridad........ 29

Observacin de estructuras internas de clulas eucariotas ....................................................... 34
HEPA
HHS
High-efficiency Particulate Air (filtro de aire de alta eficiencia)

U.S. Department of Health and Human Services (Departamento de Salud y
Fijacin y tincin de tejidos animales ..................................................................................... 39

Ciclo celular: mitosis en clulas vegetales .............................................................................. 48
HIV
Servicios Sociales de los Estados Unidos)

Human Immunodeficiency Virus (virus de la inmunodeficiencia humana, VIH)
N.A.
NB
Numeric Aperture (apertura numrica)

Nutrient Broth (caldo nutritivo)
PBS
RAMP
Phosphate-Buffered Saline (buffer fosfato salino)

Rapid Adhesive Mediated Procedure
rER
RG
rough Endoplasmatic Reticulum (retculo endoplasmtico rugoso)

Risk Group (grupo de riesgo)
RI
rpm
Refractive Index (ndice de refraccin)

revolutions per minute (revoluciones por minuto)
soln
TSB
solucin
Tryptic Soy Broth (caldo soya tripticasa)
HWD
WHO
Height Width Depth (alto ancho profundo)

World Health Organization (Organizacin Mundial de la Salud, OMS)
Anexo: Colorantes y soluciones isotnicas ............................................................................. 54
II
III
Reglas Generales de Comportamiento en el Laboratorio
Reglamento del Laboratorio
1. Es obligatorio informarse sobre los riesgos especficos de sustancias

peligrosas y/o material biolgico infeccioso.
Vase: http://radio.cuci.udg.mx/bch/ES/Sicherheit/index.html
Proteccin Personal
1. Usar batas limpias o uniformes especiales en todas las prcticas.
2. Est prohibido usar las batas o uniformes fuera del laboratorio, p. ej. en
aulas, cafeteras, oficinas, bibliotecas, salas para el personal, baos etc.
3. Usar calzado cerrado, de preferencia de piel, seguro para caminar

(no zapatos deportivos, sandalias, zapatillas, zapatos con tacn alto).
4. Usar guantes protectores apropiados para los procedimientos que entraan

contacto directo o accidental con reactivos peligrosos o materiales
biolgicos infecciosos.
Uso de guantes:
2. Hay que mantener el laboratorio limpio y ordenado:

- al material usado (p.ej. quitar escrituras y adhesivos)
- a los equipos (p.ej. limpiar centrfuga o balanza despus de su uso)
- el lugar de trabajo y lugares comunes (p.ej. campana, lavabo)
3. Las superficies de trabajo se limpian antes y al final de cada jornada.
Adems, se descontamina inmediatamente de todo derrame de material
potencialmente peligroso.
4. El laboratorio debe ser libre de materiales no relacionados con el trabajo
(p.ej. bolsas, mochilas).
5. Hay que mantener libres las salidas de emergencias. Siempre!
6. Hay que avisar a los responsables situaciones peligrosas y/o mal
funcionamiento de equipos.
- Revisar los guantes visualmente antes del uso (existencia de agujeros)

- No tocar con guantes objetos fuera del experimento (p.ej. telfono, teclado,
equipos, puertas, grifera) para evitar la distribucin del contaminante
- Cambiar guantes contaminados inmediatamente!
- No usar guantes por mucho tiempo (daa la piel)
- Desprenderse de los guantes de manera inside out (de 'dentro a fuera')
- Desechar aspticamente guantes contaminados con agentes biolgicos
infecciosos
7. Est prohibido comer, beber, fumar, aplicar cosmticos o manipular

lentes de contacto..
8. Est prohibido almacenar alimentos o bebidas para consumo humano.
9. Celulares deben ser apagados.
10. Est prohibido correr o jugar.
- Despus del uso, lavarse bien las manos y ponerse crema para piel
* No existen guantes universales, que protegen contra todo
11. Est prohibido usar equipos sin instruccin previa por el responsable
respectivo.
* Guantes desechables tienen una solo cierta resistencia contra reactivos

5. Usar gafas de seguridad, viseras u otros dispositivos para proteger los ojos y
12. Hay que lavarse las manos despus de manipular reactivos, animales y/o
materiales biolgicos, y antes de abandonar las zonas de trabajo.
el rostro contra salpicaduras, impactos o radiacin cuando es indicado.
IV
Reglas Especiales de Comportamiento en el Laboratorio

1. Est estrictamente prohibido pipetear con la boca.
2. Est prohibido colocarse materiales en la boca, pasar etiquetas por la
lengua, tocarse la cara con manos contaminadas (especialmente ojos).
3. Cualquier derrame o accidente con sustancias peligrosas y/o materiales
infecciosos se comunican al responsable del laboratorio. Se mantiene un
registro escrito de esos accidentes e incidentes.
4. Materiales contaminados hay que descontaminar antes de tirarlos o
limpiarlos para ser reutilizados.
5. Mujeres embarazadas y madres amamantando no deben trabajar con
sustancias peligrosas y/o material biolgico infeccioso.
6. Almacenar sustancias y mezclas en recipientes adecuados marcando:
- contenido (sustancia, mezcla, concentracin)
- fecha, propietario, smbolo de peligro
7. Est prohibido almacenar reactivos en envases de alimentos.
8. No se debe colocar tapas boca abajo sobre la mesa:
- eso deja residuos qumicos sobre la mesa y
- trae contaminacin al recipiente
9. No se debe devolver reactivos a su envase original para
evitar contaminacin al recipiente original.
10. Se usa una esptula para sacar reactivos de su envase.
11. No se debe daar las etiquetas al trasvasar (p.ej. por
goteo).
12. No se debe llenar recipientes ms de 90 % de su mxima
capacidad.
13. Cerrar bien los recipientes no usados.
14. Sustancias que producen polvos, gases, vapores o aerosoles txicos,
nocivos, cancergenos, corrosivos o inflamables se manejan en una
campana de extraccin.
15. Para el transporte hay que evitar derrames accidentales utilizando envases
secundarios (estrilizable) o recipientes irrompibles.
VI
Prctica de Biologa Celular
Bioseguridad
Bioseguridad
3) Para el medio ambiente
Prctica 1
- Relacin con otros organismos (p.ej. predadores, insectos tiles como abejas)
Bioseguridad
Tipo de prctica: grupal
- Relacin a los ciclos de nutrientes (p.ej. fijacin de nitrgeno)

Duracin de la prctica: 2 h
Objetivo
Adquirir el conocimiento para la mejor utilizacin de agentes biolgicos en prcticas
experimentales y con ello minimizar los riesgos que atenten contra la salud.
Introduccin
- Cambios a la biodiversidad (extinguir formas silvestres)

- Medidas para un monitoreo
4) Organismos Genticamente Modificados (GMO)
- Estabilidad gentica del husped y presencia de factores de virulencia (p.ej. E. coli K12)
- Estabilidad gentica de la modificacin en el husped
- Movilizacin del vector/de la modificacin gentica (transferencia gentica horizontal)
- Expresin de genes nuevos y la actividad del producto del gen (toxinas, factores de virulencia)
La bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas para reducir el riesgo de contraer

enfermedades por diferentes agentes biolgicos. En los laboratorios, donde se utilice cualquier
Basndose en esto los agentes biolgicos se han clasificado en cuatro grupos de riesgo (RG):
Agente biolgico del RG-1: Aquel que resulta poco probable que cause una enfermedad por
material biolgico, debe existir un manual de bioseguridad y una infraestructura adecuada para
el manejo del agente biolgico; sin embargo la actitud y el modo de proceder de aquellas
infeccin en el ser humano. El RG-1 incluye organismos no conocidos como patgenos,

microorganismos de RG > 1 con delecin (es) en su (s) gen(es) de virulencia, psicrfilos (< 20
personas que trabajan en estos laboratorios determinarn su propia seguridad.
C), termfilos (> 50 C), acidfilos (pH < 4), alcalfilos (pH > 8,5), fottrofo obligado as
como cultivos celulares (de plantas, no-vertebrata y vertebrata sin primata). Cepas microbianas
Clasificacin de los agentes biolgicos por grupos de riesgos

La Organizacin Mundial de la Salud, la Ley General de Salud en Mxico, el Real Decreto
664/1997 de Espaa, la Directiva 2000/54/EC de la Unin Europea y el U.S. Department of
Health and Human Services (HHS) coinciden en la clasificacin, que se basa en cuatro aspectos
generales:
1) Caractersticas biolgicas del agente:
representativas pueden ser Agrobacterium, Bacillus (mayora), Desulfobacter, Escherichia coli

K12, Lactobacillus, Leuconostoc, Propionibacterium (sin acnes), Pseudomonas (mayora),
Rhodococcus, Streptomyces, Thiobacillus; Aspergillus (mayora), Candida (varios), Hansenula,
Kluyveromyces, Mucor, Neurospora, Penicillium, Pichia, Rhizopus, Saccharomyces,
Trichoderma, Ustilago.
Agente biolgico del RG-2: Aquel que puede causar una enfermedad en el ser humano y
- Reproductividad (sexual, asexual, frecuencia)

- Capacidad de formar esporas, semillas etc.
2a) Virulencia para el ser humano
- Infeciosidad: dosis infectiva mnima, vas de penetracin
- Patogenicidad: virulencia y toxicidad
- Modo de transmisin: por aerosoles, contacto, lesiones, vectores
- Datos epidemiolgicos: presencia y grado de propagacin as como inmunizacin de la
poblacin
- Tenacidad: capacidad de sobrevivencia (dentro y fuera del laboratorio)
- Tratamientos profilcticos y curativos
2b) Exposicin en el trabajo
- Tipo de trabajo: organizacin y procedimiento
- Frecuencia de exposicin
- Medidas preventivas y posibilidad de desinfeccin
1
puede suponer un peligro para los trabajadores, siendo poco probable que se propague a la
poblacin y existiendo generalmente profilaxis o tratamiento eficaz. El RG-2 incluye la
mayora de organismos patgenos y parsitos, con virulencia baja para seres humanos sanos y
baja probabilidad de causar una epidemia, como: patgenos para plantas (sin riesgo para
animales), Actinomyces, Bacillus cereus, Chlamydia, Clostridium (algunos son RG-1),
Corynebacterium, Enterobacter, Enterococcus, Escherichia coli, Haemophilus, Helicobacter
pylori, Klebsiella, Mycobacterium (varios son RG-3), Neisseria, Proteus, Pseudomonas
aeruginosa, Salmonella, Serratia, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus; Aspergillus niger,
A. flavus y A. fumigatus, Candida albicans, C. glabrata, C. parapsilosis y C. tropicalis,
Microsporum, Trichphyton; Trypanosomas (varios son RG-3), Toxoplasma gondii;
Adenovirus, Coronavirus, Epstein-Barr virus, Herpes simplex, Influenza virus, Papilloma virus,
Polio virus as como material no caracterizado y posiblemente infeccioso (p.ej. heces, lodos
activados, rganos de animales, fluidos corporales etc.).
Bioseguridad
Bioseguridad
Agente biolgico del RG-3: Aquel que puede causar una enfermedad grave en el ser humano,
presenta un serio peligro para los trabajadores y riesgo de que se propague a la poblacin, pero
La mayora de las reglas a respeto de la bioseguridad se refiere a medidas tcnicas de

contencin, es decir inhibir la liberacin (accidental) de los agentes biolgicos. Se diferencia
existe generalmente una profilaxis o tratamiento eficaz. El RG-3 incluye los organismos
patgenos y parsitos, con virulencia moderada para seres humanos sanos y moderada
entre 1) las tcnicas de laboratorio, 2) equipo (barreras primarias) y 3) instalacin/diseo del

laboratorio (barreras secundarias).
probabilidad de causar una epidemia, como: Bacillus anthracis, Brucella, Mycobacterium

tuberculosis, M. leprae, M. bovis, Mycoplasma, Rickettsia, Yersinia pestis; Coccidioides
1) Tcnicas de laboratorio: El elemento ms importante para contener los riesgos biolgicos

es el seguimiento estricto de las buenas prcticas y tcnicas biolgicas (GLP). Como parte de
immitis, Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis; Trypanosoma brucei, T. cruzi;

Dengue virus, Hanta virus, Hepatitis virus, Rabia virus, Human immunodeficiency virus (HIV),
estas prcticas est el desarrollo o adopcin por parte de cada laboratorio de un manual de
operaciones (o manual de seguridad biolgica) en que se identifiquen los riesgos que pueda
Zinga virus; Creutzfeld-Jacob prin.

Agente biolgico del RG-4: Aquel que puede causar una enfermedad grave en el ser humano,
sufrir el personal y que especifique los procedimientos que puedan minimizar los riesgos.
Las causas ms comunes para infectarse son:
presenta un serio peligro para los trabajadores y alta probabilidad de que se propague a la
poblacin, sin que exista una profilaxis o tratamiento eficaz. Los virus son los nicos agentes
- Pipetear con la boca

- Lastimarse con agujas y jeringas
biolgicos presentes en este grupo, los ms representativos son: Ebola virus, Flavivirus, Herpes
B virus, Junin virus, Lassa fiebre virus, Machupo virus, Marburg virus, X-Arbovirus.
- Exposicin a aerosoles liberados por agitacin, centrifugacin, desintegracin, flamear asas,

homogeneizacin, pipetear, ultrasnicar
- Falta de higiene: desinfectar rea de trabajo, equipo y manos antes y despus del trabajo as
como inmediatamente cuando ocurre una contaminacin o derrame; estrilizar material
contaminado
2) Equipo de seguridad (barreras primarias): Se incluyen en este apartado tanto dispositivos
Fig. 1: Smbolo internacional de Riesgo Biolgico
Medidas preventivas
En base a la clasificacin en los 4 RG se puede implementar medidas preventivas para
compensar el riesgo respectivo. Estas medidas preventivas pueden ser:
a) Tcnicas:
- Construccin de edificios
o aparatos que garantizan la seguridad del personal (p.ej. campanas de seguridad biolgica
nivel 1, 2 3 que eviten la liberacin de aerosoles y filtran aires de escape (Fig. 2)), como las
prendas de proteccin personal (guantes, mascarillas, batas, calzado, lentes etc.).
a) no seguro
b) BSL-1
c)
BSL-2
d)
BSL-3
- Construccin de equipos
- Material de proteccin individual
b) Organizacionales:
- Responsabilidades
- Instrucciones de seguridad y seales
- Anotacin (experimentos, accidentes)
- Cursos de seguridad
c) Personales
- Personal calificado
- Tcnicas (microbiolgicas) apropiadas (GLP)
d) Biolgicas:
- Clulas y vectores huspedes seguros
Fig. 2: Campanas, las flechas indican el flujo de aire: rojo = contaminado, azul = estril. a) Banco de trabajo de aire
limpio: estril para el experimento e inseguro para el trabajador, que recibe aire contaminado. b) Campana de
extraccin, que protege el trabajador contra aerosoles, pero el experimento es expuesto a aire contaminado. c)
Campana de flujo laminar: adecuado para trabajos de RG-2, protegiendo tanto al trabajador como al
experimento. d) Cabina de alta bioseguridad, hermticamente sellada para evitar que cualquier agente
biolgico pueda salir; la manipulacin ocurre a travs de guantes: adecuado para trabajos de RG-3 y RG-4.
Bioseguridad
Bioseguridad
3) Diseo y construccin de la instalacin (barreras secundarias): La magnitud de las

barreras secundarias depende del tipo de agente infeccioso que se manipule en el laboratorio.
Material a utilizar
Dentro de ellas se incluyen la separacin de las zonas donde tiene acceso el pblico, la
disponibilidad de sistemas de descontaminacin (autoclaves, incineradores etc.), el filtrado de
Procedimiento
aire de salida, presin negativa, flujo de aire direccional etc. (Tab. 1).
medidas de seguridad en los laboratorios donde se trabaja con material biolgico (infeccioso).
Despus de ello el profesor trasladar a los estudiantes a cada uno de los laboratorios del
Tab. 1: Medidas de contencin (nivel de bioseguridad, BSL) que se aplican segn la naturaleza de las
Esta prctica se iniciar en el saln de clases, donde el profesor explicar a los estudiantes las
Centro Universitario para ensearles la infraestructura de cada laboratorio.
actividades que est en concordancia con los grupos de riesgos (RG).
Medidas de contencin
Material didctico y visita a los laboratorios donde se trabaja con material biolgico.
RG-2
RG-3
RG-4
BSL-2
BSL-3
BSL-4
Resultados
1. Lugar de trabajo separado de toda actividad que se

desarrolle en el mismo edificio
No
Aconsejable
Elementos de
seguridad
2. El aire introducido y extrado del lugar de trabajo se

filtra por filtros de alta eficacia para partculas en el aire
(HEPA) o de forma similar
3. Solamente se permitir el acceso al personal
designado
4. El lugar de trabajo debe ser precintado para permitir
su desinfeccin (con gas)
No
S, para la
salida de aire
Manual de
Bioseguridad
Aconsejable
No
Aconsejable
S, para la
entrada y
salida de aire
S, con esclusa
de aire
S
5. Procedimientos de desinfeccin especficos

6. El lugar de trabajo se mantendr con una presin
negativa respecto a la presin atmosfrica
S
No
S
Aconsejable
S
S
7. Control eficiente de vectores p.ej., roedores e insectos Aconsejable

8. Superficies impermeables al agua y de fcil limpieza S, para
mobiliario
S
como RG-2,
adems suelo
S
como RG-3,
adems techo
y paredes
9. Superficies resistentes a cidos, lcalis, disolventes y

desinfectantes
Aconsejable
10. Almacenamiento para agentes biolgicos
S, seguro
11. Ventanilla de observacin/un dispositivo alternativo

en las zonas para que se pueda ver a sus ocupantes
Aconsejable
Aconsejable
S, de alta
seguridad
S
12. Laboratorio con equipo propio

13. El material infectado, animales incluidos, se debe
manejar en una cabina de seguridad biolgica o en un
aislador u otra contencin apropiada
Aconsejable
Cuando
proceda
14. Incinerador para destruccin de animales muertos
Aconsejable
S
S
Si, cuando la S
infeccin se
propague por
el aire
S, disponible S, en el
mismo lugar
Laboratorio de
...
Laboratorio de
...
Clasificacin de
agentes biol. en
grupos de riesgo
Medidas de
contencin
Observaciones
Conclusiones
Laboratorio de
...
Laboratorio de
...
Bioseguridad
Bioseguridad
10. Incineracin:
Cuestionario
Definir los siguientes conceptos:
1. Agente biolgico:
11. Cules pases cuentan con laboratorios de BSL-4?:

2. Microorganismo:
Referencias bibliogrficas
3. Cultivo celular:
1. Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de Investigacin para la Salud. Diario

Oficial de la Federacin del 3 de febrero de 1983. Disponible en:
http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/compi/rlgsmis.html
2. Manual de procedimientos de Bioseguridad. Instituto de Investigaciones Biomdicas.
Universidad Nacional Autnoma de Mxico (2010). Disponible en:
4. Peligro:
http://www.biomedicas.unam.mx/_administracion/_unidades_apoyo_inst/manual_bioseguridad
.pdf
5. Dao:
3. Proteccin de los trabajadores contra los riesgos relacionados con la exposicin a agentes
biolgicos durante el trabajo. Real Decreto 664/1997, de 12 de Mayo. B.O.E. No. 124 de 24
de Mayo.
4. Biosafety in Microbbiological and biomedical laboratories. U.S. Department of Health and
6. Riesgo:
Human Service, 5th ed. (2009). Disponible en:

http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/BMBL.pdf
5a. Manual de Bioseguridad, OMS, 3a ed. (2005)
http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/CDS_CSR_LYO_2004_11SP.pdf
7. Desinfeccin:
5b. Laboratory Biosafety manual, WHO, 3rd ed. (2004)

http://www.who.int/csr/resources/publications/biosafety/Biosafety7.pdf
6. Pgina Web del Laboratorio de Biologa Celular en CUCINEGA:
http://radio.cuci.udg.mx/bch/ES/Sicherheit/index.html
8. Contaminacin:
9. Estrilizacin:
Soluciones & Espectrofotmetro
La ley de absorcin, tambin conocida como ley de Lambert y Beer, o simplemente ley de
Beer, proporciona informacin cuantitativa de cmo la atenuacin de la radiacin depende de la
Prctica 2
Preparacin de soluciones y uso del espectrofotmetro

Tipo de prctica: Equipos
Duracin de la prctica: 2-4 h
Objetivo
Adquirir la habilidad y aprender estrategias en la preparacin de soluciones y el uso del
espectrofotmetro.
Introduccin
concentracin (c) de las molculas que la absorben y de la distancia (d) que recorre el rayo de
luz en el medio ambiente (p.ej. una solucin). Cuando la luz atraviesa una solucin con el
analito, la intensidad de la radiacin disminuye (= atenuacin) como consecuencia de la
excitacin del analito (= absorcin) as como, en menor parte, la reflexin. Cuanto mayor sea la
trayectoria (d) del rayo en la solucin de analito de una concentracin (c), habr ms analito
que absorba la radiacin, y la atenuacin ser mayor (Fig. 3). La absorbancia y transmitancia
son fracciones respectivas en el espectro electromagntico de la luz. Debido a las interacciones
que suceden entre los fotones y las partculas absorbentes (= analitos), la intensidad del rayo
Solucin qumica
disminuye desde I0 hasta I. La transmitancia T de la solucin, es la fraccin de radiacin

incidente que transmite la solucin, tal como se muestra en la ecuacin T = I/I0. La
Una solucin o disolucin es una mezcla homognea de dos o ms componentes. Usualmente el

componente en mayor proporcin se denomina "solvente" y los que se hallan en menor
transmitancia suele expresarse como porcentaje o porcentaje de transmitancia (Skoog et al.,

2003).
proporcin "solutos". Las soluciones a su vez se pueden denominar "concentrada" si posee una
cantidad relativamente alta de soluto y "diluida" si la cantidad es relativamente baja (RiaoCabrera, 2007).
En funcin a la cantidad de soluto disuelto, las soluciones se pueden clasificar en insaturadas,
saturadas o sobresaturadas:
Insaturada: Solucin en que se ha disuelto una cantidad de soluto menor a la cantidad mxima
que se puede disolver en el solvente.
Saturadas: Solucin en que no se puede seguir admitiendo ms soluto, esto es cuando ms
soluto ya no puede ser disuelto en el solvente.
Sobresaturadas: Solucin en que se ha aadido ms soluto del que puede ser disuelto en el
solvente, por lo tanto, se observa que una parte del soluto se precipita (va al fondo del
recipiente).
La solubilidad puede estar influenciada por la temperatura: si la temperatura aumenta, la
capacidad para admitir ms soluto tambin aumenta.
Fundamentos sobre el uso del espectrofotmetro
Absorcin de luz: Cada especie molecular tiene la capacidad de absorber radiacin
electromagntica a una frecuencia caracterstica. En este proceso se transfiere energa a la
molcula, que provoca una disminucin en la intensidad de la radiacin electromagntica
I0
T = I/I0
A = lg I0/I
d: distancia [cm]
c: concentracin analito [mol/l]
Fig. 3: Atenuacin de un haz de radiacin por una solucin absorbente. La flecha ms grande es el rayo incidente,
significa que la energa radiante es mayor que la que trasmite la solucin.
Espectrofotmetro
Este equipo es utilizado frecuentemente para anlisis qumicos en la industria farmacutica y
alimentaria. Sirve para medir la relacin entre valores relativos de una misma magnitud
fotomtrica a dos haces de radiaciones, mide tambin la concentracin o reacciones qumicas o
bioqumicas de una muestra; ambas mediciones se realizan en funcin de una longitud de onda
(Skoog et al., 2003). Estos instrumentos son utilizados principalmente para la cuantificacin de
compuestos orgnicos e inorgnicos as como de microorganismos.
incidente. Por consiguiente, la absorcin de la radiacin atena el rayo incidente de acuerdo

con la ley de la absorcin.
10
Material a utilizar
Material
6 Tubos de ensayo de 13100
Consumibles
Etanol 70 %
1 Matraz EM o
vaso de precipitados de 50 ml
Agua destilada (A. dest.)
2 Pipetas serolgicas de 5 10 ml
Medios de cultivo
Tryptic Soy Broth (TSB) (anexo)
2 Celdas espectrofotomtricas de 1 ml
1 Perilla de tres vas
1 Micropipeta de 10 a 100 l
Nutrient Broth (NB) (anexo)
1 Micropipeta de 100 a 1000 l

Puntas amarillas y azules
Equipo
1 Autoclave
Tubos tipo Eppendorf
1 Espectrofotmetro
Procedimiento
Esta prctica complementa el conocimiento y habilidad del estudiante en la preparacin y uso
de soluciones, equipo o instrumentos utilizados en el rea de farmacia y biotecnologa. La
preparacin de una solucin no solo debe asociarse a la preparacin de una solucin qumica,
tambin existen otro tipo de soluciones, como en el caso de la biotecnologa donde se utilizan
soluciones fisiolgicas, medios de cultivos lquidos y slidos etc. Por otra parte el uso del
espectrofotmetro no solo se utiliza para medir absorbancia o transmitancia en soluciones
coloreadas sino tambin se puede utilizar para medir la absorbancia de una suspensin celular
bacteriana. Como se observar en esta prctica. En algunas disciplinas de la biotecnologa o en
ciertas circunstancias no es necesaria la exactitud de las mediciones de volmenes o cantidades
5. Tapar estos tubos; dejarlos con la tapa floja para su estrilizacin (autoclave).
6. Inocular con 100 l de caldo con Escherichia coli 3 tubos con caldo de cultivo estril e
incubar 12 h a 37 C.
7. Despus de 12 h se obtendr una suspensin celular de aprox. 109 clulas/ml.
Nota: Por fines prcticos, los puntos 5 y 6 pueden ser omitidos, si previo a la prctica los tubos
con caldo de cultivo fueron estrilizados e inoculados.
Uso del espectrofotmetro
8. Transferir de la suspensin celular (muestra) con aprox. 109 cel/ml con una micropipeta 100
y 10 l, respectivamente, a diferentes tubos Eppendorf y aadir 900 y 990 l de caldo de
cultivo estril, respectivamente. Con ello se obtiene diluciones de 1/10 y 1/100 (esto
realizarlo por triplicado).
9. De cada una de las muestras (triplicado): Transferir con una micropipeta, 1 ml de suspensin
celular original, dilucin 1/10 y 1/100, respectivamente, a una celda espectrofotomtrica as
como 1 ml de caldo de cultivo estril a otra celda espectrofotomtrica. La primera ser la
muestra y la segunda ser la referencia.
10. Calibrar el espectrofotmetro con la solucin de referencia a 600 nm (longitud de onda
visible utilizada en suspensiones microbianas) y realizar la medicin. Anotar las
absorbancias (Abs).
Eliminacin de residuos biolgicos

1. La desinfeccin de las mesetas se realiza con etanol al 70 %.
2. Los volmenes restantes de caldos de cultivos con microorganismos se estrilizan en la
autoclave a 121 C, 1 bar (15 psi) por 20 min. Despus los caldos de cultivos se desechan al
desage con abundante agua.
como frecuentemente se exige en el rea de qumica.
Resultados
Preparacin de un medio de cultivo lquido

1. Realizar los clculos necesarios (seguir instrucciones del proveedor) para obtener la cantidad
1. Realizar los clculos de la cantidad de medio de cultivo a pesar
de medio de cultivo que se disolvern en 20 ml de A. dest.

2. Pesar el medido de cultivo en una balanza semianaltica y transferirlo a un matraz EM de 50
ml y adicionar 20 ml de A. dest. (en la preparacin de medios de cultivo no es necesario
aforar la solucin).
3. Mezclar muy bien el medio de cultivo en el A. dest.; esta solucin se le llama caldo de
cultivo.
4. Transferir 3 ml de caldo de cultivo homogneo, con una pipeta serolgica de 5 10 ml, a
cada uno de los 6 tubos de ensayo.
11
12
2. Anotar el nmero de clulas en cada dilucin y la absorbancia que le corresponde.

Muestras (cel/ml)
Abs (1)
Abs (2)
Abs (3)
Cuestionario
1. Cul es la ecuacin de Lambert y Beer?
Suspensin original = 109

Dilucin 1/10 =
Diucin 1/100 =
2. Cul es la diferencia entre una solucin, suspensin, dispersin y emulsin? (no definir los
conceptos de cada una).
3. Graficar los resultados Abs vs concentracin
3 Qu es una solucin fisiolgica? Un medio de cultivo lquido es una solucin fisiolgica?

Por qu?
4. Con los resultados obtenidos responda a la siguiente pregunta: Si una suspensin bacteriana
con 109 cel/ml tiene una absorbancia de ___________ cuntas clulas microbianas tendrn las
4. Para qu se utiliza una solucin de referencia para medir al espectrofotmetro una muestra?
diluciones?
Observaciones
1. Riao-Cabrera N. (2007): Fundamentos de Qumica Analtica Bsica: Anlisis Cuantitativo.

1a ed., Universidad de Caldas, Colombia. pp. 19-20
2. Skoog D.A., West D.M., Holler F.J., Crouch S.R. (2003): Qumica Analtica. 7a ed., Mc
Graw Hill, Mxico. pp. 575-576
3. Manual de Qumica General de la Universidad Pontificia Catlica del Per (UPCP).
Disponible en: http://corinto.pucp.edu.pe/quimicageneral/contenido/62-tipos-de-solucionesy-solubilidad
Conclusiones
13
14
Microscopio
Microscopio
Prctica 3
Microscopio: componentes y observacin

Duracin de la prctica: 2-4 h
Objetivo
Conocer los componentes del microscopio y adquirir la habilidad de usarlo mediante la
observacin de distintos tipos de clulas.
Introduccin
Microscopia
Es el uso de un rayo de luz o electrones para hacer visibles los objetos que no son visibles a
simple vista. Sus principios generales son: radiacin de longitud de onda, magnificacin,
resolucin y contraste.
Fig. 4: Espectro electromagntico, imagen extrada de http://1.bp.blogspot.com/
Magnificacin
Este concepto se refiere al aparente incremento del tamao de un objeto, que es indicado por
una "x" que significa "vez". La magnificacin resulta cuando un haz de radiacin refracta al
Radiacin de longitud de onda

Cuando se habla de un haz de radiacin se refiere tanto a rayos como ondas. La luz visible es
cruzar una lente. Lentes con curvatura refractan la luz y campos magnticos refractan el haz de
electrones. Una lente con curvatura convexo refracta rayos de luz que pasan a travs de su
una parte del espectro electromagntico que incluye rayos X, microondas y ondas de radio.
Estas formas de radiacin difieren en longitud de onda y la distancia entre dos puntos de la
periferia en mayor proporcin que cuando pasan en el centro; parecido como una serie de
prismas: los rayos que atraviesan la lente se reencuentran en el punto focal (Fig. 5). En este
misma. El ojo humano es limitado a un rango de longitudes de onda (llamado "luz visible") y
enva impulsos nerviosos al cerebro, el cual los interpreta como diferentes colores, p.ej.
punto focal los rayos se dispersan y favorecen al agrandamiento de la imagen (Fig. 6). El grado
de la magnitud de la imagen depende del grosor de la lente, su curvatura y la velocidad de la
longitudes de onda de 400 nm como violeta y de 650 nm como rojo. La luz blanca est
compuesta de muchos colores (longitudes de onda) y tiene un promedio de 550 nm (Fig. 4). Por
luz al atravesar la muestra. Las propiedades que determinan la utilidad de la magnificacin son
resolucin y contraste.
otra parte los electrones son cargados negativamente y su movimiento acta como ondas, donde
sus longitudes dependen de su voltaje. Por ejemplo una longitud de onda de 10.000 V es 0,01
nm, mientras que una de 1.000.000 V es 0,001 nm. Esto significa que al usar radiaciones de
longitudes de onda ms pequeas se incrementa la utilidad del microscopio.
Fig. 6: Magnificacin de un objeto por una lente planoFig. 5 Refraccin de un haz de luz por una lente bi-
convexo
convexo: distancia focal (f) y punto focal (F)
15
16
Microscopio
Resolucin:
Esta propiedad describe la habilidad de distinguir con claridad dos objetos muy cercanos.
Microscopios ms utilizados
Cuando luz pasa por una apertura se difracta, que limita a la resolucin (Fig. 7). Los
microscopios modernos, que funcionan con luz visible y ultravioleta, pueden distinguir entre
objetos de 200 nm de distancia, los electrnicos, que funcionan con haz de electrones, tienen un
poder de resolucin de 0,1 nm. La resolucin depende de la longitud de onda de una radiacin
electromagntica, la apertura numrica de la lente y la capacidad de la lente para recuperar luz
(Bauman, 2007).
Microscopio
Tab. 2: Diferentes tipos de microscopa y su uso (Bauman, 2007)
Tipo de
microscopio
Descripcin de la imagen
Usos
Microscopio de luz Magnificacin til de 1x a 2 000x; Luz visible, la longitud de onda azul
resolucin hasta 200 nm
suministra mejor resolucin
- Campo claro
Muestras coloreadas o no teidas

en contra de un fondo brillante
- Campo obscuro
Muestras brillantes en contra de un Observacin de microorganismos

fondo obscuro
vivos y no teidos
- Contraste de fases Muestras con reas claras y

obscuras
- Nomarski
Observacin y conteo de
microorganismos muertos
Observacin de estructuras internas

de microorganismos vivos
Parecen imgenes tridimensionales Observacin de estructuras de

por contraste de interferencia
microorganismos vivos
diferencial
Fig. 7: Poder de resolucin: 2 puntos son resueltos, cuando sus patrones de difraccin no se solapan
(izquierdo), cuando se inician de solapar se alcanza el lmite de resolucin (centro) y cuando los
puntos se solapan no son resueltos (derecho).
Contraste:
Esta propiedad se refiere a las diferencias en intensidad del brillo entre dos objetos (Fig. 8) u
objeto y el soporte (fondo). La mayora de los microorganismos no son coloreados y presentan
muy poco contraste. Una forma de aumentar el contraste es tindolos. Otra forma es explotar
las diferencias entre el ndice de refraccin de la clula y del medio; a este proceso se le llama
fase (Nester et al., 2004).
- Fluorescencia
- Confocal
Microscopio
electrnico
- Transmisin
proximidad
- Scanning
inclinadas indican reas de contraste elevado.
17
Estructuras en un solo plano (corte Observacin detallada de estructuras

ptico) normalmente en
combinacin con fluorescencia
celulares en una poblacin celular
Magnificacin tpica 1 000x a

10 000x, resolucin a 0,1 nm
Usa electrones con longitudes de onda

corta; las muestras tienen que estar en
Montono, doble dimensin,
Observacin de detalles ultra-
imagen altamente magnificada,

estructurales extremas de clulas,
puede tener un incremento de color virus y bacterias
Microscopios de
(derecha) se puede distinguir estructuras. En rojo se representa la "tone curve" respectiva; curvas muy
compuestos qumicos especficos
vaco
- Scanning
Fig. 8: En reas con poco contraste (izquierda) no se puede diferenciar elementos; en reas con contraste elevado
Muestras con colores fluorescentes Localizacin de estructuras o

en contra de un fondo obscuro
tunneling
- Fuerza atmica
Montono, tridimensional, imagen Observacin de los detalles de la

altamente magnificada; puede
tener un incremento de color
superficie de la estructura celular
Magnificacin mayor de
Estos microscopios se mueven sobre
100 000 000x
la superficie de la muestra
Molculas individuales y tomos
Observacin de la superficie del
visibles
objeto, suministra finamente detalles
Molculas individuales y tomos
Observacin de material biolgico a
visibles
nivel molecular y atmico

18
Microscopio
Componentes y fundamento del microscopio

Explicar y describir con material didctico los componentes ms importantes que forman a un
microscopio. Trasladar a los estudiantes al laboratorio y demostrarles el funcionamiento del
aparato, mediante observaciones con diferentes tipos de clulas.
Microscopio
Resultados
1. Dibujar y sealar los componentes del microscopio.
Material a utilizar
Material
3 Portaobjetos con muestras teidas de clulas
Consumibles
Etanol 70 %
vegetales, bacterianas y levaduras

3 Cubreobjetos

Equipo
1 Microscopio
Procedimiento
2. Dibujar o fotografiar a las clulas observadas sealando los objetivos utilizados.
Observacin al microscopio
1. Muestras fijadas y coloreadas sobre un portaobjeto les sern entregadas a cada uno de los
equipos. Las muestras son clulas vegetales para el objetivo de 10x, levaduras para el
objetivo de 40x y bacterias para el objetivo de 100x.
2. Tomar un portaobjeto con la muestra de clula vegetal y colocar el cubreobjeto sobre la
muestra.
3. Colocar la preparacin sobre la platina y asegurarla con las pinzas, ajustar el objetivo 10x,
enfocar, primero con el anillo macromtrico y despus, para lograr nitidez, enfocar con el
anillo micromtrico. Por ltimo observar todo el campo con la perilla de movimiento. Para
observar las bacterias se debe usar el objetivo de 100x y aceite de inmersin.
Observaciones

Al final de la prctica los portaobjetos con muestra pueden ser sumergidos en etanol al 70 %
por 20 min o en solucin de hipoclorito de sodio; despus lavarlos con agua y jabn para ser
reutilizados o desecharlos directamente a donde se almacena el material de vidrio para reciclar.
Los cubreobjetos se desechan al contenedor de basura punzocortante con peligro biolgico
infeccioso. Las soluciones de hipoclorito sdico, como la leja de uso domstico, contienen 50
g/l de cloro libre y por tanto deben diluirse 1:10 para obtener una concentracin final de 5 g/l.
19
Conclusiones
20
Microscopio
Cuestionario
1. Usando un microscopio con el objetivo de 40x y una lente en el ocular de 10x Cuntas
veces magnificada se ve la muestra?
2. Por qu se debe utilizar aceite de inmersin con el objetivo de 100x y no con el objetivo de
10x?
3. Describa los 4 partes ms importante del microscopio? A cul sistema pertenece cada una?
1. Bauman R. (2007): Microbiology with Diseases by Taxonomy. 2nd ed. Pearson, San
Francisco, USA. pp. 93-122
2. Nester E.W., Anderson D.G., Roberts C.E., Pearsall N.N., Nester M.T. (2004):
Microbiology: a Human Perspective. 4th ed. McGraw Hill, New York, USA. pp. 39-45
21
Tincin de clulas
Tincin de clulas
b) Pueden unirse a las clulas mediante uniones covalentes, inicos o hidrofbicos. P.ej., un
colorante cargado positivamente puede unirse a las estructuras celulares cargadas negativa-
Prctica 4
Fijacin y tincin de clulas eucariotas y procariotas

Objetivo
Adquirir habilidad en la fijacin biolgica y tincin de diferentes tipos de clulas y observar
mente.
Los colorantes ionizables pueden ser divididos en dos clases, de acuerdo con la naturaleza y
carga de su grupo:
1) Colorantes bsicos: Azul de metileno, fucsina bsica, cristal-violeta, safranina o verde de
malaquita tienen grupos con cargas positivas (algunas formas de nitrgeno tetravalente) y son
generalmente vendidos como sales de cloruro. Los colorantes bsicos se unen a las molculas
con el microscopio sus formas, tamaos y distribucin en un mismo plano.
cargadas negativamente como cidos nucleicos y la mayora de las protenas. Dado que las
superficies de la mayora de las clulas son cargadas negativamente, los colorantes bsicos son
Introduccin
frecuentemente usados. Estos colorantes son utilizados para determinar el tamao, forma y
arreglo o distribucin de las clulas.
Fijacin de clulas
Las clulas teidas y vistas bajo el microscopio deben ser semejantes a clulas vivas. La
2) Colorantes cidos: Eosina, rosa de bengala o fucsina cida poseen grupos cargados
negativamente tales como carboxilos (-COOH) o hidroxilos (-OH). Los colorantes cidos se
fijacin es un proceso en cual las estructuras internas y externas de clulas o microorganismos

son conservadas e inmovilizadas en una posicin. Entonces, en la fijacin se inactivan las
unen a las estructuras celulares cargadas positivamente (Prescott et al., 2005).

Las clulas pueden ser coloreadas in-vitro o in-vivo (p.ej. tejidos vivos). En las tinciones in-vivo
enzimas, que pueden alterar la morfologa celular, y se endurecen las estructuras celulares, para
que estas no cambien durante la tincin y observacin. Por lo tanto, la clula muere al momento
las clulas o estructuras adquieren los colorantes de contraste y se puede estudiar sus arreglos,
distribucin, morfologa mientras estn desempeando su funcin. Este tipo de tincin puede
de la fijacin.
Hay dos tipos de fijacin fundamentalmente diferentes:
revelar donde o como se lleva a cabo una reaccin qumica-enzimtica dentro de las clulas o
tejidos, donde se almacena algn producto qumico determinado, donde est presente una
1) Fijacin al calor: las muestras biolgicas se extienden (comnmente bacterias) sobre el

portaobjeto y con una flama azul se confiere calor seco prudentemente y se fija la pelcula. Esto
protena especifica etc. Una tincin in-vitro es colorear clulas y estructuras que han sido
extradas de su sitio biolgico y tpicamente se observan formas, tamaos y estructuras con
preserva la morfologa pero no la estructura interna de las clulas.

2) Fijacin qumica: se usa para proteger las estructuras finas internas de las clulas y la
mejor detalle que in-vivo (Penney et al., 2002). En esta prctica se realiza una tincin in-vitro
morfologa de los orgnulos subcelulares. Los fijadores qumicos penetran a las clulas y
reaccionan con componentes celulares; usualmente protenas y lpidos para inactivar,
insolubilizar e inmovilizarlos. La mezcla comn de fijadores contienen tales componentes
como metanol, etanol, acetona, cido actico, cloruro de mercurio, formaldehdo o
glutar(di)aldehdo (Prescott et al., 2005).
Tinciones comunes
Los diferentes colorantes usados para teir cualquier tipo de clula tienen dos caractersticas en
comn:
a) Tienen agentes cromforos (el que proporciona color a la molcula) que absorben luz, al ser
excitados emiten diferentes colores dependiendo de la longitud de onda.
22
Las tinciones simples o diferenciales son las ms utilizadas para material biolgico en estudios
preliminares.
Tincin simple: es el uso de un solo colorante, frecuentemente azul de metileno, que se aplica
al material biolgico mediante pasos sencillos. Esta tincin se utiliza principalmente para
observar el tamao, la morfologa y la distribucin de las clulas en el mismo plano (Bauman,
2007).
Tincin diferencial: es el uso de dos o ms colorantes, donde uno es el que colorea y el (los)
otro(s) son utilizados como mordiente(s) (proporciona mayor afinidad al colorante) o como
colorante(s) de contraste. Esta tincin se utiliza para distinguir grupos de microorganismos en
el mismo plano o contrastar estructuras externas o internas de la misma clula (Bauman, 2007).
23
Tincin de clulas
Material a utilizar
Tincin de clulas
2) Preparacin de clulas epidermiales de la cebolla
Material biolgico
Consumibles
Saccharomyces cerevisiae (levadura)
Etanol 70 %
Escherichia coli, Staphylococcus aureus (bacterias)
Cebolla
Azul de metileno (anexo)

Cristal violeta (anexo)
Material
3 Portaobjetos
3 Cubreobjetos
Safranina (anexo)
Lugol (anexo)
1 Pinza
1 Placa de Petri
Etanol-Acetona (anexo)
Soluciones isotnicas (anexo)
1 Escalpelo
Equipo
1 Asa de Kolle
1 Microscopio
1 Mechero Bunsen
a) Fijar
1. Partir una cebolla y separar sus capas, extraer con ayuda del escalpelo y una pinza la capa
ms delgada.
2. Depositar la capa o membrana en una placa Petri con solucin isotnica. Introducir
oblicuamente el portaobjeto en la placa y con ayuda de una pinza colocar la membrana en
el portaobjeto, intentar que no quede arrugas.
b) Colorear
1. Cubrir con gotas de azul de metileno la membrana y esperar 5 min.
2. Colocar el portaobjeto en la placa Petri vaca, un extremo en el borde y el otro en la base
(inclinacin aprox. 45) lavar desde el extremo superior al inferior con un chorro dbil de
A. dest., presionando con una pinza la membrana para evitar que sea arrastrada.
3. Cuando el agua es clara o sin rastros del colorante, colocar el cubreobjeto sobre la muestra
evitando la presencia de burbujas.
4. Observar al microscopio a 10x y 40x.
Procedimiento
Tincin simple
La tincin simple se realiza a las tres muestras: Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli y
cebolla.
1) Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli
Tincin diferencial: Tincin de Gram (Fig. 9)

Cultivo mixto de Escherichia coli y Staphylococcus aureus
Fijacin
1. Desengrasar el portaobjeto con etanol.
2. Tomar una gota del cultivo lquido, con el asa y colocar en el centro del portaobjeto.
3. Extender con el asa haciendo un valo.
a) Fijar
1. Desengrasar el portaobjeto con etanol.
2. Tomar una gota del cultivo, si es lquido, con el asa de Kolle o nicromo y colocarla en el
centro del portaobjeto. Si es slido tomar una gota de solucin isotnica y colocarla en el
portaobjeto. Despus tomar una "asada" de la colonia y colocarla en medio de la gota.
3. Extender con el asa haciendo un valo.
4. Secar a los lados de la flama del mechero (sin quemar la muestra).
5. Repetir a partir del paso 2 (3 4 veces cuando es lquido o la muestra es muy diluida, si
proviene de medio slido, solo 1 vez).
b) Colorear
1. Colocar unas gotas de azul de metileno sobre la muestra ya fijada y esperar 90 s.
2. Lavar con A. dest. y decantar.
3. Secar y observar al microscopio la levadura con el objetivo de 40x; la bacteria con el de
4. Secar a los lados de la flama del mechero (sin quemar la muestra).

5. Repetir a partir del paso 2 (3 4 veces cuando es lquido o la muestra es muy diluida).
Tincin
1. Colocar unas gotas de cristal violeta sobre la muestra ya fijada. Esperar 90 s.
2. Inclinar el portaobjeto y lavar del extremo superior con A. dest.
3. Colocar unas gotas de Lugol para lograr una mayor afinidad al colorante. Esperar 30 s.
4. Lavar con etanol-acetona por 20 s y decantar.
6. Agregar safranina y esperar 90 s.
8. Secar y observar al microscopio con objetivo 100x y aceite de inmersin.
100x y aceite de inmersin.
24
25
Tincin de clulas
Tincin de clulas
2. Nombrar a que dominio filogentico pertenece cada clula.
3. Sealar en los dibujos los nombres de las estructuras observadas.

Fig. 9: Las fases de la tincin de Gram: Fijacin, tincin con cristal violeta, aplicar mordiente con Lugol,
decoloracin con etanol/acetona y coloracin de contraste con safranina.
Nota: para la preparacin de los colorantes vase anexo I.

1. La desinfeccin de las mesetas se realiza con etanol al 70 %.
2. Los volmenes restantes de caldos de cultivos con microorganismos se esteriliza en la
autoclave a 121 C, 1 bar (15 psi) por 20 min. Desechar los caldos de cultivo al desage con
abundante agua.
3. Al final de la prctica los portaobjetos con muestra pueden ser sumergidos en etanol al 70 %
reutilizados o depositarlos donde se almacena vidrio para reciclar. Los cubreobjetos se
desechan al contenedor de basura punzocortante con peligro biolgico infeccioso.
Resultados
1. Dibujar cada clula observada.
Observaciones
Conclusiones
26
27
Tincin de clulas
Cuestionario
1. Por qu es necesario fijar la muestra?
2. De acuerdo al rbol filogentico a qu divisin pertenece cada una de las clulas que
utilizamos en esta prctica?
3. Por qu es necesario teir la muestra?
1. Penney D.P., Powers J.M., Frank M., Willis C., Churukian C. (2002): Analysis and testing of
biological stains the Biological Stain Comission Procedures. Biotech. & Histochem., 77:
237-275
2. Presccott M.L., Harley J.P., Klein D.A. (2005): Microbiology. 6th ed., McGraw Hill,
Singapur. pp. 39-45
3. Bauman R. (2007): Microbiology with Diseases by Taxonomy. 2nd ed., Pearson, San
Francisco, USA. pp. 93-122
28
smosis
smosis
Soluciones hipotnicas: En la biologa una solucin hipotnica (hipoosmtica) tiene menor
Prctica 5
concentracin de solutos que el citosol o citoplasma. Cuando las clulas se sumergen en
Comportamiento de las clulas eucariotas frente a

soluciones con diferente osmolaridad
Objetivo
Identificar el comportamiento de las clulas expuestas a soluciones isotnicas, hipotnicas e
hipertnicas.
soluciones hipotnicas el agua se difunde del exterior hacia el interior de la clula con el fin de
equilibrar la concentracin de solutos para ambos sitios. Ejemplo tpico de una solucin
hipotnica es el agua destilada (A. dest.).
Clulas animales sufren del fenmeno de citlisis, dado que el agua entra al citosol, la clula se
hincha y se pueden romper las membranas. En el caso de eritrocitos, a este fenmeno se le
denomina hemlisis.
En clulas vegetales ocurre una presin de turgencia: cuando el agua entra a la clula se hincha
y se puede destruir la membrana (lisis) pero no la pared celular debido a su gran estabilidad;
algo muy parecido pasa con los hongos y bacterias (Speralakis 2011, Donnersberger, 2002).
Aunque en el caso de bacterias la pared celular puede ser destruida.
Introduccin
Tonicidad:
Material a utilizar
La tonicidad es la osmolaridad de una solucin comparada con la osmolaridad de cualquier tipo

de clula. En otras palabras, es la relacin entre la concentracin de los iones (solutos) en una
Material biolgico
Sangre humana
solucin y los iones dentro de las clulas. Las soluciones que tienen la misma concentracin
(osmolaridad) de iones que dentro de la clula son llamadas soluciones isotnicas. Las
Consumibles
Etanol 70 %
Solucin salina al 0,9 %
Material
3 Portaobjetos
Solucin salina al 1,5 %
Soluciones isotnicas: Cuando las clulas se sumergen en una solucin con la misma
osmolaridad, la difusin del agua es en ambas direcciones y el ndice de difusin de agua es el
3 Cubreobjetos
2 Lancetas estriles
Algodn
Aplicadores de madera
mismo en ambos sitios. Entonces es una solucin isotnica o isoosmtica. Ejemplo de una
solucin isotnica es una solucin salina de NaCl al 0,9 %.
Equipo
soluciones con mayor osmolaridad que dentro de las clulas son llamadas hipertnicas y las
soluciones con menor osmolaridad que dentro de las clulas son hipotnicas (Speralakis, 2011).
Soluciones hipertnicas: En la biologa una solucin hipertnica (hiperosmtica) es una

solucin con mayor concentracin de solutos que el citosol. Cuando se sumergen las clulas
Papel para cocina

1 Microscopio
dentro de una solucin hipertnica, la tendencia del flujo de agua es hacia fuera de las clulas
con el fin de equilibrar la concentracin de solutos. Ejemplos de soluciones hipertnicas son
mermeladas, salmueras etc.
En el caso de clulas animales, las clulas pierden agua y se arrugan, se ven hundidas o se
encogen. En los eritrocitos este proceso se conoce como crenacin.
En el caso de clulas vegetales o microbianas el agua sale del medio intracelular, el
protoplasma se retrae, producindose un espacio entre la membrana plasmtica y la pared
celular. A este fenmeno se le conoce como plasmlisis.
29
30
smosis
smosis
Procedimiento
Resultados
Nota: Durante esta prctica es necesario usar guantes.
1. Dibujar las clulas normales, la crenacin y la hemlisis.
1. Colocar una servilleta de papel sobre la superficie donde se trabaja.
Iso
Hipo
2. Colocar tres portaobjetos desengrasados sobre la servilleta, rotular en un extremo de un

portaobjeto Iso (soln. isotnica), Hipo (soln. hipotnica), Hiper (soln. hipertnica).
3. Lavar y limpiar con un antisptico el extremo libre del dedo ndice.
4. Con la lanceta pinchar rpidamente el extremo del dedo.
5. Apretar la punta del dedo hasta ver una gota de sangre.
6. Colocar una gota de sangre sobre cada portaobjeto.
Nota: El siguiente proceso debe ser rpido! para evitar que la sangre se seque.
7. Al portaobjeto sealado con Iso colocar una gota de solucin salina al 0,9 %.
8. Al portaobjeto sealado con Hipo colocar una gota de A. dest.
9. Al portaobjeto sealado con Hiper colocar una gota de solucin salina al 1,5 %.
10. Con el aplicador mezclar suavemente las soluciones con la sangre de 3 a 5 s.
11. Inmediatamente! colocar un cubreobjeto sobre cada muestra y observar al microscopio.
12. Observar con el objetivo de 40x las clulas normales, la crenacin y hemlisis.

1. Las mesetas de trabajo se desinfectan con etanol al 70 %.
Observaciones

3. Los guantes se deben colocar en el recipiente donde se almacena material biolgico
infeccioso. El color del recipiente es rojo con el smbolo de riesgo biolgico (Fig. 1).
Conclusiones
31
32
Hiper
smosis
Cuestionario
1. Qu ocurre en una clula vegetal si se sumerge en una solucin salina al 5 %?
2. Por qu en las clulas vegetales no ocurre una lsis? Qu tipo de componentes tiene su
pared celular?
3. Cuando ocurre una crenacin o hemlisis en los eritrocitos?
4. Cmo se prepara 100 ml de una solucin isotnica de NaCl? Qu osmolaridad tiene esta
solucin?
5. Qu es la diferencia entre osmolaridad y osmolalidad?
1. Donnersberger A.B., Lesak A.E. (2002): Laboratorio de Anatoma y Fisiologa. 1a ed.,
Paidotribo, Barcelona, Spain. pp. 345-347
2. Sperelakis N. (2011): Cell Physiology Source Book: Essential of Membrane Biophysics. 4th
ed. Academic Press, Waltham, USA. pp. 288
33
Estructuras intracelulares
Prctica 6
Observacin de estructuras internas de clulas eucariotas

Fig. 10: Tcnica del frotis sanguneo extendiendo la gota de sangre de un extremo al otro de un portaobjeto.
Objetivo
Observar las estructuras internas de clulas animales mediante la tcnica de frotis sanguneo.
Introduccin
Las clulas eucariotas son muy complejas con un citoplasma organizado con orgnulos
limitados por membranas biolgicas, que son similares en su composicin a la membrana
celular. El ncleo es el orgnulo ms notable y caracterstico tanto en clulas animales como en
vegetales, hongos y protistas. Por esto mismo un ejemplo tpico para observar una estructura
interna de una clula animal es el ncleo.
Frotis sanguneo
La tcnica de frotis sanguneo consiste en una extensin de sangre realizada sobre un
portaobjeto con ayuda de otro portaobjeto (Fig. 10), que permite observar bajo el microscopio
diferentes formas celulares sanguneas. Con dbil aumento se explora la preparacin para
Fig. 11: Morfologa celular y ncleo de las clulas sanguneas (extrado de "Prcticas de citologa").
localizar la zona en la que el frotis es ms perfecto (Fig. 11).

En el campo del microscopio se ven con un dominio predominante los eritrocitos (tambin
Material a utilizar
llamados glbulos rojos o hemates), teidos de color rojo. No tienen ncleo y se observa un
entorno ms claro en medio que en los bordes. Los leucocitos (tambin llamados glbulos
Material biolgico
Consumibles
Sangre humana
Etanol 70 %
Material
6 Portaobjetos
Metanol
6 Cubreobjetos
2 Lancetas estriles
Guantes de latex
Papel de cocina
blancos) se identifican fcilmente por la presencia del ncleo (Warhurst & Williams, 1996).
Estos se clasifican en:
Linfocitos: Un poco ms grandes que los eritrocitos, con un ncleo muy voluminoso que ocupa
casi toda la clula. Aparece fuertemente teido de un color violeta oscuro.
Monocitos: Normalmente son poco frecuentes, hay que desplazarse por la preparacin para
encontrar alguno. Tienen un ncleo muy grande y redondeado que aparece teido en color
violeta.
Polimorfonucleares: Presentan el ncleo fragmentado, como lbulos grandes.
Eosinfilos: Son granulocitos poco abundantes de color rojizo y el ncleo teido de color azul
marino. Estas clulas aumentan su nmero en caso de parasitosis o alergia.
Colorante de Giemsa (anexo)
1 Soporte de tincin (recipiente rectangular de plstico, Equipo

10 - 15 cm largo y 5 - 10 cm de ancho)
1 Cinta adhesiva
1 Microscopio
2 Aplicadores de madera largos (del mismo ancho que 1 Mechero Bunsen

el soporte de tincin)
Basfilos: Presentan un ncleo teido de rojo y grnulos en el citoplasma teidos de color azul
oscuro.
34
35
Procedimiento
Nota: En esta prctica se usa guantes.
Fijacin
1. Colocar una servilleta de papel sobre la superficie donde se trabaja.
2. Colocar los 6 portaobjetos desengrasados sobre la servilleta.
3. Lavar y limpiar con un antisptico el extremo libre del dedo ndice.

4. Con la lanceta pinchar rpidamente el extremo del dedo.
5. Apretar la punta del dedo hasta lograr ver una gota de sangre.

6. Colocar una gota de sangre en el extremo de uno de los portaobjetos.

7. Seguidamente colocar un portaobjeto como lo indica Fig. 10 y deslizarlo de un extremo al
Resultados
otro. Slo debe pasarse una vez de forma continua e ininterrumpida.

8. Repetir la operacin con 2 portaobjetos ms, con el fin de seleccionar la mejor tincin.
1. Dibujar y nombrar los diferentes tipos de clulas sanguneas con el ncleo correspondiente.
9. Secar al aire las extensiones lo ms rpido posible. La desecacin se facilita con un

movimiento en forma de abanico, nunca soplando ni usando calor. La rpida desecacin
evita la deformacin de las clulas sanguneas.
10. Depositar el portaobjeto con la extensin de sangre encima del soporte de tinciones.
11. Depositar sobre la extensin unas gotas de metanol y esperar que se evapore.
Tincin
1. Una vez evaporado el metanol, depositar unas gotas de Giemsa (vase anexo I) cubriendo
toda la extensin, evitar desecacin y esperar 5 min.
2. Lavar con A. dest. la preparacin hasta que arrastre todo el colorante.
3. Secar al aire o bien al calor dbil de la flama del mechero.
4. Colocar el cubreobjeto y observar al microscopio iniciando con 40x y despus con 100x.
5. Identificar las clulas sanguneas de acuerdo a la Fig. 11.
Nota: Esta tcnica es muy til en anlisis clnicos para el conteo de clulas sanguneas y
comparar los resultados con valores estandarizados. En esta prctica no se tiene tal objetivo.
36
37
Observaciones
Conclusiones
Cuestionario
1. Qu otras estructuras internas celulares eucariotas se podran observar al microscopio de
campo claro? Por qu?
2. Cul estructura interna es la ms notable dentro del compartimento de una clula vegetal?
3. Enliste las estructuras internas que constituyen a las clulas eucariotas y distinga cada una de
ellas de acuerdo al tipo de clula animal, vegetal y hongos.
1. Warhurst D.C., Williams J.E. (1996): Laboratory diagnosis of malaria. J. Clin. Pathol., 49:
533-538
2. Prcticas de Citologa (2007). Disponible en:
http://www.juntadeandalucia.es/averroes/averroes/html/adjuntos/2007/12/13/0003/frotissangre.html
38
Tejidos
Prctica 7
Fijacin y tincin de tejidos animales

Objetivo
Comprender los conceptos y tcnicas histolgicas bsicas usadas para el estudio de tejidos
Tejidos
Tcnicas histolgicas bsicas utilizando un microtomo: Para microscopia

ptica
1. Seleccionar la muestra a estudiar
2. Fijacin de la muestra
La fijacin de la muestra tiene dos objetivos:
- preservar las estructuras del tejido lo ms parecido posible a su estado in-vivo (inhibir
autolisis).
animales.
- aumentar la dureza de la muestra, para su posterior diseccin en cortes delgados.

El fijador ms usado es una solucin acuosa de formaldehdo, sea "neutral buffered formalin" o
Introduccin
paraformaldehdo al 4 %. Tambin se pueden usar otros fijadores (metanol, cido pcrico, etc).
Los fijadores hacen que precipiten (cross-linking) las protenas tisulares.
Conceptos bsicos:
Un tejido es un conjunto de clulas con caractersticas estructurales y funcionales similares, que
se organizan de una forma especfica y provienen de una capa germinal en comn.
Un rgano es una estructura anatmicamente distinguible, formada por diferentes tejidos, que
cumplen con una funcin en comn (corazn, rin etc).
Un aparato o un sistema es un conjunto de rganos para cumplir una funcin en comn (aparato
digestivo, sistema sanguneo, sistema inmunitario etc).
3. Inclusin en parafina
La inclusin en parafina tiene como objetivo que la muestra tenga una dureza suficiente y
homognea para poder hacer cortes delgados. Como la parafina es inmiscible con el agua hay
que deshidratar la muestra antes de incluirla en parafina. La deshidratacin de la muestra se
consigue pasndola por una serie de etanol con graduacin creciente: etanol 50 % (24 h) etanol 70 % (8 h) - etanol 96 % (14 h) - etanol absoluto (4 h).
Tejidos bsicos
Despus se pasa la muestra por un solvente intermedio (como xileno, benceno o tolueno, 24 h)
y se introduce en un recipiente con parafina lquida durante varias horas hasta das (la parafina
Se pueden diferenciar cinco tejidos bsicos:

1. Tejido epitelial
se mantiene lquida en una estufa a temperatura superior a su punto de fusin) hasta que la
parafina se ha adherido completamente a la muestra. Finalmente, en un molde se hace un
2. Tejido conectivo
3. Tejido muscular
bloque de parafina que contenga la muestra y se deja solidificar a temperatura ambiente.

A veces no es posible hacer la inclusin en parafina porque el proceso de deshidratacin altera
4. Sangre
5. Tejido nervioso
algunas estructuras celulares que se quieren estudiar (p.ej. los lpidos, que se desnaturalizan con
alcoholes durante el proceso de deshidratacin). Un cuidado especial requieren las tcnicas de
Recientemente se consideran tambin otros criterios de clasificacin, surgidos de la disciplina:

Biologa celular, por las caractersticas estructurales y funcionales de las clulas que se agrupan
inmunohistoqumica: tanto el fijador como la serie de etanol y la parafina hasta el aumento de

la temperatura (mantener la parafina lquida) pueden alterar los epitopes en la muestra, que
como clulas contrctiles, clulas secretoras o clulas del sistema inmune (Stevens & Lowe,
1997).
despus no sean reconocidas por los anticuerpos especficos. En estos casos se pueden hacer
cortes delgados endureciendo la muestra (fijada o incluso antes de la fijacin) por congelacin.
4. Corte de la muestra
El bloque de parafina, que contiene la muestra, se puede cortar en secciones delgadas de 2-5
m con un microtomo (o de 5-10 m con un microtomo de congelacin). Estos cortes se
colocan sobre portaobjetos para su tincin posterior.
39
40
Tejidos
Tejidos
5. Tincin de los cortes

Los diversos componentes tisulares tienen ndices de refraccin similares, y no podran
Inmunohistoqumica: con esta tcnica se usa anticuerpos especficos dirigidos contra
distinguirse si no se usan colorantes, que tien diferentes componentes segn su composicin

qumica. Como los colorantes suelen ser hidroflicos hay que desparafinizar (p.ej. con xileno, 5
fluorocromo o con una enzima, que revela un colorante (cromgeno). Si se usan anticuerpos
min) y rehidratar los cortes, pasando los portaobjetos por una serie de etanol con graduacin
decreciente: etanol absoluto (2 min) - etanol 90 % (2 min) - etanol 70 % (2 min) - etanol 50 % (2
observar los preparados.
min) - agua (5 min).

Despus de la rehidratacin se tien los cortes con el colorante o la mezcla de colorantes
adecuados:
Hematoxilina-eosina: la hematoxilina (un colorante bsico) tie las estructuras cidas (ncleo,
rER) de color azul-violeta y la eosina (un colorante cido) tie las estructuras bsicas (la
mayora de las protenas citoplasmticas, mitocondrias) de color rosa-rojo. Las fibras de
colgeno de la matriz extracelular se tien de color rosa.
Azan (Azocarmin G + Aniline blue): con esta tcnica se tie los ncleos celulares de color rojo,
el citoplasma de color rosa y las fibras de colgeno de color azul. El msculo y los eritrocitos
se tien de color rojo-naranja.
estructuras histolgicas o celulares dianas. El anticuerpo puede ser marcado con un

marcados con sustancias fluorescentes hay que utilizar un microscopio de epifluorescencia para
Despus de teir los cortes se aclara el exceso de colorantes que quede sin fijar en los tejidos y,
dependiendo de la tcnica, se vuelven a deshidratar.
6. Montaje de los cortes
Antes de observar los cortes al microscopio hay que preservarlos y cubrirlos con un
cubreobjeto. La preservacin se logra con un montaje con resina en base de plsticos (p.ej.
DPX) o aceites (p.ej. Permount). Adems, con resinas en base de plsticos se consigue que
todos los elementos (muestra-cubreobjeto-aceite de inmersin-lente) sean pticamente homogneos. Una vez que la resina se ha polimerizado, se puede examinar la preparacin con el
microscopio.
Tricrmico de Mallroy: esta tcnica utiliza la fucsina cida que tie el citoplasma de color rosa
y el ncleo celular de color rojo, el azul de anilina que tie las fibras de colgeno de color azul
Lente (objetivo)
y el naranja G que tie los eritrocitos de color naranja.

van Gieson (Hematoxilina, cido pcrico, fucsina cida): esta tcnica tie los ncleos celulares
Aceite inmersin
de color azul oscuro-negro, el citoplasma y eritrocitos de color amarillo y las fibras de

colgeno de color rojo.
Resina
PAS (cido perydico, reactivo de Schiff [= fucsina bsica]): esta tcnica tie los carbohidratos
complejos de las clulas de color rojo oscuro (p.ej. glucgeno, mucoprotenas, proteoglicanos,
Cubreobjeto
Muestra
Portaobjeto
etc).
Tinciones de lpidos: para visualizar las gotas lipdicas (lipid droplets) en las clulas (p.ej. en
Fig. 12: Sistema ptico: diferencias en los ndices de refraccin (RI) causan un deterioro de la imagen por
adipocitos) o las estructuras celulares ricas en lpidos (como la mielina) se utilizan diferentes
colorantes de Sudan.
cubreobjeto (RI = 1,51; crown glass); resina de plsticos (RI = 1,5) y la muestra (RI = 1,5, como la resina).
Tinciones argnticas: son utilizadas para ver fibras finas de colgeno (fibras de reticulina) o
clulas con prolongaciones celulares finas ricas en elementos del citoesqueleto (clulas
> 1,2), la ptica es corregida por el grosor del cubreobjeto (0,17 mm).
aberracin. El sistema se compone de: lente (RI = 1,51); aceite de inmersin (RI = 1,51) o aire (RI = 1,00);
Sistemas en base de agua usan aceite de inmersin especial (RI = 1,48); cubreobjeto de borosilicato (RI =
1,47); resina en base de glicerol (RI = 1,48). Para objetivos con una apertura numrica (N.A.) elevada (i.e. N.A.
dendrticas, axones neuronales etc.), que se tien en color negro o marrn oscuro y el fondo de
la preparacin se ve dorado.
41
42
Tejidos
Material a utilizar
Material biolgico
Un rgano interno de ave
Consumibles
Etanol 70 %, 80 %, 90 % y 100 %
Material
2 Portaobjetos

Hematoxilina de Harris (anexo)
2 Cubreobjetos
1 Esptula acondicionada con una cuchilla de
Eosina Y cida (anexo)

Xileno
microtomo desechable
1 Soporte de madera de 5 x 7 x 10 cm (HWD)
Quitaesmalte (acetona)
Mounting media
1 Escalpelo
1 Pinza larga (10 cm)
Guantes de ltex
Papel de cocina
2 Clips de carpeta
Equipo
1 Microscopio
2 Clips normales
Tejidos
3. Retirar el portaobjeto mediante un jaln suave pero firme y dejar secar el tejido pegado en el
adhesivo por 2 a 3 min.
4. Sobre un trozo de madera de 5 cm de alto y 7 cm de ancho se coloca el portaobjeto. A una
esptula de 10 cm de ancho se fija con tornillos a los lados una cuchilla desechable de un
microtomo (casero). Se invierte la esptula (cuchilla hacia abajo) y se corta con un ngulo de
20, obteniendo una pelcula muy fina (10-20 m) que queda en el adhesivo (este paso
requiere paciencia y repeticiones).
Tincin
1. Depositar unas gotas de hematoxilina (vase anexo I) sobre la pelcula y esperar 40 s.
2. Lavar con A. dest.
3. Cubrir la pelcula con una capa densa de etanol al 80 % y esperar 1 min.
4. Eliminar el etanol y depositar unas gotas de eosina cida Y (vase anexo I) y esperar 1 min.
5. Sumergir el portaobjeto con la pelcula en etanol al 90 % y despus al 100 %; aprox. 1 min
por cada inmersin (dos veces cada una).
Procedimiento
6. Para evitar perder la muestra durante el siguiente paso, se recomienda sujetarla con un clip
de carpetas, asegurando la orilla de la pelcula y la orilla del portaobjeto. Despus se coloca
El estudiante de primer semestre de una carrera de Ciencias Biolgicas o de la Salud no tiene

las bases ni los conocimientos para realizar este tipo de fijacin y cortes. Sin embargo si es
sobre el resto de la pelcula un cubreobjeto de plstico y se sujeta con un clip normal.

7. Con la ayuda de unas pinzas sujetadas al otro extremo del portaobjeto se sumerge en una
necesario que observe la conformacin de tejidos de los diferentes rganos humanos. En esta
prctica se realiza una tcnica ms sencilla, que la descrita en la introduccin, llamada RAMP
solucin de quita-esmalte por 5-10 min.

8. Sacar el portaobjeto. Clarificarlo rpidamente con xileno.
(Rapid Adhesive-Mediated Procedure), donde no se utiliza microtomo (real) sino un microtomo

"casero" y rganos de aves. Finalmente tambin se observan tejidos de rganos humanos
9. Retirar lentamente el clip de carpeta.

10. Separar el cubreobjeto de la pelcula (en este punto la pelcula no es adherida al
previamente preparados con la tcnica (real) del microtomo.
cubreobjeto) y se deposita una gota de medio para montar (mounting media = es un agente
orgnico esencial para lograr una buena resolucin bajo el microscopio) sobre el tejido y
Seleccin de la muestra
1. Seleccionar un rgano interno de un ave (normalmente pollo o gallina) recientemente
sobre esta el cubreobjeto. El tejido ahora est permanentemente conservado y se puede
sacrificado.
2. Cortar transversalmente el rgano logrando un cuadrado de aproximadamente 4 cm2 por 2
Nota: Otros colorantes pueden ser usados como: azul de metileno, verde de metileno, azul de
toluidina etc. Los tejidos que pueden ser observados de esta forma son: corazn, pulmn,
cm de alto.
observar cada vez que se desee (Fig. 12 en lugar de resina puede ser Permount).
trquea, hgado, rin, piel, nudo linfoide, timo etc. (Troyer et al., 2002).
Fijacin
1. En uno de los extremos de un portaobjeto pasar el pincel de un adhesivo (p.ej. Kola Loka)
dejando el adhesivo extendido en la superficie.
2. Invertir el portaobjeto (adhesivo abajo) y colocarlo firmemente sobre el tejido y mantenerlo
as 10 s.
43
44
Tejidos

Tejidos
Observaciones
2. Los tejidos utilizados en esta prctica se deben incinerar; si no se cuenta con un incinerador
se pueden autoclavar y desecharlos a la basura normal.
3. Los portaobjetos y cubreobjetos se desechan al contenedor de basura punzocortante con
peligro biolgico infeccioso.
4. La esptula con la cuchilla del microtomo se sumerge en etanol al 70 % por 20 min. Luego
lavarla con agua y por ltimo con A. dest.
Conclusiones

Resultados
1. Dibujar y nombrar los diferentes tipos de tejidos observados.
Cuestionario
1. Explique qu es un microtomo?
2. Es necesario utilizar un microtomo para observar tejidos animales? Por qu?
3. Cules son las diferencias entre el corte, fijacin y tincin entre las muestras de tejidos
animales y tejidos vegetales?
4. Por qu hay que deshidratar y rehidratar la muestra durante la fijacin y tincin en la

tcnica del microtomo?
45
46
Tejidos
5. Qu es un azetropo? Cmo se obtiene etanol absoluto? Qu es etanol desnaturalizado?
6. Por qu en la tcnica RAMP no se utiliza parafina?

____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
____________________________________________________________________________
1. Stevens A., Lowe J.S. (1997): Histologa Humana. 2a ed., Elsevier-Health Sciences Division,
Espaa. pp. 5.
2. Introduccin a la Histologa. (2013).
http://wzar.unizar.es/acad/histologia/texto/TemasHistologia_I/1_1_Introduccion-Tecnicas.pdf
3. Troyer D.L., Cash W.C., Provo-Klimek J., Kennedy G.A. (2002): A novel method for preparing
histology slides without a microtome. Anat. Hist. Embryol. 31:129-131
47
Ciclo delular
Ciclo delular
Prctica 8
Ciclo celular: mitosis en clulas vegetales

Duracin de la prctica: 8 d
Objetivo
Observar, identificar y aprender las diferentes fases de la mitosis en clulas vegetales.
Introduccin
Ciclo celular
El objetivo del ciclo celular es generar de una clula dos clulas hijas genticamente idnticas:
para eso se requiere duplicar en forma exacta la cantidad de DNA cromosmico y distribuir las
copias a las clulas hijas. Este proceso vara mucho en los distintos tipos de clulas. Por
ejemplo, una levadura en condiciones ideales puede dividirse en aproximadamente 2 h,
Fig. 13: Etapas del ciclo celular: G1 - S - G2 - M
Fig. 14: Cromosoma replicado.
http://www.acercaciencia.com/2012/10/15/ciclo-celular/
http://genomasur.com/lecturas/Guia12b.htm
mientras que una clula heptica de mamfero en ms o menos 24 h; aunque esto ocurre, en
promedio, menos de una vez por ao. El ciclo celular de eucariontes, examinado con el
microscopio, muestra 4 fases, y los dos acontecimientos ms notables son la divisin nuclear
(mitosis) y la divisin de la clula en dos (citocinesis) (Fig. 13).
Material a utilizar
Material biolgico
Equipo
20 semillas de haba con 8 das de germinacin
1 Microscopio
El mecanismo de la mitosis (del griego "mitos" = filamento, hilo) es semejante en todas las
clulas eucariontes, aunque existen diferencias entre clulas animales y vegetales. Durante la
Material
Navajas de afeitar o escalpelo
Consumibles
Acetocarmn (anexo)
interfase (G1, S y G2) la clula se prepara a la divisin celular: formar biomasa, replicar el
genoma, corroborar las condiciones adecuadas (p.ej. suficiente espacio). Durante toda la inter-
Aguja de diseccin (recta)

Toallas de papel
o Acetorcena (anexo)
HCl (1 N)
fase el DNA est disperso y se observa como cordones finos. Al final de la fase G2 la clula
empieza la divisin celular (mitosis o fase M), que se puede diferenciar en cuatro etapas:
Portaobjetos y cubreobjetos
Vidrios de reloj o placas Petri
Aceite de inmersin
profase, metafase, anafase y telofase; de stas la de mayor duracin suele tener la profase.
Inicialmente el DNA se "condensa", es decir se compacta, y se forman los cromosomas, que
Mechero Bunsen
Mitosis
ahora son teibles (Fig. 14); cada uno consiste en dos rplicas llamadas cromtidas unidas entre
s por el centrmero. Dentro de ste hay estructuras proteicas, los cinetcoros. Despus los
cromosomas se alinean, se separan los cromtidos a los dos polos de la clula, se re-estabiliza
el ncleo y se inicia con la separacin en dos clulas hijas (citocinesis). Al final la clula
regresa a la fase G0, el estado fisiolgico normal.
48
49
Ciclo delular
Ciclo delular
Procedimiento
1. Escoger 20 semillas de habas y colocarlas sobre una servilleta de papel, estas a su vez
colocarlas sobre una placa Petri y humedecer durante 8 das para lograr su germinacin.
2. Realizar cortes transversales lo ms delgado posible en los pices radicales de las habas.
3. Colocar los cortes en placas Petri, vidrios de reloj o portaobjetos limpios y cubrirlos con unas
gotas de HCl durante 15 min.
1. Desinfectar las mesetas de trabajo con etanol al 70 %.

reutilizados o depositados donde se almacena vidrio para reciclar.
4. Despus quitar el exceso del cido con A. dest. y cubrirlos con unas gotas de acetocarmn
(vase anexo I) y esperar 15 min.
Resultados
5. Colocar un cubreobjeto sobre la muestra con acetocarmn, encima de esto una servilleta y
presionar.
2. Dibujar y nombrar las fases celulares observadas en esta prctica.
1. Reconocer las fases celulares auxilindose de la Fig. 15.
6. Proceder a observar las diferentes etapas de mitosis al microscopio en 40x y 100x
Fig. 15: Las diferentes fases de la mitosis de izquierda a derecha: profase, prometafase, metafase, anafase y
telofase. Extrada del Manual de Biologa Celular y Molecular II
Observaciones
50
51
Ciclo delular
Conclusiones
Ciclo delular
4. Mencione las principales diferencias entre mitosis y meiosis.
Cuestionario
1. En cunto tiempo aproximadamente ocurre una divisin celular en vegetales?
1. Alberts B., Bray D., Hopkin K., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. (2011):
Introduccin a la Biologa Celular. 3a ed., Panamericana, Mxico. pp. 609-614
2. Cules son las diferencias entre la mitosis de clulas animales y clulas vegetales?
2. Martnez-Trujillo M., Farias-Chagoya A., Ballesteros L. (2011): Manual de Prcticas de

Biologa Celular y Molecular II. Disponible en: http://bios.biologia.umich.mx/
3. Explique brevemente las fases de la mitosis:

Profase:
Metafase:
Anafase:
Telofase:
Citocinesis:
52
53

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Prcticas de Biologa Celular

Prcticas de Biologa Celular

Prlogo del Texto......................................................................................................................I

Abreviaciones ........................................................................................................................ III

Biosafety Level (nivel de bioseguridad)

Di-n-butyl-Phthalate in Xylene (di-n-butil-ftalato en xileno)

Microscopio: componentes y observacin .............................................................................. 15

Good Laboratory Practice (buenas prcticas del laboratorio)

Comportamiento de las clulas eucariotas frente a soluciones con diferente osmolaridad........ 29

High-efficiency Particulate Air (filtro de aire de alta eficiencia)

Fijacin y tincin de tejidos animales ..................................................................................... 39

Servicios Sociales de los Estados Unidos)

Numeric Aperture (apertura numrica)

Phosphate-Buffered Saline (buffer fosfato salino)

rough Endoplasmatic Reticulum (retculo endoplasmtico rugoso)

Refractive Index (ndice de refraccin)

Height Width Depth (alto ancho profundo)

Anexo: Colorantes y soluciones isotnicas ............................................................................. 54

Prcticas de Biologa Celular

Prcticas de Biologa Celular

Reglas Generales de Comportamiento en el Laboratorio

Reglamento del Laboratorio

1. Es obligatorio informarse sobre los riesgos especficos de sustancias

3. Usar calzado cerrado, de preferencia de piel, seguro para caminar

4. Usar guantes protectores apropiados para los procedimientos que entraan

2. Hay que mantener el laboratorio limpio y ordenado:

- Revisar los guantes visualmente antes del uso (existencia de agujeros)

7. Est prohibido comer, beber, fumar, aplicar cosmticos o manipular

* Guantes desechables tienen una solo cierta resistencia contra reactivos

el rostro contra salpicaduras, impactos o radiacin cuando es indicado.

Prcticas de Biologa Celular

Reglas Especiales de Comportamiento en el Laboratorio

Prctica de Biologa Celular

Prctica de Biologa Celular

3) Para el medio ambiente

- Relacin a los ciclos de nutrientes (p.ej. fijacin de nitrgeno)

- Cambios a la biodiversidad (extinguir formas silvestres)

La bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas para reducir el riesgo de contraer

infeccin en el ser humano. El RG-1 incluye organismos no conocidos como patgenos,

personas que trabajan en estos laboratorios determinarn su propia seguridad.

Clasificacin de los agentes biolgicos por grupos de riesgos

representativas pueden ser Agrobacterium, Bacillus (mayora), Desulfobacter, Escherichia coli

- Reproductividad (sexual, asexual, frecuencia)

Prctica de Biologa Celular

Prctica de Biologa Celular

La mayora de las reglas a respeto de la bioseguridad se refiere a medidas tcnicas de

entre 1) las tcnicas de laboratorio, 2) equipo (barreras primarias) y 3) instalacin/diseo del

probabilidad de causar una epidemia, como: Bacillus anthracis, Brucella, Mycobacterium

1) Tcnicas de laboratorio: El elemento ms importante para contener los riesgos biolgicos

immitis, Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis; Trypanosoma brucei, T. cruzi;

Zinga virus; Creutzfeld-Jacob prin.

- Pipetear con la boca

- Exposicin a aerosoles liberados por agitacin, centrifugacin, desintegracin, flamear asas,

Fig. 1: Smbolo internacional de Riesgo Biolgico

- Clulas y vectores huspedes seguros

Prctica de Biologa Celular

Prctica de Biologa Celular

3) Diseo y construccin de la instalacin (barreras secundarias): La magnitud de las

Centro Universitario para ensearles la infraestructura de cada laboratorio.

actividades que est en concordancia con los grupos de riesgos (RG).

1. Lugar de trabajo separado de toda actividad que se

2. El aire introducido y extrado del lugar de trabajo se

5. Procedimientos de desinfeccin especficos