ANTIOKSIDATIVNI FULEROL PODSTIE OSTEOGENEZU STEM ELIJA

DOBIJENIH IZ HUMANOG MASNOG TKIVA

Saetak: Antioksidansi su navedeni kao potencijalni reagensi koji pojaavaju osteogenezu, a za
nano-fulerene je pokazano da imaju veliki antioksidativni kapacitet i u in vitro i u in vivo
eksperimentima. U ovoj studiji smo procenili uticaj polihidroksilovanog fulerena, fulerola, na
osteogenu diferencijaciju stem elija dobijenih iz humanog masnog tkiva (ADSCs). Fulerol nije
toksian za humane ADSCs pri koncentracijama do 10 M. Pri koncentraciji od 1 M, fulerol je
redukovao kulture elijskog reaktivnog kiseonika nakon petodnevne inkubacije ili u prisustvu ili
u odsustvu osteogenog medijuma. Prethodni tretman fulerola od 7 dana je poveao osteogeni
potencijal humanog ADSCs. Dalje, kada se inkubira zajedno sa osteogenim medijumom, fulerol
je pospeio osteogenu diferencijaciju na dozno zavistan nain. Konano, fulerol je pokazao da
pospeuje ekspresiju FoxO1, glavnog funkcionalnog izoforma forkhead box O transkripcionog
faktora koji titi od vrsta sa reaktivnim kiseonikom u kostima. Iako je potrebno dalje razjanjenje
povezanih mehanizama, rezultati mogu da pomognu u daljem razvoju novog pristupa u
obnavljanju kosti pomou kombinovanog tretmana nano-fulerola i ADSCs.
UVOD
Traumatske povrede i patoloka stanja kao to su osteoporoza, osteonekroza i tumor kostiju
mogu da uzrokuju frakture kostiju takve da se ne mogu zaceliti endogenim mehanizmima. Ove
teke frakture kod pojedinaca su ozbiljna pretnja zdravlju radne snage i ekonomiji. U 2008,
istraivanje je pokazalo da je 110 miliona odraslih u SAD prijavilo oteana kotano-miina
stanja, a izvetaj Svetske Zdravstvene Organizacije je pokazao da se 50% od 9 miliona
osteoporotskih fraktura koje se deavaju irom sveta desilo u SAD i u Evropi. Procenjeno je da
od 7,9 miliona fraktura godinje u SAD, 5% do 20% rezultuje odloenim ili neuspenim
leenjem. Stoga se javlja potreba za efikasnim, jeftinim i inovativnim pristupom zaceljenja kosti
u povredama i oboljenjima kotano-miinog sistema.
Primena stem elija predstavlja jedan od najcenjenijih napredaka u inenjerstvu kotanog tkiva,
koji je obeavajui u zaceljivanju kostiju. Stem elije mezenhima (MSC) imaju sposobnost
diferencijacije u raznim vrstama mezenhimskog porekla, ukljuujui hondrocite, osteoblaste i
adipocite u zavisnosti od biolokog okruenja. ta vie, MSC se moe dobiti iz vie vrsta tkiva
kao to su kotana sr, trabekularna kost, artikularna hrskavica, mii i masno tkivo. Uzimanje
masnog tkiva podrazumeva najmanje invazivnu proceduru koja se moe lako vriti, a iznos stem
elija dobijenih iz masnog tkiva je oko 5x103 elija po gramu tkiva, to je za 100 redova vie od
broja elija dobijenih iz kotane sri. Zato bi masno tkivo moglo da bude bolji izvor stem elija
za potencijalnu kliniku upotrebu. Iako se efikasnost ADSCs u pospeivanju zaceljenja kosti jo
nije ispitalo klinikim istraivanjima, prijavljeno je da ADSCs pospeuje zaceljivanje kosti kod
razliitih ivotinjskih modela.

Dok je prijavljeno da kombinovano dopremanje ADSCs i faktora rasta pospeuje osteogenezu in

vivo, objavljeni su kontradiktorni izvetaji koji su izazvali ozbiljnu zabrinutost o efikasnosti
ovog pristupa. Na primer, ADSCs ne odgovara raznim kotanim morfogenetikim proteinima
(BMP) in vitro. Dodatno, nedavni rezultati su pokazali da dopremanje humanog ADSCs i BMP-a
nisu imali prednost nad dopremanjem samog BMP-2 u ubrzavanju zaceljenja fraktura kod
pacova. Oigledna ogranienja faktora rasta usled njihovog kratkog vremena poluivota i visokih
trokova proizvodnje bi takoe trebalo da budu razmotrena. Stoga, pottrebne su alternative
faktoru rasta da bi se pojaala osteogeneza ADSCs.
Nedavno su Yamada i saradnici demonstrirali in vitro i in vivo eksperimentima da Nacetilcistein, mali antioksidativni molekul, moeda pojaa osteogenezu stromalnih elija kotane
sri pacova i regeneraciju kosti. Pretpostavljamo da bi antioksidans takoe podrao i
diferencijaciju u ADSCs. Ovde smo ispitali ekstremno jak antioksidans, polihidroksilovani
fuleren (fulerol) i po prvi put prijavili da antioksidativni fulerol pojaava ostogenezu i redukuje
vrste sa reaktivnim kiseonikom (ROS) kod humanog ADSCs, kao i poveava ekspresiju FoxO1,
veliki izoform forkhead box O transkripcionih faktora koji tite protiv ROS i poboljavaju
diferencijaciju osteoblasta u kostima.
Materijali i metode
elijske kulture
Humane ADSCs su uzete iz komercijalnog izvora (Lonza, Basel, vajcarska) i karakterisani su
za osteogenetska odreivanja iz naeg prethodnog rada. elije su odravane u osnovnom
medijumu koji je Dulbeccos Modified Eagles Medium (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA)
koji sadri 10% fetalnog goveeg seruma (Hyclone Laboratories, Logan, UT, USA), 50 mg/mL
askorbinske kiseline (AA), 100 IU/mL penicillina G, i 100 mg/mL streptomicina u vlanoj
atmosferi 5% ugljen dioksida na 37C. Da bi se indukovala osteogenetska diferencijacija, 10 mM
-glicerofosfata (GP) i 10-7 M deksametazona (DEX) dodati su onsnovnom medijumu odreenog
kao osteogenski medijum. Fulerol (M.E.R. Co., Tucson, AZ, USA) je dodat kada su elije postale
70%-80% konfluentne pre (predtretman) ili u vreme (kotretman) indukcije. Svi eksperimenti su
voeni sa elijama u prolazu 8 i sa poetnom gustinom elija od 5000 eija/m2.
Odreivanja laktat dehidrogenaze (LDH) i 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3karboksimethoksifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazoliuma (MTS)
I LDH (Biovision Inc., Milpitas, CA, USA) i MTS (Promega Corporation, Fitchburg, WI, USA)
kolorimetrijski kitovi su korieni za odreivanja toksinosti i proliferaciju elije, respektivno,
praenjem instrukcija za svaki proizvod. Za odreivanje LDH, citotoksinost od 100% je
podeena kod pozitivne kontrole u kojoj su eije tretirane sa 1% Triton X-100, deterdentom koji
dovodi do kompletnog oslobaanje LDH enzima iz elija. Kod odreivanja MTS, elije su

izluivale obojenu supstancu, kod koje je vrednost optike gustine koja se odnosi na broj elija
merena pri 490 nm.elije su tretirane razliitim dozama fulerola (010 M) 6 i 48 sati, za LDH i
MTS odreivanja, respektivno.
ROS detekcija
Reagens CM-H2DCF-DA (5-[i-6]-hlorometil-2,7-dihlorodihidrofluorescein diacetat, acetil
estar) je derivat 2,7-dihlorodihidrofluorescein diacetata (DCF-DA), ali uz jednu dodatnu tiol
reaktivnu hlorometil grupu, to pomae transport jedinjenja kroz elijsku membranu. Acetil
grupa se uklanja intracelularnom esterazom, dajui DCF-DA, koja se moe zadrati u eliji.
Sama boja DCF-DA je nefluorescentna do elijske oksidacije kada postaje fluorescentna. U
sadanjim eksperimentima ROS detekcija je izvedena uz pomo komercijalnog kompleta za
odreivanje DCF-DA (Invitrogen, Eugene, OR, USA) u skladu sa uputstvom proizvoaa.
Ukratko, nakon terapije elije su dva puta isprane sa Hank uravnoteenim slanim rastvorom i
obojenim sa 20 M DCF-DA u Hank rastvoru tokom 30 minuta 37C, a jedinice relativne
fluorescencije su oitavane na itau fluorescencije sa talasnom duinom ekscitacije od 488 nm i
talasnom duinom emisije od 515 nm. Signal je tada normalizovan dezoksiribonukleinskom
kiselinom (DNK) meren fluorescentno obojenim etidium homodimerom-1 sa talasnom duinom
ekscitacije od 528 nm i talasnom duinom emisije od 617 nm.
Bojenje alizarin crvenom
Mineralizacija je odreivana alizarin crvenim obojenjem pomou standardizovane procedure u
naoj laboratoriji. Ukratko, elije su bojene pomou 40 mM alizarin crvene (pH =4.0) tokom 20
minuta, dok je viak boje ispran vodom. Nakon fotografisanja cele podloge obinim digitalnim
aparatom, boja vezana za minerale je ekstrahovana 10% (v/v) siretnom kiselinom. Rezultujui
rastvor je zatim neutralisan sa 10% (v/v) NH4OH i preneen u 96-delnu podlogu. Optika gustina
na 405 nm je merena itaem za mikropodloge.
Kvantitativna lanana reakcija reversne transkripcijske polimeraze u realnom vremenu
(RT-PCR)
Ukupna ribonukleinska kiselina (RNK) izolovana je iz elije pomou Rneasy Mini kit (Qiagen,
Valencia, CA, USA), a komplementarna DNK (cDNK) sintetisana je pomou Reverse
Transcription System kit (Promega, Madison, WI, USA), pratei instrukcije proizvoaa. PCR u
realnom vremenu je izvoen pomou QuantiTect SYBR Green PCR master mix (Qiagen,
Valencia, CA, USA). Poetna vrednost ciklusa je izraunata iz amplifikacionog dijagrama
podele. Podaci su analizirani pomou 2-CT metode sa 18s ribozomalnom RNK (rRNK) koja
je sluila kao referenca. Ekspresija gena je normalizovana u odnosu na kontrolnu grupu u
svakom eksperimentu i predstavljena kao stepen promene. Ciljani geni, ukljuujui runt
transkripcioni faktor (Runx2), osteokalcin (OCN), alkalnu fosfatazu (ALP), peroksizom

proliferacijski aktivirani gama receptor (PPARg) i leptin (LEP), kao i njihove osnovne sekvence i
veliine proizvoda prikazane su u Tabeli 1.
Western blot
elije (oko 500 000) iz jednog dela estodelne podloge lizirane su puferom natrijum dodecil
sulfata (SDS), bez bromfenol plavog i sa 125 mM Tris-HCl pH 6.8, 150 mM -merkaptoetanola,
1% SDS, 20% glicerola, 1X koktel inhibitotra proteaze (Santa Cruz Biotechnology Inc., Dallas,
TX, USA) i 1 mM fenilmetilsulfonil fluorida (Santa Cruz Biotechnology Inc.). Lizati su
homogenizovani ultrasoninim homogenizerom i centrifugirani na 20 000 rpm tokom 20 minta
na 4C da bi se uklonili ostaci elija. Bistar supernatant je prebaen u prethodno ohlaenu tubu i
odmah stavljen u led. Koncentracija proteina elijskih lizata je odreivana pomou Bradford
kompleta za odreivanje sadraja proteina (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). 100 g od ukupnih
proteina je puteno na 5%12% SDS-poliakrilamid gel pri konstantnoj struji od 80 V i prenoeno
elektrinim putem na nitrocelulozne membrane (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) pri
konstantom naponu od 10 V tokom noi. Membrane su blokirane 5% serumom goveeg
albumina u Tris puferisanom fiziolokom rastvoru (50 mM Tris, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.05%
Tween 20) tokom jednog sata na sobnoj temperaturi, oprane i inkubirane tokom noi na 4C u
5% serumu goveeg albumina u tris puferisanom fiziolokom rastvoru sa tween rastvorom koji
sadri specifina antitela ukljuujui anti-OCN (Santa Cruz Biotechnology Inc.), anti-Runx2
(Cell Signaling, Danvers, MA, USA), anti-superoksid dismutazu (SOD) 2 (Santa Cruz
Biotechnology Inc.), anti-FoxO1a (Abcam, Cambridge, MA, USA), anti--actin (Sigma-Aldrich
Co., St Louis, MO, USA) i anti-gliceraldehide 3-fosfat dehidrogenazu (GAPDH) (Cell
Signaling). Membrane su zatim inkubirane peroksidaza konjugovanim sekundarnim antitelima
rena (Cell Signaling) tokom jednog sata na sobnoj temperaturi uz hemiluminescentni supstrat za
antitela peroksidaze dobijene iz rena i pojaiva rastvora (Thermo Scientific) u odnosu 1:1.
Membrane su inkubirane u mraku autoradiografskim filmovima (Genesee Scientific, San Diego,
CA, USA) a filmovi su razvijeni da bi se vizualizovala polja. Kvantifikovanje gustine polja: sivo
nijansirane slike (300-400 dpi) na filmovima skenirane su pomou stonog skenera.
Denzitometrija je izvedena u Fotoopu (Adobe Systems, Inc., San Jose, CA, USA). Pomou
magic wand alata iz palete alata (tools) odabrano je podruje svakog polja, snimljen je histogram
koji je zatim stavljen u dijagram. Svi Western blot testovi su raeni duplo.
Tabela 1 Target geni, osnovne sekvence i veliine proizvoda u kvantitativnoj real-time lananoj
reakciji polimeraze.
Analiza podataka
Podaci iz ROS analize, mineralizacija i ekspresija gena je izraena kao standardna devijacija
(SD). Statistika procena je izvoena Studentovim t-testom u Microsoft Excel programu
(Microsoft Corporation, Redmond, WA, USA) da bi se utvrdila razlika izmeu dve grupe, sa P
vrednou od 0,05 ili manje smatranom kao znaajna razlika.

Rezultati
Fulerol ne pokazuje toksinost u odnosu na humani ADSCs.
Slika 1A pokazuje rezultate odreivanja citotoksinosti kod humanog ADSCs predstavljenog
oslobaanjem LDH iz elije. Citotoksine aktivnosti kontrolne i grupe fulerola razliitih doza
(0.1, 0.3, 1, 3, i 10 M) tokom 6 sati su bile manje od 10% i bez znaajne razlike izmeu
kontrolne i bilo koje fulerol grupe. Slika 1B je dobijena iz odreivanja proliferacije elija
tretiranih istim dozama fulerola tokom 48 sati. Opet, nije bilo znaajnih izmena u broju elija
kod kontrolne i bilo koje grupe fulerola.
Fulerol smanjuje intraelijski ROS nivo tokom osteogenske indukcije humanog ADSCs
Fulerol pri dve doze (niska=0.1 M i visoka =1 M) je dalje testiran na ROS aktivnost
skevindera kod humanog ADSCs tokom 5 dana kultivacije. Rezultati su prikazani na Slici 2. Sa
bazalnim medijumom tretman i visokih i niskih doza je znaajno snizio intraelijski nivo ROS-a.
ROS nivoi pri svim koncentracijama osteogenskog medijuma su znaajno nii nego kod
kontrolne grupe bazalnog medijuma. Dalje, u prisustvu osteogenskog medijuma, grupa sa
visokom dozom, ali ne i grupa sa niskom dozom, imala je nivo ROS koji je bio znaajno nii
nego kod kontrolne grupe.
Predtretman fulerolom poveava osteogenski potencijal humanog ADSCs
Zatim smo ispitivali da li predtretman fulerolom moe da pojaa osteogenski potencijal humanog
ADSCs dok je redukovan intraelijskim ROS nivoom. Osteogeneza je odreivana analizom
mineralizacije i genske ekspresije osteogenih markera. Kvantitativna RT-PCR analiza je pokazala
da elijama tretiranim osteogenskim medijumom manjka A (na primer, bazalni medijum koji
sadri GP i DEX), a fulerol je za 7 dana imao znaajno vie ekspresije Runx2, OCN i ALP u
poreenju sa elijama tretiranim samo osteogenskim medijumom bez AA (Slika 3). Znaajno je
da elije nakon inkubacije u kompletnom osteogenskom medijumu za jo 2 nedelje sa
predtretmanom fulerolom pokazuju mnogo veu mineralizaciju pod alizarin crvenim obojenjem
(Slika 3B).
Fulerol potpomae osteogensku diferencijaciju humanog ADSCs
Efekti fulerola na osteogensku diferencijaciju humanog ADSCs su odreeni nezavisno kao i u
kombinaciji sa osteogenskim medijumom. Tretman fulerola pri visokim dozama (1 M) tokom
13 dana odreivan je alizarin crvenim obojenjem da bi znaajno pojaao mineralizaciju (Slike
4A i 4B). Shodno tome, ekspresija osteogenskih markera je znaajno poveana u prisustvu

visokih doza fulerola kvantitativnom RT-PCR analizom (ALP i OCN, Slika 4C) i western blot
analizom (OCN, Slika 4D).
Slika 1.: Merenja opstanka elije i elijske proliferacije kod humanog ADSCs tretiranog
razliitim dozama fulerola (10, 3, 1, 0.3, 0.1, i 0 M) (n=4).
Napomene: (A) LDH merenja estosatnim tretmanom fulerolom (B) MTS merenja tokom 48
sati fulerolom.
Skraenice: ADSCs, stem elije dobijene iz masnog tkiva; Ctrl, kontrolna grupa bez ikakvog
tretmana;
LDH,
laktat
dehidrogenaza;
MTS,
3-(4,5-dimetilltiazol-2-il)-5-(3karboksimetoksifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolin; OD, optika gustina; PC, pozitivna grupa
za merenje LDH tretmanom elija sa 1% Triton X-100 za oslobaanje najvee intracelularne
LDH u medijum
Slika 2: Fulerol redukovan produkcijom ROS u humanom ADSCs kultivisan u bazalnom
medijumu ili osteogenskom medijumu u prisustvu ili odsustvu fulerola (0.1 i 1 M) tokom 5
dana (n=5).
Napomene: Intraelijski ROS je praen pomou fluorescentne boje DCF-DA, a RFU su snimane
na itau fluorescnencije. Slovo a oznaava P 0,05 prema Ctrl u bazalnom medijumu.Slovo b
oznaava P 0,05 prema Ctrl u osteogenskom medijumu.
Skraenice: ADSCs, stem elije dobijene iz masnog tkiva; Ctrl, kontrola; DCF-DA, 2,7dihlorodihidrofluorescein diacetat; RFU, jedinice relativne fluorescencije; ROS, vrste sa
reaktivnim kiseonikom.
Zanimljivo je to je fulerol simultano inhibirao gensku ekspresiju apidogenih markera PPARg i
LEP (Slika 4C)
Fulerol poveava ekspresiju FoxO1 gena kod humanog ADSC
U pokuaju da se ispita mogui mehanicistiki put koji prati podsticanje osteogeneze fulerolom
kod humanog ADSCs, istraivali smo ekspresiju vanog transkripcionog faktora FoxO1 i
njegove target gene Runx2 i SOD2 analizom western blot. Nivo FoxO1 je bio relativno nizak u
bazalnom medijumu i naglo je podignut nakon osteogenske indukcije. Fulerol (1 M) je
uzrokovao dodatno poveanje FoxO1 u prisustvu osteogenskog medijuma (Slika 5A). Zajedno sa
stimulacijom ekspresije FoxO1, fulerol je takoe pojaao ekspresiju Runx2 i SOD2 (Slika 5B).
Diskusija
U ovoj studiji smo ispitali efekte antioksidativnog nano-fulerola na osteogenski kapacitet
primarnih kultura humanog ADSCs konvencionalnim eksperimentalnim tehnikama elijske
biologije i biohemije, ukljuujui testove preivljavanja i proliferacije elije, merenja
intracelularnog ROS, detekcije depozita kalcijuma, RT-PCR i western blot. Rezultati su
ohrabrujui u sledeim podrujima: (1) fulerol je netoksian za humani ADSCs pri dozama do 10
M, (2) fulerol je ROS skevinder za humani ADSCs, (3) predtretman ili kotretman fulerola je

pojaao osteogenski kapacitet humanog ADSCs u kulturi i (4) fulerol je stimulisao gensku
ekspresiju FoxO1 i njegove target gene Runx2 i SOD2.
Slika 3: Predtretman fulerola je poveao osteogenski potencijal humanog ADSCs.
Napomene: elije su predtretirane fulerolom (1.0 mM ili 0.1 mM) tokom 7 dana, praeno
osteogenskom indukcijoom tokom 14 dana (A) Genska ekspresija osteogenskih markera, Runx2,
OCN, i ALP putem RT-PCR sedmog dana, pomou 18s interne kontrole (B) Obojenje alizarin
crvenom 21. dana. Slova a i b oznaavaju P 0,05 prema BM i GP/DEX grupu, respektivno.
Skraenice: ADSCs, elije dobijene iz masnog tkiva; ALP, alkalna fosfataza; BM, bazalni
medijum; Ful, fulerol; GP/DEX, glicerofosfat/deksametazon; OCN, osteokalcin; OD, optika
gustina; Runx2, runt transkripcioni faktor 2.
Slika 4: Osteogenska diferencijacija humanog ADSCs tretiranog razliitim dozama fulerola (0,
0.1, i 1.0 M) za 13 dana (n=4).
Napomene: (A i B) Alizarin crveno obojenje je pokazalo da je fulerol poveao mineralizaciju
(A: slike i B: kvantifikacija); (C) Kvantitativna real-time RT-PCR analiza je otkrila da je fulerol
stimulisao ekspresiju osteogenskih gena ALP i OCN i inhibirao ekspresiju adipogenih gena
PPARg i LEP. Slova a i b oznaavaju P 0,05 prema OM i OM+Ful 0,1 grupu, respektivno. (D)
Western blot analize su pokazale da je fulerol podigao elijski nivo OCN proteina.
Skraenice: ADSCs, stem elije dobijene iz masnog tkiva; ALP, alkalna fosfataza; BM, bazalni
medijum; COL I, kolagen tip I; Ful, fulerol; GAPDH: gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza;
GP/DEX, glicerofosfat/deksametazon; LEP, leptin; OCN, osteokalcin; OD, optika gustina; OM,
osteogenski medijum; PPARg, peroksizom proliferator-aktivirani receptor gama; RT-PCR,
reversna transkripcija-polimeraza lanana reakcija ; Runx2, runt transkripcioni faktor 2.
Slika 5: Fulerol pospeuje gensku ekspresiju FoxO1.
Napomene: Ovi targeti transkripcionog faktora, Runx2 i SOD2, analizirani su pomou Western
blot. Humani ADSCs je tretiran samo sa OM ili zajedno sa 1 M fulerolom (OM + Ful) tokom 7
(A) ili 13 (B) dana.
Skraenice: ADSCs, stem elije dobijene iz masnog tkiva; BM, bazalni medijum; FoxO1,
forkhead box protein O1; Ful, fulerol; GAPDH, gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza; OD,
optika gustina; OM, osteogenski medijum; Runx2, runt transkripcioni faktor 2; SOD:
superoksid dismutaza.
Slika 6: ematski prikaz pretpostavljenih puteva za poveanje diferencijacije osteoblasta
fulerolom u mezenhimalnim stem elijama.
Napomene: Fulerol poveava osteogene markere Runx2 i OCN, i antioksidativni enzim SOD2
preko FoxO1. U meuvremenu, fulerol podrava diferencijaciju osteoblasta redukovanjem
intracelularnog ROS nivoa i direktno i indirektno.
Skraenice: , poveanje; smanjenje; OCN, osteokalcin; ROS, kulture sa reaktivnim
kiseonikom; Runx2, runt transcripcioni faktor 2; SOD2, superoksid dismutaza 2.

Fuleren ima jediinstvenu strukturu sainjenu od 60 atoma ugljenika koji formira uplju sferu
dijametra oko 1 nanometar. Sposoban da se reverzibilno redukuje do 6 elektrona i sa 34 metil
radikala dodatih C60 sferi, fulereni (fuleren i njegovi derivati) su okarakterisani kao suneri
radikala i prijavljeno je da imaju antioksidativnu aktivnost nekoliko stotina puta veu nego
ostali antioksidansi. Ovo je podrano naim prethodnim istraivanjima da je fuleren moniji od
konvencionalnih antioksidanasa, glutationa, u inhibirajuoj ekspresiji adipogenih markera i
stimuliuoj ekspresiji osteogenih markera kod stromalnih elija kotane sri mia, D1 elijama.
Razliiti fulereni su izuavani zbog njihove biomedicinske primene i dobili su vanu ulogu u
podrujima istraivanja i nanobiotehnologije i nanomedicine. Dalje, usled jednostavne i
neposredne pripreme i znatne rastvorljivosti u vodi, fulerol se smatra kao kandidat sa prioritetom
u biomedicinskoj svrsi fulerena. Nai sadanji podaci pokazali su da je fuleren sluio kao
antioksidans za humani ADSCs bez citotoksinosti pri dozama do 10 M (Slike 1 i 2), i to je u
skladu sa veinom prethodnih izvetaja koji se tiu drugih tkiva i vrsta elija.
Pokazano je da ROS inhibira osteogenezu i formiranje kosti. Mody i saradnici su prijavili da tri
antioksidansa, vodonik peroksid (H2O2), ksantin i ksantin oksidaza i minimalno oksidisani
lipoproteini male gustine inhibiraju diferencijaciju osteoblasta MC3T3-Ea elije preosteoblasta
kosti mieva i M2-10B4 stromalnih elija kotane sri mieva, dok se poveava intracelularni
oksidativni stres. Chen i saradnici su primetili dramatino smanjenje ROS kao posledicu
poveanja elijskih komponenti SOD2 i katalaze osteogenskom indukcijom stem elija
mezenhima ljudske kotane sri (BM-MSCs) dok je egzogeni H 2O2 unazadio ovu osteogensku
diferencijaciju. Barbagallo i saradnici su otkrili da pojaana ekspresija glavnog gena koji regulie
redoks, hem oksigenaza-1, pojaava osteogenezu humanog BM-MSCs. Yamada i saradnisi su
pokazali da je antioksidans N-acetilcistein koristan za osteogenezu BM-MSCs i regeneraciju
kosti kod pacova. Naroito, Reid i saradnici su pokazali da je kod humanog ADSCs ROS
poveavao i smanjivao elijske komponente tokom osteogeneze i adipogeneze, respektivno.
Stoga, preispitivali smo da li je antioksidans koristan u osteogenskoj diferencijaciji humanog
ADSCs. U ovom radu smo potvrdili da je osteogenski medijum indukovao smanjenje elijskih
komponenti ROS, a fulerol je imao aditivni efekat (Slika 2). Dalje, ili predtretman ili kontretman
antioksidativnog fulerola pospeio je osteogenezu humanog ADSCs u prisustvu osteogenske
indukcije (Slike 3 i 4). To je takoe pokazano tekuim istraivakim projektom u naoj
laboratoriji da fulerol ima slian uticaj na osteogenezu mezenhimalnih stem elija iz kotane sri.
S druge strane, osteogeneza i adipogeneza su blisko pobezane sa kapacitetom primarnih elija
tokom regeneracije kosti, a mnogi reagensi su pokazali da imaju suprotan uticaj na osteogenezu i
adipogenezu. U ovom smislu, mi i ostali smo nedavno prijavili da fulerol moe da inhibira
diferencijaciju stromalnih elijakotane sri i OP9 preadipocita u adipocite tokom aktivnosti
skevidinga protiv intracelularnog ROS. Uzevi sve u obzir, ovi rezultati su izdvojili fulerol kao
novog farmaceutskog kandidata u svrhu pospeene regeneracije kosti. Do sada, neophodno je
izvesti in vivo studije pomou fulerol tretiranog ADSCs (na primer, potkona implantacija) za
regeneraciju kosti.

FoxO1 pripada porodici heliks/forkhead transkripcionih faktora za koje se pokazalo da reguliu

ekspresiju mnogih gena ukljuenih u mnoge elijske procese, kao to su elijska proliferacija,
preivljavanje, diferencijacija i redoks ravnotea. Naroito, nekoliko nedavnih studija je otkrilo
da FoxO1 moe da podri diferencijaciju osteoblasta primarnih elija. Meutim, njegova uloga u
regulisanju osteogenske diferencijacije ADSCs jo uvek nije prijavljena. Podaci dobijeni iz
trenutnih western blot analiza pokzala je da kod humanog ADSCs ekspresija Fox1 je poveala
elijske komponente nakon adicije osteogenskog medijuma, i jo znaajnije, kotretman
fulerolom osteogenskim medijumom je dalje poboljao ekspresiju ovog transkripcionog faktora i
njegove znaajne targete Runx2, OCN, i SOD2 (Slika 5). Teixeira i saradnici su izveli
osteogensku indukciju pomou BMP-2 kod mezenhimalnih elija mieva C3H10T1/2 i otkrili da
je FoxO1 ekspresija poveala uz osteogenske markere Runx2 i ALP tokom osteogenske
diferencijacije. Ovo je konzistentno sa naim trenutnim podacima (Slika 5) u odnosu na
osteogenezu humanog ADSCs u prisustvu indukcionog medijuma koji sadri AA, DEX, i GP,
iako su Yang i saradnici prijavili negativnu ulogu FoxO1u regulaciji Runx2 i ekspresiju
osteokalcina. Naosnovu ovih preliminarnih rezultata, predloili smo mogui mehanizam kojim
fulerol moe da istakne svoj modulatorni efekat na diferencijaciju osteoblasta mezenhimalnih
stem elija kroz poveanje FoxO1 i smanjenje ROS (Slika 6). Dodatno, pretpostavljeno je da
SOD2 igra ulogu u smanjenju ROS fulerolom, dajui novu ideju trenutnim o tome kako fulerol
ispoljava svoju antioksidativnu aktivnost u elijama. Naglasak treba da je na injenici da je
predloeni mehanizam u svojoj ranoj fazi i da treba dalje da bude potvren detaljnijim
eksperimentalnim dokazima.
Nai rezultati su dali preliminarni dokaz da su nano-fuleroli u stanju da poboljaju osteogenezu
humanog ADSCs. Ova istraivanja bi mogla da ponude mogunost za upotrebu nano-fulerola
kao alternative za faktor rasta, dajui pozitivne regulatore humanog ADSCs za zaceljivanje
fraktura kosti i defekata zasnovanog na inenjerstvu tkiva.