CITOMETRIA DE FLUJO

Introduccin:
En los ltimos aos, el diagnstico clnico ha experimentado profundas
modificaciones debidas, en gran medida, a los avances producidos por los
nuevos mtodos cuantitativos de anlisis celular. De entre ellos destaca la
citometra de flujo, que ha alcanzado gran relevancia, adems de la que ya
tena en la investigacin bsica. La citometra constituye un complemento
valioso de las tcnicas clsicas utilizadas para el estudio de la morfologa,
biologa y bioqumica celular. Aunque, desde el punto de vista cronolgico, la
citometra de flujo es una tecnologa relativamente reciente, sus caractersticas
especiales como tcnica de anlisis celular han hecho que en la ltima dcada
su uso se haya extendido de forma rpida, desde los laboratorios de
investigacin bsica hasta los laboratorios clnicos (1). La citometra de flujo ha
encontrado amplia utilidad en ciencias como la inmunologa, hematologa,
oncologa, anatoma patolgica y biologa celular (2). La conjugacin de
marcadores fluorescentes con anticuerpos monoclonales o policlonales ha
hecho posible los estudios de la densidad y la distribucin de determinantes y
receptores de la superficie y del citoplasma celular, permitiendo identificar
subpoblaciones celulares (3). Por otra parte, en comparacin con los m- todos
bioqumicos de anlisis celular, en los que se obtiene un resultado promedio
para toda la muestra, la citometra de flujo es capaz de proporcionar una
informacin cuantitativa sobre cada clula en particular y permite identificar en
una muestra subpoblaciones de clulas diferentes, incluso cuando estn
escasamente representadas.
QU ES LA CITOMETRA DE FLUJO?
La citometra de flujo representa un mtodo rpido objetivo y cuantitativo de
anlisis de clulas, ncleos, cromosomas, mitocondrias u otras partculas en
suspensin. El principio en el que se basa esta tecnologa es simple: hacer
pasar clulas u otras partculas en suspensin alineadas y de una en una por
delante de un haz luminoso. La informacin producida puede agruparse en dos
tipos fundamentales: la generada por la dispersin de la luz y la relacionada
con la emisin de luz por los fluorocromos presentes en la clula o partcula al
ser excitados por el rayo luminoso. Las seales luminosas detectadas se
transforman en impulsos elctricos que se amplifican y se convierten en
seales digitales que son procesadas por una computadora (Figura 1) (4).

CONCEPTOS

SOBRE

INMUNOFLUORESCENCIA
El trmino inmunofluorescencia se usa para describir las tcnicas en que se
emplea un fluorocromo para marcar un anticuerpo. La fluorescencia ha sido
usada para visualizar ciertas molculas y estructuras por medio de la
microscopia ptica durante muchos aos. Esta ha encontrado una extensa rea
de aplicacin en la citometra de flujo. La capacidad para detectar
simultneamente la fluorescencia de dos, tres, cuatro o actualmente hasta 13
fluorocromos de diferentes longitudes de onda, abre completamente el campo
del anlisis multiparamtrico. El objetivo del anlisis por inmunofluorescencia
en citometra de flujo es asignar a cada clula a un grupo especfico de clulas
que compartan propiedades comunes. El primer paso es identificar las clulas
de inters. Por ejemplo, para el anlisis de subpoblaciones linfocitarias se
requiere seleccionar un rea de trabajo distinguiendo los leucocitos por sus
propiedades de dispersin de luz (tamao contra complejidad celular). Una vez
que las clulas de inters han sido distinguidas de los otros tipos celulares, se
puede usar la inmunofluorescencia para determinar la proporcin o el nmero
de clulas que poseen un determinado marcador, por ejemplo, del marcador
CD4 para monitorear el progreso de la enfermedad por el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH) (5), entre muchas otras aplicaciones clnicas.
PARMETROS QUE SE PUEDEN ANALIZAR POR CITOMETRA DE FLUJO
La citometra de flujo permite medir diferentes parmetros de una clula. stos
se dividen en (Figura 2):
Parmetros nucleares
Parmetros citoplsmicos
Parmetros de superficie

 Parmetros extracelulares

En la Tabla
resumen
parmetros que pueden ser medidos por medio de esta tcnica.

I se
los

Referencias Bibliogrficas.

1. Orfao A, Ciudad J, Lpez A, Lpez-Berges MC, Vidriales B, Macedo A, et

al. La citometra de flujo en el diagnstico clnico. Servicio General de
Citometra. Universidad de Salamanca, 1993.
2. Orfao A, Gonzlez M, Ciudad J, Lpez-Berges MC, Lpez A, San Miguel JF,
et al. Aplicaciones de la citometra de flujo en el diagnstico
hematolgico. Biol Clin Hematol 1992;13:456-523.
3. Goding JS. Conjugation of Antinodies with Fluorochromes Modifications to
the Standard Methods. J Immunol Meths 1976;13:215-223.
4. Shapiro HM. Practical Flow Cytometry. 4th ed. New Jersey: Wiley-Liss,
Hoboken, 2003.
5. 8. Barry SM, Anossy G. Optimal Gating Strategies for Determining
Bronchoalveolar Lavage CD4/CD8 Lymp hocyte Ratios by Flow
Cytometry. J Immunol Methods 2004;285:15-23