COLE NATIONALE VTRINAIRE DALFORT

Anne 2012

VALUATION DE LIMMUNOTOXICIT DUNE

MOLCULE PHARMACEUTIQUE (CHIMIQUE OU
BIOLOGIQUE) EN DVELOPPEMENT : BILAN DES TESTS
DISPONIBLES ET PROPOSITIONS DUN ARBRE DE
DCISIONS POUR LIDENTIFICATION DES DANGERS ET
LVALUATION DU RISQUE IMMUNOTOXIQUE

THSE
Pour le

DOCTORAT VTRINAIRE

Prsente et soutenue publiquement devant

LA FACULT DE MDECINE DE CRTEIL

le

par

Chlo, Anastasia, Marie BOISSEAU

Ne le 17 ocobtre 1986 Hyres (VAR)

JURY

Prsident : Pr.
Professeur la Facult de Mdecine de CRTEIL

Membres
Directeur : Dr. Sbastien PERROT
Matre de confrences de Pharmacie et de Toxicologie lENVA
Assesseur : Dr. Ludovic FREYBURGER
Matre de confrences dImmunologie lENVL
Invit : Mme Nathalie BOURRIT
 fvrier 2012
LISTE DES MEMBRES DU CORPS ENSEIGNANT
Directeur : M. le Professeur MIALOT Jean-Paul
Directeurs honoraires : MM. les Professeurs MORAILLON Robert, PARODI Andr-Laurent, PILET Charles, TOMA Bernard
Professeurs honoraires: Mme et MM. : BRUGERE Henri, BRUGERE-PICOUX Jeanne, BUSSIERAS Jean, CERF Olivier, CLERC Bernard,
CRESPEAU Franois, DEPUTTE Bertrand, MOUTHON Gilbert, MILHAUD Guy, POUCHELON Jean-Louis, ROZIER Jacques
DEPARTEMENT DELEVAGE ET DE PATHOLOGIE DES EQUIDES ET DES CARNIVORES (DEPEC)
Chef du dpartement : M. POLACK Bruno, Matre de confrences - Adjoint : M. BLOT Stphane, Professeur
- UNITE DE CARDIOLOGIE - UNITE DE PARASITOLOGIE ET MALADIES PARASITAIRES
Mme CHETBOUL Valrie, Professeur * M. BLAGA Radu Gheorghe, Matre de confrences (rattach au DPASP)
Mme GKOUNI Vassiliki, Praticien hospitalier M. CHERMETTE Ren, Professeur *
M. GUILLOT Jacques, Professeur
- UNITE DE CLINIQUE EQUINE M. HUBERT Blaise, Professeur contractuel
M. AUDIGIE Fabrice, Professeur Mme MARIGNAC Genevive, Matre de confrences
M. DENOIX Jean-Marie, Professeur M. POLACK Bruno, Matre de confrences
Mme DUPAYS Anne-Galle, Assistant denseignement et de recherche
contractuel - UNITE DE PATHOLOGIE CHIRURGICALE
Mme GIRAUDET Aude, Praticien hospitalier * M. FAYOLLE Pascal, Professeur
Mme MESPOULHES-RIVIERE Cline, Matre de confrences contractuel M. MAILHAC Jean-Marie, Matre de confrences
Mme PRADIER Sophie, Matre de confrences M. MOISSONNIER Pierre, Professeur*
M. NIEBAUER Gert, Professeur contractuel
- UNITE DIMAGERIE MEDICALE Mme RAVARY-PLUMIOEN Brangre, Matre de confrences (rattache au
Mme BEDU-LEPERLIER Anne-Sophie, Matre de confrences contractuel DPASP)
Mme STAMBOULI Fouzia, Praticien hospitalier Mme VIATEAU-DUVAL Vronique, Matre de confrences
- UNITE DE MEDECINE M. ZILBERSTEIN Luca, Matre de confrences
Mme BENCHEKROUN Ghita, Matre de confrences contractuel - UNITE DE REPRODUCTION ANIMALE
M. BLOT Stphane, Professeur* Mme CONSTANT Fabienne, Matre de confrences (rattache au DPASP)
Mme MAUREY-GUENEC Christelle, Matre de confrences M. DESBOIS Christophe, Matre de confrences
M. ROSENBERG Charles, Matre de confrences M. FONTBONNE Alain, Matre de confrences
- UNITE DE MEDECINE DE LELEVAGE ET DU SPORT Mme MASSE-MOREL Galle, Matre de confrences contractuel (rattache au
M. GRANDJEAN Dominique, Professeur * DPASP)
Mme YAGUIYAN-COLLIARD Laurence, Matre de confrences contractuel M. NUDELMANN Nicolas, Matre de confrences
M. REMY Dominique, Matre de confrences (rattach au DPASP)*
- DISCIPLINE : NUTRITION-ALIMENTATION M. MAUFFRE Vincent, Assistant denseignement et de recherche contractuel,
M. PARAGON Bernard, Professeur (rattach au DPASP)

- DISCIPLINE : OPHTALMOLOGIE - DISCIPLINE : URGENCE SOINS INTENSIFS

Mme CHAHORY Sabine, Matre de confrences * Mme ROUX Franoise, Matre de confrences
DEPARTEMENT DES PRODUCTIONS ANIMALES ET DE LA SANTE PUBLIQUE (DPASP)
Chef du dpartement : M. MILLEMANN Yves, Matre de confrences - Adjoint : Mme DUFOUR Barbara, Professeur
- DISCIPLINE : BIOSTATISTIQUES - UNITE DE PATHOLOGIE MEDICALE DU BETAIL ET DES
M. DESQUILBET Loc, Matre de confrences ANIMAUX DE BASSE-COUR
M. ADJOU Karim, Matre de confrences *
- UNITE DHYGIENE ET INDUSTRIE DES ALIMENTS DORIGINE M. BELBIS Guillaume, Assistant denseignement et de recherche contractuel,
ANIMALE M. HESKIA Bernard, Professeur contractuel
M. AUGUSTIN Jean-Christophe, Matre de confrences M. MILLEMANN Yves, Matre de confrences
M. BOLNOT Franois, Matre de confrences *
M. CARLIER Vincent, Professeur - UNITE DE ZOOTECHNIE, ECONOMIE RURALE
Mme COLMIN Catherine, Matre de confrences M. ARNE Pascal, Matre de confrences*
M. BOSSE Philippe, Professeur
- UNITE DES MALADIES CONTAGIEUSES M. COURREAU Jean-Franois, Professeur
M. BENET Jean-Jacques, Professeur Mme GRIMARD-BALLIF Bndicte, Professeur
Mme DUFOUR Barbara, Professeur* Mme LEROY-BARASSIN Isabelle, Matre de confrences
Mme HADDAD/HOANG-XUAN Nadia, Professeur M. PONTER Andrew, Professeur
Mme PRAUD Anne, Assistant denseignement et de recherche contractuel
DEPARTEMENT DES SCIENCES BIOLOGIQUES ET PHARMACEUTIQUES (DSBP)
Chef du dpartement : Mme COMBRISSON Hlne, Professeur - Adjoint : Mme LE PODER Sophie, Matre de confrences
- UNITE DANATOMIE DES ANIMAUX DOMESTIQUES - UNITE DE PATHOLOGIE GENERALE MICROBIOLOGIE,
M. CHATEAU Henry, Matre de confrences* IMMUNOLOGIE
Mme CREVIER-DENOIX Nathalie, Professeur M. BOULOUIS Henri-Jean, Professeur
M. DEGUEURCE Christophe, Professeur Mme QUINTIN-COLONNA Franoise, Professeur*
Mme ROBERT Cline, Matre de confrences M. MAGNE Laurent, Matre de confrences contractuel
- DISCIPLINE : ANGLAIS - UNITE DE PHARMACIE ET TOXICOLOGIE
Mme CONAN Muriel, Professeur certifi Mme ENRIQUEZ Brigitte, Professeur
M. PERROT Sbastien, Matre de confrences
- UNITE DE BIOCHIMIE M. TISSIER Renaud, Matre de confrences*
M. BELLIER Sylvain, Matre de confrences*
M. MICHAUX Jean-Michel, Matre de confrences - UNITE DE PHYSIOLOGIE ET THERAPEUTIQUE
Mme COMBRISSON Hlne, Professeur
- DISCIPLINE : EDUCATION PHYSIQUE ET SPORTIVE Mme PILOT-STORCK Fanny, Matre de confrences
M. PHILIPS, Professeur certifi M. TIRET Laurent, Matre de confrences*
- UNITE DE GENETIQUE MEDICALE ET MOLECULAIRE - UNITE DE VIROLOGIE
Mme ABITBOL Marie, Matre de confrences M. ELOIT Marc, Professeur
M. PANTHIER Jean-Jacques, Professeur* Mme LE PODER Sophie, Matre de confrences *
-UNITE DHISTOLOGIE, ANATOMIE PATHOLOGIQUE - DISCIPLINE : ETHOLOGIE
Mme CORDONNIER-LEFORT Nathalie, Matre de confrences* Mme GILBERT Caroline, Matre de confrences
M. FONTAINE Jean-Jacques, Professeur
Mme LALOY Eve, Matre de confrences contractuel
M. REYES GOMEZ Edouard, Assistant denseignement et de recherche
contractuel
* responsable dunit
 REMERCIEMENTS

Au Prsident du jury,
Professeur de la facult de mdecine de Crteil,
qui nous a fait lhonneur daccepter la prsidence du jury de thse,
hommage respectueux.

Monsieur Sbastien Perrot,

Matre de confrences de pharmacie et toxicologie lEcole Nationale Vtrinaire dAlfort,
pour son aide prcieuse dans les recherches initiales de ma thse et sa disponibilit tout au long de
mon travail,
mes sincres remerciements.

Monsieur Ludovic Freyburger,

Matre de confrences dimmunologie lEcole Nationale Vtrinaire de Lyon,
pour avoir accept lassessorat de ma thse bien quil quittait Alfort,
mes sincres remerciements.

Madame Nathalie Bourrit et Monsieur Guillaume Chevalier,

pour leur accueil au sein de Cephalon, pour leurs conseils, leurs corrections et leurs encouragements
dans mon travail au long de ces quatre mois de stage,
quils trouvent ici le tmoignage de ma reconnaissance et de ma considration.
Ac : anticorps

ADA : anti-drug antibody

ADCC : antibody-dependent cell- mediated cytotoxicity

AMM : autorisation de mise sur le march

ARNm : ARN messager

BALT : bronchius-associated lymphoid tissue

BCR : B-cell receptor

Calcein AM : acetomethoxy derivate of calcein

CBER : center for biologics evaluation and research

CD : cluster of differentiation

CDC : centre de dveloppement de Cephalon

CFU : colony forming unit

CIT : centre international de toxicologie

CMH I : complexe majeur dhistocompatibilit I

CMHII : complexe majeur dhistocompatibilit II

Con A : concanavalin A

CPA : cellule prsentatrice dantigne

DHR : dihydrorhodamine

DTH : delayed-type hypersentivity

EBV : Epstein-Barr virus

ECL : lectrochimiluminescence

ECVAM : european center for the validation of alternative methods

EDTA : ethylenediaminetetraacetic acid

EGFR : epidermal growth factor receptor

ELISA : enzyme-linked immunosorbant assay

EPO : rythropotine

FDA CDER : food and drug administration center for drug evaluation and research
FITC : fluoresceine isothiocyanate

GALT : gut-associated lymphoide tissue

GFP : green fluorescent protein

GM-CSF : granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

G-SCF : granulocute colony-stimulating factor

H&E : hmatoxyline-osine

HHV8 : human herpes virus 8

HPV : human papillomavirus

IFN: interfron

Ig : immunoglobuline

IL : interleukine

LLNA : local lymph node assay

LPS : lipopolysaccharide

LTh : lymphocyte T helper

MDGF : macrophage-derived growth factor

MTT : 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide

NAb : Neutralizing Antibody

NK : natural killer

PC /PD : pharmacocintique/pharmacodynamie

PCR : polynuclearchain reaction

PE : phycorythrine

PFU : plaque forming unit

PHA : phytohemagglutine

PK/PD : pharmacokinetics/pharmacodynamics

PLNA : popliteal lymph node assay

PMA : phorbol myristate acetate : actate de phorboldiestrase

PNH : primate non humain

PWM : pokeweed mitogen

RIA : radio immuno assay

RIPA : radio immunoprecipitation assay

RT-PCR : reverse transcriptase polynuclearchain reaction

SDS-PAGE : sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

SPA : surface plasmon resonnance assay

TCR : T-cell receptor : rcepteur des lymphocytes T

TGF- : transforming growth factor :

TLR : toll-like receptor

TNF- : tumor necrosis factor

TNP : trinitrophenyl
 LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Squences d'vnements ncessaires la rponse des lymphocytes B un antigne (d'aprs

Tizard 2008)
Figure 2 : Rcapitulatif des diffrents types de ractions allergiques (d'aprs Pichler et al. 2010)
Figure 3 : Rcapitulatif des effets indsirables des molcules biologiques (d'aprs Hausmann et al.
2010)
Figure 4 : Exemples de protocole dvaluation de la rponse (a) primaire (daprs Gore et al. 2004) ou
(b) secondaire (daprs Ulrich et al. 2004), avec la KLH, tude rat 28 jours.
Figure 5 : Principe gnral de lELISA appliqu la mesure de la rponse humorale spcifique
Exemple de la mesure dIgM anti-KLH
Figure 6 : Mcanismes de raction de l'hypersensibilit retarde (daprs Tizard 2008)
Figure 7 : Principe gnral du test de prolifration cellulaire ELISA-BrdU
Figure 8 : Protocole du PLNA secondaire
Figure 9 : volution de la nature des anticorps monoclonaux de 1980 2004 (Reichert et al. 2005)
Figure 10 : Proposition de stratgie recommande pour la dtection et la confirmation des ADA
(d'aprs Koren et al. 2008)
Figure 11 : Principe de l'ELISA en opposition (d'aprs Tizard 2008)
Figure 12 : Principe gnral de lELISA-format en opposition avec lamlioration avec la
streptavidine et la biotine
Figure 13 : Principe gnral de la radio immuno-prcipitation (d'aprs Thorpe et Swanson 2005)
Figure 14 : Principe de la dtection de la liaison de lanticorps la surface sensitive dans un test de
rsonnance plasmonique de surface (d'aprs Thorpe et Swanson 2005)
Figure 15 : Principe gnral de llectrochimiluminescence format en opposition (d'aprs Moxness
et al. 2005)
Figure 16 : Proposition de stratgie recommande pour la dtection du pouvoir neutralisant des ADA
(d'aprs Koren et al. 2008)
Figure 17 : Principe gnral dun test de liaison comptitive au ligand
Figure 18 : Principe du SDS-PAGE (Tizard 2008)
 LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1: Les principales caractristiques des lymphocytes B et T (d'aprs Tizard 2008)

Tableau 2 : Rpartition des sous-populations lymphocytaires majeures du sang priphrique chez les
mammifres en pourcentage de la population totale
Tableau 3 : Les diffrentes classes d'Ig chez les mammifres (d'aprs Tizard 2008)
Tableau 4 : Tissus lymphodes associs aux muqueuses prlever en fonction de la voie
d'administration du mdicament (ICH 2005 ; Elmore 2006)
Tableau 5 : Listes des compartiments observer pour chaque organe lymphode et des modifications
semi-quantitatives pouvant tre associes aux lsions des tissus lymphodes (d'aprs Haley et al. 2005)
Tableau 6 : Paramtres hmatologiques dune tude de toxicit gnrale (daprs OECD 1995)
Tableau 7 : Exemple de marquage phnotypique de sous-ensembles lymphocytaires chez le rat
(daprs Smith et al. 2003)
Tableau 8 : Les voies dimmunisation en fonction de lantigne thymodpendant
Tableau 9 : Rsultats dELISA KLH tude 28 jours rat avec diffrents voies dadministration de la
KLH (d'aprs Gore et al. 2004)
Tableau 10 : comparaison des diffrentes voie dimmunisation par la KLH (d'aprs Gore et al. 2004)
Tableau 11 : Diffrentes doses dimmunisation la KLH en fonction des voies dadministration et de
lutilisation dun adjuvant
Tableau 12 : Nature du prlvement en fonction de la technique de quantification des anticorps et de
la nature de l'antigne thymodpendant
Tableau 13 : Diffrences majeures entre la technique des plages dhmolyse et la technique ELISA
Tableau 14 : Effets de limmunisation par la KLH sur lvaluation microscopique en histopathologie
Tableau 15 : Avantages et limites du test de libration du chrome et de la cytomtrie en flux (d'aprs
Cederbrant et al. 2003)
Tableau 16 : Principaux modles de rsistance aux maladies et paramtres mesurs (daprs Germolec
2004)
Tableau 17 : Principaux modle de rsistance et mcanismes immunitaires valus
Tableau 18 : Principales voies dinoculation et exemples
Tableau 19 : Exemples de moment dinoculation de Listeria monocytogenes en intra-veineuse selon le
modle dtude
Tableau 20 : Exemples de moment dinoculation en fonction des germes sur une tude de toxicit
rpte, par voie orale, 28 jours, chez le Rat (daprs Zhu et al. 2007)
Tableau 21 : Exemples de moments dvaluation des paramtres post-infection en fonction de lagent
pathogne et du paramtre valu (daprs Zhu et al. 2007)
Tableau 22 : Essais biologiques pour la mesure des cytokines
Tableau 23 : Exemple de rsultats dun test de cytotoxicit
Tableau 24 : Mthodes dvaluation de la prolifration cellulaire, avantages et inconvnients (daprs
Mire-Sluis et al. 1995)
Tableau 25 : Avantages et limites relatifs des techniques dvaluation des cytokines (daprs House
1999)
Tableau 26 : Principaux mitognes, leur origine et leurs cellules cibles (daprs Tizard 2008)
Tableau 27 : Diffrences entre le test de maximisation et le test de Bhler (daprs Maurer 2007)
Tableau 28 : Avantages, limites et objectifs des mthodes chez le Cobaye et le LLNA (daprs Maurer
2007)
Tableau 29 : Caractristiques des molcules protiques entranant une rponse immunognique plutt
faible et une rponse immunognique forte.
Tableau 30 : Exemples de facteurs considrer dans lvaluation du risque de squelles cliniques lies
aux ADA ( d'aprs Koren et al. 2008)
Tableau 31: Etapes de la phase de dveloppement/optimisation dun test de dtection des ADA
(d'aprs Mire-Sluis et al. 2004)
Tableau 32 : Etapes de la phase de validation dun test de dtection des ADA (d'aprs Mire-Sluis et al.
2004 ; Shankar et al. 2008)
Tableau 33 : Exemples de tests cellulaires de dtection des anticorps neutralisants et de techniques de
mesure (d'aprs Gupta et al. 2007)
 SOMMAIRE

INTRODUCTION ...............................................................................................................9

PREMIRE PARTIE : LIMMUNOTOXICIT : MCANISMES ET TABLEAUX

CLINIQUES ......................................................................................................................11

I. Rappels immunologiques Le systme immunitaire ............................................11

I.A. Fonction ...........................................................................................................11

I.B. Base anatomique..............................................................................................11

I.B.1. Les organes lymphodes primaires .......................................................11

I.B.1.a. Le thymus ...........................................................................................12

I.B.1.b. La moelle osseuse...............................................................................12

I.B.1.c. Les plaques de Peyers.........................................................................13

I.B.2. Les organes lymphodes priphriques.................................................13

I.B.2.a. La rate.................................................................................................13

I.B.2.b. Les nuds lymphatiques ....................................................................14

I.B.2.c. Les formations lymphodes associes aux muqueuses.......................14

I.B.2.d. La moelle osseuse...............................................................................14

I.B.3. Les cellules immunocomptentes .........................................................14

I.B.3.a. Les phagocytes ...................................................................................14

I.B.3.b. Les lymphocytes.................................................................................15

I.B.3.c. Les autres cellules immunitaires ........................................................17

I.C. Rponses immunitaires....................................................................................18

I.C.1. Rle des cytokines ................................................................................18

I.C.2. Immunit mdiation humorale...........................................................18

I.C.2.a. Les anticorps.......................................................................................18

I.C.2.b. Rponses anticorps, primaire et secondaire .......................................20

I.C.3. Immunit mdiation cellulaire ...........................................................21

II. Immunotoxicit directe : rsultats de la pharmacologie du mdicament...............22

II.A. Immunosuppression .....................................................................................22

II.A.1. Augmentation de lincidence des infections.........................................23

II.A.1.a. Exemple 1 : anticorps monoclonaux anti- TNF- ............................23

II.A.1.b. Exemple 2 : anticorps monoclonaux anti-intgrine--4 ...................23

II.A.2. Augmentation de lincidence de certains cancers.................................23

II.A.2.a. Traitements anti-rejet et cancers .......................................................23

II.A.2.b. Exemple de la ciclosporine A ...........................................................24

II.B. Immunostimulation ......................................................................................24

II.B.1. Exemple de la libration directe non spcifique dhistamine...............25

II.B.2. Libration de cytokines et dsquilibres immunitaires ........................26

III. Immunotoxicit indirecte : rponse du systme immunitaire envers le

mdicament ....................................................................................................................27

III.A. Hypersensibilits..........................................................................................27

III.A.1. Hypersensibilit de type I, mdie par les IgE .....................................27

III.A.1.a. Mcanismes .....................................................................................27

III.A.1.b. Exemples .........................................................................................28

III.A.2. Hypersensibilits de type II ou cytotoxique .........................................28

III.A.2.a. Mcanismes .....................................................................................28

III.A.2.b. Exemples .........................................................................................29

III.A.3. Hypersensibilit de type III : dpt dimmun-complexes ....................29

III.A.3.a. Mcanismes .....................................................................................29

III.A.3.b. Exemples .........................................................................................30

III.A.4. Hypersensibilit de type IV ou hypersensibilit retarde, mdie par

les lymphocytes T ..................................................................................................30

III.A.4.a. Mcanismes .....................................................................................30

III.A.4.b. Exemples .........................................................................................30

III.B. Immunognicit ...........................................................................................31

 III.B.1. Dfinition..............................................................................................31

III.B.2. Molcules biologiques ..........................................................................31

III.B.2.a. Facteurs de risque ............................................................................31

III.B.2.b. Consquences de limmunognicit ................................................32

DEUXIME PARTIE : PROPOSITION DE STRATGIE ET TECHNIQUES

DANALYSE COURANTES EN IMMUNOTOXICOLOGIE PRCLINIQUE.............37

I. Prdiction de limmunotoxicit directe dune molcule pharmaceutique

chimique et valuation de son risque .............................................................................37

I.A. Rglementation................................................................................................37

I.B. Prsentation gnrale de la stratgie tage ....................................................38

I.C. Etape 1( Tier 1 ) : analyse des facteurs de risque et dtection dun

pouvoir immunotoxique .............................................................................................38

I.C.1. Etude des facteurs de risque .................................................................38

I.C.1.a. Structure et pharmacologie de la molcule ........................................38

I.C.1.b. Schma thrapeutique ........................................................................39

I.C.1.c. Population cible ..................................................................................39

I.C.2. Dtection de limmunotoxicit dans les tudes de toxicologie

gnrale 39

I.C.2.a. Marqueurs de limmunotoxicit .........................................................39

I.C.2.b. Interprtation des rsultats .................................................................40

I.C.3. Techniques principales dvaluation des marqueurs de

limmunotoxicit directe en toxicologie gnrale..................................................41

I.C.3.a. Anatomopathologie ............................................................................41

I.C.3.b. Histopathologie approfondie des organes lymphodes.......................43

I.C.3.c. Hmatologie .......................................................................................48

I.C.3.d. Biochimie ...........................................................................................49

I.C.4. Techniques complmentaires dvaluation des marqueurs de

limmunotoxicit en toxicologie gnrale .............................................................50
 I.C.4.a. Cytologie de la moelle osseuse...........................................................50

I.C.4.b. Immunophnotypage..........................................................................52

I.C.4.c. Dosage des immunoglobulines sriques.............................................57

I.D. tape 2 ( Tier 2 ) : confirmation et caractrisation du pouvoir

immunotoxique...........................................................................................................59

I.D.1. Choix des tests additionnels .................................................................59

I.D.1.a. Une approche au cas par cas ..............................................................59

I.D.1.b. Rglementation ..................................................................................60

I.D.2. valuation du risque immunotoxique...................................................61

I.D.3. Rponse humorale un antigne thymo-dpendant .............................61

I.D.3.a. Paramtres valus .............................................................................61

I.D.3.b. Techniques .........................................................................................62

I.D.3.c. Limites................................................................................................71

I.D.4. Activit des cellules Natural Killer ......................................................73

I.D.4.a. Paramtres valus .............................................................................73

I.D.4.b. Techniques .........................................................................................74

I.D.4.c. Limites................................................................................................76

I.D.5. Activit des Macrophages/Neutrophiles...............................................77

I.D.5.a. Paramtres valus .............................................................................77

I.D.5.b. Techniques .........................................................................................78

I.D.5.c. Limites................................................................................................81

I.D.6. Rponse immunitaire mdiation cellulaire ........................................81

I.D.6.a. Paramtres valus .............................................................................81

I.D.6.b. Techniques .........................................................................................83

I.D.6.c. Limites................................................................................................83

I.D.7. Rsistance de lhte aux infections et aux tumeurs..............................84

I.D.7.a. Paramtres valus .............................................................................84

 I.D.7.b. Techniques .........................................................................................87

I.D.7.c. Limites................................................................................................90

I.D.8. Quantification des cytokines ................................................................91

I.D.8.a. Paramtres valus .............................................................................91

I.D.8.b. Techniques .........................................................................................92

I.D.8.c. Limites..............................................................................................100

I.D.9. Activation des lymphocytes................................................................102

I.D.9.a. Paramtres valus ...........................................................................102

I.D.9.b. Techniques .......................................................................................102

I.D.9.c. Limites..............................................................................................104

I.E. Modle animal ...............................................................................................104

II. Prdiction de limmunotoxicit directe dune molcule pharmaceutique

biologique et valuation de son risque .........................................................................105

II.A. Rglementation ..........................................................................................105

II.B. Modle animal ...........................................................................................106

II.B.1. Principes gnraux..............................................................................106

II.B.2. Cas particuliers et alternatives............................................................106

II.B.2.a. Absence despce pertinente ...........................................................106

II.B.2.b. Anticorps monoclonaux ..................................................................108

III. Prdiction des allergies et des ractions auto-immunes dune molcule

pharmaceutique et valuation de son risque.................................................................109

III.A. Etude des facteurs de risque.......................................................................109

III.A.1. Induction dhypersensibilit ...............................................................109

III.A.1.a. Rglementation..............................................................................109

III.A.1.b. Capacit de liaison du mdicament une protine .......................110

III.A.2. Induction de ractions auto-immunes.................................................110

III.A.2.a. Rglementation..............................................................................110

III.A.2.b. Rsultats dhistopathologie ...........................................................110

 III.B. Dtection dun pouvoir sensibilisant .........................................................113

III.B.1. Hypersensibilit de type I ou anaphylaxie..........................................113

III.B.1.a. Paramtres valus.........................................................................113

III.B.1.b. Techniques.....................................................................................113

III.B.1.c. Limites ...........................................................................................115

III.B.2. Hypersensibilit de type IV ou hypersensibilit retarde ...................115

III.B.2.a. Paramtres valus.........................................................................116

III.B.2.b. Tests de sensibilisation de contact.................................................116

III.B.2.c. Le LLNA........................................................................................119

III.B.2.d. Alternative in vitro chez lHomme................................................120

III.B.2.e. Bilan et limites ...............................................................................122

III.C. Dtection dun pouvoir induire des ractions auto-immunes .................123

III.C.1. Des moyens limits.............................................................................123

III.C.2. Test du nud lymphatique poplit .....................................................123

III.C.2.a. La forme directe.............................................................................124

III.C.2.b. Les autres formes...........................................................................126

IV. Prdiction de limmunogenicit dune molcule pharmaceutique biologique et

evaluation de son risque ...............................................................................................129

IV.A. Objectifs.....................................................................................................129

IV.A.1. Interprtation des rsultats des tudes prcliniques............................129

IV.A.2. Prdiction de limmunognicit et de ses consquences chez

lHomme... ...........................................................................................................130

IV.B. Etude des facteurs de risque.......................................................................131

IV.B.1. Molcule thrapeutique ......................................................................131

IV.B.1.a. Structure.........................................................................................131

IV.B.1.b. Production et stockage...................................................................132

IV.B.2. Population cible ..................................................................................132

IV.B.2.a. Facteurs gntiques........................................................................132

 IV.B.2.b. Age ................................................................................................133

IV.B.2.c. Maladie ..........................................................................................133

IV.B.2.d. Traitement concomitant.................................................................133

IV.B.2.e. Schma thrapeutique....................................................................134

IV.B.2.f. Exposition prcdente une protine similaire ou apparente ......134

IV.B.3. Bilan....................................................................................................135

IV.C. Evaluation du risque clinique de limmunognicit ..................................135

IV.D. Stratgie gnrale en dveloppement prclinique et techniques................137

IV.D.1. Dtection des ADA.............................................................................137

IV.D.1.a. Stratgie.........................................................................................137

IV.D.1.b. Techniques ....................................................................................139

IV.D.1.c. Limites gnrales des techniques de dtection..............................147

IV.D.1.d. Dveloppement et validation dune technique de dtection des

ADA ........................................................................................................148

IV.D.2. Caractrisation du pouvoir neutralisant des ADA..............................152

IV.D.2.a. Stratgie.........................................................................................153

IV.D.2.b. Techniques ....................................................................................154

IV.D.3. Caractrisation plus approfondie des chantillons ADA+ .................162

IV.D.3.a. Quantification des isotypes prsents .............................................162

IV.D.3.b. Spcificit des ADA......................................................................163

IV.D.3.c. Affinit ..........................................................................................164

CONCLUSION................................................................................................................165

BIBLIOGRAPHIE...........................................................................................................167

LISTE DES FIGURES ....................................................................................................187

LISTE DES TABLEAUX................................................................................................189

LISTE DES ABBRVIATIONS.....................................................................................191

 INTRODUCTION

Limmunotoxicit dune substance trangre lorganisme (xnobiotique) a t

dfinie par G.E. Davis en 1983 comme les consquences indsirables dune rponse
inadquate du systme immunitaire (Descotes, 1992).

Limmunotoxicologie est donc ltude des interactions entre un xnobiotique et le

systme immunitaire, lorigine deffets indsirables (De Jong et Van Loveren,
2007).

Lors du dveloppement du mdicament, les tudes de toxicologie prcliniques ont

pour objectifs didentifier (ICH, 2009) :
- une dose initiale sre pour les tudes cliniques et la dduction du schma de
doses croissantes applicables chez lHomme ;
- les organes cibles potentiels pour la toxicit et pour ltude dune rversibilit
ventuelle de la toxicit ;
- les paramtres de toxicit surveiller durant les tudes cliniques.

Le dveloppement de limmunotoxicologie depuis les annes 1960, a permis de

mettre au point pour lindustrie pharmaceutique, un certain nombre doutilspour
mieux dtecter les susbtancesimmunotoxiques, lors du dveloppement prclinique.
Paralllement, des avances majeures en recherche mdicale ont t ralises pour les
maladies inflammatoires chroniques, les cancers, les rejets de greffe Une meilleure
comprhension des mcanismes pathologiques a donn lieu au dveloppement de
thrapies plus cibles, dont les principes actifs sont des molcules biologiques
(molcules thrapeutiques produites par des biotechnologies).Lessor de ces
biopharmaceutiques soulve des proccupations nouvelles dans le cadre de
lvaluation de leur scurit.

Le dpartement de scurit du mdicament de Cephalon France dsire mettre en place

limmunotoxicologie prclinique au Centre de Dveloppement de Cephalon
Maisons-Alfort.

Quels sont les moyens disponibles ce jour dans lindustrie pharmaceutique en

immunotoxicologie prclinique et dans quelle mesure permettent-ils de rpondre aux
objectifs rglementaires des tudes prcliniques ?
9
Ce travail bibliographique prsente les outils disponibles et des propositions de
stratgies dtude enimmunotoxicologie prclinique. Son objectif principal est de
permettre dvaluer globalement les besoins matriels et humains ncessaires la
mise en place de limmunotoxicologie prclinique au CDC.
Ltude se limite aux molcules chimiques et biologiques et naborde pas la
problmatique des vaccins.

Aprs de brefs rappels immunologiques, la premire partie sattachera dcrire les

tableaux cliniques et les mcanismes de limmunotoxicitchez lHomme.
La deuxime partie dressera un bilan des outils disponibles en immunotoxicologie
prclinique et prsentera une proposition de dmarche suivre pour lvaluation
immunotoxicologique prclinique dun mdicament.

10
 PREMIRE PARTIE : LIMMUNOTOXICIT :
MCANISMES ET TABLEAUX CLINIQUES

I. RAPPELS IMMUNOLOGIQUES LE SYSTEME

IMMUNITAIRE

I.A. Fonction
Le rle du systme immunitaire est de maintenir lintgrit de lorganisme,
impliquant ainsi la reconnaissance du soi et du non soi. Cette discrimination peut
amener par exemple llimination dagents pathognes ou bien de tumeurs
spontanes.

I.B. Base anatomique

Le systme immunitaire repose sur une base anatomique complexe qui comprend :

- les organes lymphodes,

- les cellules immunocomptentes,
- le rseau lymphatique et sanguin.

I.B.1. Les organes lymphodes primaires

Ce sont les organes qui assurent la production et/ou la maturation des lymphocytes.
Leur dveloppement est prcoce dans la vie ftale et il est indpendant de toute
stimulation antignique. En effet, les organes lymphodes primaires ne sont pas des
sites o les lymphocytes rencontrent des antignes trangers. Lors de stimulation
antignique ces organes naugmentent pas en taille.

11
La maturation des lymphocytes T se fait exclusivement dans le thymus. Celle des
lymphocytes B seffectue dans des organes variables selon lespce (le choix des
espces animales ici correspond aux espces animales couramment utilises dans
lindustrie pharmaceutique en toxicologie prclinique) :
- chez les primates (dont les hommes) et les rongeurs : principalement par la
moelle osseuse,
- chez le chien, le cochon et le lapin : principalement dans le tissu lymphode
intestinal ou plaques de Peyer.
I.B.1.a. Le thymus
Le thymus est un organe lymphode primaire majeur. Il est situ dans la cavit
thoracique devant et en-dessous du cur. Chez le cochon il stend mme dans le cou
jusqu la thyrode. La taille du thymus varie au cours de la vie : sa taille relative est
maximum chez le nouveau-n, sa taille absolue est maximum la pubert et il est
prsent ltat dbauche anatomique chez ladulte.
Lunit fonctionnelle du thymus est le lobule, entour dune trame pithliale. Une
corticale riche en thymocytes immatures se distingue dune mdullaire o se trouvent
les lymphocytes T matures, prts quitter le thymus. La majorit des thymocytes
meurent sur place (environ 95% chez les rongeurs) (Tizard, 2008). Les lymphocytes T
dirigs contre le soi sont tus par apoptose (slection ngative) (Tizard, 2008). Les
lymphocytes incomptents, cest dire prsentant un TCR dfectueux sont galement
limins. Les thymocytes, passs outre la slection ngative et reconnaissant les
CMHII avec une affinit modre, voient leur croissance stimule (slection positive).
Le micro-environnement pithlial et les hormones thymiques jouent un rle majeur
dans ce processus de maturation.
I.B.1.b. La moelle osseuse
La moelle osseuseproduit des cellules souches multipotentes qui donneront naissance
toutes les lignes de cellules immunocomptentes. La maturation des lymphocytes
B y est galement assure. Il nexiste pas de site exclusif de dveloppement dans la
moelle, il est suggr que les prcurseurs des lymphocytes B se dveloppent sur le
bord extrieur de la moelle et migrent au centre de la moelle lors de leur maturation et
multiplication.

12
 I.B.1.c. Les plaques de Peyers
Les plaques de Peyers se situent dans la paroi de lintestin grle. Leur structure et
fonction varient selon les espces. Le tissu lymphode intestinal est un site de
prolifration rapide des lymphocytes B, mais la majorit des cellules subissent
lapoptose, les survivants sont relchs dans la circulation sanguine.

I.B.2. Les organes lymphodes priphriques

Contrairement aux organes lymphodes primaires, ce sont le lieu de rencontre entre

les antignes et les cellules immunocomptentes. Leur dveloppement est tardif dans
la vie ftale et ils persistent chez ladulte. Ils grossissent lors dune stimulation
antignique. Leur structure anatomique gnral contribue faciliter le pigeage de
lantigne et optimise la prsentation de lantigne un lymphocyte. En effet ils
contiennent des cellules dendritiques qui capturent et prsentent lantigne et des
lymphocytes qui rgulent la rponse immunitaire. Ils contiennent notamment des
petits amas de lymphocytes B : les follicules lymphodes, primaires avant stimulation
antignique, secondaires aprs stimulation. Les follicules secondaires ont un centre
germinatif contenant entre autres des lymphoblastes (lymphocytes B activs).

I.B.2.a. La rate
La ratejoue le rle de filtre pour les antignes sanguins. Elle est compose de :
- la pulpe rouge qui assure la filtration du sang et le stockage des globules
rouges,
- la pulpe blanche, riche en lymphocytes formant soit des manchons
priartriels (zone thymo-dpendante, lymphocytes T) soit des follicules (zone
thymo-indpendante, lymphocytes B).
Elle exerce principalement des fonctions phagocytaires.

13
 I.B.2.b. Les nuds lymphatiques
Les nuds lymphatiquescomprennent :

- une zone corticale o prdominent les lymphocytes B arrangs en nodules qui

forment les follicules lymphodes,
- une zone paracorticale, thymo-dpendante (lymphocytes T et cellules
dendritiques),
- une zone mdullaire riche en cellules immunocomptentes varies,
principalement des lymphocytes B mais galement des cellules dendritiques,
des macrophages et des plasmocytes).
I.B.2.c. Les formations lymphodes associes aux muqueuses
Les formations lymphodes des muqueuses correspondent des tissus lymphodes
dissmins dans lorganisme, non encapsuls. Ils peuvent tre diffus comme ceux
associs aux bronches (BALT), au tractus urinaire, au tube digestif (GALT). Ou bien
individualiss comme les plaques de Peyer.
I.B.2.d. La moelle osseuse
La moelle osseuseest galement un organe lymphode secondaire. Les plasmocytes de
la moelle osseuse produisent une grande quantit danticorps lors dune rponse
secondaire un antigne (plus de 70% des anticorps). Cest la source majeure
danticorps chez le rat adulte.

I.B.3. Les cellules immunocomptentes

Les cellules impliques dans la rponse immunitaire sont trs htrognes tant par
leur origine que par leur fonction.

I.B.3.a. Les phagocytes

Les phagocytes drivent tous de cellules souches mdullaires multipotentes. Il faut
distinguer :

- les granulocytes neutrophiles circulants (95% des granulocytes totaux) qui

assurent essentiellement une fonction de phagocytose et bactricide. Les
micro-organismes sont tus par un processus appel lexplosion respiratoire

14
 ( respiratoryburst ) ou bien par des protines anti-bactriennes (dfensines)
ou encore par des enzymes lytiques ;
- les phagocytes mononucls circulants (monocytes) ou tissulaires
(macrophages). Les macrophages ont un polymorphisme morphologique et
fonctionnel vaste en fonction de leur site (histiocytes des tissus conjonctifs,
cellules de Kpfer du foie, macrophages pritonaux, macrophages
alvolaires). Des fonctions de prsentation de lantigne, dactivit tumoricide
et bactricide sajoutent leur fonction phagocytaire aux mcanismes daction
similaires ceux des granulocytes.

La phagocytose au sens large a pour fonction dliminer les micro-organismes, les

corps trangers
La phagocytose se droule en 5 tapes :
- le chimiotactisme,
- ladhrence,
- lingestion,
- la destruction,
- la digestion.
Les macrophages et les granulocytes neutrophiles peuvent phagocyter des lments
bruts ou bien des lments opsoniss (par des molcules du complment ou par
des anticorps) par lintermdiaire de rcepteurs spcifiques (CD11b/CD18 pour le
complment ou CD32 par exemple pour les anticorps).
I.B.3.b. Les lymphocytes
Ces cellules sont le support de limmunit spcifique, elles sont capables de
reconnaitre et de rpondre un antigne tranger.
Lensemble des lymphocytes est divis en deux groupes distincts non pas sur des
caractristiques morphologiques, mais sur lexistence de rcepteurs de surfaces ou
cluster of differentiation (CD).
Les principales caractristiques des lymphocytes B et T sont compiles dans le
Tableau 1.

15
Tableau 1: Les principales caractristiques des lymphocytes B et T (d'aprs Tizard,
2008)

Proprits Lymphocytes B Lymphocytes T

Lieu de Moelle osseuse, plaques de
Thymus
production Peyer
Cortex des nuds
Distribution lymphatiques, follicules Manchons priartriels splniques
splniques
Circulant Non Oui
Immunoglobuline des
Rcepteurs Htrodimre protique TCR associ
rcepteurs des cellules B
lantigne avec CD3, CD4 ou CD8
(BCR)
Antigne de
Immunoglobulines CD2, CD3, CD4 ou CD8
surface majeur
Lectine, Phytohmagglutinine, concanavalin
Mitognes
lipopolysaccharide A, phytolaque

Antignes Protines trangres Protines trangres prsentes par

reconnus solubles un complexe majeur
dhistocompatibilit (CMH)
Cellules Plasmocytes, lymphocytes Lymphocytes effecteurs,
drives mmoires lymphocytes mmoires
Produits
Immunoglobulines Cytokines, perforines
scrts

La rpartition relative des sous-populations lymphocytaires principales dans le sang

est donne dans le Tableau 2.
Les lymphocytes T comptent deux sous-populations principales :
- les lymphocytes T auxiliaires ( helpers ) qui expriment le marqueur CD4,
- les lymphocytes T cytotoxiques qui expriment le marqueur CD8.

16
Leurs fonctions sont varies :
- interaction avec dautres cellules immunocomptentes,
- immunit mdiation cellulaire,
- production de cytokines,
- mmoire immunologique.
- destruction des cellules cibles (fonction premire des LTc).
Les lymphocytes B sont le support de limmunit humorale qui assure la production
danticorps. Ils sont identifiables par leurs immunoglobulines de surface. Les
plasmocytes, cellules drives des lymphocytes B, produisent les anticorps. Un
plasmocyte donn ne produit quune seule spcificit danticorps.

Tableau 2 : Rpartition des sous-populations lymphocytaires majeures du sang

priphrique chez les mammifres en pourcentage de la population totale

Lymphocytes T Lymphocytes B CD4+ CD8+ CD4/CD8

Homme 70-75 10-15 43-48 22-24 1.9-2.4
Rat (Lewis)* 67.7 19.3 57.9 22.6 2.6
Chien 46-72 7-30 27-33 17-18 1.7
Cochon 45-57 13-38 23-43 17-39 1.4
*
(Pastoret et al., 1998)

(Tizard, 2008)

I.B.3.c. Les autres cellules immunitaires

Les cellules Natural Killer (NK) dtruisent directement les cellules qui prsentent un
dfaut dans lexpression du CMH I (par exemple les cellules tumorales, les cellules
infectes par un virus). Le CD56 chez lHomme est un antigne de surface qui leur est
propre. Elles expriment galement le CD2, CD16, CD178, CD40L (CD154), le TLR3
et le TLR9 (Tizard 2008).

Les mastocytes ont une distribution large dans les tissus conjonctifs, sous les surfaces
muqueuses, dans la peau et autour des nerfs. Ils contiennent de grandes granulations
cytoplasmiques riches en mdiateurs inflammatoires (lhistamine par exemple) et des
rcepteurs membranaires spcifiques des immunoglobulines E. De nombreux
mcanismes peuvent dclencher la dgranulation des mastocytes (Tizard, 2008).
17
I.C. Rponses immunitaires

I.C.1. Rle des cytokines

Les diffrentes rponses immunitaires sont le rsultat dinteractions entre diffrents

types cellulaires. Ces cellules interagissent entre elles notamment en scrtant des
molcules informatrices, dont la plupart sont des cytokines. Ces glycoprotines
agissent en se liant des rcepteurs spcifiques des cellules cibles. La liaison un
rcepteur spcifique modifie le comportement de la cellule grce un processus de
transduction du signal. Des facteurs de transcription sont synthtiss et activent des
gnes slectionns. La transcription des gnes peut donner lieu une nouvelle
scrtion de cytokine ou bien dautres molcules signal .

I.C.2. Immunit mdiation humorale

I.C.2.a. Les anticorps

> Structure gnrale

Les anticorps sont des immunoglobulines (Ig), molcules protiques synthtises par
les plasmocytes.

La partie N-terminale des anticorps est trs diffrente selon les anticorps et constitue
la partie variable, support de la spcificit de lanticorps pour lantigne. La partie C-
terminale constitue la partie constante. Le site de fixation lantigne est form par
lassociation des domaines variables des chanes lourde et lgre de chaque anticorps.
Chaque molcule dimmunoglobuline est donc divise en deux parties :
- deux fragments Fab qui correspondent au site de fixation lantigne,
- un fragment Fc avec des fonctions biologiques variables (activation du
complment, opsonisation, ).

> Isotypes

Ils existent cinq classes (isotypes) dimmunoglobulines chez les mammifres : IgG,
IgM, IgA, IgE et IgD. Chaque Ig est constitue par lassociation de chanes lourdes et
chanes lgres. Elles se distinguent par leur poids molculaire, leurs nombres de
sous-units, leur classe de chane lourde et leur lieu de synthse (Tableau 3).

18
Tableau 3 : Les diffrentes classes d'Ig chez les mammifres (d'aprs Tizard, 2008)

Isotype
Proprits IgM IgG IgA IgE IgD
Poids
900 000 180 000 360 000 200 000 180 000
molculaire
Sous-units 5 1 2 1 1
Chane

lourde
Tractus Tractus
Lieu Rate et Rate et Rate et
intestinal intestinal
principal nuds nuds nuds
et et
de synthse lymphatiques lymphatiques lymphatiques
respiratoire respiratoire

Les IgG sont les immunoglobulines prdominantes dans le srum. De petite taille,
elles sont capables de sortir des vaisseaux sanguins plus facilement que les autres lors
dinflammation et de participer ainsi aux dfenses des tissus et des surfaces du corps.
Elles sont produites et scrtes par les plasmocytes dans la rate, les nuds
lymphatiques et la moelle osseuse.
Les IgM sont des immunoglobulines dont la concentration est la plus leve aprs les
IgG. De trs grandes tailles, elles quittent donc rarement la circulation sanguine. Elles
sont galement produites et scrtes par les plasmocytes de la rate, des nuds
lymphatiques et de la moelle osseuse. Ce sont les Ig majoritairement produites
pendant la rponse immunitaire primaire. Leur production lors de la rponse
secondaire tend tre masque par la production importante dIgG.
Les IgA sont les immunoglobulines scrtes par les plasmocytes situs dans les
parois de lintestin, du tractus respiratoire, de lappareil urinaire, de la peau et de la
glande mammaire. Leur concentration srique est infrieure celle des IgM. Une fois
scrtes, elles passent travers les cellules pithliales dans les scrtions
corporelles. Elles permettent notamment dempcher ladhrence de pathognes aux
surfaces corporelles.
Les IgE, de mme que pour les IgA, sont produites par les plasmocytes situs sous la
surface du corps. Leur concentration srique est trs faible. Elles se lient un
rcepteur la surface des mastocytes et des basophiles. Lorsque lantigne se fixe
ces IgE, cela dclenche la libration massive de molcules inflammatoires par ces
cellules. Linflammation aigue en rsultant stimule les dfenses locales et favorise
llimination du pathogne.

19
Les IgD sont trouvs la surface des lymphocytes immatures et sont trs peu
scrtes dans la circulation sanguine. Leur structure montre de nombreuses variantes
selon les espces. Leur fonction est mconnue.
I.C.2.b. Rponses anticorps, primaire et secondaire
La production danticorps ncessite lactivation des lymphocytes B (Figure 1) portant
les immunoglobulines membranaires spcifiques de lantigne et leur augmentation
(expansion clonale).

Les lymphocytes B peuvent reconnatre les dterminants (pitopes) de lantigne

directement grce leur Ig membranaires (BCR). Mais leur activation complte
ncessite une costimulation (cytokines et interaction avec des rcepteurs de surface)
par les lymphocytes T auxiliaires (LTh2) qui lantigne a t prsent par une CPA
qui peut tre une cellule dendritique, un macrophage ou bien un lymphocyte B
(Figure 1).

Figure 1 : Squences d'vnements ncessaires la rponse des lymphocytes B un

antigne (d'aprs Tizard, 2008)

Lors de cette prolifration, les lymphocytes B se transforment en lymphoblastes qui

donnent dune part les lymphocytes B mmoires et dautre part les plasmocytes.

20
Lors dun premier contact avec lantigne (rponse primaire), la production
danticorps se dveloppe en 3 temps :

- la phase de latence avant lapparition des anticorps (3-4 jours), qui dpend de
la voie dadministration, de la dose administre et de la nature de lantigne,
- la phase de croissance exponentielle du taux danticorps,
- la phase de dcroissance conduisant la disparition des anticorps ou la
persistance dun taux rsiduel.

Les premiers anticorps apparatre sont les IgM puis les IgG.

Lors dun nouveau contact avec lantigne (rponse secondaire), la production

danticorps est plus prcoce et plus importante. Ces anticorps sont majoritairement
des IgG.

I.C.3. Immunit mdiation cellulaire

La rponse immunitaire repose galement sur des mcanismes cellulaires dans

lesquels il ny a pas de production danticorps spcifiques. Ils sont responsables par
exemple du rejet de greffe, des ractions dhypersensibilit retarde et en partie de la
dfense anti-tumorale et de limmunit antivirale.

Les piliers de cette immunit sont les lymphocytes T.

Pour les lymphocytes T4 lantigne doit tre prsent par des CPA (cellules
dendritiques, macrophages, lymphocytes B) par lintermdiaire CMH II.

LIL-12 scrte par les CPA actives stimule la diffrenciation des LT4 en
lymphocytes T auxiliaires 1 (LTh1) qui scrtent leur tour un ensemble de cytokines
dont notamment lIL-2 et lINF. Leurs proprits principales sont lactivation des
lymphocytes T CD8 et T cytotoxiques, des cellules NK et des macrophages.

21
II. IMMUNOTOXICITE DIRECTE : RESULTATS DE LA
PHARMACOLOGIE DU MEDICAMENT

Limmunotoxicit est dite directe lorsque le systme immunitaire est la victime de

lagression toxique par un xnobiotique.
Les mcanismes de limmunotoxicit reposent sur les proprits pharmacologiques du
mdicament :
- localisation de la cible,
- action du mdicament sur cette cible (inhibiteur, stimulant),
- mcanismes physiologiques pouvant tre modifis en agissant sur cette cible.
Les signes cliniques sont la consquence dun drglement de la fonction
discriminante du systme immunitaire.

II.A. Immunosuppression
Limmunosuppression fait rfrence toute dtrioration dun composant du systme
immunitaire qui rsulterait en une diminution de la fonction immunitaire (FDA -
CDER, 2002).
Ltat immunosuppressif peut saccompagner (Descotes, 1992) :
- dune baisse des rsistances antimicrobiennes rsultant en une augmentation
de lincidence des infections (notamment broncho-pulmonaires et gastro-
intestinales),
- de laugmentation de lincidence de certains cancers (notamment les
hmopathies malignes).
Dans des cas particuliers (maladies inflammatoires chroniques, greffes), on peut
chercher diminuer volontairement des mcanismes immunitaires nfastes, mais cette
action sur le systme immunitaire nest pas sans consquence.

22
 II.A.1. Augmentation de lincidence des infections

II.A.1.a. Exemple 1 : anticorps monoclonaux anti- TNF-

Le TNF- est une cytokine pro-inflammatoire, stimulant notamment lactivit des
macrophages.

Dans le cas des maladies inflammatoires chroniques (psoriasis, arthrite rhumatode,

maladie de Crohn), sa scrtion trop importante est lorigine des processus
pathologiques.

Les anticorps monoclonaux anti-TNF- (chimriques comme linflixmab ou

totalement humains comme ladalimumab) ont t utiliss avec succs dans la gestion
de ces maladies. Cependant, leur utilisation peut saccompagner dinfections graves et
dune incidence plus importante de tuberculose, dtat septique et dinfections
opportunistes (Tabrizi et Roskos, 2007). En effet, linhibition du TNF- diminue entre
autrelactivit des macrophages, ce qui limite, par exemple, le contrle des infections
intracellulaires, comme la tuberculose ou la listriose (Pichler, 2006 ; Tabrizi et
Roskos, 2007 ; Hausmann et al., 2010).

II.A.1.b. Exemple 2 : anticorps monoclonaux anti-intgrine--4

Le natalizumab est un anticorps monoclonal anti-intgrine--4 prescrit lors de rechute
de sclrose en plaques. Lintgrine--4 est une molcule dadhsion forte, permettant
notamment ladhsion des leucocytes la paroi vasculaire avant la diapdse dans les
tissus. Ce traitement augmente le risque de leucoencphalopathies progressives
multifocales suite une infection par un virus opportuniste (le John Cunningham
Virus)(Warnke et al., 2010).

II.A.2. Augmentation de lincidence de certains cancers

II.A.2.a. Traitements anti-rejet et cancers

Lors dune transplantation dorgane, le recours des immunosuppresseurs puissants
est ncessaire pour viter le rejet de lorgane ou la maladie de greffon-vs-hte.

Une analyse de la rpartition des diffrents types de cancers observe aprs une
transplantation dorgane montre que ce sont les cancers induits par les infections

23
virales qui sont les plus frquents (carcinomes cutans et HPV, dsordres
lymphoprolifratifs et EBV, sarcomes de Kaposi et HHV8, hpatocarcinomes et
hpatites B et C) (Vajdic et al., 2006 ; Vajdic et van Leeuwen, 2009).
Grulich et al. (2007) concluent que ce profil de cancers met en avant le rle de
limmunosuppression globale (plus que dune molcule immunosuppressive
particulire) recoupant les donnes montrant que les types de cancers augments aprs
transplantation rnale sont trs proches de ceux dcrits chez les patients infects par le
virus du VIH .
II.A.2.b. Exemple de la ciclosporine A
La ciclosporine A a t largement utilise comme traitement anti-rejet. Elle bloque la
transcription des gnes des cytokines, dont lIL-2 et lIL-4, dans les lymphocytes T
activs.
Des thrapies longues de ciclosporine A chez des transplants rnaux
saccompagnent dune augmentation de lincidence des cancers. La majorit des
cancers observs sont alors des carcinomes cutans (Dantal et al., 1998 ; Jensen et al.,
1999).
De plus, il a t montr que la ciclosporine A induirait la synthse de TGF-,
cytokine favorisant directement la progression des cancers. Le mcanisme de synthse
du TGF- par la ciclosporine serait linhibition de la voie calcineurine/NFAT ou bien
le blocage de la voie de signal des c-Jun N-terminal Kinases (JNKs) et du p38, mais le
mcanisme prcis nest pas connu (Matsuda et Koyasu, 2000).

II.B. Immunostimulation
Limmunostimulation renvoie laugmentation de lactivit de cellules/organes
immunitaires qui rsulte en une amplification des rponses immunitaires (De Jong et
Van Loveren, 2007).
Lorsque limmunostimulation nest pas recherche pour des indications prcises (rle
des adjuvants vaccinaux), elle peut avoir des consquences cliniques indsirables.
Cest le cas par exemple des ractions pseudo-allergiques (ou anaphylactodes).
Lors de telles ractions, on observe une libration des mmes mdiateurs que lors de
ractions immuno-allergiques vraies mais sans stimulation immunitaire spcifique
(Pichler, 2006 ; Pichler et al., 2010 ; Pichler et al., 2011 ; Descotes et al., 2007)

24
Les signes cliniques et leur gravit dpendent de facteurs multiples (mode et
frquence dadministration, prparation, association, maladie auto-immune
concomitante) (Kang et Saif, 2007). Ils peuvent tre systmiques (modrs svres
voire mortels) ou bien locaux (cutans).

Ils sont regroups dans lappellation gnrale de ractions de perfusion , en tant

quils font partie de signes ou symptmes prouvs par le patient pendant la perfusion
du mdicament ou dans la journe suivant ladministration du mdicament.

II.B.1. Exemple de la libration directe non spcifique dhistamine

La libration dhistamine par les mastocytes dans ce cas nest pas dpendante de la
fixation de lantigne aux IgE fixs la surface des mastocytes. Elle repose
probablement sur des mcanismes pharmacologiques (bien souvent mconnus). Le
tableau clinique observ est cependant similaire une rponse anaphylactique
allergique mdie par des IgE :
- rougeurs cutanes, urticaires, rythme, prurit,
- hypotension,
- bronchospasme.
Descoteset al. (2007) citent lexemple de la vancomycine et du syndrome de
lhomme rouge (Sivagnanam et Deleu, 2003)ou des morphinomimtiques
(Descotes, 1992). De mme, les ractions de perfusion observes avec le paclitaxel
seraient des ractions pseudo-allergiques (Kang et Saif, 2007) dont les mcanismes
exacts ne sont pas connus.

25
 II.B.2. Libration de cytokines et dsquilibres immunitaires

Lapparition des molcules biologiques a donn lieu des consquences

pharmacologiques sur le niveau de cytokines (Pichler, 2006) :
- un niveau lev de cytokines, dont la cause peut tre :
- iatrogne, avec une application directe systmique de cytokine, par exemple
avec lINF-,
- une libration de cytokines (modre avec l'OKT3, trs importante avec le
TGN 1412) suite la stimulation spcifique par le mdicament de certains
rcepteurs des cellules T (CD3 pour lOKT3, CD28 pour le TGN1412)
(Pallardy et Hnig, 2010),
- un dsquilibre immunitaire modifiant lquilibre des diffrents types de
rponses immunitaires, par exemple avec letanercept, un rcepteur soluble du
TNF- (Day, 2002).
Les niveaux levs de cytokines peuvent donner lieu des ractions de perfusion
anaphylactodes plus ou moins svres, les mcanismes exacts ne sont pas toujours
connus (Pichler, 2006). Le TGN1412 est un exemple marquant de ractions de
perfusion extrmement svre. Cet anticorps monoclonal est un super agoniste anti-
CD28, destin au traitement de maladies auto-immunes (arthrite rhumatode) ou de
maladies prsentant un nombre de lymphocytes T activs faible (lymphome de
cellules B) (Attarwala, 2010). Lors de la phase clinique I, ladministration du TGN
1412 en perfusion chez six volontaires sains a entrain des maux de tte, des myalgies
lombaires, de lagitation, des troubles digestifs (diarrhe, vomissement), de
lhyperthermie, de lhypotension, une tachycardie, des troubles respiratoires
(tachypne, dtresse respiratoire), des zones de ncrose au niveau des doigts et des
orteils (Suntharalingam et al., 2006).
Les dsquilibres immunitaires peuvent avoir pour consquences notamment des
maladies auto-immunes (Vial et Descotes, 2004). Des cas de lupus rythmateux sont
ainsi rapports avec letanercept (Shakoor et al., 2002 ; Pichler, 2006 ; Hausmann et
al., 2010).

26
III. IMMUNOTOXICITE INDIRECTE : REPONSE DU
SYSTEME IMMUNITAIRE ENVERS LE MEDICAMENT

Limmunotoxicit est dite indirecte lorsquelle est la consquence dune rponse

immunitaire dirige contre le xnobiotique.
Inadquate (auto-immunit, hypersensibilit) ou non dsire (Anti-Drug Antibody),
cette rponse immunitaire peut tre nuisible pour lorganisme.

III.A. Hypersensibilits
La figure 2 rsume les diffrents types dhypersensibilit, leurs mcanismes et les
consquences cliniques possibles.

III.A.1. Hypersensibilit de type I, mdie par les IgE

III.A.1.a. Mcanismes
Les IgE spcifiques produites lors dune premire exposition au mdicament se fixent
sur les mastocytes et les granulocytes basophiles. Lors des administrations suivantes,
la liaison du mdicament aux IgE-mastocytes/basophiles dclenche :
- la dgranulation de ces cellules et la libration des mdiateurs vaso-actifs
prforms dans ces granules (par exemple lhistamine),
- une activation membranaire conduisant, entre autres, par le biais dune
phospholipase A2, la libration dacide arachidonique et de l la
production de prostaglandines et de leucotrines (Descotes, 1992, chap. 5;
Tizard, 2008, chap. 25).
La gravit des effets dpend notamment de la voie dadministration de la molcule
lors des rexpositions : la voie topique est associe aux ractions modres alors que
la voie systmique provoque des ractions svres voire mortelles.
Des ractions mdies par des IgE spcifiques de la molcule (hypersensibilit de
types I) peuvent provoquer (Pichler et al., 2010; Anon., 2010) :
- des ractions de perfusion (signe ou symptme prouv durant la perfusion du
mdicament ou dans les premires 24 heures suivant ladministration, Kang et
Saif, 2007)systmiques (raction anaphylactique),
- des ractions de perfusion locales cutanes.

27
 III.A.1.b. Exemples
Les -lactamines sont les antibiotiques les plus frquemment responsables de
ractions dhypersensibilit de type I, systmiques (choc anaphylactique) ou locales
(rougeurs cutanes) (Descotes, 1992 ; Hattori et al., 1997).
Ces mcanismes sont galement fortement suspects avec loxaliplatin, un agent
cytotoxique utilis dans le traitement des cancers colorectaux. Kang et Saif (2007)
rapportent quaprs plusieurs cycles de traitements, les signes cliniques suivants ont
t observs dans certains cas :
- rougeurs cutanes, urticaires, rythme, prurit,
- hypotension,
- bronchospasme.
Le cas du cetuximab, un anticorps monoclonal chimrique souris-homme, dirig
contre le rcepteur du facteur pidermique de croissance est particulier. LEGFR est
surexprim dans certaines cellules cancreuses. Cette surexpression est associe avec
une croissance tumorale, une infiltration, une angiogense et une mtastatisation.
Ladministration du cetuximab, chez des patients atteints de cancers colorectaux ou
de carcinome pidermode du cou ou de la tte, a engendr des ractions de type
anaphylactiques svres suite la premire administration (Kang et Saif, 2007). En
effet, Chung et al. (2008) ont mis en vidence la pr-existence dIgE diriges contre
le cetuximab, chez la plupart des personnes ayant eu une raction de type
anaphylactique au cetuximab. La raction observe semble donc mdie par des IgE.
Ces IgE prexistants sont en fait dirigs contre le galactose--1,3-galactose. Cet
pitope se retrouve sur les protines de la plupart des mammifres non-primates.
Lpitope se situe dans ce cas sur la partie murine du cetuximab.

III.A.2. Hypersensibilits de type II ou cytotoxique

III.A.2.a. Mcanismes
Les ractions dhypersensibilit de type II, galement appeles hypersensibilit
cytotoxique, aboutissent la destruction de cellules normales par la rponse
immunitaire.
Des anticorps, dirigs contre des molcules de surface de cellules normales, se lient
ces marqueurs et :

28
 - activent le complment provoquant ainsi la lyse de la cellule ;
- entranent des mcanismes de cytotoxicit mdie par des cellules et
dpendantes des anticorps (ADCC).
Par ailleurs, lactivation du complment stimule la production de toxine
anaphylactique, la dgranulation des mastocyes et la libration de cytokines et de
molcules vasoactives, lorigine dun choc circulatoire.
Un mdicament peut dclencher une telle raction. Trois mcanismes sont proposs :
- le mdicament se lie fortement une molcule de surface, celle-ci est alors
reconnue comme trangre lorganisme ;
- le mdicament modifie la membrane cellulaire de telle manire que les
cellules adsorbent les anticorps et sont ensuite limines par les phagocytes ;
- le mdicament se lie directement des anticorps et active le complment. Le
complment activ se lie alors aux cellules voisines et provoquent leur lyse
(Tizard, 2008).
III.A.2.b. Exemples
Les anmies hmolytiques attribues aux pnicillines et leurs drivs, ainsi que les
thrombocytopnies observes avec la quinine reposent sur les mcanismes
dhypersensibilit de type II et plus particulirement sur celui o le mdicament se lie
de faon forte une molcule de surface cellulaire (Tizard, 2008).

III.A.3. Hypersensibilit de type III : dpt dimmun-complexes

III.A.3.a. Mcanismes
Les ractions de type III sont la consquence de dpt dimmun-complexes dans les
tissus. Les immun-complexes lis au complment (C1q) attirent les neutrophiles par
interactions avec le rcepteur Fc. Ces derniers librent alors des enzymes
protolytiques qui entranent des dommages tissulaires.
Lorsquun antigne est administr par voie veineuse un individu immunis, les
immuns-complexes se forment dans la circulation sanguine. Si leur quantit est trop
importante, ils se dposent dans la paroi des vaisseaux sanguins, notamment dans les
artres de taille moyenne ainsi que dans les vaisseaux glomrulaires, synoviaux et
ceux des plexus chorodes.

29
 III.A.3.b. Exemples
Les maladies sriques (vascularite gnralise, avec un rythme, un dme et de
lurticaire cutane) avec le cefaclor (Pichler et al., 2010) ou encore les arthrites avec
tnosynovites, voluant vers la ncrose tissulaire avec lomalizumab (Pilette et al.,
2007) sont les consquences de ractions dhypersensibilit de type III.

III.A.4. Hypersensibilit de type IV ou hypersensibilit retarde,

mdie par les lymphocytes T

III.A.4.a. Mcanismes
Les ractions dhypersensibilit retardes mettent en jeu des mcanismes cellulaires
dans lesquels les lymphocytes T jouent des rles prpondrants (Pichler et al., 2010).
Elles impliquent la reconnaissance spcifique dun antigne par des lymphocytes T.
Ceux-ci sont alors activs, prolifrent et scrtent des cytokines responsables de
laugmentation de la permabilit capillaire, de la vasodilatation et de laccumulation
de macrophages responsables de la destruction de lantigne.
III.A.4.b. Exemples
Ces mcanismes induisent des effets cliniques diffrents, par exemple pour laspirine
(Romano et al., 2011) :
- ruptions maculo-papuleuses,
- dermatites de contact ou de photocontact,
- pneumonie,
- nphrite
Dans le cas des molcules biologiques, ces ractions sont rarement observes (Pichler,
2006) et vont dun prurit gnralis sans exanthme des cas singuliers de ncrolyse
pidermique toxique, comme cela a t observ avec le cetuximab (Lin et al., 2008 ;
Hausmann et al., 2010).

30
III.B. Immunognicit

III.B.1. Dfinition

Limmunognicit est la capacit dune molcule pharmaceutique induire une

rponse immunitaire spcifiquement dirige contre elle (FDA - CDER, 2002).
Les molcules immunognes sont principalement (Tizard, 2008) :
- les molcules protiques trangres dautant plus que leur taille est importante
(> 1kDa),
- les petites molcules chimiques (haptnes) lies de faon covalente une
protine (porteuse) pour former un complexe immunogne.
Cette rponse, majoritairement humorale, donne lieu lapparition danticorps anti-
mdicament (ADA).

III.B.2. Molcules biologiques

III.B.2.a. Facteurs de risque

Un certain nombre de facteurs augmentent le risque dimmunognicit des produits
biologiques (Kromminga et Schellekens, 2005 ; Kessler et al., 2006 ; Wolbink et al.,
2009) :
- facteurs lis au produit :
diffrence structurale entre la protine exogne et la protine
endogne,
agrgation,
dgradation-oxydation, dsamidation, diffrences de glycosylation,
impurets et contaminants,
formulation, stockage, traitement aval.

31
 - facteurs lis lhte :
dose et frquence dadministration : fortes doses ou traitement
prolong,
voie dadministration : sous-cutane et intramusculaire,
comptence immunitaire : maladies concomitantes notamment du rein
et du foie, maladies auto-immunes,
co-mdication,
prdispositions gntiques : allle du CMH, expression de la protine
endogne.
III.B.2.b. Consquences de limmunognicit
Les effets des ADA vont dune absence deffets indsirables apparents des rponses
cliniques dltres varies, plus ou moins graves. Les mcanismes dorigine sont
dcrits ci-dessous et classs en fonction de leffet clinique observ. Mme si dans la
majorit des cas cette immunognicit na pas de consquences cliniques majeures
(par exemple avec le G-SCF et lINF, Wadhwa et al., 2003), dans certains cas elle
peut avoir des rpercussions graves voire ltales (par exemple avec lEPO,
Kromminga et Schellekens, 2005).

> Perte defficacit

La perte defficacit dun mdicament est leffet biologique le plus communment

rencontr. Elle peut sexpliquer par deux mcanismes :
- une limination augmente de la molcule lorsquelle forme un complexe-
immun avec lADA, ce dernier est alors appel clearing ADA (Rojas et
al., 2005 ; Ponce et al., 2009),
- une neutralisation de lactivit biologique de la molcule par des ADA se
fixant soit (Gupta et al., 2007) :
- sur le site actif de la molcule,
- proximit du site actif, entranant un encombrement strique du site
actif.
La neutralisation du mdicament par les ADA explique, par exemple, la perte
defficacit observe avec lINF-, lINF- et le facteur VIII (Wadhwa et al., 2003 ;
Kromminga et Schellekens, 2005 ; Kessler et al., 2006; Ponce et al., 2009).

32
 > Raction croise avec une molcule endogne

Les ADA peuvent galement ragir de faon croise avec la protine quivalente
endogne et neutraliser son activit. Dans ce cas les effets observs sont trs varis et
dpendent du rle biologique et de lexpression de la protine cible, par exemple
(Wadhwa et al., 2003; Kromminga et Schellekens, 2005) :
- thrombocytopnie svre de volontaires sains et dindividus malades (cancers)
aprs administration du MDGF (facteur de croissance et de diffrenciation des
mgacaryocytes), une protine analogue de la thrombopotine qui stimule la
diffrenciation des mgacaryocytes en plaquettes,
- recrudescence des cas drythroblastopnie entre 1998 et 2003 avec lEPO
chez des patients atteints dinsuffisance rnale chronique, suite un
changement de formulation du mdicament.

La figure 3 rcapitule les diffrents effets indsirables rencontrs dans le cas des
molcules biologiques.

33
Figure 2 : Rcapitulatif des diffrents types de ractions allergiques (d'aprs Pichler et al., 2010)

34
Figure 3 : Rcapitulatif des effets indsirables des molcules biologiques (d'aprsHausmann et al., 2010)

35
36
 DEUXIME PARTIE : PROPOSITION DE STRATGIE
ET TECHNIQUES DANALYSE COURANTES EN
IMMUNOTOXICOLOGIE PRCLINIQUE

Comme la mis en vidence la partie 1, limmunotoxicit dun mdicament relve de

mcanismes diffrents, dont les consquences cliniques sont extrmement varies.
Lobjectif de cette 2me partie est de proposer une dmarche en immunotoxicologie
prclinique et de prsenter les techniques danalyse frquemment utilises.

Laspect rglementaire sera pris en compte pour chaque phase.

Pour des raisons pratiques, les stratgies et les techniques de prdiction de

limmunognicit dune molcule biologique sont traites sparment, dans le
paragraphe IV.

I. PREDICTION DE LIMMUNOTOXICITE DIRECTE DUNE

MOLECULE PHARMACEUTIQUE CHIMIQUE ET
EVALUATION DE SON RISQUE

I.A. Rglementation
Daprs la lgislation europenne, limmunotoxicit directe (cf. dfinition Partie 1, II)
doit tre value pour toutes les molcules chimiques (Anon., 2000).

Daprs la lgislation amricaine, cest limmunosuppression qui doit tre value

pour chaque nouveau mdicament non biologique (FDA - CDER, 2002), car elle
considre que limmunostimulation reste assez rare.

Enfin, pour la lgislation internationale harmonise, toutes les nouvelles molcules

pharmaceutiques (non biologiques) doivent tre values pour leur potentiel
produire une immunotoxicit indirecte (ICH, 2005).

Les rsultats doivent tre intgrs dans le plan gnral dvaluation du risque toxique
de la molcule.

37
I.B. Prsentation gnrale de la stratgie tage
La mthode la plus couramment rencontre dans la littrature et conseille par la
rglementation (Anon., 2000 ; FDA - CDER, 2002 ; ICH, 2005) est une approche
tage ( Tiered approach ).

Le premier palier (Tier 1) consiste analyser les facteurs de risque lis la molcule
et dtecter des marqueurs dimmunotoxicit dans les tudes de toxicologie gnrale.

La seconde tape (Tier 2) a pour but de confirmer et, dans la mesure du possible, de
caractriser (mcanismes) le pouvoir immunotoxique de la molcule.

I.C. Etape 1( Tier 1 ) : analyse des facteurs de risque et dtection

dun pouvoir immunotoxique

I.C.1. Etude des facteurs de risque

La rglementation dfinit trois facteurs de risque dimmunotoxicit, lis la

molcule, au schma thrapeutique et la population cible. Certaines de ces
informations sont tires des tudes de pharmacologie non clinique.

I.C.1.a. Structure et pharmacologie de la molcule

Les points suivants concernant la structure et la pharmacologie de la molcule sont

des facteurs de risque (ICH, 2005 ; FDA - CDER, 2002) :

- la similarit structurale du mdicament en dveloppement avec une molcule

connue pour ses effets immunotoxiques,
- les proprits pharmacologiques du mdicament mettent en vidence une
action sur le systme immunitaire,
- laccumulation non attendue de la molcule en dveloppement dans des
tissus/cellules immunitaires,
- la mise en vidence deffets immunotoxiques en phase de dveloppement
clinique ou lors dutilisation clinique (ce cas concerne des mdicaments
possdant dj une AMM pour une certaine indication et qui serait nouveau
en dveloppement prclinique pour une autre indication).

38
 I.C.1.b. Schma thrapeutique

Les paramtres prendre en compte sont la dure de traitement, la dose applique et

la frquence dadministration.
Les situations risque immunotoxique sont les traitements de longue dure, les fortes
doses et les administrations frquentes.

I.C.1.c. Population cible

Les populations ncessitant une rflexion approfondie sur la conduite de tests

additionnels dimmunotoxicologie sont :

- les personnes avec un statut immunitaire compromis par une maladie ou un

traitement concomitant (ICH, 2005 ; FDA - CDER, 2002),
- les femmes enceintes (FDA CDER, 2002).

Par exemple, un mdicament destin des personnes infectes par le Virus de

lImmunodficience Humaine devra ncessairement faire lobjet de tests additionnels
(FDA-CDER, 2002).
Ou encore, pour un mdicament pouvant tre utilis par des femmes enceintes et dont
limmunotoxicit sur des adultes a t mise en vidence, des tests
dimmunotoxicologie dveloppementale sur la gnration F1 devront tre conduits
(dans lidal : anatomo-histopathologie des organes lymphodes et hmatologie)
(FDA - CDER, 2002 ; Kushima et al., 2007).

I.C.2. Dtection de limmunotoxicit dans les tudes de

toxicologie gnrale

I.C.2.a. Marqueurs de limmunotoxicit

Lintgration en toxicologie gnrale de critres immunologiques spcifiques dans la

lecture des rsultats danatomopathologie, dhistopathologie approfondie,
dhmatologie et de biochimie est la premire tape pour dtecter un ventuel pouvoir
immunotoxique direct (immunosuppression ou immunostimulation).

Les rsultats suggrant une immunotoxicit sont (ICH, 2005 ; FDA - CDER, 2002) :
39
 - des changements hmatologiques,
- une altration du poids et/ou de lhistologie dun organe du systme
immunitaire,
- un changement dans les globulines sriques sans cause hpatique ou rnale,
- une augmentation de lincidence des infections (notamment avec des
pathognes faibles),
- une augmentation de lincidence des tumeurs sans cause gnotoxique connue
(hormonale ou autres mcanismes).

I.C.2.b. Interprtation des rsultats

> Critres

Linterprtation des rsultats des tudes de toxicologie gnrale devra prendre en

compte les critres suivants (Basketter et al., 1995 ; FDA - CDER, 2002 ; ICH, 2005)
:

- la qualit et la quantit des changements observs,

- la prsence et la svrit des autres formes de toxicit qui pourraient rendre
insignifiant tout changement observ dans les tissus du systme immunitaire,
- la dure du traitement,
- les doses auxquelles se sont manifests ces effets,
- le nombre despces testes et les paramtres affects,
- la rversibilit des effets.

Il est important galement de tenir compte du fait quun changement statistique

significatif dans les paramtres mesurs nindique pas ncessairement un effet
significatif biologique (FDA - CDER, 2002).

> Rle du stress

Le stress est un facteur prendre en compte dans linterprtation des rsultats lors
dimmunosuppression (ICH, 2005 ; FDA - CDER, 2002). Il est possible dvaluer la
part du stress dans les rsultats observs. Par exemple, en mesurant le niveau des
hormones du stress (corticodes) et en les comparant avec lexposition au
mdicament. Gnralement les effets dus au stress sont rversibles et ne sont pas
dose-dpendants. Dans certains cas, le stress peut justifier de ne pas passer ltape 2.
40
 I.C.3. Techniques principales dvaluation des marqueurs de
limmunotoxicit directe en toxicologie gnrale

I.C.3.a. Anatomopathologie

Lanatomo-pathologie est une tape majeure dans les tudes de toxicologie gnrale.
Certains paramtres peuvent permettre de dtecter et/ou caractriser des effets
immunotoxiques du mdicament.

> Paramtres valus et techniques

Lors de lautopsie, il convient dtre attentif dventuels signes dinfection, la

prsence de tumeurs, des modifications de formes ou daspect des organes ou tissus
lymphodes.
Ces observations bien quimportantes restent dpendantes des comptences du
manipulateur.

Une technique objective pour apprcier une modification des organes lymphodes est
leur pese. Il convient de leffectuer pour les organes suivants (Anon., 1998 ; Kuper et
al., 2000) :

- le thymus,
- la rate,
- les nuds lymphatiques drainant la zone dapplication du mdicament (Tilney,
1971).

Les rsultats des groupes traits sont compars ceux du groupe tmoin.

> Limites

o Diffrence de sensibilit des organes lymphodes

Les organes lymphodes ont une sensibilit diffrente aux agressions toxiques. En
gnral, le thymus est plus sensible que la rate. Par exemple, dans ltude 28 jours rat
de Basketter et al.(1995), les variations de poids du thymus sont observes des doses
plus faibles que pour la rate.

41
o Limite de sensibilit de lanatomopathologie
Les rsultats danatomo-pathologie peuvent dans certains cas ne pas tre modifis par
des molcules immunotoxiques. Cest le cas avec la ciclosporine A, cet
immunosuppresseur puissant reconnu chez lHomme et lanimal. On nobserve pas
deffets significatifs sur le poids du thymus et de la rate dans des tudes 28 jours chez
le rat (Anon., 1998). Pourtant, la ciclosporine A affecte la mdulla du thymus
(dpltion des cellules interdigites) (Kuper et al., 2000).

o Biais physiologiques
Les variations de poids non spcifiques dorigine physiologique concernent
essentiellement le thymus :

- diminution avec lge,

- augmentation avec lembonpoint,
- variations interindividuelles importantes chez les non-rongeurs (espces peu
consanguines) selon le sexe et/ou llevage dorigine (Haley et al., 2005).

Gnralement, pour limiter le biais d ltat dengraissement, on ne compare pas les

poids dorgane, mais les rapports poids dorgane/poids de lanimal.

o Biais techniques
Laspect technique est galement trs important considrer en anatomo-pathologie.
Le prlvement du thymus et des nuds lymphatiques est techniquement difficile, du
fait de la difficult disoler ces organes des tissus adjacents.
Dans le cas du thymus, sa taille physiologique (dautant plus petite que lanimal est
g et/ou immunodprim/dficient), rend sa visualisation ardue. Le prlvement, le
parage et la pese sont alors des facteurs importants de variabilit (Ladics et al., 1995
; Kuper, 2006).
Dans le cas des nuds lymphatiques, ce sont notamment les nuds lymphatiques
msentriques qui posent problme. Haley et al. (2005) considrent alors, que
laltration du poids du thymus et de la rate sont des indicateurs sensibles et plus
fiables, que des changements de poids des nuds lymphatiques. De mme, pour
lICH (2005), la pese des nuds lymphatiques est optionnelle.
Enfin, la technique deuthanasie et dexsanguination de lanimal, influent sur le poids
de la rate (Basketter et al., 1995 ; Haley et al., 2005). Cest pourquoi pour minimiser

42
ces variations, lICH (2005) recommande de saigner compltement lanimal, dans le
cas du Chien et du Singe.

I.C.3.b. Histopathologie approfondie des organes lymphodes

Lhistopathologie approfondie est une technique complmentaire systmatiquement

couple lanatomo-pathologie des organes et tissus lymphodes. Elle est clairement
prsente comme une des tapes ncessaire et cruciale dans lvaluation de
limmunotoxicit directe des nouvelles molcules pharmaceutiques (Haley et al.,
2005 ; FDA - CDER, 2002 ; ICH, 2005).

> Paramtres valus

Son objectif est de mettre en vidence une modification qualitative et quantitative des
types cellulaires observs dans les organes et tissus lymphodes.

Le pathologiste observe compartiment par compartiment (ICH, 2005) :

- le thymus,
- la rate,
- le nud lymphatique drainant la zone dapplication,
- au moins un nud lymphatique additionnel,

les structures lymphodes associes aux muqueuses de la voie dadministration (

- Tableau 4),
- la moelle osseuse.

Il caractrise de faon semi-quantitative les changements observs dans chaque

compartiment (Tableau 5).

43
Les changements histopathologiques peuvent tre gradus de la faon suivante en
rfrence au groupe de contrle (Anon., 1998) :
- grade 1 : normal,
- grade 2 : normal 25% de diffrences par rapport la normale (augmentation
ou diminution),
- grade 3 : 25-50 % de diffrences par rapport la normale (augmentation ou
diminution),
- grade 4 : > 50 % de diffrences par rapport la normale (augmentation ou
diminution).

Tableau 4 : Tissus lymphodes associs aux muqueuses prlever en fonction de la

voie d'administration du mdicament (ICH, 2005 ; Elmore, 2006)

Voie dadministration du mdicament Tissus lymphodes associs aux

muqueuses prlever
Orale Plaques de Peyer
Intranasale Tissu lymphode associ aux bronches
(BALT) et tissu lymphode associ la
muqueuse nasale (NALT)

44
Tableau 5: Listes des compartiments observer pour chaque organe lymphode et des
modifications semi-quantitatives pouvant tre associes aux lsions des tissus lymphodes
(d'aprs Haley et al., 2005)

Organes lymphodes Compartiments Observations semi-quantitatives

Cortex
THYMUS
Mdullaire
Pulpe blanche
Manchons priartriels Ratio cortex/mdulla pour le thymus
Follicules lymphodes Lymphocytes : augments/diminus
RATE Granulocytes : augments/diminus
Centres germinaux
Zone marginale Mastocytes : augments/diminus
Mgacaryocytes : augments/diminus
Pulpe rouge
Macrophages avec des corps
Cortex intracellulaires visibles
Sinus subscapulaires Macrophages pigments
Follicules Macrophages vaculoliss
Centres germinaux Plamsocytes : augments/diminus
NUDS Veinules endothliales Ncrose graisseuse
LYMPHATIQUES hautes Inflammation ; prciser quel type
Paracortex (granulomateuse)
Mdullaire Erythrocytose sinusales ; dsigner le
sinus concern
Cordons mdullaires
Hmorragie
Sinus mdullaires Cellules ncrotiques ; dsigner le type
Composante rythrocytaire cellulaire si possible
Composante Infarctus
granulocytaire Composante rythrocytaire :
Graisse augmente/diminue
MOELLE OSSEUSE
Composante lymphode Composante granulocytaire :
Stroma augmente/diminue
Mgacaryocytes
Autres cellules
TISSUS LYMPHODES Follicules
ASSOCIES AUX
MUQUEUSES (Elmore, Zone Interfolliculaire
2006)

45
 > Technique

Aprs leur prlvement, les organes lymphodes sont fixs entiers dans le formol
(solution neutre aqueuse, tamponne au phosphate 4%). Des chantillons sont
ensuite prlevs pour tre inclus dans la paraffine afin de raliser des coupes (5m
dpaisseur). Les coupes sont ensuite colores lhmatoxyline-osine (Anon., 1998).
Elmore (2006) donne la localisation des diffrents tissus lymphodes associs aux
muqueuses et propose des techniques de prlvement.

> Limites

Pour Germolec (2004), la prcision des donnes dhistopathologie pour dtecter des
composs immunotoxiques diminue alors que le niveau de rigueur de lanalyse
augmente. En effet, si les changements histopathologiques sont considrs in toto
(c'est--dire toute anormalit observe dans le thymus, la rate, les nuds
lymphatiques), le niveau de prcision est de 80%. En revanche, si lon ne tient compte
que dun organe, la prcision tombe 60%.

Par ailleurs, il faut noter que pour Harleman (2000), lobservation de lsions
histopathologiques reste relativement rare.

> Diffrences de sensibilit des organes lymphodes

Comme pour lanatomo-pathologie, la sensibilit est variable selon les organes.

Ainsi, le thymus, et notamment son cortex, est le premier montrer des altrations
(Germolec et al., 2004 ; ICH, 2005 ; Haley et al., 2005 ; Kuper, 2006).

La densit cellulaire et le dveloppement des centres germinatifs dans les zones

folliculaires de la rate et des nuds lymphatiques, sont galement prsents comme
des paramtres sensibles (Haley et al., 2005 ; Kuper, 2006).

o Biais techniques
Les procds techniques (prlvement, prparation des lames) sont une des limites
principale de lanatomo-histopathologie approfondie en immunotoxicologie.
En effet, les changements peuvent tre trs locaux dans lorgane et un choix inadquat
de la zone prlever pourrait ne pas les mettre en vidence (Kuper, 2006). Par
exemple le manque deffets rapports sur les plaques de Peyer peut tre d au mode
46
de slection des plaques pour lexamen microscopique. Ainsi lazathioprine diminue
le nombre de plaques de Peyer macroscopiquement visibles. Seules celles visibles
sont prleves et elles prsentent une structure normale.
Dans la mme ide, la variabilit engendre par les procds techniques, est plus
marque pour les petits nuds lymphatiques et les nuds lymphatiques ne drainant
pas le site dapplication. Cest encore une raison pour laquelle, Haley et al. (2005)
ainsi que l'ICH (2005) conseillent de ne pas les prlever.

o Interprtation
La complexit de la rponse du systme immunitaire donne lieu, des difficults
dinterprtation (Kuper, 2006).
- Tout dabord, le dynamisme du systme immunitaire peut impliquer des
changements sans pour autant quils soient quantitatifs ou quils expliquent
des effets indsirables. Ce peut tre le cas dans des situations de stress.
Cependant, les relations complexes entre le systme neuro-endocrinien et le
systme immunitaire ne sont pas clairement comprises.
- Dautre part, pour certains mdicaments, il existe le phnomne dhormse :
les effets observs faible dose sont loppos de ceux observs forte dose,
sans pour autant tre bnfiques. Par exemple, pour la ciclosporine A ou
lazathioprine, leffet observ aux faibles doses est immunostimulant, alors
quau fortes doses il est immunosuppresseur
- La corrlation entre les effets observs sur certains organes lymphodes
(suppression/involution ou stimulation/expansion) et leffet global sur le
systme immunitaire (immunosuppression, immunostimulation) nest pas
ncessairement celle attendue. Par exemple, des ractions allergiques ou
dauto-immunit ont t associes avec des lsions en hyper (hyperplasie
folliculaire thymique et hyperplasie lymphode dans les nuds lymphatiques
et la rate) mais aussi dans certains cas avec des ractions en hypo (atrophie
du thymus, dfauts pithliaux thymiques, lymphopnie sanguine).
- Une altration proportionnelle des diffrents types cellulaires peut galement
rendre difficile lanalyse des donnes (Basketter et al., 1995).

47
 I.C.3.c. Hmatologie

> Paramtres valus

Les paramtres hmatologiques prendre en compte lors de lvaluation du potentiel

immunotoxique dune molcule sont similaires ceux demands lors dune tude de
toxicit classiques (OECD, 1995). Ils sont prsents dans le Tableau 6.
Lobjectif est de mettre en vidence une diffrence statistiquement significative
(augmentation ou diminution) dun des paramtres dhmatologie en comparaison
avec le groupe tmoin. On sintresse principalement aux leucocytes, granulocytes et
lymphocytes (ICH, 2005).
Anon. (1998) montre dans une tude de validation avec lazathioprine et la
ciclosporine A (deux immunosuppresseurs reconnus chez lHomme et lanimal), une
diminution de la numration leucocytaire sanguine totale, avec un effet dose,
sexpliquant dans les deux cas, par une diminution marque du nombre de
lymphocytes. Dans le cas de la ciclosporine A, leffet sur le nombre de lymphocytes
est plus sensible que leffet sur la numration leucocytaire totale, puique la
ciclosporine nimpacte quune sous-population de lymphocytes dj peu nombreux
dans la formule sanguine. Cette observation justifie donc, limportance du comptage
diffrentiel des globules blancs sanguins en immunotoxicologie.

> Techniques

Il est ncessaire de prlever du sang (veineux ou artriel) sur anticoagulant.

Le sang peut-tre prlev sur EDTA (De Jong et al., 1999) ou bien citrate de sodium
3.2% (Munson et al., 1982).
La numration cellulaire seffectue au moyen dun analyseur hmatologique (De Jong
et al., 1999 ; Smith et al., 2003 ; Ulrich et al., 2004) ou dun compteur Coulter
(Munson et al., 1982). Et peut tre confirme, pour la formule leucocytaire, par un
frottis sanguin soit en fonction des rsultats obtenus avec lanalyseur (De Jong et al.,
1999) soit de faon systmatique (Smith et al., 2003).

48
Tableau 6 : Paramtres hmatologiques dune tude de toxicit gnrale (daprs
OECD, 1995)

Numration leucocytaire totale

Numration rythrocytaire
Hmoglobine
Hmatocrite
Volume corpusculaire moyen
Hmoglobine corpusculaire moyenne
Concentration dhmoglobine corpusculaire moyenne
Numration des plaquettes
Numration des rticulocytes (pourcentage et absolue)
Formule leucocytaire (pourcentage et absolue)
Neutrophile
Lymphocyte
Monocyte
Eosinophile
Basophile

> Limites

Linconvnient majeur de lhmatologie pour dtecter une immunotoxicit est quelle

reste une mthode peu sensible mme en association avec lhistopathologie (Vos et
Van Loveren, 1998).
De plus, des variations importantes des paramtres peuvent tre observes en fonction
de lge, du sexe, de llevage et du statut sanitaire des animaux (Basketter et al.,
1995).

I.C.3.d. Biochimie

> Paramtres valus et techniques

Lobjectif est davoir une ide du niveau dimmunoglobulines dans le srum en

valuant la quantit de globulines sriques.

49
Cette mthode indirecte consiste mesurer les protines totales sriques dune part et
lalbumine srique dautre part et den dduire le rapport albumine/globuline (=
protines totales- albumine).
La mesure de ce paramtre peut permettre, selon Harleman (2000), daugmenter la
sensibilit de lanatomo-histopathologie pour dtecter des substances
immunotoxiques.

> Limite

Cette technique reste relativement imprcise, mais du fait de sa simplicit de

ralisation, est effectue en routine.

I.C.4. Techniques complmentaires dvaluation des marqueurs

de limmunotoxicit en toxicologie gnrale

Dans certains cas, les rsultats des tudes de toxicologie gnrale ont besoin dtre
prciss ou approfondis avant de poursuivre ou non la dmarche dvaluation dun
risque immunotoxique.

Ce peut tre le cas pour des donnes anormales en hmatologie ou en histopathologie.

Il peut alors tre intressant de raliser :

- une analyse cytologique de la moelle osseuse,

- une analyse immunophnotypique de coupes histologiques ou de leucocytes
sanguins.

Dans le cas o le niveau de globulines serait anormal, il est recommand de mesurer

directement les immunoglobulines sanguines (ICH, 2005).

I.C.4.a. Cytologie de la moelle osseuse

> Paramtres valus

Lobjectif de cette valuation est de mettre en vidence une altration (diminution ou

augmentation) de la concentration de cellules nucles de la moelle osseuse (nombre
de cellules/mL).

50
Pour Haley et al. (2005) cette valuation est recommande lorsque des changements
sont observs en hmatologie ou en histopathologie de la moelle osseuse. Ou bien sil
y a ncessit de diffrencier les lments lymphodes, mylodes et rythrocytaires,
qui peuvent tre difficiles distinguer en coloration H&E.
Lestimation des diffrents types cellulaires est conseille de faon systmatique pour
De Waal et al.(1995), alors que De Jong et al.(1999) ne leffectuent que sil existe une
variation de la concentration de cellules nucles entre le lot test et le lot tmoin.

> Techniques

Lvaluation de la concentration en cellules nucles de la moelle osseuse repose sur

un comptage cellulaire, de la suspension de cellules obtenue, par rinage sous
pression ( flush ), de la moelle fmorale juste aprs lexsanguination de lanimal
(afin dviter la coagulation). Cette numration peut seffectuer laide dun
compteur Coulter (De Waal et al., 1995 ; De Jong et al., 1999).
Deux techniques diffrentes sont cites pour valuer la distribution cellulaire des
cellules nucles de la moelle osseuse :
- un comptage cellulaire diffrentiel visuel dans des prparations obtenues par
cytocentrifugation, colores au May-Grunvald-Giemsa (De Waal et al., 1995).
- un comptage cellulaire diffrentiel automatis, par cytomtrie en flux. Cette
mthode repose sur des techniques dimmunophnotypage de surface, des
cellules des sous-ensembles cellulaires de la moelle osseuse (Burchiel et al.,
1999).

> Limites

Lvaluation de la moelle osseuse ne permet pas de dtecter toute les molcules

immunotoxiques. Cela dpend du mode daction de la molcule. Ainsi, De Waal et al.
(1995) montrent une diminution significative de la concentration cellulaire de la
moelle osseuse de rat aux fortes doses dazathioprine. Ou encore, De Jong et al.
(1999) trouvent une diminution significative de la concentration cellulaire de la
moelle osseuse de rat aux fortes doses de Benzo[a]pyrne administres par voie orale.
En revanche, aucune altration significative nest note pour la ciclosporine A mme
aux fortes doses, compte- tenu de son mode daction (De Waal et al., 1995).

51
Il est important de noter galement, que la prcision de la cytologie de la moelle
osseuse pour dterminer les pourcentages des diffrents types cellulaires de la moelle
osseuse est limite (Haley et al. 2005).

I.C.4.b. Immunophnotypage

Le phnotypage cellulaire permet de mieux caractriser qualitativement et

quantitativement les changements observs en histopathologie et en hmatologie
(Kuper et al., 2000 ; ICH, 2005 ; De Jong et Van Loveren, 2007).

Il peut tre ralis durant les tudes de toxicit gnrale (ICH, 2005).

Cette technique peut permettre galement didentifier des biomarqueurs pour

surveiller les tudes cliniques.

> Paramtres valus

Lobjectif du phnotypage cellulaire est qualitatif et quantitatif.

Le phnotypage consiste marquer avec diffrents outils molculaires des rcepteurs
cellulaires de certaines populations cellulaires dintrt afin :
- de mettre en vidence et de donner une valuation semi-quantitative des types
cellulaires recherchs dans un tissu ou un organe (technique
dimmunohistochimie) ;
- de discriminer et de quantifier prcisment dans une suspension de cellules
isoles les diffrents types cellulaires recherchs (technique de la cytomtrie
en flux).

> Techniques

o Immunohistochimie
Cette technique se ralise sur des coupes dorganes ou tissus lymphodes.

Elle consiste utiliser des anticorps, dirigs contre lantigne spcifique (par exemple
un CD) dune population cellulaire, conjugu une enzyme (la peroxidase du raifort
par exemple). Aprs une priode dincubation entre ces anticorps et le tissu dintrt,
sensuit une phase de lavage. Puis le substrat de lenzyme est ajout et alors les zones
dans lesquelles se trouvent les cellules dintrt sont colores.

52
Ward et al. (2006) proposent un protocole dtaill de marquage dun antigne chez la
souris ainsi quune liste, non exhaustive, danticorps disponibles dans le commerce
pour la Souris et le Rat.
La technique peut seffectuer sur des lames fixes dans le formol et incluses dans la
paraffine, aprs un dparaffinage pralable des lames (Randall et Pearse, 2008). Dans
certains cas elle est aussi ralisable sur des sections congeles (Ward et al., 2006).
Cependant, lors de la fixation, des liaisons covalentes entre le fixateur (formol) et
lantigne dintrt stablissent pouvant empcher lanticorps conjugu de se lier sa
cible.
Cest pourquoi, des techniques de dmasquage de lantigne doivent tre effectues
avant la phase dincubation avec les anticorps conjugus. Les deux techniques
principales de dmasquage de lpitope sont (Ward et al., 2006) :
- la technique enzymatique, qui consiste en une rupture des liaisons covalentes
par une protase ;
- la technique par chauffage, dont le mcanisme est inconnu, mais qui aboutit
une destruction des liaisons entre lpitope et le fixateur.
Les changements de lexpression des antignes dans les tissus lymphodes peuvent
tre classs de la manire suivante (Ward et al., 2006) :
1) changements dans la structure anatomique et dans le mode dexpression
normal de lantigne,
2) changements dans le type cellulaire exprimant lantigne,
3) perte de lantigne dans les tissus ou les cellules,
4) augmentation de lantigne dans les tissus ou les cellules,
5) expression de lantigne dans des cellules infiltrantes (inflammatoire, etc).
Les changements immunohistochimiques peuvent reflter des changements tissulaires
aigus, subaigus ou chroniques. Par exemple une diminution, aige ou chronique, du
nombre de cellules peut tre vue par une perte de cellules exprimant les antignes
donns dans un tissu spcifique ou dans une structure particulire dun organe.

o Cytomtrie en flux
Cette technique peut seffectuer sur des suspensions cellulaires obtenues partir de la
rate, du thymus, de nuds lymphatiques, du sang total et/ou de moelle osseuse.
Elle sappuie sur le principe dimmunofluorescence directe : les anticorps spcifiques
de la cible sont conjugus de faon chimique avec des marqueurs fluorescents (par
53
exemple la fluorescine isothiocyanate, FITC ; la phycorythrine, PE). Irradis avec
un certain spectre, ces marqueurs rmettent une couleur qui peut tre lue par le
cytomtre en flux. La combinaison de diffrents marqueurs fluorescents avec des
anticorps dirigs contre des pitopes distincts permet didentifier plusieurs marqueurs
de surface cellulaire la fois.
La combinaison de plusieurs marqueurs de surface permet de dfinir une sous-
population lymphocytaire. Smith et al. (2003) colorent ainsi des suspensions de
cellules isoles (sang, rate et thymus) avec des combinaisons danticorps et trois
marqueurs fluorescents (

Tableau 7).

De nombreux anticorps conjugus des marqueurs fluorescents sont disponibles dans

le commerce (exemple pour le Rat, Morris et Komocsar, 1997 ; Ward et al., 2006).
Un tableau donnant les quivalents des CD entre lHomme, le rat et la souris (Ward et
al., 1993) et des protocoles dtaills danalyse du phnotypage par cytomtrie en flux
sont galement disponibles (Morris et Komocsar, 1997 ; Smith et al., 2003 ; Ulrich et
al., 2004 ; Kushima et al., 2007).

54
Tableau 7 : Exemple de marquage phnotypique de sous-ensembles lymphocytaires
chez le rat (daprs Smith et al., 2003)

Panel danticorps Sous-ensemble cellulaire

mis en vidence
CD3-FITC/IgG1-PE*/CD45- Cocktail danticorps
CyChrome contenant un contrle
isotypique marqu*
CD3-FITC/CD4-PE/CD45- Lymphocytes T Helper
CyChrome

CD3-FITC/CD8-PE/CD45- Lymphocytes T cytotoxiques

CyChrome

CD3-FITC/CD45R- Lymphocytes B
PE/CD45-CyChrome
*
Les contrles isotypiques sont utiliss pour la confirmation
des ractions non spcifiques et le tri de rgion positive

Les grandes tapes de cette technique sont :

- le prlvement de sang (sur anticoagulant) ou dorgane (thymus, rate) ;
- la prparation de suspension de cellules isoles (FDA - CDER, 2002 ; Lee et
al., 2004) ;
- lvaluation de la viabilit des cellules ;
- le marquage avec les anticorps ;
- lanalyse par cytomtrie en flux dans les 72h suivant le marquage.
Les rsultats sont donns en numration absolue et relative.

> Limites

o Comptences techniques
Quelque soit le domaine pr-clinique dans lequel sont pratiques ces techniques,
limmunohistochimie relve des comptences dun anatomo-pathologiste vtrinaire
et la cytomtrie en flux ncessite une personne forme lutilisation de lappareil et
au traitement des donnes.
55
o Interprtation des rsultats : corrlation entre la dose et leffet observ
Limmunophnotypage en immunotoxicologie ne permet dtablir des changements
dose-dpendants des marqueurs, quavec des doses suffisamment leves. A ce jour, il
nexiste pas de bases de donnes de classement par gravit et dinterprtation des
changements significatifs observs. Cest pourquoi, on ne peut pas sappuyer sur cette
mthode pour dterminer une dose sans effets indsirables observables. Exception
faite pour les molcules dont la cible est une sous-population cellulaire du systme
immunitaire.

o Prdiction du pouvoir immunotoxique

Les variations dans le phnotypage immunitaire des cellules, dtermine par
cytomtrie en flux sont concordantes dans 64% (Anon., 2001) 83% (Luster et al.,
1992) des cas avec la classification des molcules immunotoxiques. Ceci peut
sexpliquer en partie du fait que le nombre de molcules testes dans ces tudes reste
petit ( 59 molcules), que les doses employes sont leves et que le nombre de
marqueurs phnotypiques restreints.
La corrlation entre le phnotypage et les effets immunotoxiques est valide
essentiellement pour la rate. Les donnes disponibles sur les effets de molcules
immunotoxiques sur les leucocytes circulants sont elles, plus limites et ne permettent
pas dtablir une corrlation avec les rsultats obtenus pour la rate.

Anon. (2001) conseille dexaminer les donnes de phnotypage au cas par cas,
notamment dans lextrapolation des rsultats de lanimal lHomme. Pour ce faire, il
est important davoir une bonne comprhension de la signification biologique des
diffrents marqueurs (phnotypiques, dactivation ) et des consquences
(immunologiques et sur la sant) lors de modifications de ces marqueurs, pour les
diffrents espces animales de laboratoire.

En labsence de modifications dans les autres tests dvaluation du systme

immunitaire, les changements phnotypiques observs dans les tudes chez lanimal
sont eux seuls insuffisamment valids pour tre utiliss dans lvaluation du risque
immunotoxique chez lHomme.
Pour la rglementation (FDA - CDER, 2002), lanalyse des rsultats
dimmunophnotypage eux seuls ne permettent pas de conclure sur leffet toxique
56
observ. En effet, les rsultats rendent compte (au moment du prlvement) de la
composition cellulaire de lorgane ou du tissu prlev et ne mesure pas sa
fonctionnalit immunitaire. Il est ncessaire en complment dajouter un test
me
fonctionnel (cf. 2 Partie, I.D).

I.C.4.c. Dosage des immunoglobulines sriques

Ce dosage, du fait de sa facilit de ralisation, est fortement encourag en cas

danomalie du niveau de globulines sans altration hpatique ou rnale sous-jacente.

> Paramtres valus

Lobjectif est de mesurer de faon spcifique le niveau dimmunoglobulines total ou

par isotype (IgG, IgM, IgA, IgE) dans le srum. Ce niveau permettra de donner un
reflet global de la rponse immunitaire mdiation humorale.

La mesure de ce paramtre peut permettre, selon Harleman (2000), daugmenter la

sensibilit de lanatomo-histopathologie pour dtecter des substances
immunotoxiques.

Ainsi, daprs ltude BGA 1989, Vohr (2005) rapporte une altration du niveau des
Ig G et M aux fortes doses de ciclosporine A et une altration du niveau dIg A pour
les doses moyennes de ciclosporine A.

> Techniques

Le srum est obtenu par centrifugation du sang sur un tube sec et stock -80C.
Diffrentes techniques peuvent tre utilises pour mesurer la quantit
dimmunoglobulines sriques.

o Technique immunoenzymatique : ELISA

LELISA sandwich (Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay) est la mthode la plus
souvent cite dans la littrature.
Le principe gnral est la fixation des immunoglobulines recherches au fond des
puits de polystyrne par lintermdiaire dun anticorps spcifique. La prsence de cet
immunoglobuline est ensuite dtecte par lajout dun second anticorps anti-
immunoglobuline conjugu une enzyme (le plus souvent la peroxydase du raifort).
Laddition du substrat de lenzyme (o-phnylenediamine pour la peroxydase du
57
raifort) provoque un changement de couleur proportionnel la quantit danticorps
anti-immunoglobuline lis aux immunoglobulines. Le changement de couleur est
mesur par spectrophotomtrie et les rsultats sont exprims en pourcentages des
srums de contrle ou de srums standards(Vos et al., 1982 ; De Waal et al., 1995 ;
Vohr, 2005).
Cette technique permet de dtecter des anticorps des concentrations bien plus faibles
que les deux mthodes suivantes (Descotes, 1992).
Les ractifs de ces tests ELISA (anticorps anti-immunglobulines) sont disponibles
prs de firmes spcialises (Vohr, 1995 ; Vohr, 2005).

o Techniques de prcipitation : technique de Mancini et lectrophorse

Deux techniques de prcipitation sont galement disponibles, mais trs rarement
utilises.
Limmunodiffusion radiale ou technique de Mancini (Descotes, 1992) permet,
laide dun anticorps spcifique, de mesurer une faible quantit dantigne (ici cest
limmunoglobuline recherche) au sein dun mlange de plusieurs antignes.
Lanticorps (anti-srummonospcifique dans le cas du dosage des immunoglobulines)
est incorpor dans une mince plaque de gel dpose sur une lame de verre et le srum
est plac dans un puits creus dans le gel. La liaison des anticorps anti-
immunoglobuline et des immunoglobulines correspondant forme un halo de
prcipitation autour du puits dont le diamtre extrieur est proportionnel la
concentration en antigne. On mesure la quantit dimmunoglobulines laide dune
courbe talon prpare avec des srums dont la concentration en immunoglobulines
est connue.
Cest une technique facile, peu coteuse et ne ncessitant que peu de srum (quelques
microlitres). Cependant, elle est lente et a une limite de dtection assez mdiocre (1.5
5 mg/mL).

Limmunolectrophorse (Descotes, 1992) repose sur deux proprits indpendantes

des anticorps : la mobilit lectrophortique et la spcificit antignique.
Elle consiste introduire un mlange dantignes (qui sont ici les Ig que lon souhaite
doser) dans un milieu glifi (agarose) et appliquer un champ lectrique pour
sparer les Ig selon leur mobilit lectrophortique. Un antisrum polyspcifique est
ensuite mis diffuser perpendiculairement laxe du champ lectrique. La libre
58
diffusion des Ig et des anticorps de lantisrum les uns vers les autres dtermine des
arcs de prcipitation. Linterprtation quantitative des rsultats est toutefois dlicate et
souvent limite une valuation semi-quantitative par comparaison un pool de
srum tmoin.

> Limites

Le dosage des immunoglobulines sriques totales ne donne quun reflet global de la

rponse immunitaire mdiation humorale, puisquil nest pas effectu aprs
stimulation antignique et ne tient pas compte des antignes contre lesquels sont
diriges les immunoglobulines.

I.D. tape 2 ( Tier 2 ) : confirmation et caractrisation du

pouvoir immunotoxique

I.D.1. Choix des tests additionnels

I.D.1.a. Une approche au cas par cas

Lanalyse des facteurs de risque va orienter le choix du dcideur dans la slection de

tests plus approfondis pour confirmer des suspicions ou caractriser (mcanisme
daction par exemple) plus prcisment des rsultats observs dans les tudes de
toxicologie gnrale.

Daprs un sondage ralis auprs de douze laboratoires pharmaceutiques, le choix de

raliser des tests additionnels en immunotoxicologie tait essentiellement (91% des
cas) une approche au cas par cas (Dean et al., 1998). Cette dcision tait alors
dtermine par les rsultats des tudes de toxicologie de routine dans 55% des cas ou
par les autres facteurs de risque cits ci-dessus (moins dun tiers des cas). Les
mdicaments immunomodulateurs ou antiviraux taient quant eux
systmatiquement valus pour leurs effets immunitaires.

59
 I.D.1.b. Rglementation

> Conduite de tests additionnels

La conduite de tests additionnels est ncessaire en cas de facteurs de risques avrs

(cf. 2me partie, I.C.1) et/ou de rsultats des tudes de toxicologie gnrale suggrant
une immunotoxicit (cf. 2me partie, I.C.2) (FDA - CDER, 2002 ; ICH, 2005).

> Slection des tests additionnels

Un grand nombre de tests additionnels sont disponibles pour valuer les effets du
mdicament sur le systme immunitaire et plus particulirement sur la fonctionnalit
immunitaire. Les tests de la fonction immunitaires sont couramment appels test
fonctionnels .

o Tests fonctionnels
Le test recommand de faon systmatique est la rponse humorale un antigne
thymo-dpendant. Cependant, si la cible du mdicament semble tre un type cellulaire
nintervenant pas dans les mcanismes de cette rponse, il est ncessaire dutiliser un
autre test cellulaire plus appropri. Quand le type cellulaire nest pas connu, il est
recommand de faire ce test.

Les autres tests cellulaires sont notamment :

- lactivit des cellules Natural Killer ;

- lactivit des macrophages/neutrophiles ;
- la rponse immunitaire mdiation cellulaire ;
- la rsistance de lhte linfection ou limplantation exprimentale de
tumeurs.

o Autres paramtres mesurables

Ces autres paramtres ont souvent pour objectif une meilleure comprhension des
mcanismes sous-jacents de limmunotoxicit.

Cest le cas pour la mesure :

- du niveau de cytokines,
- de lactivation des lymphocytes

60
Laction du mdicament sur les cytokines est un paramtre trs important dans le cas
des molcules biologiques pour prvenir les temptes cytokiniques aux consquences
cliniques dsastreuses (cf. 1re partie, II.B.2).

I.D.2. valuation du risque immunotoxique

Plusieurs cas de figure peuvent se prsenter lissue de lanalyse des rsultats des
tudes additionnelles. Ils dtermineront sil est ncessaire de caractriser davantage
les effets immunotoxiques (ICH, 2005).

Si les tudes additionnelles montrent quil ny a pas de risque dimmunotoxicit

dtect, des tudes plus approfondies ne sont pas ncessaires.

Si les tudes additionnelles montrent quil y a un risque dimmunotoxicit mais

napportent pas des donnes suffisantes pour prendre une dcision risque-bnfice
raisonnable, des tests plus approfondis peuvent tre effectus dans lobjectif
dapporter de lments supplmentaires pour prendre cette dcision.

Si lanalyse risque-bnfice globale suggre que le risque dimmunotoxicit est

acceptable et/ou peut tre abord dans le plan de gestion du risque, des tests plus
approfondis ne sont pas requis.

I.D.3. Rponse humorale un antigne thymo-dpendant

Lvaluation dune rponse humorale spcifique la suite dune immunisation par un

no-antigne (thymodpendant comme les rythrocytes de mouton ou la KLH) est
couramment utilise en immunotoxicologie. Elle prsente notamment lavantage
dexplorer limmunit mdiation humorale dans des conditions reproductibles de
stimulation antignique.

I.D.3.a. Paramtres valus

> Types cellulaires

Cette immunit implique plusieurs types cellulaires (les cellules prsentatrices

dantignes, les lymphocytes T auxilliaires et les lymphocytes B). Elle svalue en

61
mesurant la quantit danticorps spcifiques de lantigne thymodpendant prsent
aprs limmunisation.

> Rponse primaire et rponse secondaire

On peut valuer la rponse primaire (une seule immunisation) et lobjectif est alors de
mesurer lhabilet de lhte montrer une rponse anticorps spcifique (IgM et/ou
IgG) un antigne.
Dans certains cas, lorsque lon veut mesurer la capacit de lhte raliser une
commutation isotypique et laborer une mmoire immunitaire, la rponse
secondaire peut tre ralise (une immunisation puis un rappel).

> Rponse un antigne thymo-indpendant

Afin de prciser les mcanismes lorigine dune altration de la rponse un

antigne T-dpendant, il est possible dexplorer la rponse vis--vis dun antigne
thymo-indpendant (LPS dE.coli,). En effet, une diminution de la rponse T-
dpendante mais pas de la rponse T-indpendante montre un point dimpact au
niveau des lymphocytes T, tandis que la diminution des deux formes de rponse est en
faveur dun effet sur les lymphocytes (Descotes, 1992).

I.D.3.b. Techniques

> Immunisation

o Nature de lantigne thymodpendant

Lantigne thymodpendant peut tre lrythrocyte de mouton, ou bien de
lhmocyanine de patelle (KLH). Lhmocyanine est une protine de trs grande taille
(> 1000 kDa) provenant de lhmolymphe dun mollusque univalve marin
(Megathuracrenulata). Cest un antigne fortement immunogne (Kim et al., 2007;
Tizard, 2008).

o Modle de test
Limmunisation est gnralement ralise in vivo, mais (Ladics, 2007) propose
galement un protocole in vitro sur une suspension de cellules splniques, avec des
rythrocytes de mouton comme antigne. Dans la mthode in vitro la strilit est
requise pour prlever la suspension de cellules splniques.
62
o Voie dinjection
La voie dinjection est variable selon lantigne (Tableau 8).

Tableau 8 : Les voies dimmunisation en fonction de lantigne thymodpendant

Antigne thymodpendant Voie dimmunisation

Erythrocytes de mouton Intraveineuse (Ladics, 2007)
KLH Intraveineuse
Sous-cutane
Dans le coussinet
Intrapritonale

Roth et al. (2006) et Ulrich et al. (2004) ralisent linjection de KLH en sous-cutane.
Gore et al. (2004)et Kim et al. (2007) comparent les diffrentes voies
dadministration possibles (Tableau 9 et

Tableau 10) :

- la voie intra-coussinet permet galement de caractriser des changements

histopathologiques dans les nuds lymphatiques drainant la zone ;
- la voie IV est une alternative dans lintrt de lanimal mais galement dans le
contexte actuel des valuations immunotoxicologiques (Anon., 1998 ; Ladics
et al., 1995) ;
- la voie sous-cutane est value car cest une voie dimmunisation
couramment utilise en tudes prcliniques et cliniques.

Tableau 9 : Rsultats dELISA KLH tude 28 jours rat avec diffrents voies
dadministration de la KLH (d'aprs Gore et al., 2004)

Voie dadministration Dose KLH Rsultats (IgM/IgG)

coussinet 300g 71 g/mL 470 g/mL
IV 300g 388 g/mL 230 g/mL
SC 300g/kg 10 g/mL 19 g/mL

63
Tableau 10 : comparaison des diffrentes voie dimmunisation par la KLH (d'aprs
Gore et al., 2004)

IgM IgG
IV vs coussinet IgMiv>IgMcoussinet P< IgGIV<IgGcoussinet Non
0.0001 significatif
SC vs IgMSC<IgMIv/coussinet P < IgGSC<IgGIv/coussinet P < 0.0004
(IV/coussinet) 0.0004

La rponse IgM est significativement la plus marque avec une immunisation par IV,
alors que la rponse IgG est plus marque (non significativement) avec
ladministration intra-coussinet.
Il semble que ladministration intra-coussinet soit un bon compromis et cest celle que
choisissent Gore et al. (2004) pour leur tude de validation.

o Quantit injecter
La quantit drythrocytes de mouton injecter dpend du volume injectable chez
lanimal immuniser (0.5mL pour le rat et 0.2 mL pour la souris) et de la
concentration de la suspension. Vohr (2005) et Ladics (2007) soulignent la difficult
de trouver la concentration idale.
La quantit de KLH dpend de la voie dadministration et de la combinaison possible
avec un adjuvant (Tableau 11).

64
Tableau 11 : Diffrentes doses dimmunisation la KLH en fonction des voies
dadministration et de lutilisation dun adjuvant

Doses
Auteur IV Intra- Adjuvant
SC
coussinet
suspension saline
Ulrich et
50g/rat dhydroxyde daluminium
al.(2004)
(Alugel)
suspension saline
Roth et
50g/rat dhydroxyde daluminium
al.(2006)
(Alugel)
Gore et
al.(2004) 300g/kg 300g/kg 300g/rat non

Kim et 100 - 300 300

non
al.(2007) g/rat 1000g/rat
Herzyk et
300g/kg 300g/rat non
Gore (2004)

o Nombre dinjections
Le nombre dinjections dpend de la rponse (primaire ou secondaire) qui doit tre
value.
Pour une rponse primaire une seule injection est ncessaire.
Pour une rponse secondaire, il faut deux injections 8 jours dintervalle.

o Moments de limmunisation
Pour les rythrocytes de mouton, Vohr (2005) soulve la difficult, comme Ladics
(2007) le met en vidence dans ses protocoles dtaills, de choisir le bon moment
pour limmunisation des animaux.
Avec la KLH, sur une tude 28 jours rat, linjection est ralise J14 pour
lvaluation de la rponse primaire (Gore et al., 2004 ; Herzyk et Gore, 2004). Pour la
rponse secondaire, Ulrich et al. (2004) proposent J14 et J 22 et Roth et al. (2006)
J12 et J20 (Figure 4).
65
o Moments des prlvements
Le moment des prlvements doit tre ralis au pic de la rponse observe. Ce
pic doit tre dtermin pour chaque laboratoire. Il dpend du lot dantigne, de la
souche animale, de la rponse valuer, de lisotype mesurer, de la technique de
mesure utilise. Par exemple, aprs limmunisation avec les rythrocytes de
mouton, Ladics (2007) effectue le prlvement 4 jours aprs pour la technique in
vivo et 5 jours aprs pour la technique in vitro. Avec la KLH, Gore et al. (2004)
proposent un protocole dvaluation de la rponse primaire et Ulrich et al. (2004)
un protocole dvaluation de la rponse secondaire, sur une tude 28 jours rat
(Figure 4).

Figure 4 : Exemples de protocole dvaluation de la rponse (a) primaire (daprs

Gore et al., 2004) ou (b) secondaire (daprs Ulrich et al., 2004), avec la KLH, tude
rat 28 jours.

(a)
KLH
J1 J9 J 19 J 29

J 14
Dbut du Prise de Prise de Autopsie
traitement sang sang Dosage des
Dosage des IgG
IgM

(b) KLH KLH

J1 J9 J 29

J 14 J 22
Dbut du Prise de Autopsie
traitement sang Dosage des
IgM/IgG

66
 > Mesure de la rponse humorale

o Nature du prlvement
La nature du prlvement est conditionne par la technique de quantification des
anticorps spcifiques de lantigne thymodpendant et par la nature de lantigne
thymodpendant (Tableau 12).

Tableau 12 : Nature du prlvement en fonction de la technique de quantification des

anticorps et de la nature de l'antigne thymodpendant

Antigne Mthode Technique de Nature du

thymodpendant quantification des prlvement
anticorps spcifiques
Erythrocytes de in vivo - ELISA - srum
mouton - plages dhmolyse - suspension de
cellules isoles
(rate)
in vitro Plages dhmolyse suspension de
cellules isoles (rate)
KLH in vivo ELISA srum

La mesure de la rponse humorale spcifique peut seffectuer avec la technique des

plages dhmolyse (pour limmunisation avec les rythrocytes de mouton) ou bien
avec lELISA (pour limmunisation in vivo avec les rythrocytes de mouton et la
KLH).

o Technique des plages dhmolyse

La technique des plages dhmolyse se ralise en mettant des cellules de rate des
animaux immuniss incuber dans une glose drythrocytes de mouton. Les plages
de lyse sont ensuite comptes avec un compteur de colonie ou un microscope
dissquant. Les donnes sont en gnral exprimes soit en plages de lyse/rate ou bien
en plages de lyse/splnocytes. Le paramtre mesur nest pas la quantit danticorps
produits, mais plutt, le nombre de lymphocytes B ou plasmocytes produisant des
anticorps spcifiquement dirigs contre les rythrocytes de mouton dans la rate. Elle

67
ne tient pas compte des anticorps produits dans les autres sites (moelle osseuse, nuds
lymphatiques) (Ladics, 2007).
Cette technique est longue et fastidieuse (Kim et al., 2007 ; Ladics, 2007).

o ELISA
LELISA permet lui de mesurer, dans le srum de lanimal, les anticorps spcifiques
de lantigne thymodpendant, produits par les diffrents tissus (rate, nud
lymphatique, moelle osseuse). Selon la rponse value, les IgM (rponse primaire)
ou les IgG (rponse secondaire) peuvent tre mesurs. Cependant, Gore et al. (2004)
encouragent galement la mesure des IgG, lors de lvaluation de la rponse primaire.
En effet, leur dosage serait plus sensible pour mettre en vidence des problmes au
niveau de la commutation isotypique, ainsi que des altrations de la production de
cytokines mdie par les lymphocytes T. De plus, ils interviennent, de par leurs
proprits particulires, dans de nombreux mcanismes de dfense :
- opsonisation des antignes pour la phagocytose par les macrophages et
neutrophiles ;
- cytotoxicitmdie par les cellules dpendant des anticorps (ADCC) des
cellules NK ou des macrophages ;
- inhibition feed-back de lactivation des lymphocytes B.

La technique de lELISA est similaire celle dcrite pour le dosage des

immunoglobulines (Figure 5 et cf. I.C.4.c). Rooney et al. (2003) et Ladics (2007)
proposent un exemple de protocoledtaill aprs une immunisation aux rythrocytes
de mouton, Smith et al. (2003) aprs une immunisation la KLH.
La courbe de rfrence de lELISA est obtenue grce une srie de dilutions, dIgM
et dIgG purifies, de concentrations connues. Les Ig doivent tre de la mme espce
animale que le groupe test. Les puits ne sont pas recouverts de lantigne
thymodpendant, mais danticorps de chvre anti-IgM et anti-IgG spcifiques
despce.

68
 Figure 5 : Principe gnral de lELISA appliqu la mesure de la rponse humorale
spcifique Exemple de la mesure dIgM anti-KLH

+ Acanti-IgM
Incubation Lavage + Substrat Lecture

Puits de la plaque de
IgM anti- Ac anti IgM Ac non Substrat Produit Proxydase KLH micro-titration
KLH coupl la spcifique de color du raifort
proxydase la KLH

o Comparaison des deux techniques

Les diffrences majeures entre la technique des plages dhmolyse et lELISA sont
rcapitules dans le Tableau 13.

69
Tableau 13 : Diffrences majeures entre la technique des plages dhmolyse et la
technique ELISA

Technique des plages Technique ELISA

dhmolyse
Paramtre valu Cellules B ou Taux danticorps produits par
plasmocytes de la rate les diffrents tissus spcialiss
produisant des anticorps (rate, moelle osseuse, nuds
spcifiques anti SRBC lymphatiques)

Isotype Ig M surtout, IgG avec Tous les isotypes,

un test lgrement principalement Ig M et Ig G
modifi (Ladics, 2007) dans ce test

Dlai entre 4-6 jours 5-6 jours

immunisation et
prlvement (rponse
primaire)

Prlvement Rate (autopsie) Sang

Technique Longue, laborieuse et Plus rapide et automatise

peu automatise (existe
une technique ELISPOT,
Ladics, 2007)
Possibilit dvaluer la Non car sacrifice Oui
rponse secondaire sur terminal
le mme lot danimal

70
 I.D.3.c. Limites

> Techniques avec les rythrocytes de mouton

o Nature de lantigne
Cet antigne nest pas idal, car il existe une grande variabilit selon les donneurs.
Cest un ractif qui ne permet pas une bonne reproductibilit du test (Kim et al.,
2007).

o Voie dadministration
Seule la voie IV est dcrite pour ladministration de SRBC in vivo.

o Immunotoxicologie dveloppementale
Les rats de moins de 10 jours sont incapables dlaborer une rponse primaire aux
SRBC.
Une fois sevrs, ils peuvent dvelopper une rponse, mais elle nest mesurable
quavec le test des plages dhmolyse. En effet, avec lELISA, on obtient une
rponse de fond leve (Ladics et al., 1995 ; Ladics et al., 1998 ; Ladics, 2007).

o Validation
Ladics et al. (1995) soulignent quil y a un manque de donnes dans la littrature
comparant les changements en pathologie clinique et en histopathologie avec les
changements observs lors des tests fonctionnels.
Peu de donnes sont disponibles sur les molcules immunostimulantes avec cet
essai (Vohr 2005).
Il nexiste pas dtudes de validation (Kim et al., 2007) avec les espces non-
rongeurs (Chien et Primate Non Humain), mme si Tryphonas et al.(2001)
utilisent limmunisation au SRBC dans une tude pilote sur des macaques.

> Technique avec la KLH

Bien que moindre par rapport aux rythrocytes de mouton, il peut exister des
variations entre diffrents lots de KLH (Gore et al., 2004). Mieux vaut donc pour une
mme tude, utiliser le mme lot de KLH entre le groupe tmoin et le groupe trait.

71
Par ailleurs, il a pu tre observ une variabilit inter-individuelle dans la rponse
anticorps la KLH, ce mme dans des races consanguines comme les rats Sprague
Dawley (Gore et al., 2004).

Enfin, les protocoles concernant limmunisation la KLH ne sont pas encore

uniformes (Kim et al., 2007), notamment en ce qui concerne la voie et le moment de
limmunisation.

> Intgration dans les tudes de toxicologie gnrale

La ralisation de ce test dans le lot danimaux utilis pour les tudes de toxicologie
gnral nest pas recommande ce jour (FDA - CDER, 2002). En effet labsence
deffet de limmunisation sur les paramtres de toxicologie gnrale nest pas
largement valide. Ce test doit donc tre ralis sur des groupes satellites.

A priori, ce test doit seffectuer sur un groupe satellite des tudes de toxicologie
standard. Cependant pour des raisons videntes (rduction du nombre danimaux et
contraintes techniques adjointes), il est envisag de raliser ce test directement sur les
groupes danimaux des tudes de toxicologie gnrale. Pour cela il faut dabord
sassurer que limmunisation na pas de consquences sur les autres
paramtresmesurs,in vivo ou ex vivo, lors dune tude de toxicologie classique.
Ladics et al. (1995, 1998) ont montr labsence deffet de limmunisation par les
rythrocytes de mouton sur les paramtres hmatologiques et histopathologiques.
Pour limmunisation par la KLH aucun effet na t mise en vidence sur les
paramtres hmatologiques, les poids des organes lymphodes et les poids corporels
(Gore et al., 2004). En revanche, des rpercutions sur certains paramtres
histopathologiques (Tableau 14), sans pour autant dobservations majeures associes
au thymus, la moelle osseuse, aux plaques de Peyer, au poumon et au clon, sont
rapportes (Gore et al., 2004).
Cependant, labsence deffets de limmunisation sur dautres tests (notamment
fonctionnels) na pas encore t clairement mise en vidence.
Il semble donc plus prudent pour le moment, dans lattente de validations
supplmentaires, de raliser ces tests sur des groupes satellites des tudes de
toxicologie standard (par exemple les groupes de
pharmacocintique/pharmacodynamie).

72
Tableau 14 : Effets de limmunisation par la KLH sur lvaluation microscopique en
histopathologie

Voie
Effets microscopiques
dimmunisation
Augmentation de lincidence de la formation
SC de centres germinaux dans la rate (+)

Augmentation de lincidence de la formation

Lot immunis IV de centre germinaux dans la rate (+++)
avec de la KLH
Augmentation de lincidence des plasmocytes
de la corde mdullaire et/ou hyperplasie
Intra coussinet
folliculaire du NL poplit ipsilatral/ NL
controlatral
Lot immunis
Augmentation de lincidence de la formation
avec une Intra coussinet
des centres germinaux dans la rate
solution saline

I.D.4. Activit des cellules Natural Killer

Les cellules NK constituent la premire ligne de dfense du systme immunitaire

contre les tumeurs, les virus, les cellules infectes et les cellules prsentant une
anomalie du complexe majeur dhistocompatibilit de type 1.
On peut sintresser aux Natural Killer lorsque les rsultats de phnotypage cellulaire
montrent un changement dans leur nombre et/ou si les tudes de toxicologie gnrale
montrent une augmentation du taux dinfection virale ou de tumeurs.

I.D.4.a. Paramtres valus

Leur activit est mesure en valuant leur activit cytolytique en prsence de cellules
tumorales.

73
 I.D.4.b. Techniques

Plusieurs techniques sappuyant sur, la radioactivit, la colorimtrie ou la cytomtrie

en flux sont disponibles. Dans ces trois techniques le principe gnral est similaire :
mesurer le nombre de cellules cancreuses lyses en prsence des cellules effectrices.

> Cellules effectrices

Les cellules effectrices sont une suspension de cellules mononucles (obtenue partir
de la rate ou du sang) (Friberg et al., 1996 ; Cederbrant et al., 2003 ; Rooney et al.,
2003).
Pour garantir que lactivit cytolytique de ces suspensions cellulaires est attribuable
aux NK, Cederbrant et al. (2003) ont montr quen diminuant la proportion de NK, on
diminue significativement lactivit cytolytique de la suspension de cellules
effectrices.

> Test de libration du chrome

Le test de libration du chrome consiste marquer les cellules cibles (cellules

cancreuses par exemple) avec du chrome radioactif et les mettre incuber avec des
cellules effectrices. La radioactivit du surnageant est mesure avec un compteur
gamma. Elle est proportionnelle au nombre de cellules lyses (Friberg et al., 1996).
Ce test peut galement tre ralis sur sang total (Friberg et al., 1996).

> Test colorimtrique

Smith et al. (2003) ont propos une alternative colorimtrique. Un driv

actomethoxyl de la calcine (Calcein AM) est utilis la place du chrome
radioactif. Ce driv pntre dans les cellules. Si la cellule est vivante, une
transformation biochimique intracellulaire a lieu et une fluorescence verte est mise.
Cette fluorescence est mesure par spectrophotomtrie.

> Cytomtrie en flux

Dans la technique utilisant la cytomtrie en flux, les cellules cibles sont marques
avec de lester de carboxy-fluorescine succinimidyl (CFSE). Les cellules cibles sont
ensuite marques avec de liodure de propidium (colorant de lADN) pour identifier
les cellules cibles mortes. En effet liodure de propidium ne peut pntrer que dans les

74
cellules mortes car la membrane cellulaire est altre (Marcusson-Sthl et Cederbrant,
2003 ; Cederbrant et al., 2003). Lavantage majeur de la technique par cytomtrie en
flux dans ce cas est quelle ne ncessite quun petit nombre de cellules effectrices.
Cela permet lutilisation du sang comme source de cellules cibles et ainsi la
possibilit deffectuer plusieurs prlvements sur le mme animal et ne pas tre oblig
dutiliser de groupe satellite.

> Rsultats

Les rsultats sont reports en pourcentage de lyse spcifique (lyse provoque par les
cellules effectrices) pour chaque ratios de cellules effectrices/cellules cibles (Friberg
et al., 1996 ; Cederbrant et al., 2003).
Pour ces calculs, il est ncessaire davoir un contrle de libration spontane
(uniquement des cellules cibles marques) et un contrle de libration maximale
(cellules cibles marques avec un agent lytique) (Friberg et al., 1996).

> Comparaison des techniques

Le Tableau 15 donne les avantages et limites du test libration au chrome et de la

cytomtrie en flux.

75
Tableau 15 : Avantages et limites du test de libration du chrome et de la cytomtrie
en flux (d'aprs Cederbrant et al., 2003)

Proprit Test de libration Cytomtrie en

du chrome flux
Radioactivit oui non
Possibilit dajouter du phnotypage non oui
Les rsultats doivent tre lus dans les 27,7 heuresa 60 min
Assez de cellules du sang priphrique pour
non oui
tre inclus dans une tude rat rglementaire
Dosages rpts sur le mme animal (rat) non oui
Ncessite un lot spcifique danimal oui non
Dtermination directe de la viabilit des
non oui
cellules
Permabilit spontane des cellules cibles oui nonb
Temps de manipulation court long
a
Demi-vie du 51Cr
b
Dpend du colorant utilis, certains colorants sont trs relargus par les cellules cibles. Si le
colorant se lie de faon covalente aux protines cellulaires cela rend le relargage moins
important (ex avec le CFSE)

I.D.4.c. Limites

> Techniques

Un certain nombre de prcautions pratiques doit tre pris en considration (Friberg et

al., 1996).
Lactivit des cellules effectrices est diminue par le temps de stockage, ainsi que par
des tempratures froides. Elle est augmente par la prsence de mycoplasmes ou
dendotoxines. Cest pourquoi, il est conseill de limiter au maximum la
cryoprservation, de rduire lintervalle de temps entre le prlvement et lanalyse
(<24h pour les suspensions de cellules mononucles et <2-4h pour le sang total), de
sassurer que les suspensions cellulaires (cibles ou effectrices) sont indemnes de
mycoplasmes ou dendotoxines.

76
Les cellules cibles doivent tre dans une phase de croissance adquate pour garantir
lefficacit optimale de la lyse par les cellules effectrices (phase logarithmique de
croissance, changement par une ligne cellulaire plus jeune aprs 100 passages).
Les conditions requises pour les cellules cibles sont valides si la valeur de libration
spontane est infrieure 10% de la valeur de libration maximale.

> Spcificit

D'aprs Cederbrant et al. (2003), la difficult nest pas de mettre en vidence une
altration de lactivit des NK, mais de corrler cette altration une ralit clinique.
Friberg et al., 1996) font justement remarquer que, la corrlation entre lactivit des
NK, mesure par le test de libration du chrome, et les rponses cliniques observes
chez des patients traits avec des cytokines (IL-2, IFN-, IFN-), connues pour
augmenter leur activit, est assez pauvre. Cela peut sexpliquer en partie du fait que
les mcanismes des NK mesure ici nest pas le mcanisme prdominant in vivo
(Friberg et al., 1996).

I.D.5. Activit des Macrophages/Neutrophiles

Lvaluation de la fonctionnalit des macrophages/neutrophiles peut tre effectue

lors dinfection bactrienne.

I.D.5.a. Paramtres valus

Diffrentes phases de la phagocytose peuvent tre prises comme tmoin de lactivit

des macrophages/neutrophiles (Hubbard, 1999).

Ltude de la phase dingestion et/ou du burst oxydatif revient frquemment dans

la littrature.

77
 I.D.5.b. Techniques

> Isolement des cellules dintrt

o Macrophages
Diffrents types de macrophage peuvent tre utiliss :

- les macrophages pritonaux (Hubbard, 1999 ; Rooney et al., 2003 ; Lee et al.,
2004)
- les macrophages splniques (Hubbard, 1999)
- de lignes murines de macrophages (Hubbard, 1999).

Les techniques de prlvements spcifiques chaque type sont prcises dans les
rfrences bibliographiques.

o Neutrophiles
Lvaluation de lactivit des neutrophiles se fait sur des suspensions de cellules
mononucles du sang priphrique (Thiem et al., 1988).

> Le Phagotest

o Paramtres mesurs
Ce test consiste valuer, in vitro, la capacit des phagocytes ingrer diverses
particules : globules rouges de mouton, particules de zymosan, bactries (E.Coli,
S.Aureus, ) opsonises fluorescentes, billes de latex fluorescentes.
Dans le cas o les particules sont opsonises (avec des molcules du complment ou
avec des anticorps), le phagotest mesure alors la capacit dingestion mdie par le
rcepteur au complment, ou bien par le rcepteur aux anticorps des phagocytes
(Hubbard, 1999).

Les rsultats peuvent sexprimer en :

- nombre de macrophages activs (macrophage ayant phagocyt au moins un
lment),
- niveau dactivit des macrophages (nombre dlments phagocyts par
macrophage).

78
o Mthodes de mesure
Les phagocytes sont mis incuber avec les lments. Lingestion des lments peut
tre mesure par :
- microscopie fluorescente (Hubbard, 1999),
- cytomtrie en flux (Rooney et al., 2003).

Des kits commerciaux sont disponibles. ORPEGEN Pharma propose par exemple le
kit Phagotest (utilisation du cytomtre en flux) avec des E.Coli opsonises et non
opsonises, marques au FITC. Ce kit est compatible pour plusieurs espces : souris,
rats, chiens

Ce test est fastidieux (mme si avec la cytomtrie en flux la lecture des chantillons
est beaucoup plus rapide) et peu reproductible. De plus limprcision lie la
dfinition de lindex phagocytaire ncessite encore des efforts de standardisation et de
validation (Descotes, 1992).

> Le Bursttest

o Paramtres mesurs
Ce test consiste mesurer in vitro, la capacit des phagocytes dtruire un lment
tranger.
Cette destruction est conscutive une stimulation mtabolique des phagocytes. Elle
est connue sous le nom d oxydative burst . Elle consiste en un dversement dans
le phagosome du contenu des granulations cytoplasmiques. Cette activation
mtabolique est plus marque au niveau des granulocytes neutrophiles que des
macrophages (Descotes, 1992).

o Techniques de mesure
Il existe trois techniques de mesure de cette activit oxydative.

La colorimtrie sappuie sur la proprit dun des composants des granules

cytoplasmiques (lanion superoxyde) rduire le ferricytochrome C (Hubbard, 1999 ;
Dahlgren et al., 2007). Cette rduction se manifeste par lapparition dun pic
facilement dcelable au spectrophotomtre. Une stimulation des granulocytes est

79
ncessaire au pralable. Elle peut tre ralise avec de lactate de phorboldiestrase
(PMA) et/ou du zymosanopsonis.

La chimioluminescence (Hubbard, 1999 ; Vohr, 1995 ; Vohr, 2005) consiste

mesurer la production de photons lumineux avec un luminomtre. En effet lors de
lactivation des phagocytes, il y a production de photons. La raction peut tre
amplifie par du luminol ou de la lucignine. La quantit de photons est le reflet de
lactivation phagocytaire.

La rsonnance paramagntique lectronique ou mthode de pigeage des lectrons

(Hubbard, 1999) permet de mesurer indirectement les radicaux libres courte dure
de vie, forms lors de ces ractions de destruction. Les radicaux libres ont une trs
courte dure de vie. Cest pourquoi, dans cette technique, un compos
paramagntique est ajout. Le produit form avec les radicaux libres a une dure de
vie plus longue que les radicaux libre et est mesurable par rsonnance paramagntique
lectronique conventionnelle.

ORPEGEN Pharma propose galement le kit Bursttest sappuyant sur la technique

de cytomtrie en flux. Son principe est similaire au test de rduction du
ferricytochrome C, mais le ractif rduire est la dihydrorhodamine (DHR) 123. Le
niveau de fluorescence (refltant lactivit enzymatique) des cellules ayant produit des
radicaux doxygne est alors mesur par cytomtrie en flux.
Il est compatible avec diffrentes espces (souris, rat, lapin, chien).

80
 > Quantification des cytokines

o Paramtres mesurs
Par lintermdiaire de rcepteurs membranaires, les macrophages peuvent dtecter des
bactries et des virus. Ils rpondent notamment en scrtant des cytokines dont les
plus importantes sont lIL-1, lIL-6, lIL-12 et le TNF-. La mesure de ces cytokines
est prsente galement comme un outil pour valuer lactivit des macrophages
(Hubbard, 1999).

o Mthode de mesure
La mthode de quantification des cytokines propose par Hubbard (1999) sappuie sur
les essais biologiques dcrits dans la partie sur la quantification des cytokines (cf.
I.D.8.b).

I.D.5.c. Limites

Selon le tissu dorigine, la quantit de macrophages obtenue, lespce ou la souche

animale et lhtrognit de la population de macrophages, la fonction des
macrophages valuer sera diffrente.
Il est recommand de raliser plus quun type de test pour valuer prcisment les
effets dune molcule pharmaceutique sur la fonction macrophagique (Hubbard,
1999).

I.D.6. Rponse immunitaire mdiation cellulaire

Limmunit mdiation cellulaire reste moins frquemment value que limmunit

humorale en immunotoxicologie.

I.D.6.a. Paramtres valus

Elle peut tre value, en partie, grce la raction dhypersensibilit retarde

(DTH : Delayed-type Hypersensitivity) un antigne.
Lors dune primo-immunisation avec lantigne, une rponse Th1 est dclenche et
des lymphocytes T mmoires sont gnrs. Lors de la seconde immunisation, par voie
sous-cutane ou intradermique, lantigne, prsent par les cellules de Langerhans, est
reconnu spcifiquement par les lymphocytes mmoires prsent dans le nud
81
lymphatique drainant. Activs, ils gnrent des lymphocytes Th1, qui prolifrent et
sont librs dans la circulation sanguine. Ils reconnaissent la molcule quand ils la
rencontrent dans la peau et saccumulent autour. Ils scrtent des cytokines (lIFN,
lIL-2 et lIL-16) responsables de laugmentation de la permabilit capillaire, de la
vasodilatation et de laccumulation de macrophages au site dinjection. Sous laction
de ces molcules les granulocytes basophiles librent de la srotonine et des enzymes
et, les macrophages des mtabolites de loxygne provoquant alors des signes
inflammatoires locaux (Figure 6) (Tizard, 2008).

Figure 6 : Mcanismes de raction de l'hypersensibilit retarde (daprs Tizard,

2008)

82
 I.D.6.b. Techniques

Le test consiste administrer une premire fois lantigne, puis effectuer un rappel
la suite dune priode de repos.
La rponse au point dinjection (dme, induration) ou au niveau du nud
lymphatique drainant (centres germinaux) est observe. Elle peut tre value :
- macroscopiquement, par la taille de la zone enflamme au niveau du point
dinjection(Ulrich et al., 2004 ; Beeton et Chandy, 2007),
- microscopiquement, par lampleur de linfiltration par les lymphocytes T
et les macrophages de la zone enflamme et des centres germinaux des
nuds lymphatiques drainants (Ulrich et al., 2004 ; Roth et al., 2006).

La KLH reprsente lantigne le plus courant (Ulrich et al., 2004 ; Roth et al., 2006;
Beeton et Chandy, 2007). Il prsente lavantage majeur de pouvoir tre utilis pour
valuer la rponse mdiation humorale et la rponse mdiation cellulaire.
Dautres antignes peuvent galement tre utiliss (ovalbumine, anatoxine
ttanique,).

I.D.6.c. Limites

Ces tests sont notamment rapports chez la Souris et le Rat. Bouchez et al. (2011) ont
prsent des donnes chez le Singe Cynomolgus. Cependant la rglementation ICH
(2005) met en garde sur la reproductibilit de ces ractions et indique quil est
important de ne pas confondre avec une raction dArthus, mdie par des anticorps
ou le complment.

83
 I.D.7. Rsistance de lhte aux infections et aux tumeurs

La fonction majeure du systme immunitaire est dassurer la protection de

lorganisme contre des maladies infectieuses ou noplasiques.

I.D.7.a. Paramtres valus

Le principe dun test de rsistance de lhte est dinoculer des agents infectieux
(virus, bactrie, parasite, champignon) ou des tumeurs transplantables des animaux
traits avec la molcule teste.

La molcule teste peut entraner plusieurs altrations (pas forcment significatives)

de lune ou plusieurs des fonctions immunitaires. Il peut alors en rsulter des effets
additifs ou synergiques affectant la rsistance la maladie (Burleson et Burleson,
2007).

En fonction de lentit inocule, diffrents paramtres sont contrls (Tableau 16)

(Germolec, 2004) et diffrents mcanismes immunitaires sont mis en jeu (

Tableau 17).

Ces tests sont reconnus, pour la plupart des immunotoxicologistes, comme les plus
pertinents pour valider lutilisation des autres mthodes de dtection et pour
extrapoler lhomme les rsultats obtenus (Germolec, 2004).

84
Tableau 16 : Principaux modles de rsistance aux maladies et paramtres mesurs
(daprs Germolec, 2004)
Elment inocul
Listeria monocytogenes
Streptococcus pneumoniae
Influenza virus
Cytomegalovirus
Candida albicans
Trichinellaspiralis
Plasmodium yoelli
PYB6 sarcoma
B16F10
Paramtres mesurs
CFU dans le foie, CFU dans la rate, morbidit
Morbidit
Morbidit, titre viral/charge tissulaire
Morbidit, titre viral/charge tissulaire
Mortalit, CFU dans les muscles, CFU dans la
rate, titre en anticorps (Burleson et Burleson,
2007)
Larves enkystes, parasites adultes
Parasitmie
Incidence de tumeur (sous-cutane)
Charge tumorale (nodules pulmonaires)
85
Tableau 17 : Principaux modle de rsistance et mcanismes immunitaires valus

Elment inocul Mcanismes immunitaires valus

Immunit mdiation cellulaire locale
(macrophages, complment et
Listeria monocytogenes lymphocytes T spcifiques) activit des
neutrophiles et des NK en fin dinfection
(Cohen, 2007 ; Keil et al., 2001)
Immunit inne (complment,
macrophages, neutrophiles, cytokines des
Streptococcus pneumoniae macrophages) (Keil et al., 2001 ;
Burleson et Burleson, 2007 ; Cohen,
2007)
Immunit mdiation cellulaire et
Candida albicans
humorale (Germolec, 2004)
Immunit mdiation cellulaire et
Plasmodium yoelli
humorale (Germolec, 2004)
Immunit mdiation cellulaire et
Trichinellaspiralis
humorale (Germolec, 2004)
Immunit mdiation cellulaire
(lymphocyte T cytotoxiques) et inne
(activit des NK) (Garssen et al., 1995),
Cytomegalovirus
tude de la ractivation dune maladie
virale latente lors dimmunosuppression
(Burleson et Burleson, 2007)
Immunit mdiation cellulaire
(lymphocyte T cytotoxiques), inne
Influenza virus
(activit des NK) (Garssen et al., 1995)et
humorale (Burleson et Burleson, 2007)
PYB6 sarcoma Activit des cellules NK
B16F10 Activit des cellules NK

86
 I.D.7.b. Techniques

> Protocole dinoculation

o Voie
Les voies dinoculation sont varies selon lagent causal, la voie dadministration de
la molcule teste, les critres de mesure des investigateurs.

Les principales voies et des exemples sont donns dans le Tableau 18.

Tableau 18 : Principales voies dinoculation et exemples

Voie dinoculation Exemples Rfrences

Intra-pritonale - Cytomgalovirus Garssen et al. (1995)
- Listeria monocytogenes Cohen (2007)
Intra-veineuse - Listeria monocytogenes Zhu et al. (2007)
- B16F10 Keil et al. (2001)
Intra-trachale
- Instillation - Listeria monocytogenes Cohen (2007)
- Inhalation - Streptococcus pneumoniae Zhu et al. (2007)

o Quantit
Il est ncessaire que la quantit inocule soit suffisante pour dclencher la maladie
un niveau clinique faible ou chez un petit nombre danimaux du groupe de contrle
(non trait) (Germolec, 2004). Cest pourquoi des tudes prliminaires doivent tre
conduites chez des lots non traits pour choisir la dose idale dagent pathogne
administrer. Par exemple, pour une bactrie, une dose ltale est dfinie dans un
groupe tmoin (non trait) pour une voie dinoculation donne. Cela permettra par la
suite de dterminer sil y a eu un changement significatif de mortalit/morbidit d au
traitement avec la molcule teste (Cohen, 2007).

o Moment dinoculation
Le moment dinoculation dpend tout dabord du modle dtude (Tableau 19) et
dautre part de lagent pathogne (Tableau 20).

87
Tableau 19 : Exemples de moment dinoculation de Listeria monocytogenes en intra-
veineuse selon le modle dtude

Dure du test Modle dtude Jour Rfrence

(jour) dinoculation
16 Souris, tude de 3me Keil et al.
toxicit rpte (2001)
par voie orale
28 Rat, tude de 21me Zhu et al.
toxicit rpte (2007)
par voie orale

Tableau 20 : Exemples de moment dinoculation en fonction des germes sur une tude
de toxicit rpte, par voie orale, 28 jours, chez le Rat (daprs Zhu et al., 2007)

Agent pathogne Jour dinoculation

Influenza virus 8me
Listeria monocytogenes 21me
Streptococcus pneumoniae 27me

> Mesure des paramtres

Lvaluation des paramtres est ralise des moments diffrents par rapport
linoculation selon le paramtre valu et lagent pathogne (Tableau 21).

88
Tableau 21 : Exemples de moments dvaluation des paramtres post-infection en
fonction de lagent pathogne et du paramtre valu (daprs Zhu et al., 2007)

Agent pathogne Paramtre valu Moments de lvaluation post

inoculation
Influenza virus Titre viral dans les Jour 0, jour 2, jour 6, jour 10,
poumons jour 18, jour 21
Listeria Nombre de CFU dans la Jour 1, jour 4, jour 7
monocytogenes rate et le foie
Streptococcus Nombre de CFU dans les 1 heure, 4 heures et 24 heures
pneumoniae poumons

o Morbidit/mortalit
Lun des paramtres dvaluation post infection le plus vident et ne ncessitant pas
de ncropsie, est lobservation de signes de maladie/morbidit. Parmi les critres de
maladie, on peut noter la lthargie, lhyporexie, lhypodypsie, des troubles digestifs
(diarrhe). Dautres signes (immobilit, dyspne, jetage nasal/oral) peuvent apparatre
lors de la progression de la maladie.

Pour des raisons thiques, les animaux au stade avanc de la maladie peuvent tre
euthanasis et inclus dans le nombre des animaux morts.

o Quantification des lments pathognes

En ce qui concerne les modles tumoraux, lnumration des tumeurs se fait par
observation directe ou microscopique sur les organes cibles (Keilet al. 2001).

Parmi les critres post-infection, deux reviennent frquemment pour les modles
bactriens et viraux. Ce sont les CFU et les titres viraux. Leur mesure peut seffectuer
sur diffrents matriels (organes, fluides de lavages pritonaux ou pulmonaires)
selon la nature de lagent bactrien ou viral, la voie dinoculation, la molcule teste
(Garssen et al., 1995 ; Cohen, 2007 ; Zhu et al., 2007). Pour les organes entiers, la
technique consiste les placer dans une solution saline (non hypo-osmotique) et
homogniser.

Dans le cas de la mesure du calcul des CFU, le mlange homognis est ensuite mis
incuber sur des milieux de culture appropris la croissance des bactries. Les

89
colonies sont ensuite comptes manuellement et le nombre de CFU par organe est
calcul (Cohen, 2007; Zhu et al., 2007).

La mesure des titres viraux se fait en mesurant les plaques virales ou PFU (plaque
forming unit). Le mlange homognis est plac sur une mono-couche de cellules
caractristiques. Garssen et al. (1995) utilisent des cellules embryonnaires de Rat, Zhu
et al. (2007) choisissent des cellules rnales de chien. Le tout est recouvert dune
couche dagar. Aprs un temps dincubation variable de 2 jours (Garssen et al., 1995)
une semaine (Zhu et al., 2007)permettant le dveloppement des plaques, la mono-
couche de cellules est fixe dans du formol, la couche dagar est ensuite retire pour
permettre la coloration de la mono-couche de cellules. Garssen et al. (1995)colorent
avec du bleu de mthylne, Zhu et al.(2007) avec du violet crystal. Les plaques
virales sont ensuite comptes manuellement (Zhu et al., 2007)ou avec un microscope
stroscopique (Garssen et al., 1995) pour dterminer le titre viral.

I.D.7.c. Limites

Deux points peuvent limiter lutilisation des tests de rsistance lhte (Germolec,
2004 ; Burleson et Burleson, 2007). Tout dabord la variabilit inter-individuelle de
rsistance, qui peut tre un facteur dobtention de rsultats non significatifs. Dautre
part (et en partie pour limiter cette variabilit inter-individuelle), le recours un grand
nombre danimaux pour ces tests.

Par ailleurs, le dveloppement dun seul modle de rsistance nest pas suffisant pour
explorer un pouvoir immunotoxique(Garssen et al., 1995 ; Zhu et al., 2007).

90
 I.D.8. Quantification des cytokines

Les cytokines sont des molcules cls dans la rponse immunitaire. Leur dosage en
immunotoxicologie est un outil important dans la comprhension des mcanismes et
la prdiction de limmunotoxicitdun mdicament.

Lvaluation de ce paramtre est dautant plus importante, depuis le phnomne de

tempte cytokinique ( cytokine storm ) observs avec le TGN1412 (cf. 1re partie,
II.B.2).

I.D.8.a. Paramtres valus

> Actions du mdicament sur les cytokines

House (1999) listent et illustrent les diffrents mcanismes daction possible dun
mdicament pouvant modifier le dosage des cytokines :
- une toxicit directe contre les cellules productrices de cytokines
(mdicaments anti-mtaboliques comme lazathioprine ou bien
antimitotiques comme lecyclophosphamide) ;
- une inhibition de la production de cytokines (la ciclosporine bloque la
cascade dactivation de facteurs de transcription dont ceux des cytokines,
le FK506 ou tacrolimus altre lexpression des gnes de lIL-2) ;
- une inhibition de la libration de cytokines (la pentamidineantiprotozoale
inhibe la libration de lIL-1) ;
- une induction de facteurs immunosuppressifs (le leflunomide induit la
production de la cytokine immunosuppressive le TGF-) ;
- une altration de lhomostasie cellulaire (le tenidap inhibe la production
de lIL-1, lIL-6 et de lINF en altrant lhomostasie ionique) ;
- une altration des mcanismes dactivation cellulaire ou des mcanismes
transcriptionnels (la rapamycine altre la progression du cycle cellulaire
la fin de la phase G1 en inhibant les voies de transduction du signal du
facteur de croissance).

91
 > Caractristiques des cytokines

Il est important de rappeler les principales caractristiques des cytokines pour mieux
comprendre les techniques de dosage.
Leur demi-vie est brve dans la circulation gnrale, leur action puissante, avant tout
et principalement locale se fait trs faible concentration (de lordre du pg/mL).

I.D.8.b. Techniques

> Prlvements

En tenant compte des caractristiques des cytokines, lapproche la plus adapte pour
leur dosage est disoler et de mettre en culture des cellules ou tissus comme source de
cytokines (House, 1999).

Deux mthodes sont proposes. Elles diffrent, entre autre, par le moment de
traitement par rapport au prlvement des tissus/cellules.

o Mthode ex vivo
Les animaux sont traits puis les tissus ou cellules (rate chez les petits animaux) sont
prlevs et cultivs in vitro.
Il est important de noter que cette mthodeexclut toute tude dans le temps. En effet,
les tissus/cellules sont soustraits lactivit immunotoxique potentielle, une fois
quils sont retirs de lanimal.

o Mthode in vitro
Les tissus ou cellules sont prlevs chez des animaux nafs (non traits) et cultivs in
vitro. La molcule teste est ajoute lors de la culture.
Cette techniqueapporte lavantage majeur de pouvoir bien dfinir la population
cellulaire sur laquelle travailler. Ce qui permet dvaluer les mcanismes et dutiliser
des contrles positifs plus facilement. Cette mthode permet galement de minimiser
le nombre danimaux utiliss, puisque de multiples critres peuvent tre valus en
utilisant des cellules dun seul animal. Elle rend galement possible lutilisation de
cellules de PNH ou dHomme (Langezaal et al., 2001 ; Langezaal et al., 2002;
Hermann et al., 2003).

92
o Recours des activateurs cellulaires
La majorit des cytokines sont scrtes suite une activation des cellules
immunitaires. Comme il a t expos ci-dessus, les mcanismes daction des
mdicaments sur les cytokines sont varis. Dans les cas o la molcule teste nactive
pas elle-mme directement les cellules productrices de cytokines, il est ncessaire,
pour russir quantifier les cytokines, davoir recourt des activateurs. Ces
activateurs seront alors spcifiques de la population cellulaire cible (Tableau 26).

> Quantification

Diffrentes techniques sont disponibles pour valuer quantitativement les cytokines

partir des cultures cellulaires ou tissulaires ex vivo ou in vitro.

o Les essais biologiques

Cette technique sappuie sur un matriau vivant (cellules, tissus isols ou mme des
animaux entiers) comme systme indicateur, pour un lment particulier analyser
(House, 1999). Cest en valuant laction dune cytokine sur le systme indicateur
quon estime sa prsence et son niveau dans lchantillon.
Dans le cas des cytokines, les systmes indicateurs sont des lignes cellulaires
dfinies (culture cellulaire monoclonale, en croissance continue). Cela permet de
saffranchir de la variabilit entre donneur, dassurer une disponibilit, de garantir
labsence de contaminations cellulaires et dviter le recours des processus de
purification fastidieux (Mire-Sluis et al., 1995).
Pour autant, un certain nombre de prcautions sont prendre :
- les lignes cellulaires ne doivent pas tre cultives plus de 3-6 mois,
- labsence de Mycoplasme doit tre value rgulirement,
- le srum ftal de veau doit tre choisi en limitant le plus son effet sur les
essais biologiques.

93
Les proprits des cytokines, dont les effets sur les cellules sont mesurables,
concernent la prolifration cellulaire, la cytotoxicit, la rsistance au virus, le
chimiotactisme (Tableau 22).
Hubbard (1999) propose quelques exemples :
- test de prolifration des thymocytes et activit de lIL-1,
- test cytotoxique de fibroblastes de souris L929 et activit du TNF-,
- test de prolifration dhybridomes 7TD1 et activit de lIL-6,
- test de prolifration des cellules B9 et activit de lIL-6,
- test dactivation des lymphoblastes par lIL-1.

94
Tableau 22 : Essais biologiques pour la mesure des cytokines

Proprit de la Principe du test Critre dvaluation Techniques

cytokine mise en
vidence
Tests de Prolifration (anti- Incubation de la ligne - Nombre total de - Manuelle (comptage
prolifration (anti- prolifration) cellulaire approprie avec cellules cellulaire)
prolifration) lchantillon tester
- Quantit totale - Scintillation liquide
dADN (incorporation de
thymidinetritie) (Carfi et
al., 2007)
- Mtabolisme
cellulaire - Colorimtrique (rduction du
MTT, lecteur de plaque
microtitre ELISA) (Carfi et
al., 2007)
Test de cytotoxicit Cytotoxicit Incubation de la ligne Nombre de cellules mortes Colorimtrique (bleu de trypan,
cellulaire approprie avec lecteur de plaque microtitre ELISA)
lchantillon tester
Test antiviraux Activit antivirale Incubation de cellules sensibles Nombre de cellules Colorimtrique (bleu de trypan,
avec lchantillon tester puis vivantes lecteur de plaque microtitre ELISA)
ajout dun virus cytopathique
Chimiotactisme Capacit induire Incubation de la ligne Nombre de cellules tant Manuelle (comptage cellulaire)
la diapdse cellulaire approprie avec passes travers la
lchantillon tester dans une membrane
chambre divise par une
membrane

95
 Leffet dun mdicament sur la quantit de cytokines peut se faire en comparant les
rsultats de lchantillon trait avec ceux de lchantillon non trait.
Prenons un exemple simple :on cherche valuer laction dun mdicament sur le
TNF-. Sachant que TNF-possde des proprits cytotoxiques sur une ligne
cellulaire donne, on ralise un test de cytotoxit sur lchantillon trait et sur
lchantillon non trait (tmoin). On compare le nombre de cellules mortes entre les
deux chantillons (Tableau 23).

Tableau 23 : Exemple de rsultats dun test de cytotoxicit

Nombre de cellules mortes Interprtation

chantillon trait > chantillon tmoin le mdicament stimule lactivit quantit
deTNF-
chantillon trait < chantillon tmoin le mdicament diminue lactivit de TNF-

chantillon trait = chantillon tmoin le mdicament na pas deffet sur lactivit

de TNF-
Les mthodes de mesure de la prolifration cellulaire comportent des avantages et des
limites rpertoris dans le Tableau 24.

Tableau 24 : Mthodes dvaluation de la prolifration cellulaire, avantages et

inconvnients (daprs Mire-Sluiset al., 1995)

Mthode Avantages Inconvnients

Comptage cellulaire (manuel) Simple Fastidieux, difficile
automatiser, pas adapt pour
un grand nombre
dchantillons
Mesure de la quantit dADN par Facilement automatise, Utilisation de la radioactivit
dtection de la quantit de adapte pour un grand
thymidinetritie incorpore dans nombre dchantillons
lADN (scintillation liquide)
Mesure du mtabolisme cellulaire Automatisation (lecteur de Index de stimulation rduit par
par le test de rduction du MTT plaque ELISA), adapte rapport la thymidinetritie
(colorimtrique, lecteur ELISA) pour un grand nombre car le MTT possde une forte
dchantillons toxicit cellulaire

96
o Les essais immunologiques
Ces tests consistent utiliser des anticorps spcifiques des cytokines recherches,
pour les isoler de leur matrice biologique (surnageant de culture cellulaire) et pour les
quantifier.
Deux techniques sont communment employes : lELISA et le RIA.

Limmobilisation de la cible (ici une cytokine dintrt) sur un substrat solide (une
plaque microtitre pour lELISA ; des perles inertes pour le RIA) se fait par
lintermdiaire dun anticorps spcifique dun pitope de la cible.
Une phase de rinage est ncessaire pour liminer le surnageant et les cytokines non
immobilises.
Un second anticorps coupl avec une molcule indicatrice (comme un radio-isotope
avec le RIA) ou bien avec une enzyme capable de catalyser un substrat en un produit
color (avec lELISA) est ajout. Lpitope, dont il est spcifique est diffrent du
premier anticorps.
Il est nouveau ncessaire de rincer, afin dliminer les seconds anticorps, non fixs
leur cible.
Dans le cas de lELISA, on mesure lintensit lumineuse par spectrophotomtrie aprs
avoir ajouter le substrat de lenzyme.
Dans le cas du RIA, on mesure directement la radioactivit de lchantillon.

Des exemples dELISA chez la souris (Lee et al. 2004) et sur sang humain avec des
kits commerciaux sont disponibles (Langezaalet al., 2001 ; Langezaal et al., 2002;
Hermann et al., 2003 ; Carfi et al., 2007).

o Les techniques de biologie molculaire

Elles permettent de quantifier les cytokines non pas dans un surnageant mais partir
des cellules. Ceci permet notamment de mesurer les cytokines non scrtes.
Les deux principales techniques sont la RT-PCR temps rel (Reverse Transcription
Polynuclear Chain Reaction) et lhybridation in situ (Vandebriel et al., 1998).
La RT-PCR temps rel est une technique de quantification indirecte. En effet, elle
mesure lARNm des cytokines, obtenu aprs lyse cellulaire.
Le principe de la RT-PCR est de transcrire lARNm en ADN et damplifier les
squences dacides nucliques.
97
La RT-PCR temps rel permet de quantifier lARNm. Le principe est dajouter des
sondes spcifiques de lARNm de la cytokine dintrt. Ces sondes deviennent
fluorescentes lorsquelles se fixent lADN transcrit. La PCR est couple
lmission dun signal fluorescent proportionnel la quantit de produit PCR gnr
au cours de cycles conscutifs. Ce signal augmente proportionnellement la quantit
de produit PCR gnr au cours de chaque cycle de raction successif.
Un exemple in vitro chez le Macaque (Flores et al., 2004 ; Kobayashi et al.,
2007)estdisponible.

Lhybridation in situ permet, grce des sondes marques (radio-activement ou non),

de mettre en vidence les cytokines intracellulaires dans des fragments de tissus ou
des suspensions cellulaires. Cette technique est trs sensible, mais fastidieuse,
coteuse et ncessite de nombreux contrles internes (Bienvenu et al., 1998). Elle a
lavantage de donner lorigine cellulaire ou tissulaire des cytokines.

o La cytomtrie en flux
Elle peut-tre utilise dans ce cas pour mettre en vidence les cytokines
intracellulaires.
Cette technique permet la fois de raliser un tri sur les cellules dintrt et de mettre
en vidence les cytokines recherches dans ces cellules.
Par exemple sur un prlvement sanguin, sur hparine, les donnes de dispersion
frontale et latrale sont utilises pour identifier et trier la population lymphocyte.
Ensuite, des anticorps fluorescents dirig contre le CD3 permettent didentifier les
lymphocytes T et dexclure les lymphocytes B. Enfin, des anticorps fluorescents
dirigs contre la cytokine dintrt permettent de mettre en vidence la cytokine dans
la cellule. Il est ncessaire, avant dajouter les anticorps devant rvler la prsence des
cytokines intracellulaires, de rendre les cellules permables (solutions commerciales
disponibles).
Fellman et al. (2011) proposent un protocole chez le Chien, Flores et al. (2004) chez
le Macaque.

> Comparaison des techniques

Les avantages et les limites des tests de quantification des cytokines sont prsents
dans le Tableau 25.
98
Tableau 25 : Avantages et limites relatifs des techniques dvaluation des cytokines
(daprs House, 1999)

ESSAIS BIOLOGIQUES
Avantages Dtectent seulement les molcules fonctionnelles ; trs sensibles (pg/mL
ou moins) ; peuvent tre utiliss pour valuer la production ou lactivit
des cytokines dans de nombreuses espces
Limites Souvent manque de spcificit ; cellules indicatrices quelquefois
problmatiques ; ncessite des cultures cellulaires ; temps et main
duvre ; peu utiles pour ltude des mcanismes
ESSAIS IMMUNOLOGIQUES
Avantages Rapides (2-4h) ; monospcifiques ; ne ncessitent pas de culture
cellulaire ; faciles raliser
Limites Peuvent ne pas dtecter les molcules fonctionnelles ; sensibilit peut
tre moins bonne quun essai biologique ; ractifs non disponibles pour
toutes les espces ; utilisation limite pour ltude des mcanismes
TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE
Avantages Trs spcifiques ; peuvent dtecter un changement lchelle dune
cellule ; dtection la plus prcoce des cytokines par rapport aux autres
techniques ; idales pour ltude des mcanismes
Limites Relativement chres et longues ; ncessitent un quipement et des
techniques spcialises ; ne dtecte pas les molcules fonctionnelles ; les
sondes ne sont pas disponibles pour toutes les espces
CYTOMETRIE EN FLUX
Avantages Trs spcifique ; trs sensible ; peut tre utilise pour valuer la
production de cytokine et laction lchelle cellulaire ; plusieurs
cytokines peuvent tre values en mme temps ; trs bonne mthode
pour ltude des mcanismes
Limites Lquipement est coteux et spcialis

99
 I.D.8.c. Limites

Un certain nombre de facteurs peuvent introduire des biais dans le dosage des
cytokines. Ils relvent la fois des caractristiques des cytokines et des moyens
techniques utiliss lors du prlvement, du stockage et du dosage. Il est important de
les connatre pour limiter au maximum leur impact sur la sensibilit et la spcificit
des tests.

> Techniques

o Prlvement
Lorsque le dosage est ralis dans le surnageant de culture, des facteurs solubles
intrinsques au prlvement peuvent interagir avec les tests. Ceci explique quil faille
prfrer le srum au plasma lors dessai biologique. En effet, le plasma peut faire
coaguler les cellules et rendre la lecture du test impossible.

o Anticoagulants
Les anticoagulants utiliss lors des prlvements peuvent stimuler la production de
cytokines in vitro ou bien interagir avec les tests de dosage. Il est donc conseill de
sparer rapidement les cellules du plasma/srum rapidement aprs le prlvement.
Dans les cas des essais biologiques, lusage de lEDTA est proscrire.

o Stockage
Les cytokines sont sensibles la chaleur. Cest pourquoi, si lanalyse ne peut pas tre
ralise tout de suite, ou bien si les prlvements sont collects sur une longue
priode, il est recommand de stocker les chantillons 80C. Il est important de
suivre le mme protocole pour tous les chantillons.

o Activation
Le stimulus activateur doit tre utilis la concentration la plus basse rsultant en une
activation cellulaire (mesure par la capacit prolifrer). Il est alors possible que des
altrations modestes dans la production de cytokines soient masques.

100
 > Caractristiques des cytokines

La plupart des cytokines peuvent induire des rponses diffrentes chez la mme
cellule et une mme cellule peut rpondre diffrentes cytokines. Le choix de la
ligne cellulaire est donc primordial lors des essais.
Comme il nexiste que trs peu de lignes cellulaires disponibles ne rpondant qu
une seule cytokine spcifique, il est possible :
- de cultiver les cellules indicatrices sur un milieu de culture en prsence de
la cytokine dintrt, ou bien dintroduire des anticorps spcifiques des
cytokines non dsires (House, 1999) ;
- dajouter des anticorps dirigs contre la cytokine dintrt dans un lot
dchantillons et de comparer les rsultats avec un lot sans anticorps. La
diffrence entre les deux sera laction spcifique de la cytokine dintrt
(Mire-Sluis et al., 1995).
De plus, certaines cytokines peuvent tre prsentes sous de nombreuses formes
molculaires (par exemple lIL-6). Dautres encore, possdent une forme immature
intracellulaire et une forme mature scrte (par exemple lIL-1 ). Lors dessais
immunologiques, de telles cytokines pourront tre sous-estimes.

> Sensibilit

Le phnomne de tempte cytokinique, dcrit lors des essais cliniques chez lHomme
du TGN1412, nont pas pu tre anticips par le dosage des cytokines lors des tudes
prcliniques. Lune des limites principales du dosage des cytokines en
immunotoxicologie prclinique est la corrlation entre un modle in vitro et un
modle in vivo, et galement la corrlation entre lanimal et lHomme.

101
 I.D.9. Activation des lymphocytes

I.D.9.a. Paramtres valus

Lactivation des lymphocytes peut svaluer en mesurant leur prolifration suite

lapplication dun mitogne.

I.D.9.b. Techniques

> Prlvements

Les tests de prolifration cellulaire sont des tests ex vivo (Smith et al., 2003)ou in
vitro (Lebrec et al., 1995 ; Carfi et al., 2007 ; Collinge et al., 2010) raliss sur des
lymphocytes sanguins ou splniques afin destimer leur ractivit. Les prparations
cellulaires sont des suspensions de cellules de rate ou des suspensions de cellules
mononucles du sang priphrique (Lebrec et al., 1995).

> Mitognes

Ils existent de nombreux mitognes. Les plus utiliss sont les lectines, elles se lient
des rcepteurs membranaires glycoprotiques et dclenchent la division cellulaire.
Ces lectines sont en gnral isoles partir de plantes (Tableau 26).

Tableau 26 : Principaux mitognes, leur origine et leurs cellules cibles (daprs

Tizard, 2008)

Mitogne Origine Cellules cibles

Phytohmagglutinine Phaselousvulgaris Lymphocytes T principalement,
(PHA) lymphocytes B
Concanavalin A (Con A) Canavalisensiformis Lymphocytes T
Mitogne phytolaque Phytolacca Lymphocytes T et B
(PWM) americana
Lipopolysaccharide Bactrie Gram Lymphocytes B
(LPS) ngative

102
 > Mesure

La prolifration cellulaire peut se mesurer par les diverses techniques dj voques

prcdemment dans le dosage des cytokines.
Rayward et al. (1997) utilisent la cytomtrie en flux pour mesurer la prolifration
cellulaire partir de cellules mononucles du sang priphrique de lHomme. Il utilise
des anticorps monoclonaux (coupls des lments fluorescents) dirigs contre des
constituants des lymphocytes pour colorer les lymphocytes (aucun dtail nest donn
quant lorigine).
Dans une autre technique (Lyons et Parish, 1994), la coloration des lymphocytes se
fait avec du CFSE. Ce colorant prsente lavantage lors de division cellulaire de se
rpartir entre les cellules filles. De plus, ltude peut se raliser aussi bien in vivo
quin vitro.
Smith et al. (2003) proposent eux, une variante de la mthode de quantification de
lADN, ne reposant pas sur la radioactivit, mais sur une technique colorimtrique
immunoenzymatique ELISA. Lincorporation de BrdU dans lADN des cellules en
division, est quantifie par lintermdiaire dun anticorps anti-BrdU conjugu une
peroxydase. Le principe est prsent dans laFigure 7. Un kit commercial ELISA-
BrdU est disponible (Smith et al., 2003).

103
Figure 7 : Principe gnral du test de prolifration cellulaire ELISA-BrdU

+ Brdu

Fixation et
dnaturation

+ Ac anti-Brdu
conjugu avec une
enzyme

+ Substrat

I.D.9.c. Limites

La mesure de ce paramtre sur des cellules animales est relativement insensible pour
prdire des dsordres de la fonction immunitaire (Vohr, 2005). Lutilisation de
lymphocytes humains semble plus sensible (Collinge et al., 2010)pour dtecter des
molcules immunosuppressives connues. Ce test (ex vivo) a par ailleurs tait trs utile
dans les tudes cliniques (Buhles, 1998).

I.E. Modle animal

Dans le cas dun modle in vivo, le choix du modle animal, de la souche, de la dose,
de la dure et de la voie dadministration doit tre cohrent avec les rsultats observs
dans les tudes de toxicologie gnrale (ICH, 2005 ; FDA - CDER, 2002).
104
Gnralement les deux sexes doivent tre utiliss sauf dans le cas particulier des
PNH, si ce nest pas le cas, cela doit tre justifi.

La dose maximale doit tre plus leve que la dose sans effet nfaste observ mais
infrieure la dose induisant des changements secondaires au stress.

Une gamme de dose croissante doit tre teste pour mettre en vidence dventuelles
relations dose-effet.

Lutilisation du mini-porc comme espce non rongeur en toxicologie et en

immunotoxicologie est un sujet dactualit (Bode et al., 2010). En effet les similarits
anatomiques, physiologiques et biochimiques sont nombreuses entre le porc et
lHomme et il semble que le profil de ractions en rponse aux actions toxiques du
mdicament soit similaire celui observ chez lHomme.

Des tudes dimmunotoxicologie, comprenant des tests fonctionnels, ont t conduites

chez le mini-porc avec des immunosuppresseurs connus (ciclosporine A,
dexamthasone, ). Les rsultats de ces tudes confirment limmunosuppression
induite par ces molcules, mais les tests montrent une sensibilit variable pour valuer
leffet immunosuppresseur (Bode et al., 2010).

II. PREDICTION DE LIMMUNOTOXICITE DIRECTE DUNE

MOLECULE PHARMACEUTIQUE BIOLOGIQUE ET
EVALUATION DE SON RISQUE

II.A. Rglementation
Ltude de limmunotoxicit directe dune molcule pharmaceutique biologique ne
fait pas lobjet de recommandations prcises dans la rglementation (ICH, 2011). Il
est prcis que la dmarche tage classique ralise pour les molcules chimiques
nest pas conseille. LICH encourage la ralisation dtude de dpistage dventuels
effets toxiques suivis par des tudes mcanistiques pour mieux comprendre les effets
toxiques observs.

105
II.B. Modle animal

II.B.1. Principes gnraux

Dans le cas particulier des molcules biologiques, lespce animale pertinente est une
espce dans laquelle la molcule teste est pharmacologiquement active du fait de
lexpression du rcepteur, ou dans le cas danticorps monoclonaux de lexpression de
lpitope.

ICH (2011) propose par exemple de commencer en tudiant lhomologie de squence

du rcepteur/pitope entre les espces (Ryan et al., 1999) puis de raliser des tests
cellulaires pour dterminer des similitudes qualitatives et quantitatives croises, tels
que laffinit de liaison, occupation du ligand/rcepteur et la cintique. Un manque de
similarit ne doit pas pour autant exclure un modle animal, mais les diffrences
doivent tre prises en compte pour lvaluation du risque chez lHomme (Schneider,
2008 ; Lynch et al., 2009).

ICH (2011) recommande galement dvaluer lactivit fonctionnelle soit par des
systmes de tests cellulaires spcifiques despces et/ou dans les tudes prcliniques
in vivo de pharmacologie ou toxicologie. Laction du mdicament sur une rponse
biologique connue ou sur un marqueur pharmacodynamique peut tre une preuve de
lactivit fonctionnelle du mdicament dans lespce animale (Ryan et al., 1999;
Haggerty et al., 1999).

II.B.2. Cas particuliers et alternatives

II.B.2.a. Absence despce pertinente

Il est possible quaucune espce pertinente ne puisse tre identifie, car le

mdicament biologique ninteragit pas avec la cible chez lanimal.

Plusieurs solutions sont alors envisageables.

> PNH et miniporcs

Le recours des espces animales moins frquemment utilises en toxicologie

prclinique est une des solutions proposes. Cependant, lutilisation des PNH de
106
faon plus systmatique saccompagne de contraintes rglementaires, de problmes
thiques et conomiques non nglibeables(NC3Rs/ABPI, 2006 ; Chapman et al.,
2009).

Lusage du mini-porc est envisag en remplacement des PNH comme modle animal
pour les tudes avec des mdicaments biologiques. En effet, lorsque le mini-porc est
choisi selon les critres rglementaires comme modle animal, les rsultats sont
similaires ceux observs chez le PNH (van Mierlo et Wolthoorn, 2009). Cependant,
les donnes sur la rponse des cibles porcines aux molcules humaines sont encore
rares. Ceci sexplique en partie par le fait que le miniporc est rarement inclus dans les
tapes de slection dun modle animal (Bode et al., 2010). Il conviendrait donc, pour
gnrer ces donnes, davoir recours une dmarche prospective qui consisterait
inclure les mini-porcs dans la slection des espces sensibles laction
pharmacodynamique du mdicament et/ou une dmarche rtrospective qui
consisterait tester des molcules biologiques existantes sur les cibles porcines.

> Protine homologue, modle transgnique

o Principe
Lutilisation dun homologue animal du mdicament (NC3Rs/ABPI , 2006 ; Chapman
et al., 2009 ; Lynch et al., 2009), ou bien danimaux transgniques (animaux
exprimant le rcepteur humain) (NC3Rs/ABPI, 2006 ; Lynch et al., 2009) a t
dveloppe pour limiter le recours des PNH. Ces modles permettent par exemple
de dtecter un ventuel danger et dvaluer les effets nfastes conscutifs une
exposition pharmacologique exagre (ICH 2011). Cette alternative est
particulirement optimise lorsque linteraction du mdicament avec la cible entraine
de consquences physiologiques similaires celles attendues chez lHomme(Lynch et
al., 2009 ; ICH, 2011).

o Limites
Le dveloppement de lquivalent animal de la molcule protique est fastidieux. De
plus, lvaluation ne se fait pas sur la molcule qui va tre value chez lHomme or
les facteurs de production ne sont pas forcment identiques entre les deux molcules
(Lynch et al., 2009).

107
Concernant le miniporc, les chercheurs font face un problme majeur qui est le
manque de connaissances quand ltendue de la rponse de la molcule homologue
dans les tissus porcins au mdicament biologique humain (cytokines, anticorps
monoclonaux, ).

> Modles de la maladie

Plus rcemment, le recours des modles animaux similaires la maladie chez

lHomme a merg. Ce sont par exemple les modles animaux de la maladie, induits
ou spontans, des animaux knockout pour le gne ou encore des animaux
transgniques. Ces modles sont particulirement intressants pour valuer la toxicit
du mdicament (ICH, 2011).

II.B.2.b. Anticorps monoclonaux

Le cas particuliers des anticorps monoclonaux est important. Il a fait lobjet de

modifications rcentes dans la rglementation quand la slection dun modle
animal pertinent.

Auparavant, un profil de ractivit croise tissulaire (c'est--dire lexpression de

lpitope dans diffrents tissus) tait un lment de poids pour conclure sur la
pertinence du modle anima l(Haggerty et al., 1999 ; Ryan et al., 1999 ; ICH, 2011).
Ces tudes taient ralises par immunohistochimie, sur un panel de tissus de
diffrentes espces, en comparaison un panel de tissus humains, en utilisant des
puces ADN multi-espces, disponibles dans le commerce. Mais lexprience
malheureuse du TGN 1412 a tout remis en cause. En effet, le profil de ractivit
tissulaire croise tait similaire entre le Macaque et lHomme : le TGN 1412 ne se
liait pas un pitope autre que celui cibl pouvant conduire une ventuelle toxicit.
La limite de cette technique est quelle ne mettait pas en vidence la faon dont se
liait le mdicament sa cible et elle ne mesurait pas les consquences directes de
laction du mdicament sur sa cible. Stebbings et al. (2007)ont montr que le TGN
1412 doit tre orient dune certaine faon pour induire une prolifration
lymphocytaire et une tempte cytokinique. Et de plus, que les lymphocytes du
Macaques ne rpondent pas aussi intensment la stimulation par le TNG 1412.

108
Aujourdhui, il existe une alternative plus sensible avec la cytomtrie en flux qui
mesure la liaison de lanticorps monoclonal des cellules (ICH, 2011).

III. PREDICTION DES ALLERGIES ET DES REACTIONS

AUTO-IMMUNES DUNE MOLECULE PHARMACEUTIQUE
ET EVALUATION DE SON RISQUE

III.A. Etude des facteurs de risque

III.A.1. Induction dhypersensibilit

III.A.1.a. Rglementation

Lvaluation du pouvoir sensibilisant dune molcule en dveloppement sapplique

aux petites molcules chimiques ractognes (haptnes) capables de former un
complexe immunogne avec une protine porteuse endogne et aux molcules
biologiques (FDA - CDER, 2002).

Les facteurs de risque sont (FDA - CDER, 2002) :

- le degr dimmunognicit de la molcule,

- la voie dadministration,
- la pharmacocintique et le mtabolisme du mdicament,
- les facteurs gntiques de lhte,
- le type de lymphocytes T spcifiques du mdicament et/ou danticorps anti-
mdicament produits.

Ainsi les cas suivants doivent faire lobjet de tests systmatiques (FDA - CDER,
2002).

- Toute molcule devant tre administre par voie intranasale doit tre value
de faon systmatique pour lhypersensibilit de type I.
- Toute molcule administration topique doit tre value de faon
systmatique pour lhypersensibilit de type IV.

109
 - Les anmies et les dommages tissulaires vocateurs (par exemple une
vascularite) pouvant suggrer des ractions immunes doivent tre caractriss
(Test de Coombs, recherche danticorps ou du complment par
immunohistochimie).

III.A.1.b. Capacit de liaison du mdicament une protine

Les petites molcules peuvent devenir allergisantes si elles ou un de leurs mtabolites

se lient de faon covalente une protine.
La dtermination de la capacit du mdicament se comporter comme un haptne
peut tre intressante.
Mme si la liaison une protine ne doit pas tre considre comme un moyen de
prdire un potentiel allergisant, ce peut tre une information intressante, notamment
quand la molcule est de la mme famille quune molcule connue pour produire de
lhypersensibilit.

III.A.2. Induction de ractions auto-immunes

III.A.2.a. Rglementation

Il nexiste pas de mthode standard pour dterminer le potentiel produire des

ractions auto-immunes pour les molcules exprimentales (FDA - CDER, 2002).
Plusieurs techniques sont proposes, cependant aucune dentre elles na t
suffisamment valide ce jour pour tre utilise de faon gnrale en dveloppement.

III.A.2.b. Rsultats dhistopathologie

Certaines altrations dtectes en histopathologie peuvent tre dorigines auto-

immunes.Leurs observations doivent par consquent tre analyses de manire
approfondie pour dterminer le mcanisme et lorigine, auto-immuns ou non.

110
 > Organes non lymphodes

Le principal marqueur dune raction auto-immune est linflammation. Par

consquent des changements inflammatoires en histopathologie des tissus non
lymphodes peuvent tre indicateurs dune raction auto-immune (Kuper et al., 2000).

o Lsions typiques
Il existe des changements typiques qui doivent alerter le pathologiste quant une
origine auto-immune possible. Ces lsions sont entre autres :

- des vascularites
- des inflammations la jonction derme-piderme,
- des extensions de la matrice extracellulaire.

Bien que ces signes soient manifestes, ils ne sont que rarement rencontrs dans les
tudes de toxicologie gnrale subaigus et subchroniques(Kuper et al., 2000).

o Infiltration par des cellules mononucles

Linfiltration des tissus affects par des cellules mononucles (lymphocytes) est un
indicateur plus prcoce que les lsions typiques pour suspecter une maladie auto-
immunes. En effet, de nombreuses affections auto-immunes se caractrisent par de
telles infiltrations (par exemple : les arthrites rhumatodes, les thyrodites
chroniques). Cependant, il est important de noter que de telles infiltrations ne sont
pas pathognomoniques de ractions auto-immunes, elles peuvent tre galement
prsentes lors dallergies, dinfections virales et bactriennes (Kuper et al., 2000).

Pour certaines souches de rat (Wistar et Fischer), il est possible dobserver des
infiltrations de cellules mononucles dans le foie, les poumons et les glandes
lacrymales chez des animaux non traits. Une des hypothses est la survenue
dinfections non remarques (Kuper et al., 2000). Ces deux souches sont par ailleurs
peu prdisposes dvelopper des ractions auto-immunes, notamment car elles
rpondent prfrablement par une rponse Th1 que par une rponse Th2 et ce mme
pour des antignes qui chez dautres souches dclenchent une rponse Th2 (Kuper et
al., 2000).

111
o Formation de granulomes
Linfiltration des tissus par des cellules mononucles peut tre suivie de la formation
de granulomes lorsque les macrophages ne sont pas fonctionnels ou bien quand
lantigne ne peut tre limin (Kuper et al., 2000).

> Organes lymphodes.

Les maladies auto-immunes sont souvent accompagnes daltrations des organes

lymphodes (hyperplasie du thymus lors de maladie auto-immune chez le rat Brown
Norway trait au chlorure de mercure). Dans certains cas, ces changements peuvent
mme prcder la maladie (hyperplasie folliculaire chez la souris New Zealand Black
avant lapparition du lupus rythmateux systmique) (East et Branca, 1969 ; Kuper
et al., 2000).

> Immunohistochimie

Le recours des techniques dimmunohistochimie peut savrer utile pour dtecter

des dpts dimmuns-complexes dans les tissus, la composition de la matrice
extracellulaire modifie, le phnotypage des lymphocytes et des macrophages. Ces
lments peuvent permettre ensuite de mieux caractriser linflammation.

112
III.B. Dtection dun pouvoir sensibilisant

III.B.1. Hypersensibilit de type I ou anaphylaxie

Les tests de mise en vidence de lhypersensibilit de type I sont des tests in vivo ou
ex vivo.
Historiquement pratiqus chez le Cobaye (Hattori et al., 1997), certains protocoles
existent chez la Souris galement(Dearman et al., 2005 ; Repa et al., 2004).

III.B.1.a. Paramtres valus

Plusieurs tests sont disponibles. Ils ont tous pour but de mettre en vidence,
directement ou indirectement, la prsence dIgE spcifiques du mdicament, chez
lanimal trait.

III.B.1.b. Techniques

> ELISA

Les IgE spcifiques du mdicament peuvent tre doses directement dans le srum de
lanimal trait (Hattori et al., 1997 ; Repa et al., 2004). Le protocole est similaire
celui utilis pour le dosage des Ig lors de lvaluation de la rponse humorale (cf.
I.C.4.c).
Ce dosage nest cependant pas conseill, en effet lexposition un allergne nest pas
ncessairement suivie dune augmentation significative des IgE sriques (Dearman et
al., 2005).

> Anaphylaxie cutane passive

o Paramtres mesurs
Ce test permet de mettre indirectement en vidence les IgE, en observant les signes
cliniques locaux danaphylaxie.

o Protocole de sensibilisation
On administre, en intradermique, un animal sain, des dilutions de srum danimaux
traits avec le mdicament test. Aprs un temps de latence de 24-48 heures, on lui
administre en IV, le mdicament test (Hattori et al., 1997 ; Dearman et al., 2005).

113
o Rsultats
La rponse est positive (prsence dIgE anti-mdicament dans le srum de lanimal
trait) quand le site dinjection montre une rponse inflammatoire immdiate.
Il est quelquefois difficile de dtecter des rponses inflammatoires modres. Lajout
du colorant bleu Evans avec le compostest en IV permet de rvler plus facilement
linflammation. Ce colorant se lie lalbumine srique et ne quitte la circulation
sanguine que dans les sites dinflammation aigu o la permabilit vasculaire est
altre. Il forme alors des plaques bleues bien visibles dans les tissus. Le diamtre des
plaques est le critre de mesure de lintensit de la raction inflammatoire (Hattori et
al., 1997 ; Dearman et al., 2005).

> Anaphylaxie systmique active

o Paramtres mesurs
Ce test met galement en vidence, de faon indirecte, les IgE spcifiques du
mdicament, par lobservation des signes cliniques danaphylaxie gnralise.

o Protocole de sensibilisation
Une premire sensibilisation des animaux se fait par voies sous-cutane, trois fois
deux semaines dintervalle. Puis suit une phase de latence de 14 jours. A lissue de la
phase de latence, le mdicament est inject en IV et les signes cliniques sont observs
immdiatement.

o Rsultats
Lanaphylaxieactive systmique est gradue selon les critres chez le Cobaye (Hattori
et al., 1997) :
- ngative (-) : pas de raction anaphylactique ;
- lgre : grade 1 : prsentation de 2 symptmes parmi lagitation, mastication,
frottement nasal et toux ;
- modre : grade 2 : difficult respiratoire, cyanose ;
- svre : grade 3 : raction anaphylactique mortelle.
Elle est reconnue positive partir du grade 1

114
 III.B.1.c. Limites

> Valeur prdictive

La corrlation des tests cutans et de la srologie avec lintensit des signes cliniques
est faible (Tizard, 2008). De plus, bien que ces tests aient montr une bonne valeur
prdictive pour les protines, ce nest pas le cas pour les petites molcules chimiques
pour lesquelles sont observs des faux positifs (FDA - CDER, 2002). Cest pourquoi
lutilisation de ces tests pour lvaluation toxicologique de routine des nouvelles
molcules chimiques nest pas encourage (FDA - CDER, 2002 ; Bala et al., 2005).

> Distinction avec les ractions anaphylactodes

Comme il a t expliqu dans la partie 1, il existe des ractions pseudo-allergiques ou

anaphylactodes, dont les signes cliniques sont similaires ceux dune raction
anaphylactique. Cependant les mcanismes sont indpendants dune rponse
immunitaire spcifique, puisquils ne mettent pas en jeu les IgE (Descotes et al.,
2007). Par exemple dans une raction pseudo-allergique, la libration dhistamine par
des mastocytes nest pas mdie par des IgE.
Une raction anaphylactode peut tre diffrencie dune raction anaphylactique
vraie par diffrentes mthodes selon le mcanisme impliqu. Par exemple pour la
libration dhistamine par les mastocytes, un test in vitro est disponible (Shuto et al.,
1999 ; Yoshida et al., 2001). Il consiste incuber des mastocytes pritonaux de rat
avec le mdicament test, puis mesurer, par chromatographie liquide de haute
performance, lhistamine libre. Le rsultat de la libration dhistamine est exprim
en pourcentage de lhistamine totale (du surnageant et intracellulaire), obtenu par
hydrolyse des chantillons non traits.

III.B.2. Hypersensibilit de type IV ou hypersensibilit retarde

Certaines molcules, injectes en intradermique ou appliques en topique, induisent

une raction dhypersensibilit retarde (Figure 6)
Historiquement de nombreux tests sont dcrits, avec notamment le premier test mis au
point : le test de Draize en 1944.

115
Actuellement, il existe des tests in vivo chez le Cobaye et la Souris et un test in vitro
chez lHomme.

III.B.2.a. Paramtres valus

Selon les tests, diffrents lments de la rponse dhypersensibilit retarde peuvent

tre mesurs.
Pour les tests de sensibilisation de contact, on sintresse la raction locale cutane
au site dinjection/application du mdicament.
Pour le LLNA, on mesure la prolifration cellulaire au niveau du nud lymphatique
drainant la zone dapplication du mdicament. Dans le cas du test sur des cellules de
sang priphrique dHomme, le paramtre valu est lactivation des cellules
dendritiques.

III.B.2.b. Tests de sensibilisation de contact

Les tests de sensibilisation de contact chez le Cobaye sont le test de Bhler et le test
de maximisation. Ces tests font lobjet dune ligne directrice de la part de la
rglementation europenne (OECD, 1992) et sont galement cits par les
recommandations FDA (FDA - CDER, 2002).

> Paramtres valus

Ils consistent mesurer la raction cutane inflammatoire suite une application

intradermique ou topique de la molcule teste (Maurer, 2007).

> Sensibilisation

Le principe gnral est semblable pour ces deux tests. Il consiste en :

o une phase dinduction de 2-3 semaines, durant laquelle lanimal est sensibilis
la molcule, avec des traitements intradermiques ou topiques rpts ;
o une phase de repos de 7-10 jours, sans traitement ;
o une phase de rappel ou provocation : traitement topique dun site diffrent.

116
 > Rsultats

Les ractions cutanes sont values macroscopiquement (Maurer, 2007). Elles sont
gradues selon leur intensit :
- 0 : changements non observables
- 1 : rythme discret ou incomplet
- 2 : rythme modr et confluent
- 3 : rythme intense et gonflement.

Une molcule est classe en allergne faible ou fort en fonction du nombre danimaux
montrant des ractions aprs la phase de provocation, non pas en fonction de
lintensit des rponses observes lchelle individuelle.

Les diffrences dans le protocole des ces tests sont prsentes dans leTableau 27 :
Diffrences entre le test de maximisation et le test de Bhler (daprs Tableau 27.

117
Tableau 27 : Diffrences entre le test de maximisation et le test de Bhler (daprs
Maurer, 2007)

Test de maximisation Test de Bhler

Nombre de cobayes 10 20
Phase dinduction
Type de traitement Semaine 1 : injection Traitement occlusif
intradermique avec pendant 6h
adjuvant complet de
Freund
Semaine 2 : traitement
occlusif pendant 48h
Nombre de traitements Semaine 1 : toutes les Trois fois, raison de 1
injections le mme jour fois/semaine pendant 3
Semaine 2 : une fois semaines
Concentrations de la Semaine 1 : concentration Suprieure 10 fois la
molcule teste maximale tolre concentration dutilisation
Semaine 2 : concentration
minimale irritante
Phase de provocation
Type de traitement Traitement occlusif Traitement occlusif
pendant 24h pendant 6h
Nombre de traitements une fois une fois
Concentration de la Concentration maximale Concentration dusage
molcule teste non-irritante

La sensibilit du test de maximisation chez le Cobaye savre suprieure celle du

test de Bhler.
Le test de Bhler est davantage utilis en screening pour les sensibilisants forts et en
test prdictif secondaire pour lHomme dans le cas de sensibilisants plus faibles.
linverse le test de maximisation chez le Cobaye a t dvelopp pour le screening
des allergnes faibles et forts pour viter domettre un test prdictif pour lHomme.

118
 > Limites

Pour le test de Bhler comme pour le test de maximisation, des faux positifs sont
observs par comparaison avec les rsultats des essais chez lHomme. Cependant, ce
sont les tests ayant montr la corrlation la plus importante avec des sensibilisants
cutans connus chez lHomme.

III.B.2.c. Le LLNA

> Paramtres mesurs

Le test de sensibilisation de contact chez la Souris, le LLNA, permet de mettre en

vidence lactivation du nud lymphatique drainant la zone dapplication
(sensibilisation de contact) de la molcule teste. Le paramtre mesur est la
prolifration des cellules du nud lymphatique (Kimber, 2001).
Il permet didentifier, mais galement de graduer le pouvoir sensibilisant cutan dune
molcule.

> Sensibilisation

La sensibilisation consiste en :
- une application quotidienne de la molcule teste, sur la face dorsale de
chacune des oreilles, pendant 3 jours conscutifs ;
- une phase de repos de 2 jours, sans application ;
- une administration IV de thymidinetritie.

> Rsultats

Les animaux sont sacrifis 5h aprs ladministration IV de thymidinetritie. Les

nuds lymphatiques auriculaires sont exciss et rassembls par groupe de traitement.
Des suspensions de cellules isoles sont prpares partir des nuds lymphatiques.
La radioactivit incorpore par les cellules est mesure par un compteur de
scintillations .

Pour chaque concentration dapplication, un index de stimulation est dfini par

rapport au groupe de contrle trait par le vhicule. Les molcules avec un index de
stimulation suprieur ou gal 3, pour une ou plusieurs concentrations, sont classes
dans les sensibilisants cutans.
119
Une valeur EC3 est calcule (concentration de la molcule ncessaire pour dclencher
un index de stimulation de 3). Plus le potentiel sensibilisant dune molcule est grand,
plus lEC3 sera petit.

> Alternatives

o Techniques
Il existe galement deux alternatives au LLNA standard, ne ncessitant pas la
radioactivit.
Le LLNA : DA mesure la prolifration cellulaire en quantifiant, par bioluminescence,
ladnosine triphosphate (OECD, 2010a ; Omori et al., 2008).
Le LLNA : BrdU sappuie soit sur lELISA coupl la spectrophotomtrie, soit sur la
cytomtrie en flux pour mesurer lintgration du 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) non
radioactif dans lADN (OECD, 2010b ; Kojima et al., 2011).
La lecture des rsultats par cytomtrie en flux, permet grce au phnotypage
cellulaire, de faire la diffrence entre un irritant et un allergne faible (Burchiel et al.,
1999 ; Kirk et al., 2007).

o Validation
LECVAM (2008) donne une liste de produits de rfrence recommands pour
lvaluation dune mthode modifie du LLNA. Pour dmontrer une capacit
prdictive aussi bonne que le test LLNA standard, la mthode modifie doit tre
capable de classer correctement (sensibilisants ou non-sensibilisants) les 18 molcules
de rfrence.

III.B.2.d. Alternative in vitro chez lHomme

Lavantage majeur de cette technique est davoir des conditions plus proches de lin
vivo chez lHomme

> Paramtres mesurs

Reuter et al. (2011) proposent une mthode partir de cellules sanguines humaines,
mesurant la prolifration in vitro des cellules dendtrique.
En effet, parmi les cellules jouant un rle dans lhypersensibilit de type IV (Figure
6), les cellules dendritiques ont une place centrale par leur capacit capturer,
120
modifier et prsenter lantigne. Elles reprsentent la part la plus importante des
cellules prsentatrices dantigne dans la peau o elles sont aussi appeles cellules de
Langerhans.

> Techniques

o Isolement des cellules dintrt

La source de cellules dendritiques choisie par Reuter et al.(2011) sont les monocytes
sanguins (CD1abas/CD14haut). Ils les isolent des cellules mononucles du sang
priphrique par slection positive (Ig anti-CD14 couple des microbilles) ou par
slection ngative (kit commercial).
Ils stimulent leur diffrentiation en cellules dendritiques immatures
high low
(CD1a /CD14 ) par incubation avec de dIL-4 et du GM-CSF.

o Mesure
Les cellules dendritiques immatures sont ensuite mises en culture pendant 48 heures
avec le mdicament test.

Lactivation des cellules dendritiques est mesure en valuant lexpression du

marqueur CD86 leur surface par cytomtrie en flux.

Le pourcentage de cellules CD86+ est dtermin pour chaque chantillon et la

diffrence entre le rsultat des chantillons traits et des chantillons de contrle est
mesure (CD86).
Si CD86>20% le mdicament est considr comme sensibilisant.

o Limites
La concentration de cytokines ajouter pour induire la diffrenciation des monocytes
en cellules dendritiques est prsente comme un point critique (Reuter et al., 2011).
De mme, la cytotoxicit pour chaque chantillon pose problme. En effet partir
dun certain pourcentage de cellules mortes (20% pour Reuter et al., 2011), le
pourcentage de CD86+ augmente significativement, donnant donc des faux-positifs.

121
 III.B.2.e. Bilan et limites

> Tests de sensibilisation de contact et LLNA

Le Tableau 28prsente une synthse en parallle des points positifs et des

inconvnients des tests traditionnels sur le Cobaye et du LLNA.
Tableau 28 : Avantages, limites et objectifs des mthodes chez le Cobaye et le LLNA
(daprs Maurer, 2007)

Tests sur cobaye LLNA

- Temps ncessaire d1
- Phase dinduction et de provocation
semaine
incluses
- Test de plusieurs
- Test de Bhler : traitement topique
concentrations inclus
rend facile le test des formulations
dans le protocole
- Test de maximisation : sensibilit
standard
Avantages leve
- Validation
- Test de ractivit croise dagents
internationale ralise
chimiques et test de diffrentes
- Paramtre sensible
formulations possibles pendant la
utiliss pour mesurer la
phase de provocation
prolifration cellulaire.
- 40 ans dexprience

- Temps ncessaire de 3 6 semaines - Seule la phase

pour un test complet dinduction est incluse
- Test de Bhler : faible sensibilit, - Faux-positifs possibles
seconde tape de tests chez lHomme avec des irritants
Limites envisager - Radioactivit
- Test de maximisation : irritation locale - Sensibilit de la
due au traitement adjuvant ; une mthode avec les
modification de la mthode est formulations non
ncessaire pour les formulations connues
- Identification du danger
Objectifs - Identification du danger et indication du
potentiel sensibilisant

122
 > Technique in vitro

La validation de cette mthode reste limite car peu de molcules ont t testes ce
jour. Il faut souligner que les rsultats trouvs avec ce test donnent des rsultats
similaires au LLNA pour des molcules connues (sensibilisantes et non
sensibilisantes).
Une tude de validation inter laboratoire doit encore tre ralise en testant
davantage de molcules, mais cette technique est prometteuse.

III.C. Dtection dun pouvoir induire des ractions auto-immunes

La survenue de maladies auto-immunes induites par des mdicaments est trs faible et
de nature idosyncratique. Ce qui peut sexpliquer par une tiologie multifactorielle et
des mcanismes sous-jacents complexes. Cependant, tant donn linconfort quelles
peuvent entraner voire des situations dangereuses, elles ncessitent dtre explores
en toxicologie pr-clinique (Pieter, 2007).

III.C.1. Des moyens limits

La technique voque par la rglementation nord-amricaine est la technique du nud

lymphatique poplit (PLNA) (FDA - CDER, 2002), cependant aucune donne ne peut
justifier une utilisation gnrale en dveloppement pr-clinique.Pieters (2007) voque
dautres techniques en phase dlaboration, qui pourraient dans le futur venir en
complment du PLNA.

III.C.2. Test du nud lymphatique poplit

Il existe quatre formes du test du nud lymphatique poplit :

- la forme directe
- la forme secondaire
- la forme adoptive
- la forme modifie

123
 III.C.2.a. La forme directe

> Paramtre valu

Lobjectif de ce test est de mesurer lhyperplasie du nud lymphatique poplit aprs

une injection sous-cutane de la molcule teste dans le coussinet de la patte
postrieure dune souris ou dun rat.

> Protocole

Jour 0 : injection de la molcule dans un coussinet dun membre postrieur et

injection du volume quivalent de vhicule dans le coussinet du membre postrieur
oppos.
Jour 7 : retrait et dissection des nuds lymphatiques poplits

Le choix des doses est arbitraire (Ravel et Descotes, 2005).

> Modle animal

Ce test est plus frquemment ralis chez la souris que chez le rat. La souche murine
la plus couramment utilise est la souche Balb/c, mme sil nexiste pas de variations
inter-souches mises en vidence (Ravel et Descotes, 2005).

> Rsultats

o Index de poids
Les nuds lymphatiques sont tous pess et lindex de poids (poids du NL trait/poids
du NL contrle) est calcul.
Une rponse ngative est un index de poids ~1.
Il ny a pas daccord concernant les rponses positives, deux mthodes existent pour
traiter les rsultats (Ravel et Descotes, 2005).

o Index de cellularit
Il est aussi possible de prparer des suspensions de cellules isoles partir des nuds
lymphatiques et de dnombrer les cellules (par cytomtrie en flux ou manuellement
au microsope). Lindex de cellularit, critre plus sensible que lindex de poids, est
calcul (cellularit du NL trait/cellularit du NL contrle) (Ravel et Descotes, 2005).

124
 > Limites

o Sensibilit et spcificit
Le PLNA direct manque de sensibilit et spcificit.

Les deux limites principales de ce test sont :

- lincapacit de montrer une activation spcifique des lymphocytes T et donc

de distinguer des irritants simples de molcules capables dinduire des
ractions auto-immunes (Pieters, 2007).
- la valeur prdictive dun test application sous-cutane pour un mdicament
administr par voie orale (les mtabolites du mdicament peuvent alors ne pas
tre les mmes).

Certaines modifications peuvent tre apportes pour amliorer ces deux points (Ravel
et Descotes, 2005).

La spcificit peut tre affine en phnotypant les sous-populations lymphocytaires

(par immunohistochimie ou cytomtrie en flux).
Pour les molcules normalement administres par voie orale, il est possible de pr-
traiter les rats avec des inducteurs denzyme ou bien dactiver in vitro le mtabolisme
de la molcule.

o Validation
La validation du PLNA est, selon Ravel et Descotes (2005), limite par deux points :

- le manque de connaissances claires des mcanismes impliqus dans la rponse

du PLNA.
- la divergence dans les objectifs de recherches du PLNA actuel, qui reflte
dans une large mesure les incertitudes sur les mcanismes dune grande partie
des ractions dhypersensibilit et dauto-immunit. En effet les donnes
disponibles suggrent que le PLNA direct est un outil prdictif des maladies
auto-immunes alors que le PLNA modifi permet de prdire linduction
dhypersensibilit immdiate, bien que les donnes rcentes ne permettent pas
de conclure sur ce dernier point.

125
 III.C.2.b. Les autres formes

Les autres formes de ce test mesurent des paramtres plus prcis du mcanisme
inflammatoire.

> La forme secondaire

o Paramtre valu
Cette mthode permet de mettre en vidence une rponse mmoire mdie par les
cellules T du nud lymphatique poplit (Ravel et Descotes, 2005).

o Protocole
Les injections ralises sont identiques celles du PLNA directe, mais le protocole
dinjections est diffrent (

Figure 8).

Figure 8 : Protocole du PLNA secondaire

Prlvement
Injection Injection des NL
4-6 semaines 4-6 jours

o Rsultats
Les calculs sont similaires ceux du PLNA primaire.

> La forme adoptive

o Paramtre valu
Cette technique montre la spcificit de lactivation des lymphocytes T pour la
molcule teste ou ses mtabolites.

o Protocole
Le principe du PLNA adoptif est de sensibiliser des souris avec une ou plusieurs
injections de la molcule teste. Puis ces souris sont sacrifies et des suspensions de

126
cellules isoles sont ralises partir de leur rate. Ces suspensions sont ensuite
irradies.
Puis le protocole suivant est ralis sur un lot de souris naves :
- Jour 0 : injection de la suspension de cellules isoles irradies dans le
coussinet dun membre postrieur
- Jour 1 : injection de la molcule teste dans le mme coussinet
- Jour 5-7 : prlvement des nuds lymphatiques poplits et dtermination de
lindex de poids ou de cellularit.

o Limites
La limite majeure son utilisation dans une tude dimmunotoxicit de routine
initiale est le grand nombre danimaux ncessaire.

> La forme modifie

Cette forme est galement appele PLNA- antigne rapporteur (Pieters, 2007).

Lobjectif de ce test est de comprendre les mcanismes immunologiques possibles

impliquant lactivation des cellules T (Ravel et Descotes, 2005 ; Pieters, 2007).

o Paramtres valus
La mesure de la rponse anticorps locale spcifique du TNP-Ficoll (2,4,6-
Trinitrophenyl) ou du TNP-ovalbumine, stimule par la molcule teste, est utilise
pour caractriser son potentiel immunostimulateur (Ravel et Descotes, 2005 ; Pieters,
2007).
En effet, le TNP est un haptne, qui conjugu au Ficoll (polysaccharide de haut poids
molculaire) ou lovalbumine (protine) peut devenir immunogne.
Le TNP-Ficoll est un antigne T indpendant et le TNP-Ovabulmine est un antigne
T-dpendant.
Par consquent, la prsence danticorps anti TNP-Ficoll met en vidence la capacit
de la molcule teste stimuler des cellules T spcifiques du noantigne. La
prsence danticorps anti- TNP-Ovalbumine manifeste au minimum un potentiel pro-
inflammatoire de la molcule teste (Ravel et Descotes, 2005 ; Pieters, 2007).

o Protocole
Jour 0 : injection de la molcule teste et de lantigne rapporteur dans le coussinet
dun membre postrieur, (TNP-Ficoll ou TNP-ovalbumine)
127
Jour 7 : prlvement des nuds lymphatiques poplits et dtermination de lindex de
poids ou de cellularit et mesure de la rponse anticorps spcifique de lantigne
rapporteur par ELISPOT (Gutting et al., 1999).

o Limites
Les contraintes techniques importantes et le faible rapport cot-efficacit en
comparaison avec le PLNA direct font que cest un test plus adapt pour ltude des
mcanismes que pour les tudes dimmunotoxict de routine.

128
IV. PREDICTION DE LIMMUNOGENICITE DUNE
MOLECULE PHARMACEUTIQUE BIOLOGIQUE ET
EVALUATION DE SON RISQUE

IV.A. Objectifs
Comme il a t expliqu dans la partie 1 (cf. 1re partie, III.B.2), la production
danticorps anti-protine thrapeutique (ADA : anti-drugantibody) est un facteur
limitant de lefficacit clinique dune molcule protique et une source de toxicit.
En effet, la prsence dADA peut altrer la scurit (raction croise avec la cible
endogne), lefficacit et les paramtres pharmacologiques (pharmacodynamie et
pharmacocintique) de la protine thrapeutique.
La dtection et la caractrisation des ADA en dveloppement prclinique sont
ncessaires pour :
- interprter les rsultats des tudes prcliniques chez lanimal ;
- prdire, dans la mesure du possible, leur formation chez lHomme.

IV.A.1. Interprtation des rsultats des tudes prcliniques

Les produits pharmaceutiques biologiques destins lHomme, sont gnralement

immunogniques chez lanimal (Wierda et al., 2001).

Cest pourquoi, au cours des tudes de toxicologie gnrale (toxicit dose rpte),
la rglementation (ICH, 2011, Addendum)recommande la dtection des ADA pour
aider dans linterprtation des rsultats de ces tudes, dans les cas suivants :

- lactivit pharmacodynamique est altre ;

- des changements inattendus surviennent dans la pharmaco/toxicocintique
du mdicament pendant la phase dadministration ou aprs ;
- des signes de ractions immunitaires apparaissent (anaphylaxie,
vascularite, ).

129
 IV.A.2. Prdiction de limmunognicit et de ses consquences
chez lHomme

La prdiction de limmunognicit chez lHomme est un souci majeur en phase de

dveloppement prclinique du mdicament.

La valeur prdictive des tudes non-cliniques repose entirement sur le choix du

modle de test adapt (in vivo, in vitro, in silico) et plus particulirement sur le choix
du modle animal adquate (Wierda et al., 2001).

Ce choix doit prendre en compte deux points importants.

Tout dabord, les protines thrapeutiques sont de plus en plus frquemment

humanises voire totalement humaines (pour rduire le risque dimmunognicit chez
lHomme) (Figure 9). Par consquent, le recours aux rongeurs ou aux carnivores est
limit(Putnam et al., 2010 ; ICH, 2011, Addendum).

De plus, la rponse immunognique chez lanimal peut ne pas avoir les mmes
consquences que chez lHomme. Donc mme en prenant une espce extrmement
proche de lHomme (comme les PNH), il est ncessaire de rester vigilant en analysant
les rsultats (Bussiere, 2005).

Figure 9 : volution de la nature des anticorps monoclonaux de 1980 2004 (Reichert

et al., 2005)

130
IV.B. Etude des facteurs de risque
La rglementation (European Medicines Agency 2008) dfinit plusieurs facteurs de
risque dimmunognicit chez lHomme.

IV.B.1. Molcule thrapeutique

Certaines caractristiques de la molcule thrapeutique favorisent lapparition

dADA.
Elles sont lies la structure de la protine dune part et, aux techniques de synthse
de la molcule dautre part (Bussiere, 2005 ; Kessler et al., 2006 ; Ponce et al., 2009)

IV.B.1.a. Structure

Les diffrences de squences protiques entre le mdicament et lquivalent

endogne, les diffrences de nature et dtendue des glycosylations et dautres
modifications post-translationnelles et la prsence de no-pitopes (par exemple lors
de la cration de protine de fusion) sont des facteurs augmentant lapparition
dADA.

Ces diffrences sont notamment importantes lorsque la molcule thrapeutique nest

pas totalement humanise. Aujourdhui dans lobjectif de rduction de
limmunognicit chez lHomme, les molcules protiques tendent tre pleinement
humaines ou partiellement.

Il est important de noter que mme lorsque les protines sont totalement humaines,
ilpeut y avoir la formation dADA.

La formation de nouveaux pitopes peut tre la rsultante de transformations

enzymatiques ou de vieillissement de la molcule qui entrainent par exemple des
oxydations.

Lagrgation protique qui rsulte en des protines de haut poids molculaire

composes de multimres de monomres nativement conformes ou dnaturs est
galement un facteur de risque de limmunognicit. Les mcanismes prcis ne sont
pas connus.

131
 IV.B.1.b. Production et stockage

Les tapes de fabrication de la molcule sont galement des facteurs de risque. En

effet, une modification dans lune dentre elles peut entraner une production dADA
contre la molcule, qui navait pas lieu ou de faon limite avant ces modifications.

Les interactions entre le(s) excipient(s) et la substance active peuvent tre modifies.
Cest le cas de lEPO, une rythropotine humaine recombinante utilise dans le
traitement des anmies chez les patients atteints dinsuffisance rnale ou sous
traitement anti tumoral(van Regenmortel et al., 2005). La molcule commercialise
ds 1989 na entrain lapparition dADA que chez trois patients avec une maladie
rnale chronique. partir de 1998, une augmentation de lincidence des ADA avec
un pic en 2002 est apparue. Plus de 200 cas sont rapports chez des patients atteints
de maladie rnale chronique traits par administration sous-cutane. Ce sont des
changements dans la formulation du mdicament partir de 1998, qui ont t
incrimins. La substitution de lalbumine srique humaine par du polysorbate 80 en
est la cause. En effet le polysorbate 80 ragit avec la pice en caoutchouc du piston de
la seringue amenant la lixiviation (cest--dire lextraction dun produit soluble par
un solvant) du polysorbate 80 qui agit alors comme un adjuvant.

Lors des processus de production et/ou de stockage, on peut galement voir apparatre
des impurets, des protines des cellules htes, des contaminants, la formation
dagrgats.

Cest pourquoi toutes les tapes (production, purification, formulation, stockage)

sont considrer.

IV.B.2. Population cible

IV.B.2.a. Facteurs gntiques

> Modulant la rponse immunitaire

Le polymorphisme alllique des CMH et des gnes codant pour les TCR peuvent
influencer la rponse immunitaire et agir sur les mcanismes de tolrance
immunologique.
132
 > Lis un gne dfectueux

Le facteur de risque majeur li la population cible est la prsence ou labsence de

version endogne de la molcule biologique.

En cas dabsence, comme dans certaines dficiences gntiques, la tolrance centrale

du systme immunitaire ne peut se dvelopper vis--vis de la protine endogne. Par
consquent, la protine thrapeutique sera considre comme un no-antigne et une
rponse immunitaire sera dclenche.

Lorsque la version de la protine endogne est diffrente de celle de la protine

thrapeutique, on pourra galement observer une rponse immunitaire vis--vis de la
protine thrapeutique.

IV.B.2.b. Age

Une rponse immunitaire contre une protine thrapeutique peut tre dpendante de
lge. La rponse immunognique chez des enfants peut tre diffrente de celle de
ladulte.

Ce facteur doit tre pris en considration, mais les tudes permettant dvaluer ce
risque sont des tudes cliniques.

IV.B.2.c. Maladie

Les tats pathologiques, maintenant le systme immunitaire actif, favorisent

lapparition dADA. Cest le cas dinfections chroniques ou de maladies auto-
immunes (arthrite rhumatodes, lupus rythmateux systmique, )

IV.B.2.d. Traitement concomitant

Un traitement concomitant peut augmenter ou diminuer le risque dune rponse

immunitaire la protine thrapeutique.

Cest le cas pour certains cancers o des agents immunosuppressifs sont administrs.
Il convient cependant dvaluer le caractre immunognique de la molcule
individuellement puis en association avec le traitement concomitant.

133
Il est important galement de prendre en compte des traitements prcdents qui
auraient un impact long terme sur le systme immunitaire.

IV.B.2.e. Schma thrapeutique

La voie dadministration, la dose administre, la frquence dadministration, la dure

de traitement doivent tre prises en compte pour valuer le risque dapparition
dADA.

La voie intraveineuse semble moins immunognique que celle intramusculaire ou

sous-cutane.

Les traitements de courte dure semblent dclencher moins de rponses immunitaires

que les traitements de longue dure.

Les produits administrs de faon continue sont habituellement moins

immunogniques que ceux donns de faon intermittente.

Les traitements intermittents ou avec des rexpositions aprs un intervalle de temps

sans traitement semblent associs des rponses immunitaires augmentes.

IV.B.2.f. Exposition prcdente une protine similaire ou

apparente

Des expositions prcdentes une protine similaire ou apparente la protine

thrapeutique peut avoir conduit une pr-sensibilisation et entraner une rponse
immunitaire.

134
 IV.B.3. Bilan

Le Tableau 29 rcapitule les caractristiques dune protine plutt faible risque ou

haut risque dinduction dADA chez lHomme.

Tableau 29 : Caractristiques des molcules protiques entranant une rponse

immunognique plutt faible et une rponse immunognique forte.

Caractristiques des produits risque Caractristiques des produits haut

immunognique plutt faible risque immunognique
quivalent endogne prsent quivalent endogne absent
Patients immunodprims Patients avec une maladie autoimmune
Dose unique Dose rpte
Produit humanis Produit tranger
Administration intra-veineuse Administration sous-cutane
Trs pur Prsence dimpurets
Absence dagrgats Prsence dagrgats

IV.C. Evaluation du risque clinique de limmunognicit

Il est important de distinguer les facteurs de risques dapparition de limmunognicit
dcrits ci-dessus des consquences cliniques de limmunognicit (Tableau 30). Selon
la dangerosit de ces consquences, le dcideur prendra des mesures adaptes lors des
tudes cliniques. Ainsi, plus le risque valu sera important, plus les tests de dtection
et de caractrisation des ADA seront frquents au cours de la phase clinique de
dveloppement.

135
Tableau 30 : Exemples de facteurs considrer dans lvaluation du risque de
squelles cliniques lies aux ADA (d'aprs Koren et al., 2008)

Haut risque de squelles cliniques Plutt faible risque de squelles

cliniques
Produit
lquivalent endogne existe pas de version endogne
lquivalent endogne est unique version endogne redondante
thrapie de remplacement nest pas une thrapie de remplacement
traitement rpt traitement dose unique
pas de voie intraveineuse possible voie intraveineuse possible
Cible
la version endogne existe pas de version endogne
la version endogne est unique version endogne redondante
tat de sant tat de sant
thrapie unique dautres thrapies existent
maladie mortelle pas une maladie mortelle
pas immunodprim immunodprim
maladie autoimmune/inflammatoire pas de maladie
autoimmune/inflammatoire

136
IV.D. Stratgie gnrale en dveloppement prclinique et techniques
La dmarche gnrale est similaire quel que soit lobjectif de la dtection des ADA
(cf. IV.A) (EuropeanMedicines Agency, 2008 ; Koren et al., 2008).

Elle sarticule en deux phases :

- la dtection : dpistage et confirmation de la prsence dADA ;

- la caractrisation des ADA (effet neutralisant, affinit, quantification, ).

IV.D.1. Dtection des ADA

IV.D.1.a. Stratgie

> Dpistage

o Objectif
Lobjectif de ltape de screening est de dtecter tous les chantillons prsentant des
ADA (Figure 10).

La technique choisie doit donc tre sensible (obtention de 5% de faux positifs) et

capable de dpister tous les isotypes.

o Dmarche
La dmarche consiste tester tous les chantillons pr- et post-administration du
mdicament avec le test de dtection choisi. Si la rponse obtenue est suprieure ou
gale au seuil de positivit, lchantillon est considr ractif. Si la rponse obtenue
est infrieure au seuil de positivit et que lchantillon contient la molcule
thrapeutique dans une quantit en-dessous de la limite de dtection des tests de
pharmacocintique, il est considr ngatif (Koren et al., 2008).

Un chantillon ractif est donc un chantillon dans lequel les ADA ont pu tre
dtects de faon spcifique ou non, alors quun chantillon ngatif est un chantillon
dans lequel les ADA ne sont pas prsents ou bien ne sont pas dtectables dans les
conditions du test (Shankar et al., 2008).

137
o Limites
Il est important de noter que pour des chantillons en-dessous du seuil mais contenant
une quantit importante du mdicament, le rle dune inhibition par le mdicament
doit tre considr. Ainsi le rsultat sera report comme ngatif mais avec
lannotation dune possible interfrence avec le mdicament.

De mme des chantillons ractifs mais prsentant une quantit importante de

mdicament peuvent tre sous-valus.

Enfin, si pour un chantillon le rsultat de dtection des ADA est ngatif mais quen
parallle les valeurs de PC/PD diminuent, les ADA ont dus tre indtectables avec le
test utilis du fait dun manque de sensibilit, de spcificit ou de facteurs
dinterfrences non contrls.

Des techniques de prtraitements (dissociation acide des complexes ADA-

mdicament par exemple) (Moxness et al., 2005 ; Patton et al., 2005; Smith et al.,
2007) ou des techniques de retrait du mdicament (Lofgren et al., 2007) permettent de
diminuer les interfrences provenant de la prsence du mdicament dans la matrice.

> Confirmation

o Objectif
Ltape de confirmation doit permettre dliminer les faux positifs (Figure 10). En
effet, ltape de dpistage a permis de dtecter les chantillons ractifs . Mais cette
ractivit peut avoir deux origines :

- des liaisons spcifiques : ADA-cible

- des liaisons non spcifiques (faux positifs) : lment de la matrice-cible.

o Dmarche
La dmarche de choix pour mesurer la spcificit des rsultats est un test dinhibition
spcifique avec le mdicament. Le principe des tests dinhibition est de mesurer avec
le mme test que celui utilis pour la dtection des ADA, le changement de signal de
rponse en ajoutant le mdicament dans la phase liquide (exemple avec ELISA)
(Dubois et al., 2007 ; Mikulskis et al., 2011).

138
Des mthodes alternatives moins employes existent : tapes de dpltion des
immunoglobulines ou bien tude de la liaison des anticorps en prsence et en absence
du mdicament immobilis dans le test.

o Limites
Il est important de rapporter la quantit de mdicament ajout pour observer le niveau
dinhibition voulu parce que des titres importants en ADA et une rponse IgM
peuvent tre difficiles faire diminuer (Ponce et al., 2009).

Figure 10 : Proposition de stratgie recommande pour la dtection et la confirmation

des ADA (d'aprs Koren et al., 2008)

IV.D.1.b. Techniques

Le format de test pour la dtection des ADA dpend des exigences individuelles de
chaque laboratoire. Aucun test nest prdominant sur un autre.

Les techniques les plus frquemment utilises sont des techniques immunologiques de
liaisons. Lobjectif est de mettre en vidence la prsence dADA dans le srum ou le
plasma danimaux traits en utilisant la liaison ADA-protine thrapeutique.

139
Le srum ou le plasma des animaux traits est mis incuber avec la protine
thrapeutique. Si des ADA sont prsents dans lchantillon, ils vont se lier aux
protines thrapeutiques. La liaison est ensuite mise en vidence grce des
techniques immuno-enzymatiques, immuno-radioactives, immuno-optiques, immuno-
chimiques(Wadhwa et al., 2003 ; Mire-Sluis et al., 2004)

> Techniques immuno-enzymatiques

o Principe
La technique immuno-enzymatique de prdilection est lELISA couple la
spectrophotomtrie.

Trois formats dELISA sont utiliss : direct, indirect, en opposition ( bridging ).

- Le format direct correspond lELISA classique prsent prcdemment

(cf. 2me partie, I.C.4.c). Pour la dtection des ADA, la protine thrapeutique
est immobilise au fond des puits de la plaque microtitre. Les dilutions de
srums des animaux traits sont ajoutes. Les ADA lis aux protines
thrapeutiques sont rvls par des anticorps dune espce animale diffrente
(conjugus une enzyme) dirigs contre les isotypes de lespce animale
exprimentale (Thorpe et Swanson, 2005).

- Le format indirect a t mis au point afin de garantir un revtement uniforme

et une bonne exposition de lpitope aux ADA. Lorientation et la rpartition
de la protine thrapeutique au fond du puits se fait, soit en recouvrant les
puits danticorps monoclonaux anti-protine thrapeutique, soit en utilisant le
complexe biotine-streptavidine (Mire-Sluis et al., 2004).
Il ncessaire de mener au pralable des tudes approfondies pour montrer que
les anticorps monoclonaux naltrent pas laccessibilit des pitopes dintrt
et que lpitope li na pas de pertinence clinique. Dubois et al. (2007)
proposent un protocole dtaill chez le singe.
Dans les formats direct et indirect, lutilisation dun anticorps marqu pour la
rvlation conditionne la dtection de lisotype et la spcificit despce.

- Le format en opposition ou bridging ELISA permet de saffranchir de la

spcificit despce et disotype. Il sappuie sur le fait que les ADA possdent

140
(comme tous les anticorps) deux sites de fixation lantigne. Les puits sont
recouverts avec la protine thrapeutique et les ADA lis sont mis en vidence
par lajout de la protine thrapeutique couple une enzyme (Figure 11)
(Thorpe et Swanson, 2005). Il existe une amlioration de ce format en fixant
la protine thrapeutique grce la liaison de la biotine avec la streptavidine
(Figure 12). Cependant, dans ce format, seuls les ADA lis par un seul site de
fixation la protine thrapeutique pourront tre dtects. La capacit
dtecter les anticorps de faible affinit est donc moins importante que pour les
deux formats prcdents. Patton et al. (2005), Liang et al. (2007) et Shin et al.
(2010) proposent des protocoles.

Figure 11 : Principe de l'ELISA en opposition (d'aprs Tizard, 2008)

Les puits sont recouverts avec le

mdicament

Les srums tester sont ajouts

Le mdicament coupl une enzyme

est ajout

Le substrat de lenzyme est ajout

141
Figure 12 : Principe gnral de lELISA-format en opposition avec lamlioration
avec la streptavidine et la biotine

Ac monoclonal thrapeutique coupl avec une enzyme

ADA
Ac monoclonal thrapeutique coupl avec de la biotine

Streptavidine

o Avantage
Lavantage majeur de cette technique est son dbit danalyse important (Mire-Sluis et
al., 2004).

> Technique de radio-immuno-prcipitation

o Principe
Le RIPA consiste incuber le srum des animaux traits avec la protine
thrapeutique conjugue un marqueur radioactif. Des billes de spharose-protine A
ou-protine G (la protine A et la protine G se lient la partie Fc des anticorps) sont
ajoutes. En centrifugeant, les billes sdimentent dans le culot du tube. Le culot est
rinc plusieurs reprises afin dliminer les protines thrapeutiques radioactives non
lies (des pigeages non spcifiques de la protine thrapeutique marque sont
possibles lors de la phase de prcipitation des bille) (Mire-Sluis et al., 2004).
La radioactivit est mesure avec un compteur gamma (Tacey et al., 2003 ; Gross et
al., 2008) (Figure 13). Comme pour lanticorps rvlateur dans le format direct et
indirect de lELISA, lagent prcipitant (la bille de spharose-protine A ou G)
conditionne la spcificit despce et disotype.

142
 Figure 13 : Principe gnral de la radio immuno-prcipitation(d'aprs Thorpe et
Swanson, 2005)

o Avantages
Contrairement aux mthodes ELISA qui sappuient sur un support solide, dans le
RIPA la liaison anticorps-mdicament seffectue en phase liquide. Ceci prsente
lavantage majeur davoir une exposition optimale des pitopes de la protine
thrapeutique.
Le dbit danalyse est similaire celui de lELISA (Mire-Sluis et al., 2004).

o Limites
Le RIPA ne peut tre considr sans tenir compte des problmatiques lourdes de
scurit pour le stockage, la manipulation et llimination des produits radioactifs. Par
ailleurs la technique de marquage radioactif doit tre reproductible.
Il est important galement de noter que les liaisons en phase liquide sont
potentiellement plus faibles que lors dimmobilisation sur une surface solide.
Enfin, cette technique est difficile mettre en uvre pour les anticorps monoclonaux
thrapeutiques (Mire-Sluis et al., 2004).

> Technique de rsonnance plasmonique de surface

o Principe
La rsonnance plasmonique de surface consiste mesurer la dviation optique du
rayon rflchi, provoque par la liaison de lADA la protine thrapeutique
immobilise sur une surface de dtection (biocapteur).
Langle du rayon rflchi ou angle de rsonnance varie en fonction de la quantit
dADA fixs la surface de dtection par lintermdiaire de la protine thrapeutique.
143
Plus la quantit dADA fixs est importante, plus le milieu est rfringent et donc plus
langle de rsonnance est grand (Figure 14).
Concrtement, le biocapteur est constitu dun support de verre recouvert dune fine
couche dor, et dun hydrogel rticul de dextrancarboxymthyl (Wadhwa et al.,
2003). La protine thrapeutique est immobilise de faon covalente sur cette surface.
Le srum des animaux traits dilu dans un tampon, circule flux constant dans le
canal dcoulement, la surface du biocapteur. Entre chaque chantillon, le canal
dcoulement est rgnr par un lavage qui permet de dcrocher les ADA (Liang et
al., 2007 ; Lofgren et al., 2007).

Figure 14 : Principe de la dtection de la liaison de lanticorps la surface sensitive

dans un test de rsonnance plasmonique de surface (d'aprs Thorpe et Swanson, 2005)

o Avantages
Lavantage majeur de cette technique pour la dtection des ADA est quelle ne
ncessite aucun marquage ou couplage de molcules et que les ractifs ne sont pas
spcifiques despce ou disotype. De plus lassociation ou la dissociation des
complexes ADA-protine thrapeutique immobilise est mesurable en temps rel.
Le dextran, du fait de sa relative mobilit, permet une exposition des pitopes
suprieure celle obtenue en phase solide.
Enfin, cette technique permet de dtecter des anticorps avec toutes les valeurs de taux
dassociation et de dissociation.

144
o Limites
Cette technique est souvent moins sensible que lELISA ou le RIPA.
Il est important de souligner que le dbit danalyse de ce type dappareil est bas et que
les ractifs sont spcifiques du fournisseur.
Dans le cas danticorps monoclonaux thrapeutiques, la prsence du ligand soluble
dans lchantillon peut donner lieu des faux positifs.

> Technique dlectrochimiluminescence format en

opposition

o Principe
Dans cette technique, des protines thrapeutiques sont couples avec le marqueur
luminescent et dautres avec de la biotine. Les srums des animaux traits sont mis
incuber avec ces deux couples. LADA forme un complexe avec la protine
thrapeutique biotinyle et la protine thrapeutique couple au marqueur luminescent
(ruthnium). Des microparticules tapisses de streptavidine sont rajoutes au mlange,
et les immuno-complexes sy lient par linteraction biotine-streptavidine. Par
aimantation, les microparticules tapisses dimmuno-complexes se dposent sur
llectrode, les lments non lis sont vacus par un lavage. Ensuite, le marqueur
luminescent soumis une diffrence de potentiel et une raction chimique passe par
un tat excit. En revenant son tat de base, il met de la lumire une longueur
donde dfinie (Figure 15) (Moxness et al., 2005 ; Liang et al., 2007). Le signal de
dtection est important pendant la dure de vie du conjugu avec la molcule
lectrochimiluminescente.

145
Figure 15 : Principe gnral de llectrochimiluminescence format en opposition
(d'aprs Moxness et al., 2005)

Drug : anticorps monoclonal thrapeutique

Analyte : ADA
Ru : ruthnium

o Avantages
Cette technique prsente un dbit danalyse important.
Les ractifs nont pas de spcificit despce ou disotype.
La raction en phase liquide optimise lexposition des pitopes.
Cette technique supporte des concentrations de matrice importante.

o Limites
Comme pour la rsonnance plasmonique de surface, les ractifs et lquipement sont
spcifiques dun fournisseur.
Par ailleurs, si la protine thrapeutique est un anticorps monoclonal et que la cible de
lanticorps monoclonal est prsente dans lchantillon test et possde deux des
pitopes identiques, elle peut entraner des faux positifs.

146
 IV.D.1.c. Limites gnrales des techniques de dtection

> Sensibilit

Les limites de sensibilit des techniques de dtection des ADA sont de plusieurs
ordres. Elles relvent des procds techniques, des cibles des ADA, de la composition
du prlvement tester.
Un certain nombre dtapes des techniques de dtection des ADA peuvent diminuer la
sensibilit de dtection. Ainsi limmobilisation sur une surface solide, la conjugaison
ou le marquage de la protine thrapeutique peuvent masquer, altrer ou dgrader les
pitopes cibles des ADA et empcher leur fixation.
De mme, si les ADA dtecter sont de faible affinit, les phases de lavage rptes
favorisent leur limination et leur non dtection.
Le manque de sensibilit dune technique peut galement venir du fait que la cible des
ADA nest pas la protine thrapeutique elle-mme ou la protine thrapeutique
modifie. Il faut alors considrer les autres lments de la formulation (excipients),
les ventuels contaminants biologiques pouvant tre issus du mode de production
(culture cellulaire), les altrations possibles de la protine thrapeutique lors de ces
phases et du stockage (oxydation de rsidus amino-acides, formation de formes
anormales comme un agrgat, dgradation du produit, formes coupes ou
dsamides). Ces modifications ne sont par forcment dtectes si elles apparaissent
en quantit faible ou bien de faon transitoire.
La composition du prlvement analyser joue galement sur la sensibilit de la
technique. La sensibilit des techniques de dtection est altre par tout lment
empchant les liaisons ncessaires pour mettre en vidence les ADA. Lobstacle
principal des techniques de dtection des ADA, notamment pour lELISA, est la
prsence du mdicament et/ou de complexes ADA-mdicament dans lchantillon.
Pour minimiser ce facteur, il est ncessaire dune part, de choisir le moment le plus
favorable, en tenant compte de la cintique du mdicament, pour prlever. Dautre
part, des procds de dissociation des complexes immuns (traitement lacide
actique) sont galement disponibles pour limiter les interfrences (Patton et al.,
2005 ; Smithet al., 2007 ; Mikulskis et al., 2011).

147
Dautres composants tels que des rcepteurs solubles de la protine thrapeutique, ou
bien des protines de liaison ou bien encore des lments de nature inconnue peuvent
altrer ces liaisons.

> Spcificit

La spcificit deces techniques est principalement altre par des lments de

lchantillon tester, capables de se lier aux ractifs de dtection comme un ADA.
Dans certains cas, la liaison est une raction croise (facteurs rhumatodes, anticorps
htrophiles). Mais il est galement possible, que des anticorps naturels spcifiques de
certaines protines (les cytokines, certaines molcules dadhsion) soient prsents
avant ladministration du mdicament. Pour ces raisons il est ncessaire dinclure
dans le test des contrles ngatifs appropris, choisis lors du dveloppement et de la
validation du test.
Par ailleurs, le non respect des phases de rinage pour lELISA, le RIPA et lECL et
les phases de rgnration pour le SRP peuvent tre des biais techniques lorigine de
faux-positifs .

IV.D.1.d. Dveloppement et validation dune technique de

dtection des ADA

> Dmarche

Mettre au point une technique de dtection des ADA est une tape fastidieuse. En
effet, ces techniques sappuient sur la liaison spcifique de lADA la protine
thrapeutique. Par consquent, pour chaque protine thrapeutique il faut dvelopper
et valider la technique de dtection.
La dmarche suivre fait lobjet de textes rglementaires (European Medicines
Agency, 2008 ; FDA - CDER et CBER, 2009)et de nombreuses publications
(Wadhwa et al., 2003 ; Mire-Sluis et al., 2004 ; Koren et al., 2008 ; Shankar et al.,
2008).
Elle sarticule en deux phases.
- La phase de dveloppement/optimisation permet dajuster les points pratiques
de la technique de dtection (Tableau 31).
- La phase de validation a pour but de dterminer les caractristiques du test
(Tableau 32).

148
Tableau 31 : Etapes de la phase de dveloppement/optimisation dun test de dtection
des ADA (d'aprs Mire-Sluis et al., 2004)

Phase de dveloppement/optimisation
- Choix de la technique
- Choix du type de matrice biologique
- Dtermination de la dilution minimum requise
- Dtermination de la concentration optimale des ractifs
- Evaluation de luniformit de la plaque microtitre

Tableau 32 : Etapes de la phase de validation dun test de dtection des ADA (d'aprs
Mire-Sluis et al., 2004 ; Shankar et al., 2008)

Phase de validation
- Valeur seuil de dtection
- Valeur seuil de spcificit
- Sensibilit
- Suitabilit
- Slectivit/interfrence
- Prcision
- Robustesse
- Stabilit
- Rigidit

Il nest pas possible daborder de faon prcise chaque tape (Mire-Sluis et al., 2004;
Shankar et al., 2008), seuls quelques points pratiques seront dvelopps.

> Ractifs

Les ractifs ncessaires pour dvelopper un test de dtection des ADA sont :
- le contrle positif
- le contrle ngatif et la matrice biologique
- le contrle qualit.

149
o Contrle positif
Le contrle positif est un chantillon de srum ou de plasma contenant de faon
certaine des ADA.
Lobtention dun contrle positif peut :
- se faire par immunisation ou hyper-immunisation (association avec un
adjuvant) dun individu avec le mdicament test ou bien,
- tre un panel danticorps monoclonaux (commercial en gnral).
Plusieurs points critiques sont prendre en considration pour la slection dun
contrle positif :
- le format de test choisi (espce dpendant comme lELISA- format direct ou
indpendant comme lELISA-format en opposition) ;
- le dlai dobtention des anticorps avec une technique dimmunisation ou bien
avec un panel danticorps monoclonaux ;
- le degr dhomologie entre le mdicament et son quivalent endogne (si les
deux molcules sont trop similaires, la rponse dimmunisation simple sera
faible).
Le choix de lespce animale immuniser doit donc prendre en compte :
- le format de test : espce dpendant ou non ;
- la capacit produire des anticorps comparable en affinit, avidit, classe et
sous-classe comparable lespce de ltude ;
- le dlai dapparition des anticorps ;
- le degr dhomologie entre le mdicament et lquivalent endogne dans cette
espce.
En tenant compte de toutes ces contraintes, il est recommand de choisir la mme
espce animale que lanimal dtude.
Dans tous les cas, il est important dvaluer la quantit obtenue pour sassurer que le
volume sera suffisant pour le dveloppement du test et pendant toute la dure de
ltude.
Il est important de purifier les prparations danticorps du srum ou plasma pour leur
utilisation dans la phase doptimisation et de validation du test.

o Contrle ngatif et matrice

Le contrle ngatif ainsi que la matrice biologique sont du srum ou plasma obtenus
partir dindividus non traits de la population cible ou dindividus dune population
150
saine. En gnral il est conseill de prlever les animaux de ltude avant la premire
administration du mdicament test. Pour les tudes prcliniques il est recommand
de prlever au moins 15 animaux et la quantit maximale possible pour permettre de
rpter les tests.
Le choix du contrle ngatif et de la matrice tiendra galement compte danticorps
prexistants, de protines de liaisons, de rcepteurs solubles possiblement prsents
chez les individus non-traits.

o Contrle qualit
Lutilit des contrles qualitest de suivre les performances et lacceptabilit du test
pendant ltude. Ils comprennent des contrles de qualit positifs :
- faible concentration montrant que le test est capable de dtecter des
chantillons positifs faible concentration ;
- forte concentration permettant dassurer la pertinence de la gamme de
dosage.
Ils sont obtenus par (hyper)immunisation dun animal de la mme espce que
lespce dtude.
noter que dans le cas o ce ne serait pas la mme espce, la matrice biologique
utilise pour la dilution doit tre de la mme espce que lespce dtude.
Le contrle qualit positif faible concentration doit tre situ juste au-dessus du
seuil de positivit de faon reproductible.
En cas dutilisation de ractifs commerciaux, il est conseill :
- de vrifier dventuels changements dans le produit,
- de prvenir une cessation ventuelle de production,
- de tester diffrents lots.

> Choix dune dilution minimum

Les chantillons positifs vont tre dilus dans un diluant pour dterminer la quantit
dADA.
Cette dilution permet galement de diminuer les interfrences dues aux lments
prsents dans la matrice des prlvements et qui pourraient entraner des liaisons non-
spcifiques.

151
Le diluant peut tre de diffrentes natures (par exemple similaire un tampon de
saturation (Dubois et al., 2007) ou bien du srum dindividus sains (Smith et al.,
2007).
La dtermination de la dilution minimum nest pas simple et consiste diluer avec le
diluant une srie dchantillons prlevs sur la population avant traitement (au moins
10 individus), dfaut sur des donneurs sains.
La dilution minimum est dfinie comme tant la dilution de lchantillon qui donne
un signal proche du signal de liaisons non-spcifiques du diluant utilis pour le test.

> Prsence dlments inhibiteurs dans la matrice

Il est important de tester si des lments pouvant inhiber la liaison ADA-mdicament

(par exemple le mdicament lui-mme) sont prsents dans la matrice du prlvement
(Mire-Sluis et al., 2004).
Ce point est particulirement critique pour ltape de quantification.
Lestimation dlments inhibiteurs sappellent recovery , elle consiste ajouter
une concentration basse et leve dune prparation dADA (polyclonaux ou
monoclonaux) dans :
- le tampon du test,
- le srum/plasma de 5-10 donneurs sains,
- le srum/plasma de 5-10 donneurs traits.
Il est conseill de prendre des donneurs qui expriment un niveau de liaison non
spcifique bas et haut.

IV.D.2. Caractrisation du pouvoir neutralisant des ADA

Les anticorps neutralisants bloquent lactivit biologique de la molcule thrapeutique

en se liant soit :
- directement (aux) pitope(s) qui corresponde(nt) au site actif de la molcule
thrapeutique
ou bien
- un pitope proximit du site actif, provoquant ainsi un encombrement
strique du site actif.
Ils peuvent avoir des consquences :

152
 - limites dans le cas o ils ne modifient que lefficacit de la molcule
thrapeutique ;
- dramatiques lorsquils ragissent de faon croise avec une protine endogne
homologue, non redondante et quils neutralisent son activit biologique.

IV.D.2.a. Stratgie

> Dpistage

Seuls les chantillons positifs pour les ADA seront tests (Figure 16).

Cest une approche au cas par cas pour chaque chantillon.En effet si par exemple
lincidence dADA est faible et que la toxicit est bien dfinie, la caractrisation
intensive des ADA et les analyses pour les ADA neutralisants ne seront que peu
justifies et ne remettront pas en question lexposition au mdicament.

A linverse, si lincidence dADA est forte et la toxicit est mal dfinie, la prsence
danticorps neutralisants doit tre considre pour valuer si les animaux ont t
correctement exposs au mdicament actif et si ltude a permis une valuation
adquate de la toxicit potentielle.

> Confirmation

De mme que lorsque des ADA sont dtects lors du dpistage et que leur prsence
doit tre confirme, la caractrisation dADA neutralisants ncessite par la suite une
tape de confirmation (Figure 16). Cette tape de confirmation consiste en un test
dinhibition par le mdicament et/ou un test de dpltion des immunoglobulines.

Les chantillons montrant une activit neutralisante dans le test initial peuvent
toujours tre reports comme ngatifs si leur spcificit ne peut pas tre prouve dans
le(s) test(s) de confirmation. Ils sont alors reports comme des chantillons ADA
neutralisant ngatifs avec une activit inhibitrice non relie aux ADA.

153
 Figure 16 : Proposition de stratgie recommande pour la dtection du pouvoir
neutralisant des ADA (d'aprs Koren et al., 2008)

IV.D.2.b. Techniques

Deux mthodes existent pour mettre en vidence le pouvoir neutralisant dADA :

- les tests cellulaires ou tests biologiques,
- les tests comptitifs non cellulaires de liaison au ligand.

> Tests cellulaires

o Principe
Le principe gnral dun test cellulaire est de mimer le mcanisme par lequel
lanticorps neutralisant exerce son effet in vivo. Ces tests reposent sur le principe que
tout chantillon contenant des anticorps neutralisants rduira ou supprimera lactivit
biologique due une concentration connue de la molcule thrapeutique (Sadick et
al., 1999 ; Gupta et al., 2007).Lactivit biologique de la protine thrapeutique est
value sur une ligne cellulaire, do lappellation de tests cellulaires .

154
Les molcules thrapeutiques peuvent tre classes selon leur effet fonctionnel sur la
ligne cellulaire (Gupta et al., 2007):
- effet agoniste (cytokines, facteurs de croissance, hormones, anticorps
monoclonaux agonistes) : action par liaison directe au rcepteur sur la surface
cellulaire cible et induction dune rponse mesurable ;
- effet antagoniste (anticorps monoclonaux antagonistes, rcepteurs solubles) :
action en empchant un ligand de se lier son rcepteur cible la surface des
cellules cibles.
Selon la nature de la molcule thrapeutique, les tests biologiques ne seront pas les
mmes(Gupta et al., 2007) :
- tests directs : tests pour les molcules thrapeutiques agonistes ;
- tests indirects : tests pour les molcules thrapeutiques antagonistes.

o Slection de la ligne cellulaire

Un point de dpart pertinent pour choisir la ligne cellulaire est souvent de choisir
celle utilise pour les tests defficacit biologique. Lavantage majeur de cette
approche est la maitrise dj acquise de la technique de culture de cette ligne
(condition, milieu).
Pour autant certaines prcautions doivent tre prises :
- laction du mdicament sur la ligne cellulaire doit tre valuable avec un
critre fonctionnel,
- le critre slectionn doit reflter un des aspects du mcanisme daction du
mdicament,
- le test doit tre facile raliser et le critre biologique choisi doit permettre de
tester le srum des espces et fonctionner avec une gamme de concentration
du mdicament assez large.
Il est possible dutiliser, comme alternative, des cellules transfectes avec le rcepteur
cible.
Comme ces tests sont utiles en dveloppement prclinique et clinique ainsi que dans
les tudes de pharmacovigilance, ils doivent tre compatibles avec des srums de
diffrentes espces. Cest pourquoi la spcificit de la rponse de la ligne cellulaire
au ligand ou bien au mdicament doit tre value en prsence de srum animal et de
srum humain lors du dveloppement du test, pour minimiser lavenir des efforts
importants de re-dveloppement pour les diffrents types dtudes.
155
Il faut galement porter une attention particulire aux conditions de maintien de la
ligne cellulaire qui peuvent modifier les rsultats du test. Par exemple une
diminution de la prcision dun test peut tre observe avec des cellules avec un grand
nombre de passages en culture.
Cest pourquoi il est recommand dtablir une banque de culture pour garantir la
disponibilit continue de cellules adquates pour garantir les performances optimales
du test.

o Diffrents tests et techniques associes

Quelques exemples de critres mesurables dactivit biologique et de techniques de
mesure associes sont prsents dans le Tableau 33.

156
Tableau 33 : Exemples de tests cellulaires de dtection des anticorps neutralisants et de techniques de mesure(d'aprs Gupta et al., 2007)

Critre du test Technique de mesure Action de lanticorps Remarques

neutralisant
Interactions la Cytomtrie en flux(Griffith et al., 1999 ; Baltrukonis et al., 2006) - interfre avec la liaison du - ncessite le marquage du
surface de la cellule Lobjectif est de mesurer la liaison du mdicament sa cible la surface de la mdicament au site cible la mdicament ou danticorps
cellule. surface de la cellule, ou anti-mdicament avec un
La dmarche consiste : - affecte linternalisation du marqueur fluorescent
- Cultiver les cellules en prsence des ractifs (mdicament et chantillons mdicament dans la cellule - important de dterminer
ADA +) limpact du marquage du
- Rvler la quantit de mdicaments lis sa cible, par lintermdiaire dun mdicament sur son activit
anticorps anti-mdicament fluorescent ou encore en utilisant ds le dbut un biologique
mdicament marqu.
Phosphorylation KIRA-ELISA (KInaseReceptor Activation) (Sadick et al., 1999) - altre la phosphorylation du - ncessite une ligne cellulaire
dun substrat Cette technique permet de mesurer la phosphorylation de rcepteurs/substrats rcepteur/substrat cible qui exprime naturellement ou
intracellulaire (intra)-cellulaires, qui est un marqueur prcoce de lactivit biologique de la induite par le mdicament, ou qui est transfecte de faon
cellule. - altre la phosphorylation stable avec le rcepteur ou le
La technique est la suivante : induite par le ligand en substrat cible
- culture des cellules en prsence des ractifs (mdicament et chantillons bloquant le mdicament - ncessite des anticorps
ADA +) spcifiques du site de
- lyse des cellules phosphorylation
- quantification des rcepteurs phosphoryls par ELISA

157
Flux intracellulaire Imagerie fluorescente - altre les mouvements de - ncessite une ligne cellulaire
Lobjectif est de mettre en vidence des flux de molcules intracellulaires molcules signales (par avec une molcule
2+
marques avec un marqueur fluorescent, comme par exemple de Ca (Burchiel exemple les facteurs de rapporteuse marque avec une
et al., 1999 ; Ashby et al., 2004). transcription,) dun protine de fluorescence verte
compartiment un autre (GFP, Green Fluorescence
Protein)
- ncessite un anticorps
fluorescent dirig contre la
molcule signal qui se
redistribue dans la cellule
Prolifration - Radioactivit (intgration de thymidinetritie) - altre la prolifration - ncessite une ligne cellulaire
cellulaire - Sans radioactivit (BrdU ELISA, MTT, colorant bleu Alamar, ) cellulaire induite par le qui est dpendante du
Lobjectif est de mettre en vidence lactivation cellulaire en mesurant la mdicament, ou mdicament ou ligand pour sa
prolifration cellulaire. - altre la prolifration croissance
De nombreuses techniques de mesure de la prolifration cellulaire sont dj induite par le ligand en
me
dcrites (cf. 2 partie, I.D.8 et I.D.9). bloquant le mdicament, ou
Dans le cadre de la dtection dADA neutralisants, Shin et al. (2010) proposent - altre leffet anti-prolifratif
un exemple de mesure de prolifration avec un kit commercial et Lofgren et al. du mdicament
(2007) et Finco et al. (2011) utilisent le colorant bleu Alamar.

158
Expression dune ELISA, RIA, ECL, SPA - influence lexpression de la - la protine peut tre mesure
protine Lobjectif est de quantifier une protine qui tmoigne de lactivation biologique protine par le mdicament, dans le surnageant cellulaire
de la cellule par le mdicament. ou ou dans le lysat cellulaire par
Par exemple, Lofgren et al. (2007) mesurent, avec un kit commercial ELISA, la - influence lexpression de la un ELISA
scrtion dIL8. protine induite par le
ligand en bloquant le
mdicament
Expression de Technologie des puces ADN, RT-PCR quantitative - altre lexpression de - lARNm est mesur dans le
lARNm Des puces ADN marques avec un marqueur luminescent permettent de lARNm de la protine lysat cellulaire qui a tendance
quantifier lARNm de gnes exprims lors de lactivation cellulaire (Sakamoto cible, ou tre visqueux et qui
et al., 2003 ; Lofgren et al., 2007). - Affecte lexpression de ncessite dtre optimis pour
me
La technique de RT-PCR quantitative est dcrite prcdemment (cf. 2 partie, lARNm de la protine cible rduire la variabilit du test
I.8.D). induite par le ligand
Expression de gne Luciferase, -galactosidase, transacetylasechloramphenicol (CAT) - altre lexpression du gne - ncessite de mettre au point
rapporteur Lobjectif est de mesurer lactivation dun gne par le mdicament. Des rapporteur par le une ligne cellulaire avec un
modles cellulaires ayant intgr de manire stable un gne rapporteur (par mdicament, ou gne rapporteur qui puisse
exemple celui de la lucifrase) rgul par la molcule thrapeutique permettent - altre lexpression du gne rpondre en prsence du
de mesurer (par fluorescence (Wagner et al., 2006)ou luminescence (Kotarsky rapporteur induite par le srum despce tester
et al, 2003; Wu et al., 2003)) laction du mdicament en mesurant lexpression ligand en bloquant le
phnotypique de ce gne rapporteur. mdicament

159
o Limites
Il est intressant que la concentration du mdicament dans les chantillons
accompagne le rsultat du test, permettant ainsi de donner une indication pour
linterprtation.

En effet, la sensibilit des tests cellulaires est affecte lorsque la molcule

thrapeutique est prsente en quantit trop importante dans les prlvements. La
molcule peut tre prsente sous forme libre mais galement sous forme dimmun-
complexes ADA-mdicament.

Deux dmarches sont proposes pour pallier cet inconvnient :

- refaire un test de dtection des ADA neutralisants aprs llimination
physiologique du mdicament chez les individus traits,
- recourir une mthode de retrait du mdicament dans les chantillons par
dissociation acide et adsorption par affinit (Lofgren et al., 2006).
Par ailleurs le dveloppement et la validation dun test de dtection dADA
neutralisants ncessitent des tapes similaires celles dcrites pour les tests de
dtection des ADA. Les recommandations rglementaires(European Medicines
Agency, 2008 ; FDA - CDER & CBER, 2009) sont galement prsentes en dtails
par Gupta et al. (2007) et illustres par ltude de Baltrukonis et al. (2006).
Une attention plus particulire concerne le contrle positif. Le contrle anticorps
positif doit neutraliser lactivit biologique du mdicament in vitro. Le contrle idal
serait de lantisrum dhomme montrant une rponse anticorps neutralisante au
mdicament. Cependant en dveloppement pr-clinique les contrles positifs sont
gnralement obtenus partir danimaux hyper-immuniss. Les anticorps
polyclonaux obtenus sont purifis et inclus dans une matrice une concentration
spcifique. Si des anticorps polyclonaux ne sont pas disponibles, des anticorps
monoclonaux peuvent tre produits et utiliss individuellement ou en association
comme contrle positif. Comme des lots danticorps issus du mme animal immunis
peuvent tre diffrents, une qualification du test avec chacun des lots est ncessaire.

160
 > Tests de liaison comptitive au ligand

o Principe
Le principe dun test de liaison comptitive au ligand est de mesurer la prsence
dADA neutralisants par la diminution de la liaison dun mdicament sa cible (

Figure 17).

Figure 17 : Principe gnral dun test de liaison comptitive au ligand

Les techniques de mesure de cette liaison sont lELISA conventionnel ou lELISA

format en opposition (Baltrukonis et al., 2006 ; Shin et al., 2010 ; Finco et al.,
2011) et llectrochimiluminescence (Cludts et al., 2010 ; Finco et al., 2011).

o Comparaison avec les tests cellulaires

Les instances rglementaires recommandent prfrentiellement lutilisation de tests
cellulaires (European Medicines Agency, 2008; FDA - CDER & CBER, 2009), mais
approuvent lutilisation de tests de liaison comptitive au ligand lorsque les tests
cellulaires ne sont pas adapts ou non faisables.

Les tudes compares de Finco et al. (2011), mais galement de Baltrukonis et al.
(2006), Shin et al. (2010), Cludts et al. (2010)concluent une sensibilit quivalente
voire dans certains cas suprieure des tests non cellulaires. Moins contraignants

161
dvelopper, ils prsentent galement moins de variabilit et moins dinterfrences de
matrice.

IV.D.3. Caractrisation plus approfondie des chantillons ADA+

Une caractrisation plus approfondie des chantillons ADA+ peut tre ncessaire lors
de mdicament haut risque ou pour une meilleure comprhension des mcanismes.

IV.D.3.a. Quantification des isotypes prsents

> Objectifs

Alors que les tests de dpistage doivent permettre de dtecter tous les isotypes
prsents, il peut tre intressant dans certains cas de dterminer certains isotypes.

Par exemple, la prsence dIgE doit alerter les investigateurs sur la possibilit de
chocs anaphylactiques dans les tudes cliniques. De mme, certains isotypes, comme
les IgG4 sont gnrs lors dexposition chronique et sont dautant plus pathogniques
quils activent le complment (FDA - CDER & CBER, 2009).

> Techniques

Les techniques de dpistage des ADA (cf. 2me partie, IV.D.1.b) permettent galement
de quantifier les ADA.

Lexpression des rsultats peut se faire en unit de masse (concentration) ou bien en

titre (inverse de la dernire dilution dont le signal tombe donne un rsultat positif). Il
semble que lexpression des rsultats en titre soit plus fiable et requiert moins de
travail de validation (Shankar et al., 2008). En effet lexpression en unit de masse est
entirement dpendante de la nature du contrle positif utilis pour tablir la courbe
dtalonnage, le paralllisme doit tre dmontr entre le contrle positif et les
chantillons de ltude.

> Limites

La quantification des ADA est un point dlicat. En effet, une des difficults majeures
avec les tests de dtection des ADA est linterprtation et lvaluation des rsultats
obtenus pour la quantification des ADA (Wadhwa et al., 2003).
162
Les contrles positifs (cf. 2me partie, IV.D.1.d) permettent de valider la prsence
dADA, en revanche leur utilit est limite pour la quantification pour deux raisons :
- les anticorps polyclonaux sont un mlange htrogne danticorps avec des
caractristiques diffrentes (isotypes, affinit, avidit),
- les quantits danticorps prsentes dans diffrents chantillons peuvent varier
considrablement.
Par consquent ces tests ne sont que des tests semi-quantitatifs.

IV.D.3.b. Spcificit des ADA

> Objectif

Lanalyse de la spcificit des ADA permet de confirmer la spcificit de la rponse

immunitaire et galement de dterminer la cible prcise des ADA (European
Medicines Agency, 2008; FDA - CDER & CBER, 2009).

> Technique

Lvaluation de la spcificit des ADA pour le mdicament ncessite une mthode

qui spare les diffrents composants prsents dans le mdicament, permettant ainsi de
dterminer lequel est reconnu par les anticorps.
La technique employe par (Wadhwa et al., 1999; Wadhwa et al., 2003) est une
technique de biologie molculaire : l'lectrophorse en gel de polyacrylamide
contenant du laurylsulfate de sodium ou SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis).
Cette technique consiste sparer en bande les diffrents lments protiques du
mdicament par lectrophorse. Puis lchantillon contenant les ADA est ajout. La
liaison des ADA aux diffrentes bandes est rvle par un ractif anti-
immunoglobuline marqu et une raction de chimiluminescence (Figure 18).

163
Figure 18 : Principe du SDS-PAGE (d'aprs Tizard, 2008)

Il est important de noter que certains ADA ne parviendront pas se lier la

composante antignique du mdicament aprs avoir t soumis la SDS-PAGE.

IV.D.3.c. Affinit

Laffinit dun anticorps se dfinit comme la constante dassociation intrinsque dun

anticorps et dun antigne, elle mesure la force et la stabilit de liaison entre le
paratope et lpitope.
Grce la technique de rsonance plasmonique de surface (cf. 2me partie, IV.D.1.b),
laffinit relative de diffrents anticorps peut tre value par lobservation directe de
la dissociation des ADA et du mdicament (Wadhwa et al., 2003 ; Liang et al., 2007).

164
 CONCLUSION

La dtection de limmunotoxicit dans le dveloppement prclinique du mdicament

rpond aux exigences rglementaires. Cette rglementation sappuie sur les donnes
de dveloppement clinique et de pharmacovigilance chez lHomme.

Lobjectif de limmunotoxicologie est de prdire, avant le dveloppement clinique

chez lHomme un effet immunotoxique potentiel du mdicament. En effet, Dean et al.
(1998) ont montr que dans 60% des cas, le projet est abandonn quand
limmunotoxicit est dtecte pendant la phase de dveloppement clinique.
Cependant, si limmunotoxicit est dtecte en dveloppement prclinique, dans 91%
des cas le projet nest pas abandonn, mais ce rsultat oriente lvolution future du
mdicament.

Dans le cas des mdicaments biologiques, limmunotoxicologie est confronte

principalement aux limites de la pertinence du modle animal choisi pour les tudes
prcliniques. En effet, trouver un modle animal avec une cible de la molcule
similaire dans son profil dactions et de ractions celle de lHomme est difficile et
fastidieux.

Par ailleurs, lhumanisation des molcules biologiques tend rendre leur

immunognicit chez lanimal ininterprtable pour la prdiction de la formation
dADA chez lHomme. Le recours aux modles animaux pour prdire la toxicit du
mdicament chez lHomme implique une connaissance particulire de leurs
spcificits anatomiques, physiologiques, biochimiques, pathologiques
connaissances qui justifient le rle du vtrinaire en recherche et dveloppement dans
lindustrie pharmaceutique humaine.

En immunotoxicologie en particulier, lexpertise du vtrinaire anatomo-pathologiste

est primordiale du fait du rle majeur de lhistopathologie dans la dtection dun effet
immunotoxique.

165
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186
 LISTE DES FIGURES

Figure 1 : Squences d'vnements ncessaires la rponse des lymphocytes B un

antigne (d'aprs Tizard, 2008)
Figure 2 : Rcapitulatif des diffrents types de ractions allergiques (d'aprs Pichler et
al., 2010)
Figure 3 : Rcapitulatif des effets indsirables des molcules biologiques
(d'aprsHausmann et al., 2010)
Figure 4 : Exemples de protocole dvaluation de la rponse (a) primaire (daprs
Gore et al., 2004) ou (b) secondaire (daprs Ulrich et al., 2004), avec la KLH, tude
rat 28 jours.
Figure 5 : Principe gnral de lELISA appliqu la mesure de la rponse humorale
spcifique Exemple de la mesure dIgM anti-KLH
Figure 6 : Mcanismes de raction de l'hypersensibilit retarde (daprs Tizard,
2008)
Figure 7 : Principe gnral du test de prolifration cellulaire ELISA-BrdU
Figure 8 : Protocole du PLNA secondaire
Figure 9 : volution de la nature des anticorps monoclonaux de 1980 2004 (Reichert
et al., 2005)
Figure 10 : Proposition de stratgie recommande pour la dtection et la confirmation
des ADA (d'aprs Koren et al., 2008)
Figure 11 : Principe de l'ELISA en opposition (d'aprs Tizard, 2008)
Figure 12 : Principe gnral de lELISA-format en opposition avec lamlioration
avec la streptavidine et la biotine
Figure 13 : Principe gnral de la radio immuno-prcipitation(d'aprs Thorpe et
Swanson, 2005)
Figure 14 : Principe de la dtection de la liaison de lanticorps la surface sensitive
dans un test de rsonnance plasmonique de surface (d'aprs Thorpe et Swanson, 2005)
Figure 15 : Principe gnral de llectrochimiluminescence format en opposition
(d'aprs Moxness et al., 2005)
Figure 16 : Proposition de stratgie recommande pour la dtection du pouvoir
neutralisant des ADA (d'aprs Koren et al., 2008)
Figure 17 : Principe gnral dun test de liaison comptitive au ligand

187
Figure 18 : Principe du SDS-PAGE (d'aprs Tizard, 2008)

188
 LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1: Les principales caractristiques des lymphocytes B et T (d'aprs Tizard,

2008)
Tableau 2 : Rpartition des sous-populations lymphocytaires majeures du sang
priphrique chez les mammifres en pourcentage de la population totale
Tableau 3 : Les diffrentes classes d'Ig chez les mammifres (d'aprs Tizard, 2008)
Tableau 4 : Tissus lymphodes associs aux muqueuses prlever en fonction de la
voie d'administration du mdicament (ICH, 2005 ; Elmore, 2006)
Tableau 5: Listes des compartiments observer pour chaque organe lymphode et des
modifications semi-quantitatives pouvant tre associes aux lsions des tissus
lymphodes (d'aprs Haley et al., 2005)
Tableau 6 : Paramtres hmatologiques dune tude de toxicit gnrale (daprs
OECD, 1995)
Tableau 7 : Exemple de marquage phnotypique de sous-ensembles lymphocytaires
chez le rat (daprs Smith et al., 2003)
Tableau 8 : Les voies dimmunisation en fonction de lantigne thymodpendant
Tableau 9 : Rsultats dELISA KLH tude 28 jours rat avec diffrents voies
dadministration de la KLH (d'aprs Gore et al., 2004)
Tableau 10 : comparaison des diffrentes voie dimmunisation par la KLH (d'aprs
Gore et al., 2004)
Tableau 11 : Diffrentes doses dimmunisation la KLH en fonction des voies
dadministration et de lutilisation dun adjuvant
Tableau 12 : Nature du prlvement en fonction de la technique de quantification des
anticorps et de la nature de l'antigne thymodpendant
Tableau 13 : Diffrences majeures entre la technique des plages dhmolyse et la
technique ELISA
Tableau 14 : Effets de limmunisation par la KLH sur lvaluation microscopique en
histopathologie
Tableau 15 : Avantages et limites du test de libration du chrome et de la cytomtrie
en flux (d'aprs Cederbrant et al., 2003)
Tableau 16 : Principaux modles de rsistance aux maladies et paramtres mesurs
(daprs Germolec, 2004)

189
Tableau 17 : Principaux modle de rsistance et mcanismes immunitaires valus
Tableau 18 : Principales voies dinoculation et exemples
Tableau 19 : Exemples de moment dinoculation de Listeria monocytogenes en intra-
veineuse selon le modle dtude
Tableau 20 : Exemples de moment dinoculation en fonction des germes sur une tude
de toxicit rpte, par voie orale, 28 jours, chez le Rat (daprs Zhu et al., 2007)
Tableau 21 : Exemples de moments dvaluation des paramtres post-infection en
fonction de lagent pathogne et du paramtre valu (daprs Zhu et al., 2007)
Tableau 22 : Essais biologiques pour la mesure des cytokines
Tableau 23 : Exemple de rsultats dun test de cytotoxicit
Tableau 24 : Mthodes dvaluation de la prolifration cellulaire, avantages et
inconvnients (daprs Mire-Sluiset al., 1995)
Tableau 25 : Avantages et limites relatifs des techniques dvaluation des cytokines
(daprs House, 1999)
Tableau 26 : Principaux mitognes, leur origine et leurs cellules cibles (daprs
Tizard, 2008)
Tableau 27 : Diffrences entre le test de maximisation et le test de Bhler (daprs
Maurer, 2007)
Tableau 28 : Avantages, limites et objectifs des mthodes chez le Cobaye et le LLNA
(daprs Maurer, 2007)
Tableau 29 : Caractristiques des molcules protiques entranant une rponse
immunognique plutt faible et une rponse immunognique forte.
Tableau 30 : Exemples de facteurs considrer dans lvaluation du risque de
squelles cliniques lies aux ADA (d'aprs Koren et al., 2008)
Tableau 31 : Etapes de la phase de dveloppement/optimisation dun test de dtection
des ADA (d'aprs Mire-Sluis et al., 2004)
Tableau 32 : Etapes de la phase de validation dun test de dtection des ADA (d'aprs
Mire-Sluis et al., 2004 ; Shankar et al., 2008)
Tableau 33 : Exemples de tests cellulaires de dtection des anticorps neutralisants et
de techniques de mesure(d'aprs Gupta et al., 2007)

190
 LISTE DES ABBRVIATIONS

Ac : Anticorps

ADA : Anti-drug antibody

ADCC : Antibody-dependent cell- mediated cytotoxicity

AMM : Autorisation de mise sur le march

ARNm : ARN messager

BALT : Bronchius-associated lymphoid tissue

BCR : B-cell receptor

Calcein AM : Acetomethoxy derivate of calcein

CBER : Center for biologics evaluation and research

CD : Cluster of differentiation

CDC : Centre de dveloppement de Cephalon

CFU : Colony forming unit

CIT : Centre international de toxicologie

CMH I : Complexe majeur dhistocompatibilit I

CMHII : Complexe majeur dhistocompatibilit II

Con A : Concanavalin A

CPA : Cellule prsentatrice dantigne

DHR : Dihydrorhodamine

DTH : Delayed-type hypersentivity

EBV : Epstein-Barr virus

ECL : Electrochimiluminescence

191
ECVAM : European center for the validation of alternative methods

EDTA : Ethylenediaminetetraacetic acid

EGFR : Epidermal growth factor receptor

ELISA : Enzyme-linked immunosorbant assay

EPO : Erythropotine

FDA CDER : Food and drug administration center for drug evaluation and
research

FITC : Fluoresceineisothiocyanate

GALT : Gut-associated lymphoide tissue

GFP : Green fluorescent protein

GM-CSF : Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

G-SCF : Granulocyte colony-stimulating factor

H&E : Hmatoxyline-osine

HHV8 : Human herpes virus 8

HPV : Human papillomavirus

ICH : International conference on harmonisation

IFN : Interfron

Ig : Immunoglobuline

IL : Interleukine

JNK : c-Jun N-terminal kinase

LLNA : Local lymphnodeassay

LPS : Lipopolysaccharide

LTc : Lymphocyte T cytotoxique

192
LTh : Lymphocyte T helper

MDGF : Macrophage-derived growth factor

MTT : 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyl tetrazolium bromide

NAb : Neutralizing Antibody

NK : Natural killer

PC /PD : Pharmacocintique/pharmacodynamie

PCR : Polynuclearchainreaction

PE : Phycorythrine

PFU : Plaque forming unit

PHA : Phytohemagglutine

PK/PD : Pharmacokinetics/pharmacodynamics

PLNA : Popliteallymphnodeassay

PMA : Phorbolmyristateacetate : actate de phorboldiestrase

PNH : Primate non humain

PWM : Pokeweed mitogen

RIA : Radio immuno assay

RIPA : Radio immunoprecipitation assay

RT-PCR : Reverse transcriptase polynuclearchain reaction

SDS-PAGE : Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

SPA : Surface plasmonresonnanceassay

TCR : T-cellreceptor : Rcepteur des lymphocytes T

TGF- : Transforming growth factor :

TLR : Toll-like receptor

193
TNF- : Tumor necrosis factor

TNP : Trinitrophenyl

194
 VALUATION DE LIMMUNOTOXICIT DUNE
MOLCULE PHARMACEUTIQUE (CHIMIQUE OU
BIOLOGIQUE) EN DVELOPPEMENT : BILAN DES TESTS
DISPONIBLES ET PROPOSITIONS DUN ARBRE DE
DCISONS POUR LIDENTIFICATION DES DANGERS ET
LVALUATION DU RISQUE IMMUNOTOXIQUE
NOM et Prnom : BOISSEAU Chlo
Rsum

Lvaluation du potentiel immunotoxique lors du dveloppement dun mdicament chimique

ou biologique destin lHomme est demande par les instances rglementaires europennes
et nord-amricaines. Lobjectif de ce travail est de prsenter un bilan bibliographique des
mthodes et tests disponibles et de proposer une dmarche suivre en immunotoxicologie
prclinique.

La prsentation des consquences cliniques de limmunotoxicit chez lHomme et des

mcanismes sous-jacents permet de sparer, dune part, les effets pharmacologiques du
mdicament sur le systme immunitaire et, dautre part, la rponse immunitaire de
lorganisme vis--vis du mdicament. Le premier aspect concerne principalement les
immunosuppressions alors que le second comprend les ractions allergiques et auto-immunes
ainsi que le cas complexe de limmunognicit des molcules biologiques.
Ltude de limmunosuppression est la base historique de limmunotoxicologie, ce qui
explique des mthodes et des tests largement valids pour son valuation. Les ractions
allergiques et auto-immunes sont moins documentes et les mcanismes sous-jacents sont
souvent mal connus. Les tests pour leur valuation ne sont pas tous encore largement valids.

La prdiction de limmunognicit des molcules protiques est limite par le choix dun
modle animal adapt. Ltude de limmunognicit prclinique entre plutt dans le cadre de
linterprtation des donnes de pharmacocintique et pharmacodynamie prclinique.

Mots cls : IMMUNOTOXICOLOGIE / IMMUNOTOXICITE / TOXICOLOGIE /

IMMUNOSUPPRESSION / IMMUNOSTIMULATION / HYPERSENSIBILITE /
ALLERGIE / AUTO-IMMUNITE / IMMUNOGENICITE / DEVELOPPEMENT
PRECLINIQUE / MEDICAMENT BIOLOGIQUE / IMMUNOPHENOTYPAGE /
CYTOKINE / MACROPHAGE / ELISA / RIA / KLH / SRBC / ADA / LLNA / PLNA

Jury :
Prsident : Pr.
Directeur : Dr. Sbastien PERROT
Assesseur : Dr. Ludovic FREYBURGER
Invit : Mme Nathalie BOURRIT
 IMMUNOTOXICITY ASSESSMENT OF A (CHEMICAL OR
BIOLOGICAL) PHARMACEUTICAL MOLECULE IN
DEVELOPMENT : CURRENT AVAILABLE TEST RESULTS
AND PROPOSED DIAGNOSTIC FLOW CHART FOR
IDENTIFYING HAZARDS AND ASSESSING IMMUONTOXIC
RISK

Last name and first name: BOISSEAU Chlo

Summary

European and North American regulatory agencies require assessments of the potential
immunotoxicity of drugs in development for humans. The purpose of this work is to present a
bibliographic review of available methods and tests and to propose an approach to preclinical
immunotoxicology.

A study of the clinical consequences of immunotoxicity in humans and of its underlying

mechanisms enables us to identify, on the one hand, the pharmacological effects of a given
drug on the immune system and, on the other, the organisms auto-immune response to the
drug. The first involves primarily immunosuppressive response while the second encompasses
allergic and autoimmune reactions, as well as the complex area of the immunogenicity of
biological molecules.
Historically, immunosuppressive studies constitute the foundation of immunotoxicology,
which explains the widely validated methods and tests applied in its assessment. Allergic and
autoimmune reactions are less documented, hence their underlying mechanisms are often
poorly understood. Tests available for the assessment thereof are not all widely validated.

Lastly, the predictive merits of the immunogenicity of protein molecules are limited by the
choice of a suitable animal model. Therefore, the study of pre-clinical immunogenicity is
confined to the interpretation of pharmacokinetic data and preclinical pharmacodynamic
findings.

Keywords: IMMUNOTOXICOLOGY / IMMUNOTOXICITY / DRUG SAFETY /

IMMUNOSUPPRESSION / IMMUNOSTIMULATION / HYPERSENSITIVITY /
ALLERGY / AUTOIMMUNITY / IMMUNOGENICITY / NONCLINICAL
DEVELOPMENT / BIOLOGICS / IMMUNOPHENOTYPING / CYTOKINE /
MACROPHAGE / ELISA / RIA / KLH / SRBC / ADA / LLNA / PLNA

The jury:
President of the Jury: Professor..
Director: Dr. Sbastien PERROT
Assessor: Dr. Ludovic FREYBURGER
Guest: Mrs. Nathalie BOURRIT