Isolamento e caracterizao de fosfatases do tipo 2C e

protenas PYR/PYL em Armeria welwitschii.

Rodolfo Miguel Aparcio Delgado

[2011]
 Isolamento e caracterizao de fosfatases do tipo 2C e
protenas PYR/PYL em Armeria welwitschii.

Rodolfo Miguel Aparcio Delgado

Trabalho de projeto apresentado Escola Superior de Turismo e Tecnologia do Mar

do Instituto Politcnico de Leiria para obteno do Grau de Mestre em Biotecnologia
dos Recursos Marinhos

Trabalho de projeto realizado sob a orientao do Doutor Amrico do Patrocnio

Rodrigues, professor adjunto da Escola Superior de Turismo e Tescnologia do Mar
do Instituto Politcnico de Leiria

[2011]
ii
Titulo: Isolamento e caracterizao de fosfatases do tipo 2C e protenas PYR/PYL em
Armeria welwitschii.

Copyright Rodolfo Miguel Aparcio Delgado

Escola Superior de Turismo e Tecnologia do Mar Peniche
Instituto Politcnico de Leiria
2011

A Escola Superior de Turismo e Tecnologia do Mar e o Instituto Politcnico de Leiria

tm o direito, perptuo e sem limites geogrficos, de arquivar e publicar esta
dissertao/trabalho de projeto/relatrio de estgio atravs de exemplares impressos
reproduzidos em papel ou de forma digital, ou por qualquer outro meio conhecido ou que
venha a ser inventado, e de a divulgar atravs de repositrios cientficos e de admitir a sua
cpia e distribuio com objetivos educacionais ou de investigao, no comerciais, desde
que seja dado crdito ao autor e editor.

iii
iv
 memria do meu av,
aos meus pais, av e irmo,
Ftima

v
vi
Agradecimentos

Quero agradecer primeiramente ao Doutor Amrico Rodrigues, sem a sua ajuda

nada seria possvel. Pela qualidade dos conhecimentos que adquiri e rigor cientfico.
Gostar do que fazemos meio caminho andado para atingir os objetivos;

instituio que me acolheu;

Doutora Cllia Afonso por todo o esforo demonstrado na coordenao desta

primeira edio do mestrado;
Por me disponibilizar o material biolgico (Armeria welwitschii);

Agradeo a todos os meus colegas de curso.

A cincia feita principalmente pela partilha de conhecimentos;

A toda a minha famlia, pelo apoio incondicional que proporcionaram;

Ftima, o meu suporte, a minha companhia e nunca me ter deixado desistir nos
momentos mais difceis.

vii
viii
Resumo
x
 Resumo

O cido abscisico (ABA) tem um papel fundamental na resposta a situaes de

stress, em particular stress hdrico e salino. Recentemente foi identificada em Arabidopsis
thaliana uma famlia de recetores citoplasmticos de ABA (protenas PYR/PYL/RCAR) que,
em presena de ABA, inibem a atividade das protenas fosfatases do tipo 2C (PP2C) do
grupo A que so reguladores negativos da resposta a ABA.
O habitat natural de Armeria welwitschii um habitat em que em que o stress hdrico
e salino elevado e em que, os mecanismos de resistncia a esses tipos de stress
assumem um papel particularmente importante na sobrevivncia dos indivduos. A
existncia de populaes a diferentes distncias do mar e, portanto, sujeitas provavelmente
a nveis bastante diferentes de stress constitui uma oportunidade para analisar a forma
como os diferentes componentes da via de sinalizao de ABA (e em particular as protenas
PYR/PYL/RCAR e as PP2Cs) so reguladas de forma a permitir a adaptao a essas
condies.
Neste trabalho, a identificao de genes que codificam protenas PYR/PYL/RCAR e
fosfatases do tipo 2C do grupo A em Armeria welwitschii, teve como base a anlise de
sequncias dessas protenas, e a correspondente sequncia de nucletidos, de espcies
como Physcomitrella patens, Selaginella moellendorffii, Populus trichocarpa e Oryza sativa e
Arabidopsis thaliana de forma a permitir o desenho de primers degenerados.
As sequncias foram alinhadas e as zonas conservadas foram consideradas para o
desenho de primers degenerados. A amplificao foi efetuada utilizando cDNA obtido por
transcrio reversa do RNA total extrado de Armeria welwitschii.
Por reamplificao do produto obtido numa primeira reao e aps clonagem dos
produtos de amplificao verificou-se que se tinha isolado uma sequncia de cDNA que
apresentava uma elevada semelhana com PP2Cs de Arabidopsis thaliana.

Palavras-chave: cido Abscisico (ABA), Armeria welwitschii, Recetores PYR/PYL/RCAR,

Fosfatases do tipo 2C (PP2C), stress hdrico e salino, Primers degenerados, PCR,
Clonagem,

xi
xii
Abstract
xiv
 Abstract

Abscisic acid (ABA) plays a key role in the response to stress, particularly water and
salt stress. Recently, has been identified in Arabidopsis thaliana a family of cytoplasmic ABA
receptors (proteins PYR/PYL/RCAR) which, in the presence of ABA, inhibit the activity of
protein phosphatases type 2C (PP2C) of group A, that are negative regulators of ABA
response.
The natural habitat of Armeria welwitschii is a habitat in which water and salt stress
are high and the mechanisms of resistance to these types of stress play a particularly
important role in the survival of individuals. The existence of populations at different
distances from the sea, subjected to very different levels of stress is an opportunity to
analyze how the different components of ABA signaling pathway (in particular proteins like
PYR/PYL and PP2Cs) behave to allow adaptation at these conditions.
In this work, the identification of genes that encode proteins PYR/PYL/RCAR and
phosphatase 2C of group A in Armeria welwitschii, was based on sequence analysis of these
proteins and the corresponding nucleotide sequence of species such as Physcomitrella
patens, Selaginella moellendorffii, Populus trichocarpa and Oryza sativa and Arabidopsis
thaliana to allow the design of degenerate primers.
The sequences were aligned and the conserved areas were considered for the
design of degenerate primers. Amplification was performed using cDNA obtained by reverse
transcription of total RNA extracted from Armeria welwitschii.
By reamplification of the product in a first reaction and after cloning of amplification
products, it was shown that a sequence of cDNA had a high similarity to Arabidopsis thaliana
PP2Cs.

Keywords: Abscisic acid (ABA), Armeria welwitschii, PYR/PYL/RCAR receptors, Type 2C

phosphatases (PP2C), Water and salt stress , Degenerate primers, PCR, Cloning.

xv
xvi
ndice
xviii
 ndice

Resumo Pgina xi

Abstract Pgina vi

1. Introduo.
1.1.O cido abscisico (ABA): Uma hormona fundamental.
1.2.A anlise gentica de mutantes de Arabidopsis thaliana evidencia a importncia de PP2C na
sinalizao ABA. Pgina 1.

1.2.1.Fosfatases do tipo 2C pertencentes ao grupo A so reguladores negativos na sinalizao

ABA.Pgina 2.

1.2.2.Fosfatases do tipo PP2C do grupo A esto bem conservadas em plantas no

vasculares.Pgina 6.

1.3.Quinases SnRK2 tambm participam na sinalizao ABA. Pgina 8.

1.4.As fosfatases do tipo 2C desfosforilam e inativam quinases SnRK2. Pgina 10.

1.5.Quinases (SnRK2) so reguladores positivos da sinalizao ABA e fosforilam fatores de

transcrio. Pgina 11.

1.6.Recetores ABA.
1.6.1.Identificao, localizao e interao dos recetores PYR/PYL/RCAR. Pgina 12.
1.6.2.Interao de recetores PYR/PYL/RCAR e PP2Cs, a problemtica dos mutantes dominantes
insensveis. Pgina 14.

1.6.3.A inibio da atividade de PP2C dependente de uma dosagem especfica de diferentes

recetores PYR/PYL. Pgina 15.

1.6.4.Modelo de sinalizao ABA. Pgina 16.

1.7.Armeria welwitschii. Pgina 17.

2. Objetivos. Pgina 21.

3. Metodologia.
3.1.Identificao e anlise de protenas ortlogas de PP2C e PYR/PYL de Arabidopsis thaliana em
diferentes plantas.
3.2.Extrao de RNA e sntese de cDNA.
3.2.1.Extrao de RNA com TRIzol. Pgina 25.

xix
 ndice

3.2.2.Tratamento do RNA total com DNase.

3.3.Transcrio reversa.
Pgina 26.

3.4.Desenho de primers degenerados.

Pgina 27.

3.5.Amplificao e purificao de fragmentos de interesse.

3.5.1.Condies de amplificao.
3.5.2.Separao e recuperao de fragmentos. Pgina 28.

3.5.3.Purificao e aumento da concentrao dos produtos de PCR.

3.6.Clonagem.
3.6.1.Ligao dos fragmentos ao vetor de clonagem.
3.6.2.Transformao em clulas competentes.
Pgina 29.

3.7.Sequenciao e anlise das sequncias obtidas.

Pgina 30.

4. Resultados.
4.1.Extrao de RNA.
4.2.Desenho de primers degenerados.
4.2.1.Alinhamento da sequncia de protenas PYR/PYL/RCAR e desenho dos respetivos primers.
Pgina 33.

4.2.2. Alinhamento de protenas fosfatases do tipo 2C e desenho dos respetivos primers.

Pgina 34.

4.3. Sequncias de primers degenerados e fragmentos esperados.

4.3.1. Recetores PYR/PYL/RCAR.
Pgina 37.

4.3.2. Fosfatases do tipo 2C do grupo A.

Pgina 38.

4.4. Produtos de PCR obtidos.

Pgina 39.

4.5. Clonagem e sequenciao dos produtos de PCR obtidos.

Pgina 42.

xx
 ndice

5. Discusso e Concluso.
Pgina 47.

6. Perspetivas futuras.
Pgina 53.

7. Referncias bibliogrficas.
Pgina 57.

xxi
 ndice

Lista de Figuras:

Figura 1.1 Comparao entre as protenas ABI1 e ABi2 dando enfase substituio Gly-por-Asp
nos mutantes abi1 e abi2 perto do centro de coordenao AVLCRGKT.

Figura 1.2 Diversidade de fosfatases do tipo 2C de Arabidopsis thaliana inseridas em diferentes

grupos (A-J).

Figura 1.2 rvore filogentica de MpABI1, PpABI1, PpABI2 (musgo) e ABI1 (Arabidopsis thaliana).
Alinhamentos dependentes do algoritmo Clustal W.

Figura 1.3 Evoluo dos componentes intervenientes na sinalizao ABA.

Figura 1.5 rvore filogentica referente superfamlia de quinases CDPK/SnRK em Arabidopsis

thaliana, baseando-se no alinhamento de domnios catalticos.

Figura 1.6 rvore filogentica composta por sequncias de aminocidos das quinases pertencentes
famlia SnRK2 de espcies como Oryza Sativa e Arabidopsis thaliana.

Figura 1.4 rvore filogentica de protenas PYR/PYL/RCAR de Arabidopsis thaliana composta por
14 membros segundo o estudo realizado por Ma Y. et al., 2009, Park et al., 2009 e Santiago et al.,
2009.

Figura 1.8 Mudanas na conformao do recetor na presena/ausncia de ABA e posterior

ancoragem a PP2C. O resduo de prolina (a azul) conservado e demonstra a importante funo da
ancoragem do recetor fosfatase do tipo 2C.

Figura 1.5 Diferenas no modelo de sinalizao ABA na presena de wildtype (A) e um mutante
insensvel dominante (B).

Figura 1.6 Modelo de sinalizao ABA em condies normais.

Figura 1.7 Modelo de sinalizao ABA em condies de stress.

Figura 1.12 Modelo de sinalizao ABA em condies de stress na presena do mutante abi1-1 que
confere insensibilidade a ABA.

Figura 4.1 Zonas conservadas obtidas no alinhamento de sequncias de protenas PYR/PYL/RCAR

de Arabidopsis thaliana, Oryza sativa e Physcomitrella patens utlizadas no desenho dos primers
PYR_Fw1 (A), PYR_Fw2 (B), PYR_Rev1 (C) e PYR_Rev2 (D).

xxii
 ndice

Figura 4.2 As Fosfatases do tipo 2C do grupo A das espcies Arabidopsis thaliana, Oryza sativa,
Populus trichocarpa, Selaginella moellendorffi e Physcomitrella patens apresentam dois ramos
distintos.

Figura 4.3 Zona conservada considerada para o desenho do primer degenerado PP_Fw1-II.

Figura 4.4 Zona conservada considerada para o desenho do primer degenerado PP_Fw2-I.

Figura 4.5 Zonas conservadas consideradas para o desenho dos primers degenerados PP_Fw2
(A), PP_Rev2 (B) e PP_Rev1 (C).

Figura 4.6 Gel de agarose que demonstra amplificao a partir de cDNA de Arabidopsis thaliana e
posterior reamplificao. Amplificao com PP_Fw2-I/PP_Rev1 (A) e PP_Fw1-II/PP_Rev1 (B).
Reamplificao a partir dos produtos obtidos em A e B com os pares de primers PP_Fw2-I/PP_Rev1
(C e D). M-Marcador.

Figura 4.7 Gel de agarose que demonstra a amplificao a partir de cDNA de Arabidopsis thaliana e
posterior reamplificao com as combinaes de primers especficos de PP2Cs. Amplificao com
PP_Fw2-I/Rev1 (A) e PP_Fw1-II/Rev1 (B). Reamplificao com PP_Fw2-I/PP_Rev2 (A1); PP_Fw2-
I/PP_Rev1 (A2); PP_Fw2/PP_Rev2 (A3); PP_Fw2/PP_Rev1 (A4); PP_Fw1-II/PP_Rev2 (B1);
PP_Fw1-II/PP_Rev1 (B2); PP_Fw2/PP_Rev2 (B3) e PP_Fw2/PP_Rev1 (B4). M-marcador.

Figura 4.8 Gel de agarose que demonstra a amplificao a partir de cDNA de Arabidopsis thaliana e
posterior reamplificao com as combinaes de primers especficos para PYR/PYL/RCAR.
Amplificao com PYR_Fw1/PYR_Rev2 (A) e reamplificao com PYR_Fw1/PYR_Rev1 (B);
PYR_Fw1/PYR_Rev2 (C); PYR_Fw2/PYR_Rev1 (D) e PYR_Fw2/PYR_Rev2 (E). M-marcador.

Figura 4.9 Gel de agarose que demonstra a tentativa de amplificao em Armeria welwitschii com a
multiplicidade de primers degenerados. A amplificao apenas ocorre com o par de primers PP_Fw2-
I/PP_Rev1 (A e B).

Figura 4.10 Gel de agarose que demonstra a forte amplificao atravs do par de primers PP_Fw2-
I/PP_Rev1.

Figura 4.11 A sequncia parcial (Seq1) de Armeria welwitschii apresenta elevada semelhana com
fosfatases do tipo 2C do grupo A.

xxiii
 ndice

Lista de Tabelas:

Tabela 1 Primers degenerados obtidos tendo em conta o alinhamento de protenas PYR/PYL/RCAR

de Arabidopsis thaliana e ortlogos Oryza sativa e Populus trichocarpa (Tm melting temperature).

Tabela 2 Primers degenerados obtidos pelo alinhamento de protenas PYR/PYL /RCAR de

Arabidopsis thaliana e ortlogos Oryza sativa e Populus trichocarpa, Physcomitrella patens e
Selaginella moellendorffii (Invitrogen).

xxiv
1.Introduo
xxvi
 1.Introduo

1.1. O cido abscisico (ABA): Uma hormona fundamental.

Nos Estados Unidos, o grupo liderado por Ohkuma ao estudar em algodo

compostos que promoviam a absciso das folhas identificou um composto, que foi
denominado abscisina II, e que provou ser tambm eficiente na inibio do crescimento de
aveia (Ohkuma et al. 1963). Pouco tempo depois, outro grupo, liderado por Conforth, na
tentativa de encontrar compostos envolvidos na dormncia de gemas axilares, isolou um
composto presente em folhas de sicmoro, a que chamaram dormina. Este composto
mostrou ser um eficiente inibidor da germinao em embries de trigo. Posteriormente
verificou-se que abscisina II e dormina eram o mesmo composto e foi adotada a designao
de cido abscisico (Conforth et al.,1965).
Como organismos ssseis, as plantas tm que rapidamente reconhecer e adaptar-se
a mudanas ambientais repentinas. O cido abscisico uma hormona ubqua em todas as
plantas superiores e que tem um papel fundamental na resposta ao stress ambiental (em
particular o causado pela seca, salinidade e frio) participando tambm no controlo de vrios
aspectos cruciais do crescimento e desenvolvimento (Giraudat et al.,1994).
Em particular, o stress hdrico nas plantas, que se deve principalmente a condies
de seca e salinidade extremas, causa o aumento dos nveis de cido abscisico. Este
aumento determinante na ativao dos mecanismos que permitem reduzir a perda de
gua pelos estomas (Ward et al., 1995), e tambm determinante na inibio das fases de
transio embriognica para germinativa, germinativa para vegetativa e vegetativa para a
reprodutiva, fundamentais para a progresso do ciclo de vida de uma planta. (Finkelstein et
al., 2002).
A anlise gentica de mutantes com uma com uma resposta alterada a ABA permitiu
a identificao de vrios dos componentes da via de sinalizao desta hormona. Muitos
destes componentes participam em eventos de fosforilao/desfosforilao que so
mecanismos comuns em todos os organismos vivos e participam no controlo de inmeros
processos celulares, entre os quais, esto envolvidas protenas fosfatase e quinase (Leung
and Giraudat, 1998).

1.2. A anlise gentica de mutantes de Arabidopsis thaliana evidencia a

importncia de PP2C na sinalizao ABA.

Os primeiros rastreios para identificao de mutantes com sensibilidade alterada a

ABA foram efetuados com sementes de Arabidopsis thaliana tratadas com agente
mutagnico metanosulfonato de etilo. A germinao destas sementes em concentraes
variveis de ABA permitiu a identificao de mutantes que apresentam reduzida dormncia

1
 1.Introduo

da semente mas com sintomas de maior perda de gua e murchar da planta em condies
desfavorveis. Estes mutantes apresentam, portanto, um fentipo de insensibilidade a ABA
comparativamente a plantas silvestres (WT- wildtype) e foram denominados abi (abscisic
acid insensitive) 1 a 5 (Koornneeff et al., 1984).
O gene ABI1 (ABSCISIC ACID INSENSITIVE 1) foi clonado a partir de Arabidopsis
thaliana por anlise molecular de um mutante (abi1-1) insensvel a ABA (Leung et al., 1994;
Meyer et al., 1994). ABI1 codifica para uma protena de 434 aminocidos caracterizada por
possuir dois domnios: o N-terminal, sem qualquer similaridade com protenas conhecidas e
o C-terminal, pertencente a um grupo de protenas fosfatase serina/treonina do tipo 2C
(PP2C) (Leung and Giraudat, 1996). O gene ABI2 codifica igualmente uma PP2C que
apresenta um elevado grau de semelhana com ABI1. O mutante abi1-1 possui uma
substituio Gly-para-Asp na posio 180 que, de acordo com os estudos iniciais, causa
uma acentuada reduo da atividade da fosfatase. O mesmo se verifica no mutante abi2-1
com substituio Gly-para-Asp na posio 168. A substituio ocorre em posies
equivalentes da zona cataltica das protenas ABI1 e ABI2, mais especificamente perto do
centro de coordenao de Mg2+ (Figura 1.1) (Rodriguez et al., 1998).

Figura 1.8 Comparao entre as protenas ABI1 e ABi2 dando enfase substituio Gly-por-Asp
nos mutantes abi1 e abi2 perto do centro de coordenao AVLCRGKT (Rodriguez et al., 1998).

2
 1.Introduo

1.2.1. Fosfatases do tipo 2C pertencentes ao grupo A so reguladores

negativos na sinalizao ABA.

As fosfatases a nvel geral dividem-se em duas grandes classes: protena Tirosina

(PTPs) e serina/treonina que so classificadas nas famlias de fosfatases M (PPMs) e
fosfatases P (PPP). A famlia PPP inclui as fosfatases do tipo 1 (PP1), 2A (PP2A) e 2B
(PP2B), enquanto a famlia PPM inclui as fosfatases do tipo 2C (PP2C) e piruvato
desidrogenase. No genoma de Arabidopsis thaliana foram identificadas 112 fosfatases, das
quais 76 so do tipo 2C (PP2C), caracterizadas em 10 grupos de A-J (Figura 1.2).
(Schweighofer et al., 2004).

Figura 1.9 Diversidade de fosfatases do tipo 2C de Arabidopsis thaliana inseridas em diferentes

grupos (A-J) (Schweighofer et al. 2004).

3
 1.Introduo

Dos 10 grupos, o grupo A constitudo por 9 fosfatases das quais pelo menos 6
(ABI1, ABI2, PP2CA/AHG3, AHG1, HAB1 e HAB2) tm um papel importante na sinalizao
de ABA. (Gosti et al., 1999; Merlot et al., 2001;Saez et al., 2004; Yoshida et al., 2006b; Saez
et al., 2006; Nishimura et al., 2007).
O fentipo dos mutantes abi1-1 e abi2-1 demonstram claramente a participao
deste grupo de fosfatases do tipo 2C na sinalizao ABA. Os dados inicialmente existentes
que apontavam para uma pronunciada diminuio da atividade fosfatase destas protenas
mutadas, conjuntamente com o fentipo de insensibilidade a ABA apresentado por estes
mutantes sugeriam que as PP2C poderiam funcionar como reguladores positivos da
resposta a ABA.
Contudo, vrios estudos posteriores pareciam indicar um papel como reguladores
negativos. O rastreio de linhas mutantes em fundo abi1-1 permitiu a identificao de vrios
mutantes secundrios (mutantes que para alm da mutao abi1-1 apresentavam uma outra
mutao nesse gene) permitiu a identificao e caracterizao de mutantes recessivos de
perda de funo abi1-1R1 a abi1-1R7). Um rastreio semelhante em fundo abi2-1 permitiu a
identificao do mutante abi2-1R1. Estes mutantes tinham perdido o fentipo de
insensibilidade a ABA, caracterstico do fundo em que tinham sido produzido, e exibiam
maior sensibilidade que WT, apresentando uma maior inibio da germinao e crescimento
da raiz quando aplicado ABA exgeno. Estas novas mutaes (abi1-1R1 a abi1-1R7 abi2-
1R2) do origem a protenas com reduzida ou nula atividade fosfatase e esses mutantes
apresentam um fentipo de hipersensibilidade a ABA, o que sugere que ABI1 e ABI2 so
reguladores negativos na resposta a ABA. (Gosti et al., 1999; Merlot et al., 2001).
O papel das PP2Cs do grupo A como reguladores negativos da sinalizao de ABA
fica definitivamente estabelecido com a identificao e caracterizao de outras de outras
protenas deste grupo bem como pela anlise gentica dos respetivos mutantes. A protena
codificada pelo gene AtP2C-HA de Arabidopsis thaliana, composta por 511 aminocidos,
regulada na presena de ABA e apresenta elevado grau de semelhana com ABI1 e ABI2
(Rodriguez et al.,1998b) pelo que foi includa na famlia de fosfatases do tipo 2C grupo A
tendo sido posteriormente, devido ao fentipo dos mutantes de perda de funo,
denominada de HAB1 (HYPERSENSITIVE TO ABA 1). Um quinto cluster contm PP2Cs
como ABI1, ABI2, HAB1 e uma fosfatase desconhecida At1g17550. Alinhamentos
demonstram 75% de homologia entre HAB1 e At1g17550, e 60% entre as quatro protenas e
At1g17550, sendo esta protena desconhecida denominada de HAB2 (HYPERSENSITIVE
TO ABA2). A fuso de GFP ao promotor de HAB1 permitiu corroborar dados obtidos por
Rodriguez (1998b), ou seja, existe expresso de ProHAB1:GFP em toda a planta (epiderme
do cotiledone, clulas guarda, semente, embrio, raiz e folha) e deste modo HAB1
regulado por ABA. Em comparao com wildtype, a expresso de HAB1 atravs do

4
 1.Introduo

promotor 35S demonstra insensibilidade a ABA, mas no to acentuada como o mutante

dominante e insensvel abi2-1. Os diferentes graus de insensibilidade de 35S:HAB1 e abi2-1
so apresentados pelo aumento da transpirao com perda do peso fresco da planta, o
rpido crescimento da raiz e desenvolvimento proeminente da germinao. O
desenvolvimento de um mutante knockout (hab1-1 hipersensvel), demonstra expresso na
presena de ABA e em comparao com plantas wildtype a dormncia na germinao por
parte do mutante elevada. O ganho de funo e perda de funo de fosfatases PP2C,
permite afirmar o seu papel como regulador negativo na sinalizao ABA (Saez et al., 2004).
O isolamento de quatro mutantes ahg (ABA-hypersensitive germination) demonstra
inibio da germinao na presena de ABA. Testes germinativos demonstram germinao
por parte do mutante insensvel abi1-1 na presena de 5M de ABA, e em semelhantes
condies verifica-se a inibio da germinao dos mutantes (ahg1, ahg2, ahg3 e ahg4)
hipersensveis. O estabelecimento de duplos mutantes atravs do cruzamento de abi1-1
com cada um dos quatro mutantes revela desenvolvimento da germinao, o que demonstra
a forte dominncia do mutante abi1-1. Contudo os mutantes ahg3 e ahg1 so os que mais
oferecem resistncia dominncia causada pelo mutante abi1-1 (Nishimura et al., 2004).
Os genes AHG3 e AHG1 foram identificados atravs dos mutantes hipersensveis
ahg3 e ahg1 respetivamente. Partilham das mesmas caractersticas, das quais, a forte
expresso em semente e por se inserirem no mesmo ramo do grupo A de fosfatases 2C.
Ambos demonstram, capacidade de funcionar em sinergia, contudo com funes diferentes.
AHG1 expressa no embrio enquanto AHG3 expressa em meristemas e feixes
vasculares (Yoshida et al., 2006b; Nishimura et al., 2007).
O estabelecimento de mutantes knockout, alelos de ABI1 (abi1-2, abi1-3
hipersensveis) e o mutante hab1-1 (tambm hipersensvel) permitiu a elaborao de duplos
mutantes (hab1-1 abi1-2 e hab1-1 abi1-3). Os duplos mutantes demonstram na presena de
ABA inibio da germinao, reduo da perda de gua por transpirao, diminuio do
crescimento vegetativo, eficiente fecho estomtico, assim como, expresses de genes
responsveis pela resposta ABA. O conceito de regulao negativa para ABI1 e HAB1
portanto inequvoco e a cooperao entre ambos aumenta a performance da planta face a
questes de stress hdrico (Saez et al., 2006).
A multiplicidade de fosfatases (HAB1, ABI1, ABI2 e PP2CA) que regula a sinalizao
ABA demonstra um mecanismo verstil. A mltipla regulao foi comprovada pelos
mutantes simples (hab1-1, abi1-2 e pp2ca-1) duplos (hab1-1abi1-2, hab1-1pp2ca-1 e abi1-
2pp2ca-1) e triplos (hab1-1 abi1-2 pp2ca-1 e hab1-1 abi1-2 abi2-2), assim como, o diferente
grau de hipersensibilidade obtido na presena de ABA exgeno. Os triplos mutantes
necessitam de uma quantidade muito baixa de ABA (na ordem dos nM) para inibir o
crescimento e germinao. Mutantes knockout abi1-2 e abi2-2 hipersensveis demonstram

5
 1.Introduo

inibio da germinao, reduzido crescimento e fecho estomtico, por outro lado, o duplo
mutante abi1-1 abi2-2 comporta-se de forma contrria, pois abi1-1 dominante e insensvel.
(Rubio et al., 2009).
Trs genes (At5g59220, At1g07430 e At2g29380) codificam para fosfatases do tipo
2C denominadas HAI1, HAI2 e HAI3 (HIGHLY ABA-INDUCED PP2C GENES) e so
fortemente reguladas por ABA na fase vegetativa. A fraca expresso destas fosfatases
conferida pelos dois triplos mutantes (srk2d/e/i; areb1/areb2/abf3) na presena de ABA
(Fujita et al., 2009). Estas trs novas fosfatases pertencem ao grupo A, onde se inserem as
fosfatases (ABI1, ABI2, HAB1, HAB2, AHG1 e AHG3) descritas e referenciadas
anteriormente (Schweighofer et al., 2004).

1.2.2. Fosfatases do tipo PP2C do grupo A esto bem conservadas em plantas no

vasculares.

A expresso ectpica do mutante abi1-1 de Arabidopsis thaliana (angiosprmica) em

Physcomitrella patens (brifita) reduz a sensibilidade a ABA exgeno e reduz a tolerncia ao
stress abitico. Deste modo a presena de PP2Cs na regulao da sinalizao ABA em
Physcomitrella patens inequvoca. Mais de 51 genes codificam para PP2Cs em
Physcomitrella patens e possuem um domnio cataltico conservado. O alinhamento do
domnio cataltico de PP2Cs de Arabidopsis thaliana e Physcomitrella patens demonstra a
presena de 2 genes (PpABI1A e PpABI1B) semelhantes a ABI1. Estes genes so ativados
por ABA exgeno o que indica a tolerncia ao stress osmtico por parte de Physcomitrella
patens. O estabelecimento do mutante ppabi1a hipersensvel induz a expresso de genes,
inibe o crescimento do protonema e exibe tolerncia ao frio na presena de ABA ao
contrrio de wildtype. A regulao negativa dada por fosfatases do tipo 2C, em espcies
evolutivamente distantes encontra-se conservada (Komatsu et al., 2009).
Com o aumento da concentrao de ABA, o gametfito de Marchantia polymorpha
(brifita-heptica) apresenta um decrscimo do peso fresco/seco, o que indica a presena
de um mecanismo de sinalizao ABA. MpABI1 (protena com 568 aminocidos) exibe
similaridade com ABI1, o mesmo grupo em que esto inseridas as fosfatases ABI1, ABI2,
HAB1, HAB2 e PP2CA de Arabidopsis thaliana e fosfatases PpABI1A e PpABI1B de
Physcomitrella patens (Figura1.3).

6
 1.Introduo

Figura 1.10 rvore filogentica de MpABI1, PpABI1, PpABI2 (musgo) e ABI1 (Arabidopsis thaliana).
Alinhamentos dependentes do algoritmo Clustal W. (Tougane et al.2010).

A fosfatase MpABI1 demonstra afinidade por caties bivalentes Mg 2+ e Mn2+ e a

mutao com substituio Gly-por-Asp na posio 298 influencia a reduo da atividade
como acontece com o mutante insensvel abi1-1. A fuso de GFP com MpABI1 permite
esclarecer a sua principal funo no ncleo e ligeiramente no citoplasma. A sobrexpresso
do gene que codifica para a fosfatase MpABI1 demonstrada pela insensibilidade na
presena de ABA. MpABI1 similar a ABI1 e ambas partilham a regulao negativa na
sinalizao ABA, assim como, esta regulao se encontra conservada em espcies
filogeneticamente distantes (Tougane et al., 2010).
A conquista do meio terrestre foi possvel devido capacidade de aquisio de um
mecanismo de tolerncia seca, visto que a falta de gua um dos principais problemas de
adaptao. O mecanismo de sinalizao presente em Marchantia polymorpha e
Physcomitrella patens a prova viva da capacidade que tipo de plantas (no vasculares)
tem de colonizar o meio terrestre e possibilitar exposio a condies de seca. (Figura 1.4).

Figura 1.11 Evoluo dos componentes intervenientes na sinalizao ABA (Umezawa et al., 2010).

7
 1.Introduo

Como prova evolutiva visvel a conservao de intervenientes na sinalizao ABA

(PP2C, SnRK2 e PYR/PYL/RCAR) medida que se migra do ambiente intermdio para o
terrestre (Umezawa et al., 2009). A disponibilidade de gua poder ser o fator chave que
originou o aumento do nmero de componentes da sinalizao ABA.

1.3. Quinases SnRK2 tambm participam na sinalizao ABA.

A quinase PKABA1 proveniente do trigo e est envolvida na sinalizao ABA por

demonstrar tolerncia dessecao, favorecer dormncia da semente, assim como,
suprimir genes indutores de giberelinas essenciais ps-germinao. Esta quinase insere-
se no grupo de quinases serina/treonina, SNF1 (yeast sucrose non-fermenting protein
kinases) (Gomez-Cadenas et al., 1999).
A protena AAPK (ABA-Activated Protein Kinase) de Vicia fava ativada na presena
de ABA e demonstra estar envolvida na regulao dos estomas. Esta regulao foi
comprovada pela substituio do aminocido Lisina-por-Alanina na posio 43 da quinase
AAPK. O mutante AAPK (K43A) insensvel na presena de ABA induz o fecho dos estomas.
(Li et al., 2000).
O gene OST1 (OPEN STOMATA 1) codifica para uma protena de 362 aminocidos
de massa molecular de 41kDa. uma protena quinase serina/treonina e possui uma regio
N-terminal (1-297aminocidos) que apresenta um domnio cataltico conservado. OST1 foi
isolado em Arabidopsis thaliana pela semelhana que tem com o gene AAPK presente em
Vicia fava. Alm de OST1 em Arabidopsis thaliana, outras 9 quinases partilham da mesma
semelhana e foram denominadas OSKL (OST1 kinase-like protens) pertencendo
subfamlia2, SNF1 de protenas quinase (SnRK2) mencionadas por Hardie (1999).
Mutantes (ost1-1 e ost1-2), tendo como referencia plantas wildtype vistos atravs de
termografia de infravermelho exibem ao nvel das folhas a diferena de 1C. A perda de
peso fresco por parte dos mutantes combina com a excessiva transpirao da planta e
consequente perda de gua pelos estomas. De forma anloga, e na presena de ABA os
mutantes apresentam um fentipo semelhante, os estomas permanecem abertos e no
reagem ao estmulo. Tal como ost1, o mutante insensvel abi1-1 na presena de ABA
demonstra baixa produo de ROS e os estomas permanecem abertos, de modo contrrio
acontece com as formas nativas ABI1 e OST1, na presena de ABA ROS so produzidos e
os estomas fecham. OST1 portanto um regulador positivo e demonstra regulao
antagnica a ABI1 (Mustilli et al., 2002).
Paralelamente, outro grupo de investigao isolou protenas quinase de 44kDa em
clulas T87 provenientes de Arabidopsis thaliana provando estar envolvidas na resposta a
ABA (Yoshida R., 2002), assim como outros autores referenciam protenas de peso

8
 1.Introduo

molecular semelhante (Anderberg and Walker-Simmons, 1992; Gomez-Cadenas et al.,

1999; Li et al., 2000) quer pela fosforilao de fatores de transcrio ABRE (Uno et al.,
2000).
Nove genes encontrados atravs da base de dados de Arabidopsis thaliana
pertencem subfamlia2 de quinases (SnRK2) e foram denominados de SRK2A a SRK2I. A
protena SRK2E especialmente ativada por ABA, mas o knockout (srk2e) do gene que a
traduz, exibe abertura estomatal elevada na presena de ABA, o murchar de folhas em
condies de baixa humidade, assim como, a acentuada perda de gua a que est
associado, mas no demonstra, mudanas na germinao comparando com plantas
wildtype (Yoshida R., 2002). O fentipo exibido pelo mutante srk2e no to pronunciado
como o mutante abi1-1 (Yoshida R., 2002) mas assemelha-se ao comportamento do
mutante ost1 j mencionado anteriormente (Mustilli et al., 2002).
O genoma de Arabidopsis thaliana possui 36 SnRKs das quais 10 (SnRK2.1 a
SnRK2.10) pertencem a SnRK2 (SNF1-related proten kinase2) (Figura 1.5) (Hrabak et al.,
2003).

Figura 1.12 rvore filogentica referente superfamlia de quinases CDPK/SnRK em Arabidopsis

thaliana, baseando-se no alinhamento de domnios catalticos (Hrabak et al., 2003).

9
 1.Introduo

Existem tambm 10 SnRK2 (SAPK1 a SAPK10) em arroz (Oryza sativa) das quais
SAPK8, SAPK9 e SAPK10 pertencem subclasse III de quinases, assim como SnRK2.2,
SnRK2.3, e SnRK2.6 em Arabidopsis thaliana (Figura1.6) (Kobayashi et al., 2004).

Figura 1.13 rvore filogentica composta por sequncias de aminocidos das quinases
pertencentes famlia SnRK2 de espcies como Oryza Sativa e Arabidopsis thaliana (Kobayashi et
al. 2004).

A nvel geral as SnRK2 esto categorizadas em 3 subclasses e encontram-se

conservadas ao nvel das plantas superiores. A quinase SRK2E (Yoshida R. et al.,2002) a
mesma que SnRK2.6 (Hrabak et al., 2003) e OST1 (Mustilli et al., 2002).
A quinase SRK2C/SnRk2.8 uma protena que ativa quando submetida ao stress
osmtico. A funo de regulador positivo pode ser explicado pela sobrexpresso da quinase.
Os dois mutantes srk2c-1 e srk2c-2 demonstram hipersensibilidade a ABA, exibindo reduo
do crescimento da raiz mas no no fecho dos estomas em condies de dessecao
(Umezawa et al., 2004).

1.4. As fosfatases do tipo 2C desfosforilam e inativam quinases SnRK2.

A interao entre ABI1 e o domnio II da quinase SRK2E/OST1/SnRK2.6 foi

comprovado atravs do ensaio de dois hbridos em levedura (Yoshida et al., 2006;
Umezawa et al., 2009).
HAB1, assim como o mutante hab1G246D desfosforilam a quinase OST1 na presena
de ABA e a confirmao demonstrada pelo decrscimo da atividade da quinase in vitro. A
interao exibida no ncleo e citoplasma por fluorescncia bimolecular em clulas de

10
 1.Introduo

tabaco, com confirmao a partir do teste de co-imunoprecipitao. Na presena de ABA, a

quinase OST1 ativada em plantas wildtype (Ler e Col), em mutantes knockout
hipersensveis hab1-1, abi1-2 e mesmo no duplo mutante hab1-1 abi1-2, mas inibida por
mutantes insensveis abi1G180D e abi2G168D (Vlad et al., 2009). Outro grupo, por fluorescncia
bimolecular, demonstra interao entre a quinase SRK2D e a fosfatase HAI1 no ncleo e
citoplasma de clulas da epiderme de cebola (Fujita et al., 2009).
Atravs do ensaio de dois hbridos em levedura possvel verificar varias
combinaes na interao de fosfatases 2C do grupo A com quinases SnRK2 (Umezawa et
al., 2009). O grande problema recai no facto de mutantes insensveis e dominantes abi1-1 e
abi1-2 conferirem insensibilidade a ABA e mesmo assim possurem a capacidade de
interagir com quinases SnRK2. O esclarecimento para este problema dado pela
identificao de recetores PYR/PYL/RCAR que ser explicado adiante.

1.5. Quinases (SnRK2) so reguladores positivos da sinalizao ABA e fosforilam

fatores de transcrio.

O duplo mutante srk2d srk2i exibe fentipos de insensibilidade a ABA pela inibio
da germinao e crescimento da raiz. O duplo mutante demonstra reduzida capacidade de
fosforilar fatores de transcrio, o que indica que SRK2D e SRK2I esto envolvidos na
ativao de fatores de transcrio ABF (ABA Response Element Binding Factor - ABRE), o
que corrobora a funo de regulao positiva na sinalizao ABA (Fujii et al., 2007).
O estabelecimento de mutantes simples (srk2d, srk2e, srk2i), duplos (srk2d/e,
srk2e/i, srk2d/i) e triplo (srk2d/e/i) demonstram: perda da atividade, perda na capacidade de
fosforilao de fatores de transcrio (bZIP), e como consequncia, a perda de dormncia
ocorrendo defeitos durante o desenvolvimento da semente. A intensidade destes fentipos
demonstrada medida que se avana dos mutantes simples para o triplo. As quinases
SRK2D, SRK2E e SRK2I esto portanto envolvidas na sinalizao ABA pela fosforilao de
fatores de transcrio ABI5 e AREB3 e permitem o desenvolvimento da semente e
germinao (Nakashima et al., 2009).
O fator de transcrio AREB1 fosforilado por 5 protenas quinase (SnRK2):
SRK2C/SnRK2.8, SRK2D/SnRK2.2, SRK2E/SnRK2.6, SRK2F/SnRK2.7 e SRK2I/SnRK2.3.
As interaes entre as quinases e o fator de transcrio so confirmados por fluorescncia
bimolecular no ncleo de clulas da epiderme da cebola. O triplo knockout dado pelo
mutante srkd/e/i demonstra reduzida tolerncia seca e elevada insensibilidade a ABA. As
quinases SRK2D, SRK2E e SRK2I funcionam em sinergia e regulam positivamente fatores
de transcrio com vista a propiciar eficincia germinativa, assim como, obter resposta ao
stress hdrico durante a etapa vegetativa (Fujita et al., 2009).

11
 1.Introduo

1.6. Recetores ABA.

FCA, ABAR/CHLH/GUN5 e GCR foram descritos como recetores ABA e foram

referenciados como tendo localizao no ncleo, cloroplasto e membrana plasmtica
respetivamente (Razem et al., 2006; Shen et al., 2006; Liu et al., 2007). Uma grande
controvrsia rodeia estes recetores visto que outros estudos poem em causa a sua funo.
O recetor FCA, no demonstra ligao com ABA (Risk et al., 2008) e o papel de
GCR2 foi questionado na medida em que a perda de funo dos mutantes gcr1 e gcr2 e o
duplo mutante demonstram a mesma sensibilidade que wildtype a ABA (Gao et al., 2007) e
est em concordncia com outro grupo que demonstra duplos (gcr2 gcl1, gcr2 gcl2, gcl1
gcl2) e triplo mutante (gcr2 gcl1 gcl2) com a mesma sensibilidade a ABA que wildtype na
germinao e primeiras etapas do desenvolvimento da planta (Guo et al., 2008). Foi
confirmado tambm por ensaios que ABA no de liga GCR2 (Risk et al., 2009).
ABAR/CHLH/GUN5 demonstra capacidade de regular a germinao, ps-
germinao e movimento estomatal na presena de ABA (Shen et al., 2006). Em cevada,
XanF possui elevada semelhana com Mg-Chelatase em Arabidopsis thaliana (82%), mas
foi comprovado no ser um recetor ABA. Os mutantes demonstram a mesma resposta que
wildtype relativo germinao, crescimento ps-germinativo e abertura estomatal, indicando
que Mg-Chelatase no um recetor ABA (Mueller and Hansson, 2009). Em comparao
com wildtype, mutantes abar-2 e abar-3 exibem diferenas na germinao e ps-germinao
mas no no movimento estomatal o que indica uma nova evidncia relativa ligao de
ABA a Mg-chelatase (Wu et al., 2009).
Por outro lado os recetores G no so questionados. Dois recetores, GTG1 e GTG2,
demonstram localizao na membrana e ligam-se a GPA1 inibindo-os. O duplo mutante
gtg1-1 gtg2-1 exibe insensibilidade a ABA e comprova a participao de GTG1 e GTG2 na
sinalizao ABA (Pandey et al., 2009).
Os recetores PYR/PYL/RCAR so os que alegaram maior consistncia em torno da
sinalizao ABA e permitiram explicar a problemtica que envolve a regulao ABA na
presena de mutantes dominantes e insensveis como abi1-1 e abi1-2.

1.6.1. Identificao, localizao e interao dos recetores PYR/PYL/RCAR.

A procura de compostos qumicos levou ao encontro de pyrabactin como agonista de

ABA. O gene PYR1 (PYRABACTIN RESISTANCE 1) foi descoberto por anlise gentica
baseada em pyrabactin. Em Arabidopsis thaliana existem 13 genes denominados Pyl1 a
Pyl13 (semelhantes a PYR1), que codificam para uma a famlia de protenas que oscila
entre os 159-221 resduos (Figura 1.7). Mutantes triplo (pyr1;pyl1;pyl4) e quadruplo

12
 1.Introduo

(pyr1;pyl1;pyl2;pyl4), exibem insensibilidade a ABA na germinao e crescimento acentuado

da raiz. O ensaio de dois hbridos em levedura revelou a interao do recetor PYR1 com a
fosfatase HAB1 em resposta a ABA (Park et al., 2009), assim como foi confirmada a
interao in vivo de PYL5 e HAB1 em folhas de tabaco com localizao no ncleo e citosol
atravs do teste de fluorescncia bimolecular (Santiago et al., 2009).

Figura 1.14 rvore filogentica de protenas PYR/PYL/RCAR de Arabidopsis thaliana composta por
14 membros segundo o estudo realizado por Ma Y. et al., 2009, Park et al., 2009 e Santiago et al.,
2009 (Umezawa et al., 2010).

Outro grupo, pelo ensaio de dois hbridos em levedura demonstrou a ligao de

protenas a ABI2. A protena (At1g01360.1) sem funo definida, foi denominada RCAR1
(REGULATORY COMPONENT OF ABA RECEPTOR 1) e pertence a uma famlia de
protenas com 14 membros em Arabidopsis thaliana (Figura 1.7), as mesmas descobertas
por Park (2009). O fecho estomatal, dormncia na germinao e no crescimento da raiz em
resposta a ABA intensifica-se quando RCAR1 sobrexpressado. O mutante portanto
hipersensvel na presena de ABA (Ma Y. et al., 2009).
Ambos os genes PYR1 e RCAR1 codificam para protenas pertencentes
superfamlia de protenas START/Bet V e partilham entre si zonas conservadas que
funcionam como um bolso hidrofbico com afinidade para lpidos, hormonas e antibiticos
(Radauer et al., 2008).

13
 1.Introduo

1.6.2. Interao de recetores PYR/PYL/RCAR e PP2Cs, a problemtica dos mutantes

dominantes insensveis.

Os mutantes PYR1S152L e PYR1P88S causam insensibilidade a pyrabactin reduzindo a

interao com a fosfatase, por outro lado, o mutante insensvel abi2-1 no interage com o
recetor. O mutante PYR1P88S liga-se a ABA contudo no se consegue ligar fosfatase HAB1
(Park et al., 2009), pois a substituio de prolina por serina na posio 88 do recetor PYR1
no permite a ancoragem protena fosfatase 2C (Figura 1.8) (Melcher et al., 2009; Weiner
et al., 2009; Cutler et al., 2010).

Figura 1.15 Mudanas na conformao do recetor na presena/ausncia de ABA e posterior

ancoragem a PP2C. O resduo de prolina (a azul) conservado e demonstra a importante funo da
ancoragem do recetor fosfatase do tipo 2C (Cutler et al., 2009).

necessrio elevada concentrao em ABA para o recetor insensvel PYR1P88S para

inibir a fosfatase PP2C (IC50=50M) enquanto para PYR1 muito inferior (IC50=125nM)
(Park et al., 2009). O complexo RCAR1-ABI2 interrompido quando se sujeitam mutantes
insensveis abi2-1 e abi1-1, por outro lado, ABI1 e ABI2 so inibidos por RCAR1 a
concentraes de 60nM e 70nM de ABA, respetivamente (Ma Y. et al., 2009).
A baixa atividade da quinase SnRK2 na presena do quadruplo mutante
pyr1;pyl1;pyl2;pyl4 uma consequncia direta da interao entre PP2Cs e SnRK2s (Park et
al., 2009), e a interao inexistente do mutante insensvel e dominante hab1G246D com PYL5
(Santiago et al., 2009) provada pela interao com OST1 in vivo e consequente
desfosforilao da quinase na presena do mesmo mutante (Vlad et al., 2009).
Em condies de stress produzido ABA endgeno na planta. Os recetores
PYR/PYL/RCAR ligam-se a ABA e interage com PP2Cs para inibir a sua atividade. As
quinases por sua vez so livres da regulao negativa dependente de PP2C e fosforilam
fatores de transcrio bZIP como AREB/ABF ou protenas membranares que envolvem
canais inicos. Em contraste, na presena de mutantes insensveis e dominantes (como
abi1-1), fogem ao controlo negativo dos recetores PYR/PYL/RCAR, resultando na inativao

14
 1.Introduo

de quinases SnRK2, mesmo na presena de ABA (Figura 1.9) (Santiago et al., 2010;
Umezawa et al., 2010).

Figura 1.16 Diferenas no modelo de sinalizao ABA na presena de wildtype (A) e um mutante
insensvel dominante (B) (Umezawa et al., 2010).

1.6.3. A inibio da atividade de PP2C dependente de uma dosagem especfica de

diferentes recetores PYR/PYL.

O valor da concentrao requerida para atingir 50% da atividade (IC50) de HAB1

dependente do tipo de recetor PYR/PYL.
Como exemplo:
Para HAB1, valores de 35nM, 135nM, 188nM e 390nM na presena de PYL5, PYL8,
PYL4 e PYR1 respetivamente.
Para ABI2, valores de 115nM, 118nM, 110nM e 360nM na presena de PYL5, PYL8,
PYL4 e PYR1 respetivamente.
Para ABI1, valores de 123nM, 75nM, 272nM e 330nM na presena de PYL5, PYL8,
PYL4 e PYR1 respetivamente.

15
 1.Introduo

Dada a multiplicidade de PP2Cs do grupo A (9 membros) e PYR/PYL (14 membros), a

ligao entre as duas protenas PYR/PYL-PP2C demonstra interao preferencial. O
complexo ABA-receptor-PP2C comporta-se num sistema de afinidade escala do
nanomolar (Santiago et al., 2009).

1.6.4. Modelo de sinalizao ABA.

Em condies normais, PP2C desfosforila e inativa SnRK2, no havendo progresso

da sinalizao ABA (Figura1.10).

Figura 1.17 Modelo de sinalizao ABA em condies normais. (Umezawa et al., 2009).

Na presena de ABA, os recetores PYR/PYL/RCAR interagem com a fosfatase

inibindo a sua atividade, libertando as quinases SnRK2 da regulao negativa, podendo
deste modo fosforilar fatores de transcrio (Figura 1.11).

Figura 1.18 Modelo de sinalizao ABA em condies de stress (Umezawa et al., 2009).

16
 1.Introduo

Na presena de ABA, o mutante abi1-1 foge ao controlo dos recetores

PYR/PYL/RCAR, a PP2C desfosforila continuamente SnRK2 e a progresso da sinalizao
interrompida (Figura1.12).

Figura 1.19 Modelo de sinalizao ABA em condies de stress na presena do mutante abi1-1 que
confere insensibilidade a ABA (Umezawa et al., 2009).

1.7. Armeria welwitschii.

Armeria welwitschii uma planta superior costeira, angiosprmica pertencente

famlia das plumbaginceas e est presente em rochas e areias martimas (dunas).
Geograficamente destaca-se ao longo da costa portuguesa que compreende o espao entre
Cascais e Figueira da Foz (Coutinho A.X.P.)
Armeria Berlengensis, endmica da Ilha da Berlenga, semelhante a Armeria
welwitschii, endmica e presente nas caractersticas falsias de Peniche. Uma possvel
explicao pode ser dada pela permanente ligao que a espcie Larus argentatus tem com
os dois locais, permitindo o transporte de sementes, uma vez que a probabilidade de serem
digeridas reduzida. A frequente migrao desta ave, deve-se ao fato da Ilha da Berlenga
ser uma rea propcia nidificao, e por outro lado, Peniche possuir um porto de pesca e
indstria transformadora de pescado, em que os sub-produtos so um forte atrativo (Aguilar
J.F. e Feliner G.N. ,2003).
O ambiente de Armeria welwitschii considerado inspito e mesmo hostil. Os ventos
fortes, o frio (inverno), a fraca disponibilidade de gua principalmente no vero, os solos
ridos e a elevada salinidade (3,5%) proveniente de vagas (spray marinho) condicionam a
vegetao destes locais. A resistncia por parte de Armeria welwitschii a estes fatores
permitem-na caracterizar como tolerante, fazendo dela um bom objeto de estudo, uma vez

17
 1.Introduo

que o conhecimento a nvel bioqumico, gentico e molecular escasso ou mesmo

inexistente.
Compreender o papel que as PP2C e as protenas PYR/PYL podero ter nos
mecanismos de adaptao a habitats costeiros seria uma mais-valia para uma melhor
compreenso desses mecanismos em particular e em geral para o conhecimento dos
mecanismos de resposta a stress.

18
2.Objetivo
20
 2.Objetivo

O objetivo deste trabalho consiste no isolamento e caracterizao de genes que

codificam PP2Cs e protenas PYR/PYL em Armeria welwitschii, com recurso ao PCR e
utilizando primers degenerados de forma a permitir analisar posteriormente o papel que
estas protenas podero ter nos mecanismos de adaptao a ambientes sujeitos a elevada
salinidade e secura.

21
22
3.Metodologia
24
 3.Metodologia

3.1. Identificao e anlise de protenas ortlogas de PP2C e PYR/PYL de

Arabidopsis thaliana em diferentes plantas.

Utilizando a sequncia das PP2C do grupo A e das protenas PYR/PYL de

Arabidopsis thaliana (Dicotilednea) (http://www.arabidopsis.org/) procurou-se, utilizando a
aplicao BLAST, verificar da existncia de homologia destas protenas com protenas de
outras plantas como Physcomitrella patens (musgo) desprovido de vasos condutores,
pertencente diviso de plantas denominadas como Brifitas (plantas avasculares)
(http://genome.jgi-psf.org/Phypa1_1/Phypa1_1.home.html); Selaginella moellendorffii (feto)
pertencente diviso Pteridfita que apresenta vascularizao mas sem semente
(http://genome.jgi-psf.org/Selmo1/Selmo1.home.html) e destacando na diviso Magnoliofita,
espcies como Populus trichocarpa (choupo), Dicotilednea (http://genome.jgi-
psf.org/Poptr1_1/Poptr1_1.home.html) e Oryza sativa (arroz) Monocotilednea
(http://rice.plantbiology.msu.edu/index.shtml).
Estas espcies representam grandes grupos a nvel das plantas e cada uma das
espcies mencionadas possui a sua respetiva base de dados.
O alinhamento das sequncias ortlogas identificadas foi efetuado utilizando o
programa MegAlign (Lasergene) de acordo com o algoritmo Clustal W.
A elaborao das rvores filogenticas correspondentes foi efetuada utilizando
programa PhyloDraw (Choi et al., 2000) e os alinhamentos visualizados com utilizao do
programa GeneDoc (Nicholas et al., 1997).

3.2. Extrao de RNA e sntese de cDNA.

3.2.1. Extrao de RNA com TRIzol.

Para a extrao de RNA utilizaram-se folhas de plntulas de Armeria welwitschii

mantidas em cultura in vitro, o que permitiu facilitar o processo de extrao, pois se trata de
tecidos jovens e pouco lenhificados.
Aps seccionado, o material biolgico foi utilizado de imediato ou mantido a -80C
at se proceder extrao de RNA.
Todo o material de vidro e os almofarizes utilizados, foram previamente tratados com
uma soluo de hidrxido de sdio 0.1M, lavados com H2O-DEPC e esterilizados a seco, a
130C, durante 15 horas, para garantir que o material se encontrava livre de RNases.
No passo de homogeneizao, 200mg de folhas de Armeria welwitschii foram
maceradas num almofariz com azoto lquido at apresentar o aspeto de um p muito fino.
Adicionou-se 1ml de TRIzol e homogeneizou-se.

25
 3.Metodologia

O material insolvel foi separado por centrifugao a 12,000 x g durante 10 minutos

a 4C. O sobrenadante foi recuperado e incubado durante 3 minutos temperatura ambiente
para permitir a dissociao de complexos ncleo-proteicos, aps o que se adicionou 0,2ml
de clorofrmio, agitou-se vigorosamente durante 15 segundos, e, aps uma incubao
temperatura ambiente durante 3 minutos, centrifugou-se a 12,000 x g durante 10 minutos a
4C, para separao das fases.
Precipitou-se a fase aquosa com 0,5ml de isopropanol e incubou-se temperatura
ambiente durante 10 minutos. Aps centrifugao a 15.000 x g durante 10minutos a 4C,
removeu-se o sobrenadante e lavou-se o pellet com 1ml de etanol 70%, agitou-se em vortex
e centrifugou-se a 7.500 x g durante 5 minutos a 4C. Rejeitou-se o sobrenadante e secou-
se o pellet que foi ressuspendido em 20l de H2O ultrapura livre de DNAses/RNases.

A quantificao de RNA foi efetuada por espectrofotometria, como descrito por

Sambrook et al. (1989) medindo a absorvncia a 260nm. A razo absorvncia a
260nm/absorvncia a 280nm foi utilizada para avaliar o grau de pureza do RNA, tendo-se
considerado valores aceitveis entre 1.7 e 2.0.

3.2.2. Tratamento do RNA total com DNase.

Para remover eventuais contaminaes com DNA, as amostras de RNA foram

tratadas com DNase, essencialmente como descrito por Ausubel et al. (1993). A mistura de
reao (100mM de acetato de sdio, 5mM de MgSO4, 1 U DNase I, 1 U de inibidor de
RNases, e 15 a 100g de RNA total, num volume total de 200ml) foi incubada a 37C,
durante 30 minutos e purificada atravs de uma extrao fenol clorofrmio (Sambrook et al.,
1989) tendo, no final, o RNA sido ressuspendido em 10l de H2O-DEPC.
A quantificao e avaliao da integridade do RNA, aps o tratamento com DNase,
foi efetuado como descrito anteriormente.

3.3. Transcrio reversa.

Para se proceder sntese de cDNA utilizou-se a enzima SuperScript III

(Invitrogen, life tecnologies) e 1,5g de RNA total, previamente tratado com DNAse como
descrito anteriormente.

26
 3.Metodologia

Adicionou-se os componentes seguintes a um tubo de centrifugao livre de

nucleases:
- 1.5 g de RNA total;
- 1 l oligo dT (0.1 ug/ul)
- 1l de dNTPs (dATP, dGTP, dCTP e dTTP) 10mM cada;
- gua para perfazer 12l.

Incubou-se a mistura a 65 durante 5minutos e colocou-se brevemente em gelo.

Aps uma breve centrifugao adicionou-se:

- 4l de 5x first-strand Buffer;
- 2l de DDT 0,1M;
- 1l de RNaseOUT (40 unidades/l);
- 1l de SuperScript III RT (200 unidades/l).

Incubou-se a 42C durante 2 horas. Seguidamente incubou-se a 5 minutos a 65C

para inativao da enzima.

3.4. Desenho de primers degenerados.

Para o desenho dos primers degenerados foram escolhidas as zonas em que as

sequncias das protenas apresentavam maior grau de semelhana e as correspondentes
sequncias de cDNA de diferentes espcies, dependendo das sequncias disponveis para
o gene pretendido.
Os primers degenerados foram desenhados de forma a apresentar, tanto quanto
possvel, um tamanho de 22 a 30bp, um contedo em G+C prximo dos 50%, uma
temperatura de fuso superior a 55C e um nmero reduzido de bases degeneradas. Foi
ainda minimizada a possibilidade de ocorrncia de emparelhamento entre distintas regies
de cada primer e de primers entre si.

27
 3.Metodologia

3.5. Amplificao e purificao de fragmentos de interesse.

3.5.1. Condies de amplificao.

Os fragmentos foram amplificados por PCR utilizando a seguinte mistura de reao:

- 25,5 l de H2O ultrapura livre de DNAses/RNases;
- 5 l de tampo 10x (Fermentas, life sciences);
- 5 l de MgCl2 a 25mM (Fermentas, life sciences);
- 2 l de 4dNTPs a 10mM (Fermentas, life sciences)
- 1 l cDNA;
- 5 l de primer degenerado forward a 10 M (Invitrogene, life Technologies);
- 5 l de primer degenerado reverse a 10 M (Invitrogene, life Technologies);
- 1,5 l de Taq DNA polimerase 1u/ l (Fermentas, life sciences);
- 50 l de volume final para a reao de amplificao.

As reaes de PCR foram efetuadas sob o seguinte programa:

-2minutos a 94C;
-30segundos a 94C;
-1minuto a 45C; 40x
-1minuto e 30segundos a 72C;
-10minutos a 72C;
-15C at as amostras serem removidas do PCR.

A reamplificao dos produtos da primeira reao foi efetuada nas mesmas

condies excetuando a alterao da temperatura de annealing que foi alterada de 45C
para 50C e a utilizao de 1,5 l do produto de PCR da amplificao anterior (em vez de
cDNA).

3.5.2. Separao e recuperao de fragmentos.

Os produtos de PCR foram separados por eletroforese em gel de agarose 1%,

corado com brometo de etdio. O tamanho aproximado dos fragmentos obtidos foi avaliado
utilizando o marcador ORangeRuler 200bp (0.05 g/ l) (Fermentas-life sciences). As bandas
foram visualizadas utilizando o sistema de foto-documentao ChemiDoc XRS (BioRad).

3.5.3. Purificao e aumento da concentrao dos produtos de PCR.

28
 3.Metodologia

Dado que a intensidade de algumas das bandas obtidas, mesmo aps

reamplificao, era relativamente fraca, optou-se por purificar e aumentar a concentrao
dos produtos de PCR antes de proceder clonagem dos mesmos. Aps juntar num nico
tubo o produto de 4 reaes de PCR efetuou-se um purificao com fenol/clorofrmio aps o
que o DNA foi precipitado adicionando 1/10 vol. de acetato de sdio 3M e 3 vol. de etanol
absoluto. Incubou-se a -20C durante 1hora, centrifugou-se a 12.000 x g durante 20minutos
temperatura ambiente. O pellet foi lavado com 600l de etanol 70%, agitou-se ao vortex
durante 15segundos, centrifugou-se durante 10minutos a 12.000 x g, rejeitou-se o
sobrenadante e secou-se o pellet. O DNA foi ressuspendido com 25l de gua ultra pura.

3.6. Clonagem.

Para a clonagem dos fragmentos foi utilizada a estratgia de clonagem T/A de

produtos de PCR. Os produtos de amplificao de uma reao de PCR apresentam
geralmente extremidades A 3 projetadas, o que permite a sua clonagem de forma eficiente
em vetores que apresentem extremidades T 3 projetadas (vetores-T), tendo sido utilizado o
de pGEM-T Easy Vector (Promega).

3.6.1. Ligao dos fragmentos ao vetor de clonagem.

Efetuou-se a reao de ligao nas seguintes condies:

- 1.5 l do tampo de ligao x10;
- 1.0 l de pGEM-T Easy Vector (50ng/l);
- 1.0 l do produto de PCR;
- 1.0 l de T4 DNA Ligase;
- 10.5 l H2O.
Incubou-se a 4C overnight.

3.6.2. Transformao em clulas competentes.

A um tubo contendo aproximadamente 50l de clulas competentes DH5 , foram

adicionados 10l da reao de ligao, agitou-se levemente e incubou-se em gelo durante
10 minutos. Submeteu-se o tubo a choque trmico, a 42C durante 50-55 a segundos,
repondo-o de imediato em gelo onde foi incubado durante 2minutos. Adicionou-se 700l de
meio SOC s clulas transformadas e incubou-se durante 60 minutos a 37C com agitao
(~150rpm).

29
 3.Metodologia

Aps centrifugao durante 1min a 10000 x g eliminou-se 650 l do sobrenadante e

o restante foi utilizado para ressuspender as bactrias que foram plaqueadas em meio LB
slido enriquecido com LB/ampicilina/IPTG/X-Gal. Incubou-se overnight a 37C e
selecionaram-se as colnias de cor branca que foram utilizadas para inocular 3ml de meio
LB lquido contendo ampicilina. Aps a repicagem das colnias para meio lquido, os tubos
foram incubados a 37C, com agitao, 250 rpm, durante 16 horas. A extrao do DNA
plasmdico foi efetuada pelo processo de lise alcalina, mni-prep, como descrito por
Sambrook et al. (1989). O DNA plasmdico extrado foi ressuspendido em 30l de H2O-MQ.
Para confirmao da insero dos fragmentos, 3l de DNA plasmdico foram
digeridos com Eco RI (Fermentas). Os produtos da restrio foram separados em gel de
agarose 1% e verificou-se se os fragmentos obtidos apresentavam o tamanho esperado. As
amostras de DNA plasmdico em que havia sido confirmada a insero do fragmento
pretendido foram purificadas atravs de uma extrao fenol-clorofrmio e sequenciadas.

3.7. Sequenciao e anlise das sequncias obtidas.

A sequenciao foi efetuada num sequenciador automtico ABI Prism 373A

automatic sequencer (Applied Biosystems) nas condies definidas pelo fabricante. As
amostras foram preparadas utilizando o kit Big Dye terminator (Applied Biosystems),
essencialmente de acordo com as instrues do fabricante, adicionando, no entanto, apenas
2l de ABI mix mistura de reao, e utilizando o primer M13rev.
As sequncias foram analisadas e editadas utilizando o programa Chromas
(Technelysium Pty Ltd), para remoo das sequncias correspondentes ao vetor e correo
de eventuais erros na definio da sequncia de bases.
As sequncias obtidas foram comparadas com as sequncias existentes na base de
dados (http://www.arabidopsis.org) utilizando os servios BLAST.

30
4.Resultados
32
 4.Resultados

4.1. Extrao de RNA.

O protocolo utilizado permitiu a extrao de RNA total com um grau de pureza

adequado (entre 1.8 e 2.0) e em quantidade suficiente para as reaes de transcrio
reversa.

4.2. Desenho de primers degenerados.

O alinhamento da sequncia das protenas PYR/PYL/RCAR e das PP2Cs grupo

A, atravs do programa MegAlign, permitiu obter uma viso geral sobre as zonas mais
conservadas.
O desenho de primers degenerados foi possvel para ambas as protenas, mas a
presena de aminocidos como Leucina (L), Serina (S) e Arginina (R) em algumas zonas
conservadas, dificultou a reduo do nmero de bases degeneradas.

4.2.1. Alinhamento da sequncia de protenas PYR/PYL/RCAR e desenho dos

respetivos primers.

O alinhamento de sequncias de protenas PYR/PYL/RCAR de Arabidopsis

thaliana (como referncia) e ortlogos de Oryza sativa e Populus trichocarpa permitiu
evidenciar quatro zonas bastante conservadas.
As duas primeiras zonas conservadas foram escolhidas para a definio de dois
primers forward (denominados PYR_Fw1 e PYR_Fw2) e as duas ltimas, na regio final
da protena, foram utilizadas no caso dos dois primers reverse (PYR_Rev1 e PYR_Rev2)
(Figura 4.1).

33
 4.Resultados

A B

C D

Figura 4.12 Zonas conservadas obtidas no alinhamento de sequncias de protenas

PYR/PYL/RCAR de Arabidopsis thaliana, Oryza sativa e Physcomitrella patens utlizadas no
desenho dos primers PYR_Fw1 (A), PYR_Fw2 (B), PYR_Rev1 (C) e PYR_Rev2 (D).

4.2.2. Alinhamento de protenas fosfatases do tipo 2C e desenho dos respetivos

primers.

Para o alinhamento de protenas fosfatases 2C do grupo A, foram utilizadas

sequncias de Arabidopsis thaliana (como referencia) e ortlogos de Oryza sativa,
Populus trichocarpa, Selaginella moellendorffi e Physcomitrella patens.
O domnio N terminal das PP2C apresenta elevada variabilidade e apenas o
domnio C terminal, que corresponde ao domnio cataltico, se encontra conservado.
O alinhamento global ao nvel do domnio cataltico das sequncias de PP2C do
grupo A de Arabidopsis thaliana permite definir dois grupos distintos. O Grupo I, um ramo
que contm fosfatases como ABI1, e HAB1; e o Grupo II, outro ramo em que se incluem
fosfatases como PP2CA e AHG1.

34
 4.Resultados

Figura 4.13 As Fosfatases do tipo 2C do grupo A das espcies Arabidopsis thaliana, Oryza
sativa, Populus trichocarpa, Selaginella moellendorffi e Physcomitrella patens apresentam dois
ramos distintos.

A interessante subdiviso em dois ramos (Figura 4.2) pode sugerir que esses dois
grupos tenham um papel algo distinto na regulao da via de sinalizao de ABA.
A divergncia dos dois grupos foi observada em duas zonas conservadas no incio
do domnio cataltico o que permitiu o desenho de um primer forward especfico para
cada um dos grupos. Um primer caracterstico do grupo II, denominado PP_Fw1-II, foi
desenhado a partir da primeira zona conservada do domnio cataltico (Figura 4.3).

35
 4.Resultados

Figura 4.14 Zona conservada considerada para o desenho do primer degenerado PP_Fw1-II.

Outro primer, referente ao grupo I denominado PP_Fw2-I, foi desenhado a partir

da segunda zona conservada do domnio cataltico (Figura 4.4).

Figura 4.15 Zona conservada considerada para o desenho do primer degenerado PP_Fw2-I.

Uma terceira regio conservada, ainda na parte inicial do domnio cataltico

originou outro primer forward, denominado por PP_Fw2 (Figura 4.5A).
No final do domnio cataltico duas regies foram estabelecidas para primers
reverse, denominados por PP_Rev2 (Figura 4.5B), interno e PP_Rev1 (Figura 4.5C)
externo.

36
 4.Resultados

A B C

Figura 4.16 Zonas conservadas consideradas para o desenho dos primers degenerados
PP_Fw2 (A), PP_Rev2 (B) e PP_Rev1 (C).

Os primers denominados como PP_Fw2, PP_Rev1 e PP_Rev2 tm em

considerao o alinhamento geral, ou seja, todas as fosfatases do tipo 2C do grupo A
consideradas na Figura 4.2.

4.3. Sequncias de primers degenerados e fragmentos esperados.

4.3.1. Recetores PYR/PYL/RCAR.

Tendo em conta os alinhamentos de sequncias de protenas PYR/PYL/RCAR

referidos anteriormente foram desenhados os primers degenerados que encontram-se
descritos na tabela seguinte (Tabela 1):

Tabela 3 Primers degenerados obtidos tendo em conta o alinhamento de protenas

PYR/PYL/RCAR de Arabidopsis thaliana e ortlogos Oryza sativa e Populus trichocarpa (Tm
melting temperature).

Nome do primer Sequncia (53) GC (%) Tm (C)

PYR_Fw1 GAN AAN CCN CAR VVN TAY AAR CAY TT 39% 50
PYR_Fw2 GTN RTN WSN GGN YTN CCN GC 60% 51
PYR_Rev1 TAR TTN SYN ARN CKR TGN WCN CCN CC 51% 55
PYR_Rev2 GGN AYR TCN ACN AYR TAN SWY TC 45% 49

37
 4.Resultados

Considerando o local das sequncias em que os primers degenerados especficos

de PYR/PYL/RCAR emparelham e o tamanho dessas mesmas sequncias nos vrios
organismos considerados, foi possvel extrapolar o tamanho provvel dos fragmentos
esperados para a combinao dos diferentes pares de primers possveis. As diferentes
combinaes de primers originam previsivelmente fragmentos com os seguintes
tamanhos:
Fw1/Rev1: aproximadamente 210bp
Fw1/Rev2: aproximadamente 315bp
Fw2/Rev1: aproximadamente 105bp
Fw2/Rev2: aproximadamente 215bp

4.3.2. Fosfatases do tipo 2C do grupo A.

Os primers resultantes do alinhamento de protenas fosfatases do tipo 2C do

grupo A encontram-se descritos na seguinte tabela (Tabela 2):

Tabela 4 Primers degenerados obtidos pelo alinhamento de protenas PYR/PYL/RCAR de

Arabidopsis thaliana e ortlogos Oryza sativa, Populus trichocarpa, Physcomitrella patens e
Selaginella moellendorffii (Invitrogen).

Nome do primer Sequncia (53) GC (%) Tm (C)

PP_Fw1-II GGN MGN HSN MGN GAN ATG GA 59% 50
PP_Fw2-I TTY GGN GTN TAY GAY GGN CAY GG 54% 53
PP_Fw2 AAY TGY GGN GAY WRN MGN GCN GT 54% 53
PP_Rev1 ACR TCC CAN ARN CCR TCN SWN GC 58% 55
PP_Rev2 TCN CCD ATN SHN CKN SWC ATN GC 55% 53

Considerando a localizao dos primers e os alinhamentos das sequncias das

fosfatases do tipo 2C do grupo A de Arabidopsis thaliana, foi possvel extrapolar o
tamanho aproximado dos fragmentos esperados para a combinao dos diferentes pares
de primers possveis. As diferentes combinaes de primers originam previsivelmente
fragmentos com os seguintes tamanhos:
Fw1-II/Rev1: aproximadamente 655bp
Fw1-II/Rev2: aproximadamente 550bp
Fw2-I/Rev1: aproximadamente 505bp
Fw2-I/Rev2: aproximadamente 400bp
Fw2/Rev1: aproximadamente 290bp
Fw2/Rev2: aproximadamente 180bp

38
 4.Resultados

4.4. Produtos de PCR obtidos.

Numa fase inicial, a estratgia de amplificao passou pelo uso de pares de

primers mais externos, e posterior reamplificao com a combinao dos pares de
primers possveis. As primeiras tentativas de amplificao atravs de primers
degenerados especficos para PYR/PYL/RCAR e PP2Cs no demonstraram resultados
utilizando cDNA de Armria welwitschii.
Para verificar a eficcia dos primers na amplificao das sequncias pretendidas,
decidiu-se efetuar um teste utilizando cDNA de Arabidopsis thaliana que havia sido
utilizado anteriormente em outras reaes de amplificao. Numa primeira amplificao,
atravs de pares de primers desenhados para amplificar PP2Cs, apenas PP_Fw2-I/Rev2
funcionaram, conseguindo-se resultados na amplificao e reamplificao (Figura 4.6).

Figura 4.17 Gel de agarose que demonstra amplificao a partir de cDNA de Arabidopsis
thaliana e posterior reamplificao. Amplificao com PP_Fw2-I/PP_Rev1 (A) e PP_Fw1-
II/PP_Rev1 (B). Reamplificao a partir dos produtos obtidos em A e B com os pares de primers
PP_Fw2-I/PP_Rev1 (C e D). M-Marcador.

Para confirmar a viabilidade dos primers degenerados de PP2Cs, foi feito duas
amplificaes iniciais usando os pares de primers mais externos, PP_Fw2-I/Rev1 e
PP_Fw1/PP_Rev1 respetivamente. Uma reamplificao seguinte foi feita com as
combinaes de primers possveis (Figura 4.7).

39
 4.Resultados

Figura 4.18 Gel de agarose que demonstra a amplificao a partir de cDNA de Arabidopsis
thaliana e posterior reamplificao com as combinaes de primers especficos de PP2Cs.
Amplificao com PP_Fw2-I/Rev1 (A) e PP_Fw1-II/Rev1 (B). Reamplificao com PP_Fw2-
I/PP_Rev2 (A1); PP_Fw2-I/PP_Rev1 (A2); PP_Fw2/PP_Rev2 (A3); PP_Fw2/PP_Rev1 (A4);
PP_Fw1-II/PP_Rev2 (B1); PP_Fw1-II/PP_Rev1 (B2); PP_Fw2/PP_Rev2 (B3) e PP_Fw2/PP_Rev1
(B4). M-marcador.

Fw2-I/Rev1 foram os nicos pares de primers que resultaram como notado

anteriormente (Figura 4.6), mas com a diferena de no terem amplificado na primeira
reao. A utilizao de primers degenerados especficos de PYR/PYL/RCAR no
demonstrou amplificao quando foi utilizado cDNA de Arabidopsis thaliana. Os produtos
resultantes no so especficos (Figura 4.8).

Figura 4.19 Gel de agarose que demonstra a amplificao a partir de cDNA de Arabidopsis
thaliana e posterior reamplificao com as combinaes de primers especficos para
PYR/PYL/RCAR. Amplificao com PYR_Fw1/PYR_Rev2 (A) e reamplificao com
PYR_Fw1/PYR_Rev1 (B); PYR_Fw1/PYR_Rev2 (C); PYR_Fw2/PYR_Rev1 (D) e
PYR_Fw2/PYR_Rev2 (E). M-marcador.

40
 4.Resultados

Na tentativa de tentar amplificar novamente a partir do cDNA de Armeria

welwitschii, alguns parmetros foram alterados. Alteraes foram definidas ao nvel do
programa de PCR e na alterao da quantidade dos reagentes. O aumento dos ciclos (30
para 40), tempo de annealing e extenso, assim como o aumento do volume do template
foram propostos.
Apesar das alteraes e aps vrias tentativas de amplificao, no foram
observados resultados usando primers especficos de PYR/PYL/RCAR quer de PP2Cs.
Os resultados foram obtidos aps a obteno de um novo cDNA de Armeria
welwitschii. Com a consecutiva amplificao, as bandas por vezes no apareciam ou
M
apareciam A
com fraca intensidade. M apareceram com sucesso, devem-se
As bandas que
apenas ao par de primers degenerados PP_Fw2-I/PP_Rev1, especficos de PP2Cs
(Figura 4.9). No houve amplificao a partir de primers especficos para
PYR/PYL/RCAR, com a utilizao do novo cDNA de Armeria welwitschii.

Figura 4.20 Gel de agarose que demonstra a tentativa de amplificao em Armeria welwitschii
com a multiplicidade de primers degenerados. A amplificao apenas ocorre com o par de primers
PP_Fw2-I/PP_Rev1 (A e B).

A partir deste ponto, PP_Fw2-I/PP_Rev1foi o nico par de primers utilizado para

amplificar grande parte da sequncia que codifica para protenas fosfatases do tipo 2C
pertencentes ao grupo A.
O facto de se ter obtido bandas de fraca intensidade est relacionado com a
quantidade de Taq DNA polimerase utilizada. A utilizao de um volume de 0,5l no foi
suficiente dado a fraca concentrao disponvel (1u/l).
O volume foi corrigido para 1,5l, o que resultou na visualizao da grande
intensidade de bandas em comparao com produtos de PCR anteriormente descritos. O

41
 4.Resultados

aumento do volume de Taq. DNA polimerase proporcionou a obteno de uma

quantidade aprecivel dos produtos de PCR originados a partir do par de primers
degenerados PP_Fw2-I/PP_Rev1 (Figura 4.10).

Figura 4.21 Gel de agarose que demonstra a forte amplificao atravs do par de primers
PP_Fw2-I/PP_Rev1.

4.5. Clonagem e sequenciao dos produtos de PCR obtidos.

Aps a clonagem foram selecionadas 8 colnias de cor branca para posterior

anlise.
A anlise por restrio com EcoRI permitiu verificar que, tendo em conta o
tamanho dos fragmentos obtidos por restrio se teriam obtido 4 produtos diferentes, os
quais aps purificao foram sequenciados.
As sequncias obtidas foram comparadas com as sequncias de protenas
existentes na base de dados de Arabidopsis thaliana (Tair). Trs delas apresentavam
homologia com outras protenas que no fosfatases (AT1G80530, AT3G52930,
ATCG00920) mas uma delas apresentava elevada semelhana com fosfatases do tipo
2C (Figura 4.11).

42
 4.Resultados

Figura 4.22 A sequncia parcial (Seq1) de Armeria welwitschii apresenta elevada semelhana
com fosfatases do tipo 2C do grupo A.

43
44
5.Discusso e Concluso
46
 5.Discusso e Concluso

Para identificar os genes que codifiquem protenas PYR/PYL/RCAR e fosfatases do

tipo 2C do grupo A em Armeria welwitschii, recorreu-se amplificao do cDNA utilizando
primers degenerados. O desenho de primers baseou-se no alinhamento de sequncias de
protenas de Arabidopsis thaliana e ortlogos de espcies como Oryza sativa, Populus
trichocarpa, Selaginella moellendorffi e Physcomitrella patens, bem como no alinhamento
das correspondentes sequncias de nucletidos. A partir das sequncias proteicas
disponveis de PYR/PYL/RCAR e PP2Cs do grupo A, foram escolhidas regies conservadas
o mais perto possvel das extremidades (N-terminal e C-terminal). Ao desenhar os primers
degenerados tentou-se evitar resduos de serina, leucina e arginina. Estes aminocidos so
codificados por uma diversa combinao de codes aumentando o nmero de bases
degeneradas e esse aumento traduzido numa elevada combinao de nucletidos o que
diminui a eficincia e especificidade dos primers.
Para a amplificao de genes codificantes de protenas PYR/PYL/RCAR e PP2Cs do
grupo A, optou-se pela estratgia de uma primeira reao de PCR com uma temperatura de
annealing baixa (45C), utilizando primers mais externos seguida de uma reamplificao
com uma temperatura de annealing mais elevada (50C). Ao utilizar uma temperatura
relativamente baixa, a especificidade dos primers na primeira amplificao reduzida,
podendo haver emparelhamentos no especficos, mas por outro lado, aumenta a
possibilidade de poder amplificar o(s) gene(s) alvo. Mesmo havendo emparelhamento por
parte dos primers mais externos na primeira amplificao, a quantidade de DNA resultante
da reao pode no ser visualizada por eletroforese, devido quantidade de DNA ser
reduzida, o que se verificou. A reamplificao recorrendo ao template da primeira reao e
utilizando uma temperatura de annealing mais elevada vai permitir aumentar a
especificidade da reao, em particular quando utilizados primers mais internos, ao mesmo
tempo que permite eventualmente obter uma quantidade de produto que permita a sua
clonagem e posterior anlise.
As protenas PYR/PYL/RCAR das espcies Arabidopsis thaliana e ortlogas de
Populus trichocarpa e Oryza sativa, so protenas relativamente pequenas apresentando
entre os 159 e 251 resduos de aminocidos (Santiago et al., 2009). A amplificao de
genes responsveis pela traduo de protenas PYR/PYL/RCAR no foi bem-sucedida. O
alinhamento das sequncias de protenas PYR/PYL/RCAR, mostra que, apesar de estas
protenas apresentarem elevada semelhana, apresentam apenas quatro regies
conservadas suficientemente longas para o desenho de primers degenerados. Essas quatro
regies foram as utilizadas para o desenho dos primers.
Estes primers mostraram no ser adequados para a amplificao dos genes
codificantes de protenas PYR/PYL/RCAR, nas condies utilizadas, pois no foi possvel
amplificar qualquer protena desta famlia a partir de cDNA de Armeria welwitschii, como

47
 5.Discusso e Concluso

tambm falharam as tentativas de amplificao utilizando um cDNA controlo obtido por

transcrio reversa de RNA obtido de folhas de Arabidopsis thaliana.
O alinhamento geral de sequncias proteicas a partir do domnio cataltico de
fosfatases do tipo 2C do grupo A de espcies como Arabidopsis thaliana e ortlogos de
Oryza sativa, Populus trichocarpa, Selaginella moellendorffi e Physcomitrella patens permitiu
a confirmao de dois ramos distintos (Schweighofer et al., 2004). As sequncias presentes
nos dois ramos do alinhamento geral, foram selecionadas e alinhadas novamente para se
obter primers forward (PP_Fw1-II, um primer mais externo e PP_Fw2-I, um primer mais
interno) especficos de cada ramo com o objetivo de reduzir a quantidade de bases
degeneradas nas duas regies conservadas. Os restantes primers foram definidos pelo
alinhamento geral, com o desenho de um primer forward PP_Fw2 mais interno e dois
reverse, PP_REV1 e PP_Rev2 mais externo e interno respetivamente.
A amplificao de genes que codificam para fosfatases do tipo 2C do grupo A foi
bem-sucedida, recorrendo ao par de primers PP_Fw2-I/PP_Rev1. Analisando de um modo
critico os primers desenhados: a regio utilizada para desenhar o primer PP_Fw1-II
apresenta na sua extremidade 5 elevado nmero de bases degeneradas apresentado no
entanto uma extremidade 3 menos degenerada (ltimos 6 nucletidos). O primer PP_Fw2-I
apresenta muito menos bases degeneradas e, portanto, no surpreende o facto de ter sido o
que possibilitou a amplificao da sequncia parcial dos genes pretendidos. interessante
notar que tambm no caso dos primers reverse, o primer que apresenta menor nmero de
bases degeneradas, PP_Rev1, foi tambm o que permitiu a amplificao de uma sequncia
parcial de um gene codificante de PP2C.
O produto de re-amplificao utilizando o par de primers PP_Fw2-I/PP_Rev1 exibe
duas bandas distintas, uma com sensivelmente 250 pares de bases e outra com pouco mais
de 450. O tamanho dos fragmentos desta ltima banda (450bp) consistente com o
tamanho dos fragmentos esperados (cerca de 500).
Para identificar os fragmentos obtidos, recorreu-se clonagem no vetor pGEM-T e
os clones obtidos foram sequenciados.
O vetor pGEM possui extremidades T 3 projetadas, o que facilitou a ligao aos
fragmentos que possuam extremidades A 3 projetadas geradas pela Taq DNA polimerase.
O processo de seleo dos clones que continham os fragmentos clonados foi facilitada pelo
facto de o vetor utilizado permitir a seleo dos clones pelo sistema colnias brancas/azuis
(o mcs (multiple cloning site) interrompe o gene lacz). Aps a extrao do DNA plasmidico
confirmou-se a insero do fragmento e o seu tamanho por digesto com EcoRI. O padro
de restrio dos oito clones analisados sugeria que teriam sido clonados 4 fragmentos
distintos que foram sequenciados.

48
 5.Discusso e Concluso

As 4 sequncias obtidas foram comparadas com as sequncias presentes nas bases

de dados recorrendo aos servios blast das bases de dados NCBI e Tair. Trs sequncias
correspondem a produtos de amplificao no especficos. Apenas uma das sequncias
apresentava elevada semelhana com sequncias de PP2C de Arabidopsis thaliana.
Essa sequncia apresenta elevada semelhana com as sequncias de PP2C de
Arabidopsis thaliana e em particular com a fosfatase AT1g43900. Esta fosfatase faz parte da
superfamlia das PP2Cs mas est includa no grupo F (Schweighofer et al., 2004), o que
sugere que, apesar da tambm elevada semelhana com as PP2Cs do grupo A, a
sequncia obtida poder ser uma sequncia parcial de um ortlogo de uma fosfatase do
grupo (F).
Os primers utilizados foram desenhados tendo em conta as zonas mais conservadas
das PP2Cs do grupo A, ou seja o seu domnio cataltico. No entanto, o domnio cataltico
apresenta uma semelhana assinalvel em praticamente todas as PP2C, o que poder
eventualmente explicar que a sequncia obtida seja de um gene que codifica uma protena
de outro grupo das PP2C.
A identificao do grupo das PP2Cs em que estar includa a PP2C de que foi
isolada uma sequncia parcial apenas ser possvel aps obteno da sequncia completa
do cDNA por 5RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) e 3 RACE. Contudo, ter-se
obtido uma sequncia parcial correspondente a uma protena pertencente s PP2Cs permite
admitir que o isolamento e posterior sequenciao de um nmero mais elevado dos clones
obtidos poder permitir a identificao e posterior caracterizao de outras protenas deste
grupo de fosfatases e, provavelmente, de algumas pertencentes ao grupo A.

49
50
6.Perspetivas Futuras
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 6.Perspetivas Futuras

Este trabalho confirma a presena de uma fosfatase parcial do tipo 2C em Armeria

welwitschii. Embora esta fosfatase se identifique mais com o grupo F que com o grupo A em
Arabidopsis thaliana, mais trabalho pode ser feito:

Relativamente fosfatase encontrada:

Garantir o reconhecimento de toda a fosfatase atravs de RACE (Rapid Amplification
of cDNA Ends).

Relativamente s fosfatases 2C do grupo A:

Todos os clones obtidos no foram sequenciados, poder ser possvel encontrar
genes correspondentes a PP2Cs do grupo A em outros clones.

Aps se obter ortlogos de fosfatases do grupo A de Arabidopsis thaliana, poder

ser identificada a sua funo e quantificada a sua expresso:
Caracterizao funcional dos genes utilizando ensaios de dois hbridos em levedura
e ensaios de complementao em Arabidopsis thaliana.
Utilizao de PCR quantitativo para anlise dos nveis de expresso dos genes que
as codificam em populaes de Armeria welwitschii da orla martima e em regies
mais interiores.

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54
7.Referncias bibliogrficas
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 7.Referncias bibliogrficas

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