SHARMA 2010

PHYTOCHEMICAL SCREENING AND IN VITRO ANTIMICROBIAL ACTIVITY

OF COMBINED CITRUS PARADISI AND FICUS CARICA LINN AQUEOUS
EXTRACTS

Abstract: To investigate the antimicrobial properties of the combined essential

oil of Citrus paradisi var. star ruby and Ficus carica extracts. The Citrus paradisi
and Ficus carica were tested against pathogenic microorganisms; S. aureus, E.
coli, K pneumoniae, B. subtilis, M. luteus and Candida albicans. The extracts
tested exhibited good antimicrobial activity against all the clinical isolates when
compared with standard.
The different extracts showed remarkable inhibitory action against various Gram
positive and Gram negative bacteria and two fungal species. The methanolic,
petroleum ether, chloroform, ethyl ether, ethanol extract Citrus paradisi and
Ficus carica was screened for its antimicrobial activity. Antimicrobial activity was
detected by observing the growth response of different organisms to the
methanolic extract. It was generally based on the inhibition of growth of
microorganisms which were measured with a desired concentration of the plant
extract of Citrus paradisi to be examined with the standard concentarion
preparation.

Introduction

The worldwide emergence of E. coli, pneumoniae, - Haemophilus and many

others a-lactamase producers has become a major therapeutic problem. Multi-
drug resistant strains of E. coli, K. pneumoniae are widely distributed in
hospitals and are increasingly being isolated from community acquired
infections. Candida albicans also a nosocomial pathogen, has been reported to
account for 50-70% cases of invasive candidiasis. Alamingly, the incidence of
nosocomial candidemia has risen sharply in the last decade. All this has
resulted in severe consequences including increased cost of medicines and
mortality of patients. Plants have traditionally been used in folk medicine as well
as to extend the shelf life of foods, showing inhibition against bacteria, fungi and
yeasts. Antibiotics provide the main basis for the therapy of microbial (bacterial
and fungal) infections. Since the discovery of these antibiotics and their uses as
chemotherapeutic agents there was a belief in the medical fraternity that this
would lead to the eventual eradication of infectious diseases. Citrus fragances
have been particularly attributed with mood enhancing properties by aroma
therapists.
The essential oils obtained from genus Citrus are recommended for the
treatment of anxiety also. Volatile oils isolated from grapefruit (Citrus paradisi),
lemon (Citrus limn), bergamot (Citrus bergamia), lime (Citrus aurantifolia),
mandarin (Citrus nobilis) and orange (Citrus aurantium) are often used in the
treatment of anxiety. Citrus carica is grows in tropical and subtropical regions of
India, used for variety of purpose in traditional medicine. The usefulness of this
plant is scientifically evidenced and different biologically active
phytoconstituents were isolated form plant. In traditional medicine the roots are
used in treatment of leucoderma and ringworms and its fruits which are sweet,
have antipyretic, purgative, aphrodisiac properties and have shown to be useful
in inflammations and paralysis. F. carica has been reported to have numerous
bioactive compounds such as arabinose, B-setosterols and xanthotoxol.

Plant Material: All other chemical and reagents were procured from authorized
suppliers and were of analytical grades. The plants material Citrus paradisi and
Ficus carica whole parts were collected from local rea of Indore Madhya
Pradesh India and identified at the Department of Pharmacogonsy Dr. Hari
Singh Gaur University Sagar.

Preparation of extracts: leaves were taken and air dried in shade for ten days.
Then whole dried plants are made coarse powder. Now the extraction was
occurred by the soxhlet apparatus using the methanol (50-60C), petroleum
ether, chloroform ethyl ether, ethanol extract of the leaves in their increasing
order of polarity as a solvent. Then the extracts were concentrated by putting
the extract on water bath or by distillation. The extracts so obtained were
concentrated to dryness by evaporting the solvent under reduced pressure
using rotary evaporator.
The aqueous extract was prepared by cold maceration of 250 g of the shade-
dried leaf powder in 500ml of chloroform wter (1:99) for 7 days. The various
extracts obtained were filtered, concentrated, dried in vacuum and the residue
stored in a refrigerator at 2-8 C for use in subsequent experiments.

Preliminary Photochemical Screening: the dry extracts were subjected to

various chemical tests to detect the presence of different phytoconstituents. The
coarse powder of leaves of Citrus Paradisi and Ficus Carica (100g) was
subjected to successive extraction with different solvent in their increasing order
of polarity from methanol, petroleum ether (60-80C), chloroform, acetone,
ethyl ether and ethanol. The extracts were concentrated and subjected to
various chemical tests to detect the presence of different phytoconstituents.

Formulation of Extract: for anti-microbial activity study on the day of

experimentation, the different amount of powder was suspended in distilled
water to get different concentration of suspensin.

Antibacterial and antifungal Studies: the various extracts were tested for
their effect on Gram +ve bacteria Gram ve bacteria such as S. aureus, E. coli,
K. pneumoniae, B. subtilis, M. luteus and Candida albicans. Fungi used for the
present study were Candida albicans.
Minimum inhibitory concentration of the extracts was evaluated by cup plate
diffusion method for antibacterial and antifungal activity 0.1 ml of overnight
grown nutrient broth culture of the bacteria was transferred aseptically to sterile
glass Petri dish. Sterile molten nutrient agar (45C) was then poured, mixed
uniformly rotating the plate and allowed to solidify. Cups were made out in the
centre of the seeded nutrient agar plate using a sterile cork borer (6mm). The
various extracts of the Citrus paradisi leaf of different concentrations viz. 5, 0,
20, 50, 100, 200, 400 mg/ml were made using dimethyl sulphoxide (DMSO) as
a diluting solvent. The samples were added with a sterile micropipette to each
of the cups. The plates were then incubated al 37C for 24 hrs. Plates with cups
containing only DMSO served as a control.
Agar well Diffusion: the antimicrobial activity of the essential oil was
determined by using the agar well diffusion technique. Nutrient agar plates were
each seeded with 0.5ml of an overnight culture of each bacterial, while the
sabouraud dextrose agar plates were each similarly seeded with each fungal
strain. The 24 hrs broth culture of each bacterium and three days inoculated
fungus culture were used to seed sterile molten nutrient agar and sabouraud
dextrose agar at 45C respectively, allowed to set and well made by sterile cork
borer and 100 ul (0.1 ml) solution of essential oil added in to in each well.

Results and discussion

The antimicrobial affect of plant extract against the different strains are
illustrated in table 1. The five different crude extracts viz petroleum ether,
chloroform, ethyl ether, ethanol and aqueous extract of Citrus paradisi and
Ficus carica were tested against various Gram + ve and Gram ve bacteria.
The results ilustrated in table 1 revealed the extract of Citrus paradisi as most
active against S. aureus, E. coli and K. pneumoniae in the dilution of 5 to 400
concentrations . It is clear that all the extract at various concentrations have
shown antibacterial activity equivalent to that of standard against the entire
tested organism. Petroleum ether, methanol and aqueous extracts have shown
better activity than the standard against all the four microorganisms. Chloroform
extract was only effective against Bacillus subtilis, M. luteus and C. albicans.
Acetone extract was most effective against M. luteus and C. albicans. Acetone
extract was most effective against M. luteus and C. albicans. The zone of
inhibition varied among suggesting that the varying degree of efficacy and
different phytoconstituents of herb on the target organism. Preliminary
phytochemical screening of different extracts showed the presence of alkaloids,
tannins, saponin, flavonoids, steroids and glycosides.

The antibacterial activity of the plants may be due to the presence of various
active principles in the leaves.
From the antimicrobial screening it was found that the methanolic extract of
Citrus pardisi and Ficus carica possessed significant antibacterial and antifungal
activity when compared with the other extracts and standard drugs. Further
studies involving the isolation, characterization and purification of the chemical
compounds of the plant and screening for antibacterial and antifungal may
result in the development of a potent entity which will be of lower toxicity and a
high therapeutic value to the mankind. Thus, it can be concluded that while
screening of various extracts of Citrus paradisi leaf against various Gram +ve
and Gram ve bacteria and fungi, ethanol extracts extracts exhibited very
satisfactory inhibitory activity.
TAMIZAJE FITOQUMICO Y ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA IN VITRO DEL
COMBINADO CITRUS PARADISI Y FICUS CARICA LINN EXTRACTOS
ACUOSOS
Resumen: Para investigar las propiedades antimicrobianas del combinado del
aceite esencial de Citrus paradisi var. rub estrella y extracto de Ficus carica. El
carica Citrus paradisi y Ficus fueron probados contra los microorganismos
patgenos; S. aureus, E. coli, K. pneumoniae, B. subtilis, M. luteus y Candida
albicans. Los extractos ensayados mostraron una buena actividad
antimicrobiana contra todos los aislados clnicos en comparacin con el
estndar.
Los diferentes extractos mostraron notable accin inhibidora frente a varias
bacterias Gram negativas y Gram positivas y dos especies de hongos. El
metanol, ter de petrleo, cloroformo, ter etlico, extracto de etanol Citrus
paradisi y Ficus carica se proyect para su actividad antimicrobiana. Se detect
actividad antimicrobiana mediante la observacin de la respuesta de
crecimiento de diferentes organismos para el extracto metanlico. Se basa
generalmente en la inhibicin del crecimiento de microorganismos que se
midieron con una concentracin deseada del extracto de la planta de Citrus
paradisi a examinar con la preparacin concentarion estndar.
Resultado y discusin
El antimicrobiano afecta de extracto de la planta contra las diferentes cepas se
ilustran en la tabla 1. Los cinco extractos crudos diferentes viz.petroleum ter,
ter etlico cloroformo, etanol y extracto acuoso de Citrus paradisi y Ficus
carica fueron probados contra varias bacterias Gram + ve y bacterias Gram -ve.
Los resultados ilustrados en la Tabla 1 revelaron el extracto de Citrus paradisi
como ms activo contra S. aureus, E. coli y K. pneumoniae en la dilucin de 5 a
400 concentraciones. Es evidente que todo el extracto de col diversas
concentraciones han demostrado actividad antibacteriana equivalente a la de la
norma contra todo el organismo ensayado. ter de petrleo, metanol y
extractos acuosos han demostrado mejor actividad tan el estndar contra los
cuatro microorganismos. Extracto de cloroformo fue slo afectiva contra
Bacillus subtilis, M. luteus y C. albicans. Extracto de acetona era ms eficaz
contra M. luteus y C. albicans. La zona de inhibicin vari entre lo que sugiere
que el grado variable de eficacia y diferentes fitoconstituyentes de la hierba en
el organismo objetivo. Tamizaje fitoqumico preliminar de diferentes extractos
mostr la presencia de alcaloides, taninos, saponina, flavonoides, esteroides y
glucsidos.
La actividad antibacteriana de las plantas puede ser debido a la presencia de
varios principios activos en las hojas. A partir de la proyeccin antimicrobiano
se encontr que el extracto metanlico de Citrus paradisi y Ficus carica posea
actividad antibacteriana y antifngica significativa en comparacin con los otros
extractos y frmacos estndar. Otros estudios que implican el aislamiento,
caracterizacin y purificacin de los compuestos qumicos de la planta y la
deteccin de resultados antibacterianos y antifngicos mayo en el desarrollo de
una entidad potente que ser de menor toxicidad y un alto valor teraputico
para la humanidad. Por lo tanto, se puede concluir que mientras que la
deteccin de diversos extractos de Citrus paradisi hoja contra diversos Gram +
ve y -ve bacterias Gram y hongos, extractos de etanol exhiben actividad
inhibidora muy satisfactorio.

Resumen: Para investigar las propiedades antimicrobianas del aceite esencial

combinado de Citrus paradisi var. rub estrella y extractos Ficus carica. El carica Citrus
paradisi y Ficus fueron probados contra los microorganismos patgenos; S. aureus, E.
coli, K. pneumoniae, B. subtilis, M. luteus y Candida albicans. Los extractos ensayados
mostraron una buena actividad antimicrobiana contra todos los aislados clnicos en
comparacin con el estndar.
Los diferentes extractos mostraron notable accin inhibidora frente a varias bacterias
Gram negativas y Gram positivas y dos especies de hongos. El metanol, ter de
petrleo, cloroformo, ter etlico, extracto de etanol Citrus paradisi y Ficus carica se
proyect para su actividad antimicrobiana. La actividad antimicrobiana se detecta
mediante la observacin de la respuesta de crecimiento de diferentes organismos para
el extracto metanlico. Se basa generalmente en la inhibicin del crecimiento de
microorganismos que se midieron con una concentracin deseada del extracto de la
planta de Citrus paradisi a examinar con la preparacin concentracin estndar.

Introduccin
La emergencia mundial de E. coli, pneumoniae, - Haemophilus y muchos otros a-
lactamasa productores ha convertido en un problema teraputico importante. Cepas
resistentes a mltiples frmacos de E. coli, K. pneumoniae se encuentran ampliamente
distribuidas en los hospitales y son cada vez ms aislados de infecciones adquiridas
en la comunidad. Candida albicans tambin un patgeno nosocomial, se ha informado
de dar cuenta de 50-70% de los casos de candidiasis invasiva. Alamingly, la incidencia
de candidemia nosocomial ha aumentado considerablemente en la ltima dcada.
Todo esto ha dado lugar a graves consecuencias, incluyendo aumento del costo de los
medicamentos y la mortalidad de los pacientes. Las plantas se han utilizado
tradicionalmente en la medicina popular, as como para extender la vida til de los
alimentos, que muestra la inhibicin contra bacterias, hongos y levaduras. Los
antibiticos son la base principal para la terapia de infecciones microbiana (bacterias y
hongos). Desde el descubrimiento de estos antibiticos y sus usos como agentes
quimioteraputicos haba una creencia en la fraternidad mdica que esto llevara a la
eventual erradicacin de las enfermedades infecciosas. Fragancias ctricas han sido
particularmente atribuido con el estado de nimo mejora de propiedades por
terapeutas aroma.
Los aceites esenciales obtenidos de gnero Citrus se recomiendan para el tratamiento
de la ansiedad tambin. Aceites voltiles aislados de toronja (Citrus paradisi), limn
(Citrus limon), bergamota (bergamia Citrus), lima (Citrus aurantifolia), mandarina
(Citrus nobilis) y naranja (Citrus aurantium) a menudo se utilizan en el tratamiento de
la ansiedad. Carica Citrus es crece en regiones tropicales y subtropicales de la India,
que se utiliza para una variedad de propsitos en la medicina tradicional. La utilidad de
esta planta est cientficamente evidencia y diferentes fitoconstituyentes
biolgicamente activos se aislaron forma de la planta. En la medicina tradicional de las
races se utilizan en el tratamiento de leucoderma y tia y sus frutos que son dulces,
tener antipirticas, purgante, propiedades afrodisacas y que han demostrado ser til
en las inflamaciones y parlisis. F. carica se ha informado que tienen numerosos
compuestos bioactivos tales como arabinosa, B-sitosteroles y xantotoxina.

Planta Material: Todos los dems productos qumicos y reactivos fueron adquiridos de
proveedores autorizados y eran de grado analtico. Las plantas paradisi Citrus
materiales y Ficus carica piezas enteras fueron recogidos de rea local de Indore
Madhya Pradesh India e identificaron en el Departamento de Farmacognosia Dr. Hari
Singh Gaur Universidad Sagar.

Preparacin de extractos: hojas se tomaron y se seca al aire en la sombra durante

diez das. Plantas Entonces toda secas se hacen polvo grueso. Ahora, la extraccin se
produjo por el aparato de Soxhlet usando el metanol (50-60 C), ter de petrleo, ter
etlico cloroformo, extracto etanlico de las hojas en orden creciente de su polaridad
como disolvente. A continuacin, los extractos se concentraron al poner el extracto en
un bao de agua o mediante destilacin. Los extractos as obtenidos se concentraron
hasta sequedad mediante evaporting el disolvente bajo presin reducida usando un
evaporador rotatorio.
El extracto acuoso fue elaborado por maceracin en fro de 250 g del polvo de hoja de
sombra seca en 500 ml de agua cloroformo (1:99) durante 7 das. Los diferentes
extractos obtenidos se filtr, se concentr, se sec al vaco y el residuo almacenado
en un refrigerador a 2-8 C para su uso en experimentos posteriores.

Screening fotoqumico preliminar: los extractos secos se sometieron a diversas

pruebas qumicas para detectar la presencia de diferentes fitoconstituyentes. El polvo
grueso de las hojas de Citrus paradisi y Ficus Carica (100 g) se someti a extraccin
sucesiva con diferente disolvente en orden creciente de su polaridad a partir de
metanol, ter de petrleo (60 -80 C), cloroformo, acetona, ter etlico y etanol . Los
extractos se concentraron y se sometieron a diversas pruebas qumicas para detectar
la presencia de diferentes fitoconstituyentes.

Formulacin de Extracto: para estudiar la actividad anti-microbiana en el da de la

experimentacin, la diferente cantidad de polvo se suspendi en agua destilada para
obtener diferentes concentraciones de suspensin.

Antibacterial y Estudios antifngicos: los diversos extractos se ensayaron para

determinar su efecto sobre Gram + ve bacterias Gram - cinco bacterias tales como S.
aureus, E. coli, K. pneumoniae, B. subtilis, M. luteus y Candida albicans. Los hongos
utilizados para el presente estudio fueron Candida albicans.
La concentracin mnima inhibitoria de los extractos se evalu por el mtodo de
difusin en placa taza para la actividad antibacteriana y antifngica 0,1 ml de crecer
durante la noche cultivo de caldo de nutrientes de las bacterias se transfiri
aspticamente al vidrio placa de Petri estril. A continuacin, agar nutriente fundido
estril (45 C) se verti, mezclado uniformemente girar la placa y se dej solidificar.
Copas se hicieron en el centro de la placa de agar nutriente sin semillas usando un
sacabocados estril (6 mm). Los diferentes extractos de la hoja de Citrus paradisi de
diferentes concentraciones viz. 5, 0, 20, 50, 100, 200, se hicieron 400 mg / ml usando
sulfxido de dimetilo (DMSO) como disolvente de dilucin. Se aadieron las muestras
con una micropipeta estril para cada una de las tazas. Las placas se incubaron a
continuacin al 37 C durante 24 hrs. Las placas con las tazas que contienen
solamente DMSO sirvieron como control.

Bien de difusin en agar: la actividad antimicrobiana del aceite esencial se determin

mediante el uso de la tcnica de difusin en pocillo de agar. Placas de agar de
nutrientes fueron cada uno se sembr con 0,5 ml de un cultivo nocturno de cada
bacteriana, mientras que las placas de agar Sabouraud dextrosa eran cada uno de
manera similar sembraron con cada cepa fngica. El 24 hrs caldo de cultivo de cada
bacteria y tres das de cultivo hongo inoculado se utilizaron para sembrar agar
nutriente fundido estril y agar de dextrosa Sabouraud a 45 C, respectivamente,
permiti establecer y bien hecha por perforador de corcho estril y 100 ul (0,1 ml)
solucin de de aceite esencial aadido en a en cada pocillo.

Resultados y discusin
El antimicrobiano afecta de extracto de la planta contra las diferentes cepas se ilustran
en la tabla 1. El cinco extractos crudos diferentes viz ter de petrleo, cloroformo, ter
etlico, etanol y extracto acuoso de Citrus paradisi y Ficus carica se ensayaron contra
varios Gram + ve y Gram - ve bacterias. Los resultados ilustrados en la Tabla 1
revelaron el extracto de Citrus paradisi como ms activo contra S. aureus, E. coli y K.
pneumoniae en la dilucin de 5 a 400 concentraciones. Es evidente que todo el
extracto a diversas concentraciones han demostrado actividad antibacteriana
equivalente a la de la norma contra todo el organismo ensayado. ter de petrleo,
metanol y extractos acuosos han demostrado mejor actividad que el estndar contra
todos los cuatro microorganismos. Extracto de cloroformo fue slo eficaz contra
Bacillus subtilis, M. luteus y C. albicans. Extracto de acetona era ms eficaz contra M.
luteus y C. albicans. Extracto de acetona era ms eficaz contra M. luteus y C. albicans.
La zona de inhibicin vari entre lo que sugiere que el grado variable de eficacia y
diferentes fitoconstituyentes de la hierba en el organismo objetivo. Tamizaje fitoqumico
preliminar de diferentes extractos mostr la presencia de alcaloides, taninos, saponina,
flavonoides, esteroides y glucsidos. la actividad antibacteriana de las plantas puede
ser debido a la presencia de varios principios activos en las hojas.
A partir de la proyeccin antimicrobiano se encontr que el extracto metanlico de
Citrus pardisi Ficus carica y posea actividad antibacteriana y antifngica significativa
en comparacin con los otros extractos y frmacos estndar. Otros estudios que
implican el aislamiento, caracterizacin y purificacin de los compuestos qumicos de
la planta y la deteccin de antibacteriana y antifngica puede resultar en el desarrollo
de una entidad potente que ser de menor toxicidad y un alto valor teraputico para la
humanidad. Por lo tanto, se puede concluir que mientras que la deteccin de diversos
extractos de Citrus paradisi hoja contra diversos Gram + ve y -ve bacterias Gram y
hongos, etanol extrae extractos mostraron actividad inhibitoria muy satisfactorio.