5 MTODOS DE CUANTIFICACIN DE PROTENAS: Mtodo de

Bradford, Biuret y Lowry.

Tipo de prctica: Duracin: Indicaciones de peligro:

Grupal (2
4 horas No presenta indicadores de peligro
personas)

5.1. Objetivos

Comparar los mtodos de cuantificacin de protenas.

Determinar el rendimiento y pureza de una protena: Casena.
Apreciar el uso de las tcnicas espectrofotomtricas para la
cuantificacin de material biolgico.

5.2. Conceptos relacionados

Ley de Lambert-Beer, reactivo de Biuret, reactivo de Bradford, curva de

calibracin, casena, reactivo de Lowry.

5.3. Fundamento terico

Para el estudio de la estructura de una protena, de la actividad de una enzima

o el contenido protenico de un alimento, es necesario conocer
cuantitativamente la concentracin de las protenas.

Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de

estos mtodos se basan en: a) la propiedad intrnseca de las protenas para
absorber luz en el UV, b) para la formacin de derivados qumicos, o c) la
capacidad que tienen las protenas de formar complejos.
Entre los mtodos que se basan en la formacin de complejos colorimtricos
entre las protenas y reactivos especficos se encuentran:

Tabla 1. Principales mtodos para la cuantificacin de protenas y sus

rangos de sensibilidad.

Mtodo Rango de Ventajas Aplicaciones

sensibilidad
(g)
Bradford 1-15 Limite bajo de Resultados rpidos
deteccin Muestras que
Compatible con contienen agentes

agentes reductores

reductores

Rapidez
Lowry 25-100 a Color estable Mayormente usado
500nm
Preciso til para cuantificar
2-30 a 660 protenas de
nm membrana

1-2 a 750 nm
Biuret 1000-10000 Muy especfico Determinacin de
para protenas. protenas en
cereal.
Muestra pocas
interferencias

Es barato

Mtodo de Bradford
 Est basado en el cambio de color del colorante azul brillante de
Coomassie en respuesta a diferentes concentraciones de protenas. Este
compuesto interacciona con aminocidos bsicos (especialmente
arginina) y aromticos. Esta unin del colorante con las protenas
provoca un cambio en el mximo de absorcin del colorante desde 465 a
595 nm. Por lo tanto, este mtodo se basa en la propiedad del Azul
Brillante de Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores
diferentes, rojo y azul. La forma roja se convierte en azul cuando el
colorante se une a la protena. Experimentalmente se mide la diferencia
de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-465nm).

Figura1. Estructura del azul de Coomassie.

Mtodo de Lowry

Es un mtodo colorimtrico de valoracin cuantitativa de las protenas. A

la muestra se aade un reactivo que forma un complejo coloreado con
las protenas, siendo la intensidad de color proporcional a la
concentracin de protenas, segn la ley de Lambert-Beer

Este mtodo consta de dos etapas:

 1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las protenas formando
complejos con los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Estos
complejos Cu2+-protena tienen un color azul claro. Adems, provocan
el desdoblamiento de la estructura tridimensional de la protena,
exponindose los residuos fenlicos de tirosina que van a participar en la
segunda etapa de la reaccin. El Cu2+ se mantiene en solucin alcalina
en forma de su complejo con tartrato.

1) La reduccin, tambin en medio bsico, del reactivo de Folin-Ciocalteau,

por los grupos fenlicos de los residuos de tirosina, presentes en la
mayora de las protenas, actuando el cobre como catalizador. El
principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau es el cido
fosfomolibdotngstico, de color amarillo, que al ser reducido por los
grupos fenlicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

Mtodo de Biuret

La reaccin de Biuret es una reaccin coloreada (violeta) debida a la formacin

de un complejo de Cu en un medio alcalino en compuestos que poseen ms de
un enlace peptdico, como las protenas:
Figura 2. Reaccin de Biuret.

La curva de patrn es un mtodo de qumica analtica empleado para medir la

concentracin de una sustancia en una muestra por comparacin con una serie
de elementos de concentracin conocida. Se basa en la existencia de una
relacin en principio lineal entre un carcter medible (por ejemplo la
absorbancia en los enfoques de espectrofotometra) y la variable a determinar
(la concentracin). Para ello, se efectan diluciones de unas muestras de
contenido conocido y se produce su lectura y el consiguiente establecimiento
de una funcin matemtica que relacione ambas; despus, se lee el mismo
carcter en la muestra problema y, mediante la sustitucin de la variable
independiente de esa funcin, se obtiene la concentracin de esta. Se dice
pues que la respuesta de la muestra puede cuantificarse y, empleando la curva
patrn, se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta encontrar la
concentracin.

5.4. Materiales

30 Tubos de ensayo. Gradillas para tubos

Agitador Vortex
Micropipetas de 20-100 l y
de 100-1000 l

5.5. Equipos

Espectrofotmetro.
Bao maria.

5.6. Sustancias

Reactivo de Bradford Reactivo de Biuret

Reactivo de Lowry
Suero albumina srica bovina NaCl al 1% (P/P)
NaOH 1N
(BSA) (10 mg/mL)
 Agua destilada

5.7. Procedimiento
Reactivo de Biuret: En un matraz de un litro disuelva 1,5 g de CuSO 4.5H2O y
6 gramos de tartrato de sodio en 500 mL de agua destilada. Aada, con
agitacin constante, 300 mL de NaOH 10% recien preparado y libre de
carbonatos. Complete el volumen con agua destilada y almacene en botella
oscura. La presencia de un precipitado rojo o negro indica que la solucin debe
desecharse.

Reactivo de Lowry: Prepare las siguientes 3 soluciones.

Solucin A: Na2CO3 2%.

Solucin B: CuSO4 0,5%

Solucin C: Tartrato de sodio y potasio 1%

Disuleva 50 mL de la solucin A, mas 0,5 mL de solucin B y 0,5 mL de

solucin C. Este es el reactivo de Lowry y puede durar hasta una semana en
nevera.

Reactivo de Bradford: Reactivo de Bradford (Muy importante. No

confundir el coomasie G- 250 con el coomasie R-250).

Azul de coomasie G-250 5 mg

Etanol 2.5 ml

Ac. fosforico 5 ml

agua Hasta 50 ml
Mezclar en el orden indicado, disolver con agitacion y a continuacion filtrar.

Preparacin de soluciones problema.

Caseina.
Pesar 0.1 g de casena y colocarla en un vaso de precipitado de 100 mL.
Aadir 30 mL de solucin de NaCl al 1%, agregar gota a gota una
disolucin concentrada de NaOH 1N hasta completar la disolucin de la
protena.
Pasar la disolucin anterior a un matraz aforado de 100 mL y aforar. Esta
es la disolucin problema y de estas se tomarn alcuotas.

Leche

Para la preparacin de la muestra problema de leche; tomar 0.05 mL de

leche y realizar una dilucin de 1:10 (Vol. Final: 1 mL). Si la
concentracin de protena no se encuentra dentro del rango de
absorbancia preparar diluciones de 1:20, 1:100 y 1:1000 de la solucin
inicial.

Preparacin de las soluciones para la curva de calibracin.

A continuacin, a seis tubos de ensayo adicionar los siguientes

volmenes: 0.1ml, 0.2ml, 0.4ml, 0.8ml y 1.0ml de solucin de albumina
srica bovina (BSA 10 mg/mL), y completar el volumen a 3 mL con la
solucin de cloruro de sodio, como se describe en la tabla 1.
En seguida, adicionar a los tubos 7 a 10 la muestra problema, de
acuerdo a lo descrito en la tabla 1.

Cuantificacin de proteinas por el mtodo de Biuret

 1. Tomar una alicuota de 0.5 mL de cada uno de los tubos 1 al 9 y
adicionarle 2,5 mL del reactivo de Biuret.
2. Cuantificar a 550 nm
3. Posteriormente, llevar los tubos a 100 C durante 20 minutos, hasta la
formacin del complejo. Dejar reposar las soluciones hasta alcanzar la
temperatura ambiente y cuantificar nuevamente a 550 nm.

Cuantificacin de proteinas por el mtodo de Lowry.

1. Diluir el reactivo de Folin en proporcin 1:2 disuelto en agua. Es
importante que este reactivo se diluya en la menor cantidad posible,
realice el calculo para diluir solo lo que usted va a utilizar (en muy
txico). Guardarlo en un tubo de ensayo hasta su uso en el item 5.
2. Tomar 0.5 mL de las muestras de la curva de calibracin y de las
muestras problemas y adicionar cada una en un tubo de ensayo.
3. Adiocione 2.5 mL del reactivo de Lowry a cada uno de los tubos de
ensayo.
4. Agite y deje incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos.
5. Adicione 0,25 mL del reactivo de Folin diluido anteriormente.
6. Agite y deje incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
7. Cuantificar a 550 nm.

Cuantificacin de proteinas por el mtodo de Bradford.

1. Tomar Tomar 0.1 mL de las muestras de la curva de calibracin y de las
muestras problemas y adicionar cada una en un tubo de ensayo.
2. Adcionar 0,9 mL del reactivo de Bradford.
3. Cuantificar a 595 nm.

Llene sus dato en una tabla similar a las tabla 1, en el que se

envidencien las absorbancias para cada uno de los mtodos de
cuantificacin usados, y para el caso del mtodo de Biuret para las
absorbancias pre y pos calentamiento.

Curva de calibracin.

Realice una curva de calibracin usando albumina diluida en una solucin de

NaCl 0.9%, use solo 4 puntos y como concentracin mxima 1mg/mL.

Tubo Protena
Solucin * Absorbancia
No. (mg)
1 3 ml NaCl al 0.9%, Blanco
2 ___ mL BSA y ___ mL NaCl
3 ___ mL BSA y ___ mL NaCl
4 ___ mL BSA y ___ mL NaCl
5 ___ mL BSA y ___ mL NaCl
6 0.25 ml casena y 2.75 ml NaCl
 7 0.5 mL casena y 2.5 mL NaCl
8 0.25 mL leche diluida y 2.75 mL
NaCl
9 0.5 mL leche diluida y 2.5 mL NaCl
*Cada una de las soluciones debe tener un volumen final de 3 mL.

Registrar los resultados en la tabla 2.

Tabla 2: Concentracin de protena en las muestras problema.

Tubo No. Protena (mg) Factor de disolucin Protena (mg/mL)

6
7
8
9

1.8 Responda las siguientes preguntas:

1.8.1 Defina con sus propias palabras que es una curva patrn.
1.8.2 Explique por qu en el mtodo de Biuret la absorbancia de una protena
se lee a una longitud de 550 nm.
1.8.3 Cul mtodo es el ms sensible?, y el menos sensible?. Por qu?.
1.8.4 Decide qu mtodo de determinacin de protenas elegiras para la
cuantificacin de protenas en: suero, orina, durante una purificacin
enzimtica, en un extracto bacteriano concentrado, en preparaciones de
membranas plasmticas solubilizadas con SDS, en preparaciones de
membranas mitocondriales solubilizadas con Tritn X-100. Justifique su
respuesta.

Referencias bibliogrficas

1. Lehninger A, Nelson DL, Cox M (1997). Principles of Biochemistry,

Worth Publishers, 2 edicin.

2 D. Voet, JG Voet, CW Pratt. Fundamentos de Bioqumica. Editorial

Mdica Panamericana. 2 Ed.Bioqumica, Madrid, 2007.
3 Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the
quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle
of protein-dye binding. Anal Biochem. 72: 248-254.

4 Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., and Randall, R. J. (1951)

Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem.
193, 265-275).

5 Gornall A, Bardawill CJ, David MM (1949). Determination of serum

proteins by means of the biuret reaction. J Biol Chem. 177: 751
766.