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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMDICAS

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS QUMICO-BIOLGICAS

ACADEMIA DE BIOQUMICA

LIC. EN QUMICO FARMACUTICO BILOGO

BAS981800

MANUAL DE PRCTICAS DE BIOQUMICA I

FECHA DE ACTUALIZACIN DICIEMBRE 2014


Contenido
Pag.
Presentacin 3
Practica No.1 Explicacin y manejo del material de laboratorio 4
Practica No.2 Bioseguridad 7
Practica No.3 Espectrofotometra 10
Practica No.4 Uso, calibracin y manejo del potencimetro 13
Practica No.5 Identificacin de aminocidos 16
Practica No.6 Disociacin de aminocidos 21
Practica No.7 Identificacin y cuantificacin de protenas 24
Practica No.8 Propiedades qumicas de las protenas 28
Practica No.9 Anlisis Enzimtico Cualitativo; Efecto del calor sobre
la actividad de las enzimas 33
Practica No.10 Cintica Enzimtica: Efecto del pH y temperatura sobre
la actividad enzimtica 36
Practica No.11 Cintica Enzimtica: Efecto de la concentracin de sustrato
sobre la actividad enzimtica 41
Practica No.12 Cintica Enzimtica: Efecto de inhibidores 44
Practica No.13 Estudio del bombeo de protones por levaduras 48
Practica No. 14 Aislamiento de ADN 50

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SESIN 1.
PRESENTACIN DEL DOCENTE
FORMAS DE EVALUACIN
ELABORACIN DE REPORTE
ASPECTOS GENERALES

En esta sesin, el docente se presenta y explica ampliamente el mtodo de evaluacin


de laboratorio y la forma de elaboracin, entrega y ponderacin de los reportes de
prctica, sin dejar de lado la bitcora, que es la prueba tangible del trabajo
experimental. Este rubro es a consideracin del maestro que imparte el laboratorio, el
nmero de crditos de la materia, las horas de laboratorio y el maestro que imparte la
materia.
Explicacin del reglamento del laboratorio. Explicar a los alumnos que existen las
normas oficiales de seguridad, los reglamentos internos de la UACJ (Universidad
Autnoma de Ciudad Jurez) y el reglamento de la Academia de Bioqumica. Lo ms
importante el sentido comn.
Destacar la asistencia al laboratorio como primordial, la entrega de reportes de prctica
y el uso de la bitcora de laboratorio.
El uso de elementos de seguridad como la bata y dems accesorios como obligatorios.
El material del laboratorio es responsabilidad de quien lo utiliza, recomendar a los
alumnos el buen uso de este.
Dar las indicaciones acerca de cmo se debe comportar en el laboratorio (como se
recibe y como se entrega).

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SESIN 2 PRACTICA # 1
EXPLICACIN Y MANEJO DEL MATERIAL DE LABORATORIO

OBJETIVO
Desarrollar destreza en el manejo tanto de material como de instrumentacin aplicable
a tcnicas de experimentacin en el rea bioqumica.
PRERREQUISITOS
1.- Conocimientos sobre diluciones, soluciones y mezclas.
2.- Definicin de cido, base y amortiguador.
3.- Conocimiento bsico del manejo del potencimetro y el fotocolormetro.
4.- Que es una solucin Molar, Normal y % w/v
INTRODUCCIN
Para llevar a cabo con xito un experimento en cualquier laboratorio es necesario que
se manejen tcnicas bsicas de experimentacin tales como:
- Tcnicas de medicin de lquidos.
- Tcnicas de pesado de slidos.
- Tcnicas de mezclado de lquidos y slidos.
Todas estas tcnicas se relacionan con frecuencia con las actividades que
cotidianamente se llevan a cabo en el laboratorio de Bioqumica. A continuacin se dan
algunos datos sobre cada una de estas tcnicas.
Medicin de lquidos: Los instrumentos de medicin de lquidos ms utilizados son:
pipetas, probetas y matraces volumtricos. Las pipetas sirven para medir volmenes de
hasta 25 ml. En este rango de volumen, las pipetas tienen un uso muy frecuente en el
laboratorio por su exactitud y confiabilidad. Existen dos tipos generales de pipetas: las
serolgicas y las volumtricas.
La pipetas serolgicas miden volmenes diversos debido a que estn graduadas en
diferentes medidas, por ejemplo, una pipeta de 1.0 ml. esta graduada en dcimas de
mililitro y por lo tanto sirve para la medicin de cualquier volumen menor de 1.0 ml. Las
pipetas ms frecuentemente usadas son de 1.0, 2.0, 5.0 y 10.0 ml.
Las pipetas volumtricas slo miden volmenes fijos ya que estn graduadas para
medir un solo volumen, por ejemplo, una pipeta volumtrica de 1.0 ml. solo servir para
medir este volumen.
Algunas pipetas estn diseadas para que al momento de liberar el lquido que se est
midiendo quede una pequea porcin en la punta de las mismas, esta porcin debe
dejarse contenida en la pipeta porque de otra manera se introducir un error en la
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medicin. La manera de reconocer este tipo de pipetas es por las letras TD (To Deliver)
que se encuentran en la parte superior de la pipeta. Otras pipetas estn diseadas para
liberar todo el volumen incluyendo la porcin que se queda en la punta, este tipo de
pipetas se reconocen por las letras TC (To Contain), en este caso, si no se libera el
total del lquido medido se incurre en un error de medicin.
Las buretas varan en tamao, generalmente de 1 a 100 ml. El flujo del lquido es
controlado por una llave de vidrio o de tefln. Si es de vidrio requiere lubricacin. Las
buretas deben llenarse por arriba de la marca de cero y posteriormente abrir la llave
cuidadosamente para que fluya el lquido y el menisco se ajuste a cero. Dentro de los
usos indicados para las buretas se encuentran las titulaciones y para medicin de
volumenes de lquidos txicos, cidos, sustancias corrosivas, etc.
Las probetas son cilindros graduados que miden volmenes por arriba de los 25 ml.
todas ellas son usadas para medir volmenes diversos, por ejemplo, con una probeta
de 50 ml. se pueden medir volmenes de 26, 38 o 42 ml etc.. Estos volmenes se
denotan por marcas que se encuentran entre una graduacin y otra. las probetas ms
frecuentemente utilizadas son: 50, 100, 250, 500 y 1000 ml.. Para medir volumen en
una probeta se tiene que tomar en cuenta la siguiente regla: La superficie de un lquido
dentro de una probeta siempre forma una curva o menisco. El diseo de la probeta esta
hecho para medir volmenes exactos al igualar la parte inferior del menisco con la
graduacin. Si se mide el volumen con la parte superior del menisco, se incurrir en un
error.
Los matraces volumtricos, tambien llamados de aforacin, sirven para medir
volmenes exactos y son usados cuando se hacen soluciones porcentuales y molares.
Los matraces ms frecuentemente usados son de 50, 100, 500 y 1000 ml.. El uso de
estos matraces sigue la misma tcnica de medicin que las probetas.
Todos los recipientes arriba mencionados son material de vidrio, por lo tanto, estn
expuestos a cambios de tamao en altas y bajas temperaturas y esto puede modificar
drsticamente la exactitud de la medicin. El diseo de este material de cristalera est
hecho para medir volmenes a una temperatura promedio de 25C.
Medicin de slidos: La balanza granataria y la balanza analtica son las ms utilizadas
en la medicin de reactivos qumicos de textura slida. La granataria tiene una
exactitud de aproximadamente una dcima de gramo, se utiliza para pesar cantidades
mayores de un gramo y cuando la precisin no sea menor de 0.1 g.
La balanza analtica se utiliza cuando el peso deseado requiera una precisin menor de
0.1 g. Es uno de los instrumentos ms sensibles y permite pesar hasta dcimas de
miligramo.
Sin embargo, el uso de ambos tipos de balanzas requiere de cuidados bsicos
comunes tales como: limpieza completa de todas las partes de la balanza; mantener la
tara especfica de la balanza antes de cualquier pesada y hacer pesadas racionales
con respecto a la capacidad de la balanza.
Las balanzas de torcin son tiles en el laboratorio de bioqumica como una
herramienta para el buen uso de la centrfuga ya que para equilibrar los tubos de
centrfuga siempre debe hacerse en base al peso y no al volumen del contenido.
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La centrfuga es un aparato que permite separar slidos de lquidos. Es un instrumento
que separa suspensiones a alta velocidad. El material slido se queda en la base del
recipiente (sedimento) y la porcin lquida en la parte superior del recipiente (lquido
sobrenadante).
Los recipientes utilizados en la centrfuga generalmente son tubos de ensayo y estos
siempre deben balancearse en cuanto a peso y al ser colocados en la centrfuga
siempre debe ser en direcciones opuestas.
Mezclado de lquidos y slidos: Las soluciones normales, molares y porcentuales as
como los diferentes tipos de diluciones son las mezclas ms utilizadas en el laboratorio.
Frecuentemente, las soluciones involucran mezclas de slidos en lquidos o de lquidos
en lquidos en tanto que las diluciones solo involucran mezclas lquidos en lquidos. De
la destreza con que se lleven a cabo estas mezclas depende el xito de la
experimentacin en el laboratorio.
El fotocolormetro permite cuantificar concentracin de sustancias en base al color
desarrollado. La concentracin de una sustancia en solucin generalmente es
determinada por una reaccin de color, siendo el principio general que a mayor
concentracin de la sustancia en la solucin mayor ser la intensidad del desarrollo del
color. Los fotocolormetros son instrumentos que nos sirven para hacer estas
determinaciones.

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SESIN 3 Y 4 PRCTICA # 2
BIOSEGURIDAD
OBJETIVO
Que el alumno se familiarice con el material Peligroso Biolgico infeccioso, su manejo y
desecho adecuado, de acuerdo a las normas mexicanas NOM-087 y NOM-052.
INTRODUCCIN
Residuos peligrosos biolgicos infecciosos
Qu son los residuos peligrosos biolgicos infecciosos?
Los residuos peligrosos biolgicos infecciosos en lo sucesivo (RPBI), son aquellos que
se generan durante las actividades asistenciales a la salud de humanos o animales en
los centros de salud, laboratorios clnicos o de investigacin, bioterios, centros de
enseanza e investigacin, principalmente; que por el contenido de sus componentes
puedan representar un riesgo para la salud y el ambiente.
Cules son considerados los RPBI?
De acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, son
considerados los siguientes:
La sangre: La sangre y los componentes de sta, slo en su forma lquida, as como los
derivados no comerciales, incluyendo las clulas progenitoras, hematopoyticas y las
fracciones celulares o acelulares de la sangre resultante (hemoderivados).
Los cultivos y cepas de agentes biolgico-infecciosos: Los cultivos generados en los
procedimientos de diagnstico e investigacin, as como los generados en la
produccin y control de agentes biolgico-infecciosos. Utensilios desechables usados
para contener, transferir, inocular y mezclar cultivos de agentes biolgico-infecciosos.
Los patolgicos: Los tejidos, rganos y partes que se extirpan o remueven durante las
necropsias, la ciruga o algn otro tipo de intervencin quirrgica, que no se encuentren
en formol. Las muestras biolgicas para anlisis qumico, microbiolgico, citolgico e
histolgico, excluyendo orina y excremento. Los cadveres y partes de animales que
fueron inoculados con agentes enteropatgenos en centros de investigacin y bioterios.
Los residuos no anatmicos
Son residuos no anatmicos los siguientes:
Los recipientes desechables que contengan sangre lquida.
Los materiales de curacin, empapados, saturados, o goteando sangre o cualquiera de
los siguientes fluidos corporales: lquido sinovial, lquido pericrdico, lquido pleural,
lquido Cfalo-Raqudeo o lquido peritoneal.
Los materiales desechables que contengan esputo, secreciones pulmonares y
cualquier material usado para contener stos, de pacientes con sospecha o diagnstico

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de tuberculosis o de otra enfermedad infecciosa segn sea determinado por la SSA
mediante memorndum interno o el Boletn Epidemiolgico.
Los materiales desechables que estn empapados, saturados o goteando sangre, o
secreciones de pacientes con sospecha o diagnstico de fiebres hemorrgicas, as
como otras enfermedades infecciosas emergentes segn sea determinado por la SSA
mediante memorndum interno o el Boletn Epidemiolgico.
Materiales absorbentes utilizados en las jaulas de animales que hayan sido expuestos
a agentes enteropatgenos.
Los objetos punzocortantes
Los que han estado en contacto con humanos o animales o sus muestras biolgicas
durante el diagnstico y tratamiento, nicamente: tubos capilares, navajas, lancetas,
agujas de jeringas desechables, agujas hipodrmicas, de sutura, de acupuntura y para
tatuaje, bisturs y estiletes de catter, excepto todo material de vidrio roto utilizado en el
laboratorio, el cual deber desinfectar o esterilizar antes de ser dispuesto como residuo
municipal.
Por qu representan un riesgo a la salud o al ambiente?
Por sus caractersticas, ya que pueden contener agentes biolgicos infecciosos que se
definen como cualquier microorganismo capaz de producir enfermedades cuando esta
presente en concentraciones suficientes (inculo), en un ambiente propicio
(supervivencia), en un hospedero susceptible y en presencia de una va de entrada).
Existe regulacin para los RPBI?
Con la finalidad de prevenir alguna situacin de emergencia debida al mal manejo de
los RPBI, la autoridad Ambiental (SEMARNAT) public el 7 de noviembre de 1995 la
Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-1995, Que establece los requisitos
para la separacin, envasado, almacenamiento, recoleccin, transporte, tratamiento y
disposicin final de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos que se generan en
establecimientos que presten atencin mdica.
Debido a que esta Norma present algunos problemas de interpretacin como en su
aplicacin, se gestiono en coordinacin con la Secretara de Salud, su modificacin,
derivndose el 1 de noviembre de 2001 el Proyecto de Norma Oficial Mexicana NOM-
087-SEMARNAT-SSA1-2000, Proteccin Ambiental - Salud Ambiental Residuos
Peligrosos Biolgico-Infecciosos Clasificacin y especificaciones de manejo. De este
proyecto se derivaron 370 comentarios, mismos que fueron contestados y publicados
en el Diario Oficial de la Federacin el da 20 de enero de 2003.
Finalmente el 17 de febrero de 2003 se publica en el Diario Oficial de la Federacin la
Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002, Proteccin Ambiental
Salud Ambiental Residuos Peligrosos Biolgico-Infecciosos Clasificacin y
especificaciones de Manejo.
A quines aplica la NOM-087-SEMARANT-SSA1-2002?

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Con base en el campo de aplicacin de esta norma es de observancia obligatoria a
todos aquellos que por sus actividades generen los RPBI descritos en la Norma, sin
importar el volumen de sus generacin, aclarando que aquellos que su generacin sea
menor a 25 kilogramos al mes, podrn ubicarse como generadores de Nivel I, esto para
el tiempo de almacenamiento de sus RPBI.
Existe otra Norma Oficial Mexicana donde aparezcan los RPBI?
Existe la Norma Oficial Mexicana NOM-052-SEMARNAT-2005 que establece las
caractersticas, el procedimiento de identificacin, clasificacin y los listados de los
residuos peligrosos, sin embargo esta es de carcter General, por lo que para los RPBI
prevalecen las condiciones establecidas en la NOM-087-SEMARNAT-SSA1-2002.
Cul es la infraestructura para el tratamiento de los RPBI?
A partir de la publicacin de la Norma Oficial Mexicana NOM-087-SEMARNAT-1995, se
desarrollo la infraestructura para el tratamiento de este tipo de residuos, con la
condicin de que dicha norma establece que los residuos denominados patolgicos
sean incinerados, por ese motivo se incremento el nmero de hornos para el
tratamiento de los residuos, sin embargo han sido muchos equipos que han cerrado por
no cumplir con los parmetros establecidos en la Norma Oficial Mexicana NOM-098-
SEMARNAT-2002, Proteccin ambiental-Incineracin de residuos, especificaciones de
operacin y lmites de emisin de contaminantes. Actualmente la incineracin es uno
de los procesos de tratamiento ms observados por las asociaciones no
Gubernamentales por ese motivo se concluye que las empresas que actualmente
cuentan con esta autorizacin son capaces de cumplir con los parmetros establecidos
en la NOM-098.

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SESIN 5 Y 6 PRACTICA # 3
ESPECTROFOTOMETRA
INTRODUCCIN:
La fotocolorimetra o espectrofotometra, es una tcnica que permite medir la absorcin
de radiacin electromagntica, ultravioleta y visible de numerosas especies qumicas
inorgnicas y orgnicas, para su anlisis cualitativo y cuantitativo.
Las molculas son capaces de absorber radiaciones electromagnticas. Tanto la
longitud de onda () de la radiacin absorbida como la eficiencia con que se absorbe
dependen de la estructura de la molcula y del medio en que se halla.
La mayora de los instrumentos espectroscpicos para medir las radiaciones UV-
Visible e IR incluyen cinco componentes, una fuente estable de engra radiante, un
selector de longitud de onda que asla una regin limitada del espectro para hacer la
medicin; uno o mas recipientes para la muestra; un detector de radiacin que
convierte la energa radiante en una seal elctrica que puede medirse y un sistema
que procesa y lee la seal que consta, actualmente de una computadora.
Cada especie molecular tiene la capacidad de absorber su propia frecuencia
caracterstica de la radiacin electromagntica. Este proceso transfiere energa a la
molcula y provoca una disminucin en la intensidad de la radiacin electromagntica
incidente. Por consiguiente, la absorcin de la radiacin atena el rayo incidente de
acuerdo con la ley de absorcin que se describe como Lambert-Beer.
Esta ley proporciona informacin cuantitativa de cmo es que la atenuacin de la
radiacin, depende de la concentracin de las molculas que la absorben y de la
distancia que recorre el rayo en el medio absorbente. Cuando la luz atraviesa una
solucin de analito, la intensidad de la radiacin disminuye como consecuencia de la
excitacin del analito.
A = bc Donde: = Coeficiente de extincin molar
b = Grosor de la cubeta
c = Concentracin
La ley de Beer se puede utilizar de distintas maneras. Pueden calcularse las
absortividades molares de las especies si se conocen sus concentraciones. Tambin
se puede utilizar el valor de absorbancia medida para conocer la concentracin si es
que se conocen absortividades y la longitud de la trayectoria de la radiacin. As mismo
se aplica a las soluciones que contienen ms de un tipo de sustancia absorbente.
Suponiendo que no haya interaccin entre las distintas especies, la absorbancia total
de un sistema con varias componentes es la suma de sus absorbancias individuales.
Un espectro de absorcin es una representacin grafica de la absorbancia de un
analito (o de otra magnitud equivalente) en funcin de la longitud de onda de la
de otro parmetro relacionado con la energa de la radiacin utilizada).
El mximo de absorbancia obtenido en el espectro de absorcin de un analito, nos dar
la longitud de onda que proporciona la mayor sensibilidad posible, y por tanto ser lo
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que se utilizar en el anlisis cuantitativo de dicho analito. Todas las disoluciones que
presentan color, absorben radiacin electromagntica perteneciente al espectro visible.
OBJETIVO:
Aprender el uso del espectrofotmetro para determinar los espectros de
absorcin y curvas de calibracin de dos sustancias coloridas.
MATERIAL:
Solucin de H2SO4 0.5M (bureta)
Solucin de KMnO4 4x10-4 M
Solucin K2Cr2O7 1.6x10-3 M
11 tubos de ensaye de 15x160mm
2 pipetas de 10mL
2 pipetas de 5mL
2 celdillas para espectrofotmetro
1 gradilla
Espectrofotmetro
METODOLOGA:
Experimento No. 1: Determinacin de los espectros de absorcin
Tomar alcuotas de aproximadamente 3mL de KMnO4, y K2Cr2O7.
Colocar en celdillas por separado para medir la absorbancia de cada solucin desde
los 330nm a los 600nm en intervalos de 30nm; determinando as la longitud de onda de
mxima absorbancia para cada solucin.
En cada longitud de onda se deber calibrar primero a cero con la solucin de H 2SO4
(blanco).
Registrar las absorbancias de ambas soluciones a cada longitud de onda.
Experimento No. 2: Preparacin de curvas de calibracin para cada solucin estndar
Tomar alcuotas de KMnO4, y K2Cr2O7 y muestras problema.
Preparar, a partir de las soluciones estndares de KMnO4, y K2Cr2O7 por
separado, diluciones a 1:2, 1:4, 1:8 y 1:16 de cada solucin. Utilizando como diluyente
H2SO4.
Leer y registrar las absorbancias de cada dilucin a la longitud de onda que se
haya registrado el mximo de absorcin para cada solucin estndar de KMnO 4, y
K2Cr2O7. (Experimento anterior).

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Leer y registrar absorbancias de las muestras problema a la longitud de onda
correspondiente al analito de la misma.
Utilizar en todos los casos H2SO4 como blanco.
Proporcionar muestra problema de concentracin desconocida proporcionada
por el maestro.
RESULTADOS:
Experimento No. 1 Representar en una tabla, las absorbancias obtenidas a las distintas
longitudes de onda de ambas soluciones estndares de KMnO4, y K2Cr2O7. Ilustrar de
mejor manera esta tabla en una grafica de Espectro de absorcin (Absorbancia contra
longitud de onda) comparando el comportamiento de las soluciones. Determinar la
longitud de onda a la cual se observo el mximo de absorcin en cada solucin
estndar.
Experimento No. 2 Se reportaran tablas de las diluciones realizadas de cada estndar
con sus respectivas absorbancias registradas y la concentracin molar de cada
dilucin. De igual manera se medirn las absorbancias de muestras problemas de
concentracin desconocida proporcionadas en el laboratorio.
Realizar una curva de calibracin para cada solucin estndar de KMnO4, y K2Cr2O7
graficando absorbancia contra concentracin molar.
Utilizar esta curva para determinar las concentraciones de las soluciones problema con
su respectivo porcentaje de error:

valor real valor obtenido


% Error 100
valor real

DISCUSIN:
CONCLUSIN:
BIBLIOGRAFA CONSULTADA:
CUESTIONARIO:
1) De acuerdo a sus datos, diga cual es el rango de concentraciones en el que podra
utilizar su curva de KMnO4. Por qu?
2) Qu caractersticas nos indican que una curva de calibracin es adecuada?
3) Qu pasara si intenta utilizar la curva realizada en esta prctica para calcular la
concentracin de una muestra problema conteniendo K2Cr2O7 150 mM?
4) De acuerdo a sus datos, Cul es el coeficiente de extincin molar del K 2Cr2O7?
(utilice las unidades adecuadas).
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SESIN 7 PRCTICA 4
USO, CALIBRACIN Y MANEJO DEL POTENCIMETRO

OBJETIVO:
Que el alumno conozca el instrumento de medicin, principios y fundamento para
aplicarlo en las caractersticas cido base de las soluciones.
INTRODUCCIN:
El potencimetro, es un sensor utilizado en el mtodo electroqumico como equipo de
medicin, en la cuantificacin del potencial Hidrgeno (pH) de cualquier disolucin.
La determinacin del pH, consiste en medir el potencial que se desarrolla a travs de
una fina membrana de vidrio que separa dos soluciones, con diferente concentracin
de protones. En consecuencia, se conoce la sensibilidad y la selectividad de las
membranas de vidrio ante el pH.
Un electrodo para medir el pH consiste en un par de electrodos, uno de calomel
(mercurio, cloruro de mercurio) y otro de vidrio, sumergidos en la disolucin en la que
queremos encontrar el pH. El soporte del electrodo es de vidrio comn y no es
conductor, mientras que el bulbo sensible se encuentra formado por un vidrio
polarizable (vidrio sensible de pH). Se llena el bulbo con la solucin de HCl 0.1N
saturado con AgCl. El voltaje en el interior del tubo es constante (pH 7) de manera que
la diferencia de potencial solo depende del pH del medio externo. El alambre que se
sumerge al interior (normalmente Ag/AgCl) permite conducir este potencial hasta un
amplificador.
El pH metro es relativamente inmune a las interferencias de color, turbidez, material
coloidal, cloro libre, substancias oxidantes y/o reductoras. La medicin es afectada solo
cuando la superficie de la membrana est sucia con grasa o material orgnico insoluble
en agua, que le impide hacer contacto con la muestra, por lo que se recomienda la
limpieza escrupulosa de los electrodos. Los electrodos deben ser enjuagados con agua
destilada entre muestras (el uso adecuado de la pizeta es de vital importancia),
posteriormente deber secarse el electrodo preferentemente con papel klenex o papel
sanitario de textura suave pero que no deje pelusa, nunca debe secarse con tela
porque podra cargase electrostticamente.
Como los electrodos de vidrio de pH cuantifican la concentracin de H+ relativa a sus
referencias, deben ser calibrados peridicamente para asegurar la precisin, es por eso
que se utilizan soluciones especficas llamadas buffers de calibracin (disoluciones
reguladoras de pH conocido). Estas soluciones son: solucin buffer (fosfato) de pH 7
color amarillo, solucin buffer (biftalato) de pH 4 color rojo, solucin buffer (borato) de
pH 10 color azul.

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El pHmetro digital porttil Conductronic pH 10, modelo 1024, electrodo y batera
cuadrada. Debe mantenerse siempre humedecido.
Para su calibracin a un punto:
Conecte el electrodo al instrumento y encienda la tecla ON.
Introduzca el electrodo en la solucin patrn de pH 7 y permita la lectura que la lectura
se estabilice (aproximadamente 30 seg).
Ajuste la perilla de compensacin de temperatura temp oC a la temperatura de la
solucin patrn (buffer).
Ajuste la perilla de calibracin calbrate, hasta que el medidor indique el valor pH 7.0 de
la solucin patrn (buffer).
Retire el electrodo de la solucin patrn (buffer) y enjuguelo muy bien con agua
destilada (pizeta), pero no seque el electrodo.
Ajuste la perilla de compensacin de temperatura temp. oC a la temperatura a la
temperatura de la solucin a medir.
Introduzca el electrodo en la solucin a medir y lea el valor pH del medidor. Si el valor
de la solucin no est entre 3 unidades de pH de la solucin patrn (7.0 pH), se
necesita hacer una calibracin a dos puntos (con dos buffers de diferente pH, 7 y 4, o 7
y 10 dependiendo de las soluciones que vaya a manejar).
Despus de cada medicin, retire el electrodo y enjuguelo muy bien con agua
destilada (pizeta)
Calibracin a dos puntos
Siga los pasos de calibracin a un punto hasta el paso 5
Sumerja el electrodo en la segunda solucin patrn de pH 4.00 o pH 10.00. La
temperatura de esta solucin patrn debe ser idntica a la de la primera
Ajuste el control de pendiente slope, hasta que el medidor indique el valor del pH de la
segunda solucin patrn.

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Retire el electrodo, enjuguelo con agua destilada y proceda a efectuar las mediciones.
No olvide enjuagar el electrodo muy bien con agua destilada (pizeta) despus de cada
medicin.
Precauciones
El pHmetro debe siempre mantenerse en su estuche si no se est utilizando, con
respecto al electrodo deber mantenerse en la solucin buffer de pH 4.0, misma que se
encuentra en el pequeo recipiente en el que descansa el electrodo.

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SESION 8 y 9 PRACTICA #5
IDENTIFICACIN DE AMINOCIDOS
INTRODUCCIN:
Alrededor de 20 L-amonicidos forman las unidades monomricas de las cuales se
constituyen las protenas.
Solo los L-aminocidos existen en las protenas. Todos los aminocidos
contienen grupos funcionales amino y carboxilo; en un L-aminocido, ambos grupos
estn unidos al mismo tomo de carbono, con la siguiente estructura:

A este se le llama carbono quiral ya que tiene 4 sustituyentes diferentes, lo que confiere
actividad ptica a los aminocidos (con excepcin de la glicina). El carbono quiral de
los aminocidos contiene un grupo carboxilo (COOH) y un grupo amino (-NH2), un
tomo de hidrgeno y un radical de composicin variable, llamado cadena lateral, que
permite diferenciar a los aminocidos (R). Reacciones especficas con grupos
funcionales de las cadenas laterales, se utilizan en diversas pruebas bioqumicas que
permiten identificar aminocidos especficos en muestras de suero sanguneo, orina,
etc.
Dependiendo del pH, un aminocido puede tener carga negativa positiva,
negativa o cero. Los aminocidos portan por lo menos 2 grupos cidos dbiles
ionizables, un -COOH y un -NH3+. En solucin estos grupos tienen 2 formas, una con
carga y otra sin carga.
RCOOH RCOO- + H+
R-NH3+ R-NH2 + H+
El R-COOH y el R-NH3+ representa las formas protonadas, acdicas y R-COO- y
R-NH2 las bases conjugadas de los cidos correspondientes.
Al pH del plasma sanguneo o del lquido intracelular (7.4 a 7.1
respectivamente), los grupos carboxilos existen enteramente como iones carboxilato,
R-COO- a estos valores de pH, la mayor parte de los grupos amino estn
predominantemente en la forma R-NH3+. Por lo tanto, las especies inicas prevalentes
de los aminocidos presentes en la sangre y en la mayor parte de los tejidos deben de
presentarse de la siguiente forma:

Pueden aplicarse varias tcnicas para aislar e identificar a los aminocidos. La


cromatografa es una de ellas. En todas las separaciones cromatogrficas, las
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molculas son separadas dentro de una fase estacionaria y una fase mvil. La
separacin depende de la tendencia relativa de las molculas en la mezcla, de
asociarse con ms fuerza a una u otra fase.
Bsicamente en las cromatografas las muestras se aplican en una tira de papel
o placa fina (fase estacionaria) y se suspenden en un recipiente que contiene el
solvente cromatogrfico (fase mvil), el cual avanza sobre la fase estacionaria,
arrastrando los diferentes componentes de la muestra, a diferentes velocidades,
dependiendo de alguna de sus caractersticas como polaridad, tamao, etc.
OBJETIVO:
Aprender a utilizar reacciones especficas de cadena lateral y cromatografa en
capa fina para identificar los aminocidos presentes en una muestra problema.
MATERIAL:
1 gradilla
Equipo para cromatografia de capa fina
5 pipetas de 1.0mL - Pipetas Pateur
4 pipetas Pasteur - Papel sanitario
5 pipetas de 5.0mL
1 pipeta de 10.0mL
1 bureta
METODOLOGIA:
Experimento No. 1: Identificacin de aminocidos
A) Prueba de Sullivan: Se toman alcuotas de agua destilada, cistena o cistina, y dos
muestras problema. Y en 3 tubos por separado y previamente etiquetados se les
realiza la prueba de Sullivan como se describe en el siguiente cuadro:

Tubo H2O dest (mL) Cisteina (mL) Muestra (mL) NaCN (mL)

1 0.5 - - 0.5

2 - 0.5 - 0.5

3 - - 0.5 0.5

Se dejan reposar las soluciones en cada tubo por 10 minutos. Y se agrega a todos los
tubos Nitroprusiato de sodio (2-3 gotas) e hidrxido de amonio (NH4OH) (2 gotas).
17
Comparar las coloraciones. Un color rojizo indicar prueba positiva, es decir, presencia
de aminocidos que en su radical contiene azufre.
B) Prueba de identificacin de fenoles p_sustituidos (tirosina) con Nitrosonaftol: En 3
tubos por separado y etiquetados se realizan las soluciones siguientes:

Tubo H2O dest Tirosina (mL) Muestra Nitrosofaftol

1 0.5 mL - - 2-3 gotas

2 - 0.5 - 2-3 gotas

3 - - 0.5 2-3 gotas

Mezclar y calentar en bao de ebullicin durante 5minutos. Y por ultimo agregarle a


todos los tubos 0.5mL de Acido Nitrico (HNO3).
Comparar las coloraciones. La aparicin de un color rojo es positiva (presencia de
tirosina).
C) Prueba de la Ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno): En 4 tubos por separado y
etiquetados se realizan las soluciones siguientes.

Tubo H20 dest Prolina (mL) Tirosina Muestra Ninhidrina


(mL) (mL) (mL)

1 0.5 - - - 0.5

2 - 0.5 - - 0.5

3 - - 0.5 - 0.5

4 - - - 0.5 0.5

Mezclar y calentar a ebullicin 1 minuto. La aparicin de un color azul violceo


es positiva con excepcin de la prolina y la hidroxiprolina.
Experimento No. 2: Cromatografa en capa fina.
Se proporcionaran alcuotas que se colocaran en tubos por separado de
estndares de distintos aminocidos junto con dos muestras problemas a identificar.
1.- Trazar una lnea con lpiz sobre la placa a un centmetro de la base de la
placa (utilizar regla y guantes para manipular la capa fina).
2.- A esta altura, colocar una gota de cada uno de los estndares de aminocido,
as como de las muestras problema, manteniendo una separacin suficiente entre cada
gota (ver figura).
3.- Dejar secar al aire (no soplar).
18
4.- Mientras tanto aadir el solvente (fase mvil) de butanol:cido actico;agua
en proporciones de 40:10:50 respectivamente a la cmara cromatogrfica y sellar sta
con vaselina.
5.- Colocar las placas de cromatografa en la cmara, cuidando de no empalmar
una con otra. Las placas deben quedar con la muestra de aminocidos en la parte
inferior para hacer una cromatografa ascendente.
6.- Cerrar la cmara y dejar que ascienda el solvente por la placa hasta un poco
antes que salga.
7.- Sacar las placas y marcar con lpiz hasta donde avanz el solvente.
8.- Dejar secar la placa al aire durante unos minutos.
9.- Rociar toda la placa con la solucin de ninhidrina y calentar ligeramente en la
estufa hasta que se revele el color, indicando la presencia de los aminocidos.
10.- Medir los frentes del solvente y del soluto para cada mancha y calcular sus
respectivos Rf (relacin de frentes).

Rf= frente del soluto/frente del solvente.

11.- Comparar el Rf de los aminocidos estndares con los de las muestras


problema para identificar los aminocidos presentes en cada mezcla.

Frente de soluto

Esquema de una cromatografa ascendente en capa fina.


RESULTADOS:

19
Se reportarn y describirn los cambios de color presentes en las pruebas de
Sullivan, ninhidrina y nitrosonaftol e indicar si las pruebas resultaron positivas o
negativas, y que significa esto en cada caso.
Explicar la importancia del NaCN utilizado en la prueba de Sullivan.
En el caso de la cromatografia de capa fina, se reportarn los valores de Rfs
para cada aminocido estndar y cada aminocido presente en cada mezcla.
Utilizando los datos obtenidos a partir de las pruebas bioqumicas y a partir de la
cromatografa, definir que aminocidos estn presentes en cada una de las muestras
problema.
DISCUSION:
CONCLUSIONES:
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:
CUESTIONARIO:
1) Mencione dos enfermedades humanas cuyo diagnstico requiere la identificacin de
aminocidos en muestras de fluidos, y explique por que razn es importante dicha
identificacin.
2) Como se calcula el punto isoelctrico de los aminocidos y que importancia tienen
este valor?
3) Considerara adecuado utilizar los Rf calculados en esta prctica para determinar
los aminocidos presentes en una muestra problema, separada con una fase mvil
diferente? Y si la fase mvil fuera la misma, pero el experimento se realizara otro da,
en otro laboratorio? Explique
4) En base a los resultados obtenidos por todo el grupo indique como se separaran los
siguientes aminocidos, de manera ascendente, utilizando las mismas condiciones que
en el presente experimento:
Ala, Met, Phe, Tyr, His, Glu, Gln.
5) Si el Rf de la L-Gly es de 0.45 y el de la L-Ala es de 0.52, cuales seran los valores
de Rf para la D-Gly y D-Ala, respectivamente?

20
SESIN 10 y 11 PRCTICA # 6
DISOCIACIN DE AMINOCIDOS
OBJETIVO
Comprender el comportamiento de los aminocidos como molculas anfotricas y
correlacionar esta propiedad con las caractersticas de los grupo radicales.
FUNDAMENTO:
Los aminocidos son molculas que presentan la siguiente estructura qumica
genrica:
H
|
R - C - COO-
|
+
NH3
Los aminocidos contienen un carbn asmetrico (con excepcin de la glicina) llamado
carbono alfa, al cual se le unen cuatro radicales que son:
- un grupo carboxilo (COO-)
- un grupo amino (+NH3)
- un tomo de hidrgeno (H) y
un radical de composicin variable que permite diferenciar a los aminocidos (R),
llamado cadena lateral. Debido a las caracteristicas fisicoqumicas de la cadena lateral,
es posible relacionar su posicin, dentro de la estructura proteca ya que si es de
caracteristicas no polares (hidrofbico), al contacto con el agua tender a plegarse dentro
de la cadena polipeptdica; o si es de caractersticas polares (hidroflico), tender a
interactuar con el agua. Desde luego, para saber cual es la estructura de la cadena
lateral debemos de conocer cual es el pH de la solucin ya que dependiendo del pH la
cadena lateral estar protonada (H+) o desprotonada, este parmetro se puede conocer
utilizando los pKa de cada aminocido y la ecuacin de Henderson-Hasselbach lo cual
permite determinar cual es la estructura predominante a un pH dado; por ejemplo:
H H H

| pk1 | pK2 |

R - C - COOH -----> R - C - COO- ------> R - C - COO-

| | l
+ +
NH3 NH3 NH2

pH = cido pH = alcalino

21
Los cambios de carga observados en el aminocido mostrado, dependen del pH en que
se encuentre, como se observa en la figura anterior, bajo condiciones cidas el
aminocido est totalmente protonado y en condiciones alcalinas est totalmente
desprotonado, esto se debe a que los aminocidos son cidos dbiles y por lo tanto
tienen una constante de disociacin por cada grupo o radical capaz de comportarse
como cido o base dbil. Esto permite conocer el punto isoeltrico de un aminocido, el
cual se define como el pH en el cual la carga neta es cero (cmo se le llama a este
estado del aminocido?).
Los aminocidos que son utilizados para la sntesis de protenas son 20, los cuales se
les ha identificado como aminocidos naturales y los no naturales son los que an
cuando siendo aminocidos, no forman parte estructural de las protenas (no estn
representados en el cdigo gentico).
En esta prctica se revisar el comportamiento inico de los aminocidos en solucin
por medio de su disociacin en funcin del pH.
MATERIAL
2 vasos de precipitados de 100 ml
1 bureta, soporte y pinzas
2 pipetas de 5 ml de 10 ml
piseta
PHmetro
Agitador magntico con imanes de agitacin.
Soluciones:
glicina 0.1 M,
cido asprtico 0.1 M,
NaOH 0.1 N
HCl 0.1 N.
METODOLOGIA
Cargar cada bureta con las soluciones de NaOH 0.1 N y HCl 0.1 N
Colocar 30 ml de la solucin de glicina 0.1M en vaso con un imn de agitacin, llevar al
agitador y medir el pH; en agitacin constante, agregar gota a gota la solucin de NaOH
0.1N y registrar el pH, continuar el procedimiento hasta titular completamente (pH
bsico).
Repetir el procedimiento con un nuevo volumen de glicina 0.1 M y titular con la solucin
de HCl 0.1N.
Repetir todo el procedimiento con un volumen de 30 ml de cido asprtico.
22
ANLISIS DE DATOS
a) Elaborar una curva de titulacin para cada aminocido, con los valores de pH en
el eje de las oredenadas y los volmenes equivalentes del cido y de la base en el eje de
las absisas.
b) Determinar en la grfica de titulacin los valores de pKa, punto isoelctrico y las
zonas de amortiguamiento de cada aminocido.

23
SESIN 12 y 13 PRCTICA # 7
IDENTIFICACIN Y CUANTIFICACIN DE PROTENAS
INTRODUCCIN:
La palabra protena proviene del griego preemintente, que significa primero. Fue
inicialmente propuesta por Berzelius en 1838 para referirse a una serie de compuestos
orgnicos con cierta complejidad, nitrogenados, que se encuentran altamente
distribuidos en la naturaleza y son la base estructural y funcional de todo organismo
vivo.
Las protenas estn compuesta por aminocidos naturales ordenados en una
secuencia discreta, y unidos entre si por enlaces peptdicos que siempre involucran
radicales amino y carboxilo de cada aminocido de la siguiente manera:
Aminocido 1: Aminocido 2:
NH2-CH-COOH H-N-CH-COOH
R H R
Prdida de Agua
Enlace peptdico:

La variabilidad de las protenas se debe a una serie de aspectos tales como:


complejidad estructural, residuos aminocidos que la forman, propiedades qumicas y
fsicas de cada protena en el organismo que la contiene.
Por tanto el anlisis qumico de las protenas en base a sus propiedades es muy
amplio.
Ya que la identificacin de protenas es muy importante en el campo medico,
clnico y para su investigacin, existen tcnicas muy utilizadas con este objetivo. En
esta ocasin consideramos algunas como: reaccin de Xantoproteica, reaccin con
ninhidrina y reaccin de Biuret.
Reaccin Xantoproteica:
Esta reaccin afecta la integridad estructural de los residuos aminoacdicos de
las protenas. Es debida a la formacin de un compuesto aromtico nitrado de color
amarillo, cuando las protenas son tratadas con cido ntrico concentrado. La prueba es
especfica, y da resultado positivo en aquellas protenas con aminocidos portadores
de grupos bencnicos, especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la
prueba se neutraliza con un lcali vira a un color anaranjado oscuro (anillo por
esterificacin).
Reaccin de Biuret:

24
Entre las reacciones coloreadas especficas de las protenas, que sirven por
tanto para su identificacin, destaca la reaccin de Biuret. Esta reaccin la producen
los pptidos y las protenas, pero no los aminocidos, ya que se debe a la presencia
del enlace peptdico CO-NH que se destruye al liberarse los aminocidos. En el
reactivo de Biuret (CuSO4 + NaOH), el Cu, en un medio fuertemente alcalino, se
coordina con los enlaces peptdicos, formando un complejo de color violeta, cuya
intensidad de color depende de la concentracin de protenas.
Reaccin con Ninhidrina:
Al igual que las otras reacciones, esta forma un complejo color prpura, para
todas las sustancias o mezclas que presentan aminocidos. No es especfica como las
anteriores, pero es de gran ayuda para la identificacin primaria de protenas, que
despus nos lleven a realizar ms pruebas de identificacin ya especfica.
OBJETIVO:
Identificar protenas por la presencia de enlaces peptdicos y grupos aromticos,
y cuantificarlas mediante la tcnica de Biuret.
MATERIAL:
15 tubos de ensaye
1 gradilla
5 pipetas de 1.0mL
2 pipetas de 5.0mL
1 pipeta de 10.0mL
1 bureta
METODOLOGIA:
Experimento No. 1: Identificacin de protenas
A) Reaccin Xantoprotica
Colocar los mismos estndares en tubos por separado, como lo indica el
siguiente cuadro:

Tubo Estandar (mL) Agua Dest. (mL) HNO3 (mL)

1 0.5 peptona - 0.5

2 0.5 gelatina - 0.5

3 0.5 albmina - 0.5

4 0.5 tirosina - 0.5

5 (blanco) - 0.5 0.5

25
Las soluciones anteriores, se llevan a ebullicin por 5 minutos en bao mara
previamente preparado en estufa.
Se deja reposar y enfriar por 10 minutos y se le agregan a todos los tubos
algunas gotas de NH4OH por estratificacin para observar los cambios de color y en
algunos casos la formacin de anillo de interfase.
B) Reaccin de Biuret.
Colocar los mismos estndares de la prueba anterior en tubos por separado, como lo
indica el siguiente cuadro:

Tubo Estandar (mL) Agua Dest. (mL) Reactivo de Biuret

1 1 peptona - 1

2 1 gelatina - 1

3 1 albmina - 1

4 1 tirosina - 1

5 (blanco) - 1 1

Experimento II. Curva de calibracin y cuantificacin de protenas.


1.- Es conveniente, antes de realizar la prctica, hacer los clculos necesarios
para preparar, a partir de un estndar de albmina al 1%, soluciones de albmina a las
siguientes concentraciones: 0, 1, 2, 5 y 10 mg/mL.
2.- Una vez preparadas las soluciones con diferentes concentraciones de
albmina (estndares de calibracin), tomar 2 mL de cada uno y colocarlos en tubos
limpios y etiquetados (5 tubos).
3.- Tomar 2 mL de cada muestra problema y colocarlos en otros tubos.
4.- Agregar a cada tubo 2 mL de reactivo de Biuret.
5.- Colocar en reposo durante 15 minutos, a temperatura ambiente, esperando el
cambio de color.
6.- Medir en el espectrofotmetro a una longitud de onda de 595nm, utilizando
como blanco agua destilada.
7.- Con las absorbancias medidas para cada uno de los estndares de
calibracin, realizar una curva de calibracin que ser utilizada para determinar la
concentracin de las muestras problema.

26
RESULTADOS:
Se reportan los resultados de las pruebas Xantoproteica, y Biuret, como la
descripcin de los cambios de colores en las soluciones de la siguiente forma: (++)
color intenso, (+) cambio ligero, y (-) sin formacin de color. Indicar que significa el
cambio de color en cada reaccin.
Se reportara una grfica en la que se presenten las distintas concentraciones de
albmina (estndares) contra la absorbancia que presentan de modo que se obtenga
una curva de calibracin. Incluya una tabla con los valores de absorbancia de cada
estndar y muestra problema.
Utilizar esta curva para determinar las concentraciones de las soluciones
problema con su respectivo porcentaje de error:
valor real valor obtenido
% Error 100
valor real

DISCUSIN:
CONCLUSIONES:
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:
CUESTIONARIO:
1) Describir y explicar mediante un esquema la reaccin entre el reactivo de Biuret y los
enlaces peptdicos.
2) Investigue otros dos mtodos empleados comnmente para cuantificar protenas.
Diga cual es el rango de concentraciones en el que se utilizan estos dos mtodos, as
como el mtodo de Biuret. Cul de los tres mtodos es el mas sensible?
3) Explique por qu razn en la presente prctica se utiliz una curva de calibracin de
albmina para luego cuantificar muestras problema que no contenan albmina.

27
SESIN 14 y 15 PRACTICA # 8
PROPIEDADES QUMICAS DE LAS PROTENAS
INTRODUCCIN:
Las protenas poseen diversas funciones biolgicas y son importantes para el
funcionamiento normal de la clula. Algunas de las funciones que tiene las protenas
dentro del organismo son las siguientes: actan como enzimas (aceleran o retardan
reacciones), tienen parte en el sistema inmunolgico, tienen funcin estructural,
transportan sustancias, participan como hormonas, tambin pueden funcionar como
receptores, y tiene propiedades cido-base.
Las protenas en disoluciones muestran cambios profundos en su solubilidad en
funcin de distintos factores: a) pH, b) fuerza inica, c) propiedades dielctricas del
disolvente, y d) la temperatura. Estas propiedades suelen utilizarse para separar
mezclas de protenas, ya que cada protena posee una composicin de aminocidos
caracterstica la cual determina su comportamiento como electrolito.
Precipitacin Isoelctrica:
El pH a la que una protena muestra un mnimo de solubilidad es su pH
isoelctrico. Definido por aquel valor de pH al que una molcula no posee carga
elctrica y es incapaz de trasladarse en un campo elctrico. En estas condiciones no
existe repulsin electrosttica, entre molculas de protena vecinas y tienden a
precipitar.
Puesto que las diferentes protenas poseen valores de pH isoelctrico tambin
distinto, debido a que difieren en el contenido de aminocidos con grupos R o cadenas
laterales ionizables, con frecuencia pueden separarse unas de otras mediante
precipitacin isoelctrica. Cuando el pH de una mezcla de protenas se ajusta a su pH
isoelctrico de alguno de sus componentes, la mayor parte o casi todos sus
componentes precipitarn. La protena precipitada permanece en su configuracin
nativa, y puede redisolverse en un medio de pH apropiado y concentracin salina
adecuada.
Solubilizacin y precipitacin por Salado
Las sales neutras ejercen efectos pronunciados sobre la solubilidad de las
protenas globulares; a bajas concentraciones las sales incrementan la solubilidad de
muchas protenas, este fenmeno es llamado Solubilizacin por salado (salting-in). Por
otra parte, a medida que la fuerza inica aumenta, la solubilidad de una protena
comienza a disminuir. A una fuerza inica lo suficientemente elevada una protena
puede ser casi completamente precipitada de su disolucin, dicho efecto es llamado
precipitacin por salado (salting-out).
OBJETIVO:
Comprobar el efecto del pH, naturaleza y concentracin de los iones, sobre la
solubilidad de las protenas; y determinar punto Isoelctrico mediante precipitacin.

28
MATERIAL:
1.- 13 tubos de ensaye de 10 x150 mm.
2.- 1 pipeta de 10ml.
3.- 6 pipetas de 5ml.
4.- 1 gradilla
METODOLOGA:
En esta prctica se trata de provocar cambios de solubilidad en las protenas
que se encuentran en el organismo, mediante la modificacin de las propiedades de
los solventes.
Experimento No.1 Determinacin del punto isolelctrico del albuminato de sodio por
adicin de un cido
Preparar una serie de tubos como se indica a continuacin (mL):

Tubo Acetato de sodio cido actico cido actico


0.1 N
0.1 N 0.01 N

1 0.5 9.5 -

2 1 9 -

3 1.5 8.5 -

4 2 8 -

5 3 7 -

6 4 6 -

7 6 4 -

8 8 2 -

9 6 - 4

10 8 - 2

Agregar a cada tubo 1 mL de albuminato al 10%.


Mezclar bien y observar los cambios que se presente la solubilidad del albuminato en
cada tubo.

29
Calcular el pH de cada tubo utilizando la ecuacin de Henderson- Hasselbach y
determinar el punto Isoelctrico (PI) del albuminato (utilice la siguiente tabla).

TUBO pH PRECIPITACIN

10

Experimento No.2 Solubilizacin y precipitacin por sales.


Preparar 9 tubos como se indica a continuacin (mL) :
Tubo NaCl 10 % ZnSO4 10 % Co(CH3COO)2 10% Etanol H2O

1 1

2 0.5 0.5

3 0.1 0.9

4 1

5 0.5 0.5

6 0.1 0.9

7 1

8 0.5 0.5

9 0.1 0.9

10 1

11 0.5 0.5

12 0.1 0.9

30
Agregar a cada tubo 1 mL de albuminato al 1%. Agitar y observar precipitacin.
Asignar a cada tubo de manera arbitraria un porcentaje de solubilidad.
Calcular la fuerza inica de cada tubo y representar sus resultados en la
siguiente tabla.

Fuerza
TUBO Sal inica % Solubilidad

10

RESULTADOS:
Se reportara para el primer experimento una tabla con los valores de pH calculados
para cada tubo, as como la cantidad de precipitado formado. Para ello se utilizarn
cruces: (+++) muy precipitada (++) precipitacin media (+) poca precipitacin (-)
completamente solubilizada. A partir de esta tabla, se determinar el punto isoelctrico
del albminato como aquel pH al cual exista el mayor precipitado.
En el experimento dos se reportar la tabla con fuerza inica de cada tubo as como
porcentaje de solubilidad asignado. NOTA: el porcentaje de solubilidad ser inverso a
la cantidad de precipitado.
A partir de esta tabla, construya una grafica de %de solubilidad contra fuerza inica,
utilizando una lnea diferente para cada sal. O bien, construya tres grficas de barras
separadas, una para cada sal. NOTA: En el eje de las x, las fuerzas inicas deben
estar ordenadas de menor a mayor.
DISCUSION:

31
Se compararn los valores obtenidos de punto isoelctrico con los que presenta la
bibliografa y se dar una explicacin del por que de las diferencias encontradas (si las
hay).
Explicar el comportamiento observado en las graficas de solubilidad contra fuerza
inica. Explicar las diferencias existentes entre el comportamiento de las tres sales (si
las hay).
CONCLUSIONES:
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:

32
SESION 16 Y 17 Prctica # 9
ANLISIS ENZIMTICO CUALITATIVO: EFECTO DEL CALOR SOBRE LA
ACTIVIDAD DE LAS ENZIMAS

INTRODUCCIN:
Las enzimas son protenas especializadas en la catlisis de las reacciones
biolgicas. Se encuentran entre las mas notables de las biomolculas conocidas
debido a su extraordinaria especificidad y a su poder cataltico, que es mucho mayor
que la de los catalizadores hechos por el hombre.
Gran parte de la historia de la bioqumica es la historia de la investigacin de
las enzimas. El nombre enzima no se emple sino hasta 1887, pero mucho antes ya
se sospechaba que ciertos catalizadores biolgicos intervenan en la fermentacin del
azcar para formar alcohol (de aqu el nombre de fermentos). La primera teora
general sobre la catlisis qumica, publicada por J. J. Berzelius en 1835, inclua un
ejemplo de lo que ahora conocemos como enzimas; como la diastasa de la malta, y
sealaba que la hidrlisis del almidn se cataliza por el cido sulfrico con menor
eficacia que con la diastasa.
La actividad e algunas enzimas dependen solamente de su estructura
proteica, mientras que otros necesitan adems, de uno ms componentes no proteicos
llamados cofactores. El cofactor puede ser un ion metlico o bien puede ser una
molcula orgnica llamada coenzima. Algunas enzimas necesitan ambos.
Los cofactores son generalmente estables frente a la accin del calor,
mientras que muchas protenas enzimticas pierden su actividad por la calefaccin.
El complejo enzima-cofactor catalticamente activo recibe el nombre de
holoenzima. Cuando se separa el cofactor, la protena restante por si sola es inactiva
catalticamente, recibe el nombre de apoenzima.
OBEJTIVO:
Determinar el efecto fisicoqumico que generan las enzimas sobre diferentes
sustratos.
MATERIAL:
6 tubos de ensaye
3 pipetas de 1 mL
2 pipetas de 5mL
2 pipetas pasteur
2 gradillas
6 tapones

33
METODOLOGIA:
Experimento No. 1 Actividad de la ureasa
Preparar tres tubos como se indica en el siguiente cuadro.

Tubo Semilla Agua(ml)


vegetal

1 Pizca 0

2 Pizca 5

3 pizca 5

Mezclar y tratar de homogenizar el polvo de sandia. Colocar un tapn de algodn a


los tubos 1 y 2 y poner en bao a ebullicin durante 20min. (cuidar que no se acabe
el agua del bao). Aadir a cada tubo lo que se indica a continuacin:

tubo Agua (ml) Azul de


bromotimol (gotas)

1 5.0 2

2 0 2

3 0 2

En caso de que la solucin tenga color azul en algn tubo, aadir cido dbil (gotas),
hasta obtener una coloracin amarilla en todos los tubos.
Aadir a todos los tubos 5ml de urea. Mezclar rpidamente y tomar el tiempo que
transcurre en cada tubo hasta alcanzar el vire de color amarillo a color azul.
Experimento No. 2 Determinacin de la actividad de la renina
Preparar la siguiente serie de tubos como se muestra a continuacin:

leche oxalato de amonio sol. de renina


tubo (mL) (mL) (gotas)

1 3 0 3

2 3 0.5 3

3 3 0.5 3

34
Al tubo 1 agregar 0.5 mL de agua destilada.
Mezclar e incubar durante 10 minutos a 37 C, y anotar los cambios observados.
Llevar a ebullicin el tubo 3 y dejar enfriar.
Agregar a los tubos 2 y 3 10 gotas de CaCl2.
Anotar los cambios observados en todos los tubos y compararlos entre s.
RESULTADOS:
Para el primer experimento, mostrar la coloracin inicial de cada tubo, as como
la cantidad de cido requerida para alcanzar la tonalidad amarilla. Lo ms importante:
indique el tiempo aproximado o relativo que le llev a cada tubo virar de amarillo a azul,
una vez aadida la urea.
En el segundo experimento se reportara la aparicin de cuajo, as como la
proporcin en la que aparece ste en cada tubo.
Presente sus datos en forma de tablas y dibujos, pero no olvide describirlos. Indique
bien claramente, para ambos experimentos, cual es la enzima y cual es el sustrato. No
confunda con los indicadores y/o cofactores, sobre todo en el experimento 1.
DISCUSION Y CONCLUSIONES:
Primer experimento
Explique claramente cual es la reaccin catalizada por la ureasa. Explique el papel del
cido dbil y del azul de bromotimol y explique claramente a que se deben los cambios
de color observados. (Recuerde, el cambio importante es el vire de amarillo a azul Por
qu?)
Analize finalmente el efecto del calor (ebullicin) sobre la ureasa.
Segundo experimento
Analizar el efecto del oxalato de amonio y calcio sobre la actividad de la enzima renina.
Analizar el efecto de la ebullicin sobre la misma.
Explicar el porque de sus resultados en ambos experimentos.
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:

35
SESION 19 Y 20 Prctica #. 10
CINETICA ENZIMATICA: EFECTO DEL PH Y TEMPERATURA

OBJETIVOS:
El alumno analizar el efecto del pH y de la temperatura sobre la actividad enzimtica
en una reaccin. Basado en:
Discutir el efecto sobre el comportamiento cataltico de una enzima al variar el pH de
la mezcla de reaccin.
Discutir los cambios que se presentan en la cintica enzimtica al variar la
temperatura de reaccin.
Determinar las condiciones ptimas de reaccin en funcin de estos dos factores ( pH,
temperatura).
PRE-RREQUISITOS:
Describir el efecto del pH sobre la estabilidad y actividad de una enzima.
Describir el efecto de la temperatura sobre la estabilidad y actividad de una enzima.
Describir el sitio activo y sitio de enlace de una enzima.
Describir los agentes desnaturalizantes y su mecanismo de accin sobre una enzima.
Explicar los conceptos de pH y temperatura ptimos de una enzima en una reaccin
catalizada.
INTRODUCCION:
Es lgico pensar que el pH de una solucin influye sobre la velocidad de una reaccin
catalizada por enzimas. El sitio activo y el sitio de enlace de una enzima generalmente
estn compuestos por grupos ionizables que deben presentarse con una forma inica
apropiada o especfica, de tal manera, que se pueda mantener la conformacin
adecuada de estos sitios en la enzima y pueda llevarse a cabo la unin del sustrato y
su transformacin hacia productos.
Igualmente puede existir un sustrato con grupos ionizables y debe contener una forma
inica especfica para que pueda unirse a la enzima y posteriormente se realize la
catlisis. Los efectos de pH sobre la estabilidad de una enzima se debe tomar en
cuenta en cualquier estudio de efecto de pH sobre la catlisis de sustrato.
Se observa que el pH ptimo de la reaccin enzima -sustrato es a 6.8 segn la grfica
de la curva A, sin embargo, no nos indica porque declina la velocidad por arriba y abajo
de este valor.
En la curva B se observa que la preincubacin de la enzima entre pH de 5.0 - 8.0 no
tiene efecto sobre la actividad medida a pH 6.8. Por lo tanto, la interpretacin de las 2
grficas nos indica que la cada en la actividad entre 6.8 - 8.0 y entre 6.8 - 5.0 es el
36
resultado de la formacin de una estructura inica impropia de la enzima y/o sustrato o
los dos.
Cuando la enzima es preincubada a pH entre 5.0 - 8.0, se mantiene la actividad
completa de la enzima a 6.8. Por arriba o abajo de este valor de pH resulta en
inactivacin de la enzima.
La estabilidad de la enzima depende de varios factores, por ejemplo, temperatura,
fuerza inica, naturaleza del amortiguador, concentracin de iones metlicos,
concentracin de sustratos o cofactores y concentracin de enzima.
El ltimo factor es muy importante ya que existen algunas enzimas que a bajas
concentaciones se disocian en monmeros y que son menos estables.
Otro de los factores que afectan la velocidad de una reaccin es la temperatura, de tal
suerte que un incremento de temperatura proporciona mayor energa cintica a las
molculas reactantes, dando como resultado choques ms productivos por unidad de
tiempo. La actividad cataltica de las enzimas resulta de una estructura altamente
ordenada. Si la molcula absorbe mucha energa, la estructura se rompe y la enzima
se desnaturaliza y por lo tanto pierde su actividad cataltica.
Si se grafica velocidad vs. temperatura se obtiene una curva en forma de campana, en
el cual el pico se conoce como temperatura ptima. La estabilidad a la temperatura, de
una enzima depende del pH, fuerza inica del medio, as como de la presencia o
ausencia de metales. La mayora de los sustratos ejercen un efecto de proteccin a la
enzima contra la desnaturalizacin por temperatura. Las enzimas de bajo PM
compuestas de cadenas sencillas y que poseen enlaces disulfuro son ms estables al
calor que las de alto PM. Las enzimas obtenidas de un extracto crudo libre de clulas
son ms estables al calor por la alta concentracin de otras protenas (efecto protector).
MATERIAL :
1.- 14 tubos de ensaye
2.- 1 gradilla
3.- Celdas de fotocolormetro
4.- Fotocolormetro
5.- Baos de agua de temperatura controlada
6.- 3 Pipetas de 1.0 ml
7.- 2 pipetas de 5.0 ml

37
METODOLOGIA:
Efecto del pH

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8

Sacarosa 0.3 M 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Amortiguador pH = 0.5 0 0 0 0 0 0 0
2.5

Amortiguador pH = 0 0.5 0 0 0 0 0 0
2.5

Amortiguador pH = 0 0 0.5 0 0 0 0 0
3.5

Amortiguador pH = 0 0 0 0.5 0 0 0 0
4.5

Amortiguador pH = 0 0 0 0 0.5 0 0 0
5.5

Amortiguador pH = 0 0 0 0 0 0.5 0 0
6.5

Amortiguador pH = 0 0 0 0 0 0 0.5 0
7.5

Agua 0 0 0 0 0 0 0 1.0

Mezclar e incubar a 37 C durante 2 min.


Agregar 0.5 mL de Enzima (Invertasa) a todos los tubos.
Mezclar e incubar a 25C durante 20 min.
Agregar 1 mL de Dinitrosalicilato a todos los tubos.
Mezclar y calentar en bao de agua a ebullicin durante 5 min. Enfriar y leer a 540 nm
ajustando a cero con el tubo No. 8

38
Efecto de la Temperatura

Tubo 1 2 3 4 5 6 7

Sacarosa 0.3 M 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Amortiguaor pH = 4.7 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Invertasa 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 0

Agua 0 0 0 0 0 0 1.0

Temperatura C 4 26 37 45 60 100 25

Mezclar e incubar 5 min a la temperatura indicada.


Agregar 1 mL de Dinitrosalicilato a todos los tubos.
Mezclar y calentar en bao de agua a ebullicin durante 5 min. Enfriar y leer a 540 nm
ajustando a cero con el tubo No. 7
RESULTADOS :
1.- Grafique los resultados obtenidos de velocidad vs pH.
2.- Grafique los resultados obtenidos de velocidad vs temperatura.
3.- Indique cuales son los valores de pH y temperatura ptimos obtenidos.
CUESTIONARIO :
1.- La pepsina presenta su mxima actividad a un pH 1. Mencione cules podran ser
los grupos funcionales presentes en el sitio activo y sobre cuales residuos de
aminocidos rompe los enlaces peptdicos.
2.- Si la concentracin de sustrato en una reaccin enzimtica es igual a un 1/3 de Km.
Cul ser la velocidad inicial de la reaccin.
3.- De acuerdo a la clasificacin de las enzimas a que clase pertenece una enzima que
participa en la conversin de un azcar de tipo aldosa a un azcar de tipo cetosa.
4.- En esta prctica se ha observado como influye el pH en la actividad de invertasa, a
una concentracin de sacarosa dada. La estaquiosa es un tetrasacrido y es un
sustrato para esta enzima y se ha observado que es hidrolizado a una velocidad igual
al 5% de la sacarosa, bajo las mismas condiciones de concentracin y pH. Cmo
explicara esta velocidad mxima tan baja en relacin al pH de la reaccin. ( a-Gal-a-
Gal-a-Glu--Fru ).
5.- Cuando las soluciones enzimticas son calentadas, hay una prdida progresiva de
la actividad cataltica con el tiempo. As, una solucin de hexocinasa incubada a 45C
durante 12 minutos pierde el 50% de su actividad; pero cuando la hexocinasa se incuba
a 45C, en presencia de altas concentraciones de glucosa durante el mismo tiempo,
39
solamente se pierde un 3% de su actividad. Explique el porque de la variacin
desnaturalizante de la hexocinasa por efecto de la temperatura en ausencia y
presencia del sustrato.

40
SESION 21 Y 22 Prctica #. 11
EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO SOBRE LA ACTIVIDAD
ENZIMTICA
INTRODUCCION:
Los principios generales de la cintica qumica pueden ser aplicados a las
reacciones catalizadas por las enzimas, pero stas muestran tambin una
caracterstica que no se observa en las reacciones no enzimticas: la saturacin con
el sustrato. A una concentracin de sustrato baja, la velocidad de una reaccin
enzimtica es proporcional a la concertacin de sustrato, por lo tanto, es
aproximadamente de primer orden con respecto al mismo. Sin embargo, a medida
que la concentracin de sustrato aumenta, la velocidad de la reaccin deja de
aumentar proporcionalmente a la concentracin de sustrato, en esta zona el orden se
dice mixto. Con un aumento posterior de la concentracin de sustrato, la velocidad de
la reaccin llega a ser independiente de la concentracin del sustrato y se aproxima
asintticamente a una velocidad constante. En este intervalo de concentracin de
sustrato la reaccin es de orden cero esencialmente y se dice entonces que la
enzima se halle saturada con sustrato. El efecto de saturacin condujo a algunos
investigadores a formular la teora de que la enzima y el sustrato reaccionan de forma
reversible para formar un complejo como una primera etapa esencial de la reaccin
catalizada.
L. Michaelis y M. Menten desarrollaron una teora del anlisis cintico de las
reacciones catalizadas por enzimas, la cual se ampli posteriormente por G.E. Briggs y
B.S. Haldane. En esta teora se supone primero la formacin del complejo enzima
sustrato ES, que, a continuacin se escinde para formar la enzima libre y el producto P:

k1 k2

E+S k-1 ES k-2 E+P


Con el objeto de definir una expresin matemtica que relacione la velocidad
inicial de la reaccin enzimtica, la cual es igual a la velocidad de la ruptura del
complejo enzima sustrato, con la concentracin inicial de sustrato libre, propusieron el
siguiente modelo, que hasta la fecha an se utiliza para describir la actividad de las
enzimas y estudiarlas bajo diferentes condiciones:

Vmax S
Vo Ecuacin de Michaelis-Menten
KM S

Donde KM y Vmax son dos parmetros aproximadamente constantes que


caracterizan a cada enzima determinada.
OBJETIVO:
Determinar los parmetros Vmax y KM de la enzima invertasa.

41
MATERIAL:
Tubos de ensaye
Una gradilla
Pipetas de 1 mL
Pipetas de 5 mL
Un bao de agua a 37 grados centgrados
Un bao de agua a ebullicin
METODOLOGIA:
La invertasa es una enzima hidroltica que acta sobre la sacarosa (un
disacrido) liberando glucosa y fructosa. La actividad de la enzima se detiene al aadir
una disolucin alcalina y el poder reductor de los productos se mide hacindolos
reaccionar en el reactivo de dinitrosalicilato.

SACAROSA (M)

TUBO ENZIMA AMORTIGUADOR 0.02 0.03 0.05 0.1 0.3 AGUA

1 1mL 0.5mL 1mL 0mL 0mL 0mL 0mL 0mL

2 1mL 0.5mL 0mL 1mL 0mL 0mL 0mL 0mL

3 1mL 0.5mL 0mL 0mL 1mL 0mL 0mL 0mL

4 1mL 0.5mL 0mL 0mL 0mL 1mL 0mL 0mL

5 1mL 0.5mL 0mL 0mL 0mL 0mL 1mL 0mL

6 1mL 0.5mL 0mL 0mL 0mL 0mL 0mL 1mL

Mezclar e incubar a 35 C por 20 minutos.


Aadir a todos los tubos 1 mL de dinitrosalicilato.
Mezclar y calentar en bao de agua a ebullicin durante 5 minutos. Enfriar y leer a
540 nm ajustando a cero con el tubo no.6
Para el segundo da, repetir el experimento anterior, solo que se preparar un
duplicado de cada tubo. Leer absorbancia de la primera serie de tubos a los 10 minutos
y de la segunda serie a los 20 minutos.
RESULTADOS:

42
Reportar los valores de absorbancia en cada tubo, con sus respectivas
concentraciones de sustrato y tiempo en que se midi. Presentar una tabla como la
siguiente.

[Sacarosa] (M) Abs/10 min Abs/20min

0.02

0.03, etc.

En base a sta, calcule la actividad de la enzima (velociad inicial, Vo) como el cambio
en unidades de absorbancia por unidad de tiempo. Hay dos formas de hacerlo: 1)
Graficando Abs vs. Tiempo, donde Vo = pendiente de la regin recta de la grfica. 2) Si
se cuenta con un solo dato de Abs a un solo tiempo, Vo = Abs/tiempo (min).
Con los valores de actividad en unidades de absorbancia/min y las concentraciones
construya la grafica de Michaelis-Menten y la de Linewaver-Burk, y en base a estas
determine los parmetros cinticos de la enzima.
DISCUSION Y CONCLUSIONES:
Explique claramente la forma en que se calcul la velocidad inicial. Compare sus
resultados de ambos das y de motivos para las diferencias (si las hay). Lo mismo para
el clculo de Km y Vmax. Compare estos parmetros con valores encontrados en
alguna referencia. Explique la reaccin catalizada por la enzima y su importancia.

1.- La velocidad inicial de una reaccin enzimtica es dependiente exclusivamente de


la cantidad de sustrato presente? si, no por qu?
2.- Cual es la diferencia entre los cambios de energa libre que existen entre un
proceso catalizado por una enzima y el mismo proceso no catalizado.
3.- Por qu a concentraciones de sustrato mucho mayores que el valor de la Km la
velocidad de la reaccin es independiente de la concentracin de sustrato?
4.- La Km de una enzima vara con la concentracin de enzima? si, no, por qu?
BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:

43
SESION 23 Y 24 PRACTICA No. 12

CINTICA ENZIMTICA. EFECTO DE INHIBIDORES

INTRODUCCION:

Algunos compuestos reaccionan con las enzimas disminuyendo su actividad


cataltica. Este efecto se utiliza para preparar frmacos o insecticidas que inhiben
selectivamente ciertas enzimas en las bacterias o insectos, sin afectar al hospedero.

La inhibicin puede ser reversible o irreversible, sin embargo, la inhibicin


reversible es generalmente ms til para regular la actividad de las enzimas. Los
estudios logrados en base a inhibidores, han contribuido a la informacin actual sobre
cintica enzimtica y mecanismos tanto metablicos como clnicos.

Los dos tipos principales de inhibicin reversible son: La inhibicin competitiva y la


no competitiva. En la primera, el compuesto inhibidor interacciona con el sitio cataltico,
compitiendo con el sustrato por la unin con dicho sitio. En este caso el grado de
inhibicin depende directamente de la concentracin del inhibidor, con respecto al
sustrato especfico, por lo tanto, si la concentracin de sustrato es mayor que la del
inhibidor, no se presentar el efecto inhibitorio. Ms an, si a una enzima bajo el efecto
de un inhibidor competitivo se le adiciona mayor cantidad de sustrato, casi siempre
desaparecer el efecto inhibitorio.

La mayora de los inhibidores competitivos tienen una estructura qumica


semejante a la del sustrato natural por lo tanto son muy especficos.

La inhibicin no competitiva es aquella, donde el inhibidor se combina con la


enzima unindose a un sitio diferente al sitio cataltico de manera que la enzima puede
unirse al sustrato y al inhibidor simultneamente. La inhibicin ocurre porque al unirse el
inhibidor provoca cambios moleculares en la enzima que disminuyen su actividad. De
acuerdo al modo en que el inhibidor se une a la enzima y al efecto cintico que tiene
sobre ella, esta inhibicin se subdivide en Acompetitiva y Mixta. Dentro de los inhibidores
mixtos se incluyen los clsicos no-competitivos.

Los inhibidores no competitivos son a veces inespecficos o sea que un mismo


inhibidor puede afectar a varias enzimas a la vez. Existen inhibidores muy complejos
como el pentacloruro de mercurio, el benzoato de sodio o muy simples como los iones
metlicos plata, cobre, plomo y cianuro. Algunos de estos inhibidores son reversibles y
otros irreversibles.

OBJETIVO:

Determinar el tipo de inhibicin ejercida por CuSO4 sobre la actividad de la enzima


invertasa.

44
MATERIAL :

1.- 21 tubos de ensaye


2.- 2 gradillas
3.- 2 Celdas de fotocolormetro
4.- Fotocolormetro
5.- Baos de agua de temperatura controlada
6.- 3 Pipetas de 1.0 ml
7.- 2 pipetas de 5.0 ml
METODOLOGIA:

Primer da:

Preparar los siguientes tubos:

Tubo Sacarosa Agua Amortiguador Arabinosa Invertasa


0.02 Molar

1 2 mL [0.02] 2 mL 1 mL ---- 2 mL

2 2 mL [0.03] 2 mL 1 mL ---- 2 mL

3 2 mL [0.05] 2 mL 1 mL ---- 2 mL

4 2 mL [0.10] 2 mL 1 mL ---- 2 mL

5 2 mL [0.30] 2 mL 1 mL ---- 2 mL

6 2 mL [0.02] ---- 1 mL 2 mL 2 mL

7 2 mL [0.03] ---- 1 mL 2 mL 2 mL

8 2 mL [0.05] ---- 1 mL 2 mL 2 mL

9 2 mL [0.10] ---- 1 mL 2 mL 2 mL

10 2 mL [0.30] ---- 1 mL 2 mL 2 mL

11 0 1 mL 0.5 mL 1 mL 1 mL

Mezclar e incubar a 35C.

45
A los diez minutos tomar 3.5 mL de cada uno de los tubos 1-10 y pasarlos a 10 tubos
limpios y etiquetados. Usar para ello una pipeta de 5 mL y enjuagar con agua destilada
entre tubo y tubo.

Agregar a cada tubo nuevo 1 mL de dinitrosalicilato (DNS) agitar y poner a ebullicin


durante 5 minutos. Dejar enfriar.

A los veinte minutos sacar todos los tubos y repetir el procedimiento anterior. (1 mL DNS,
mezclar, poner a ebullicin y enfriar)

Medir Abs de todos los tubos a 540 nm, utilizando como blanco el tubo 11

Segundo da:

Preparar los siguientes tubos:

Tubo Sacarosa Agua Amortiguador Arabinosa Invertasa


0.01 Molar

1 2 mL [0.02] 2 mL 1 mL ---- 2 mL

2 2 mL [0.03] 2 mL 1 mL ---- 2 mL

3 2 mL [0.05] 2 mL 1 mL ---- 2 mL

4 2 mL [0.10] 2 mL 1 mL ---- 2 mL

5 2 mL [0.30] 2 mL 1 mL ---- 2 mL

6 2 mL [0.02] 1 ml 1 mL 1 mL 2 mL

7 2 mL [0.03] 1 mL 1 mL 1 mL 2 mL

8 2 mL [0.05] 1 mL 1 mL 1 mL 2 mL

9 2 mL [0.10] 1 mL 1 mL 1 mL 2 mL

10 2 mL [0.30] 1 mL 1 mL 1 mL 2 mL

11 0 1 mL 0.5 mL 1 mL 1 mL

Repetir el procedimiento del primer da.

RESULTADOS:

Deber calcular las Vo para cada tubo, del primero y segundo da.

46
Los tubos 1 al 5 de ambos das son los controles de velocidad en ausencia de inhibidor.
Haga un promedio de las Vo obtenidas el primero y segundo da. Con el promedio de
velocidades construya una grfica de Michaellis-Menten.

Los tubos 6 al 10 de ambos das son los datos de velocidad en presencia de inhibidor.
Los del primer da son en presencia de Arabinosa 0.02 Molar y los del segundo da son
en presencia de Arabinosa 0.01Molar. Construya grficas de Michaellis para cada
concentracin de inhibidor.

En una misma grfica de Lineweaver-Burk represente los recprocos de:

a) Vo en ausencia de inhibidor (tubos 1-5, promedio de los dos das)

b) Vo con Arabinosa 0.02 Molar (tubos 6-10 da 1)

c) Vo con Arabinosa 0.01 Molar (tubos 6-10 da 2)

Calcule parmetros cinticos (Km y Vmax) de la enzima, reales y aparentes, para cada
condicin.

Determine, de acuerdo a esta grfica y a los parmetros calculados, que tipo de


inhibicin presenta la Arabinosa.

DISCUSION Y CONCLUSIONES:

Compare sus velocidades control contra las de la prctica 6. Explique las diferencias
basndose en todos los factores que modifican la actividad enzimtica. Explique
claramente que tipo de inhibidor es la Arabinosa e indique de que forma se unir a la
enzima. Busque en bibliografa usos de la arabinosa y efectos sobre algn tipo de
enzima (no necesariamente la invertasa) o incluso sobre microroganismos. Compare la
estructura del inhibidor con la del sustrato para apoyar mas su conclusin sobre tipo de
inhibodor.

BIBLIOGRAFIA CONSULTADA:

47
SESION 25 y 26 PRACTICA # 13

ESTUDIO DEL BOMBEO DE PROTONES POR LEVADURAS


(Prctica adaptada del Manual de prcticas de laboratorio, Bioqumica y Biologa Molecular
Departamento de Bioqumica Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autnoma de Mxico.)

Objetivo.- Analizar el metabolismo celular por medio de la variacin en los parmetros


fisicoqumicos del medio

FUNDAMENTO
Las levaduras Saccharomyces cerevisiae son organismos unicelulares que en la
membrana plasmtica tienen una ATPasa de H+ que acopla la hidrlisis del ATP con el
bombeo de protones hacia afuera de la clula. Esta enzima es semejante desde un
punto de vista estructural y funcional a la ATPasa de Na +/K+ de las clulas animales y,
al igual que sta, se inhibe con concentraciones micromolares de vanadato. Como
resultado de la actividad de la ATPasa de H+ en la levadura, se genera un gradiente
electroqumico de protones que se utiliza para impulsar el transporte de nutrientes al
interior de la clula por sistemas de transporte simportadores o uniportadores. La
ATPasa de H+ consume hasta un 25 % del ATP que se sintetiza en la clula.
Adems de esta ATPasa de H+ de la membrana plasmtica, las levaduras tienen
otra bomba de protones en la membrana interna de las mitocondrias, la ATP sintasa,
que se encarga de la sntesis del ATP. En contraste con la enzima de membrana
plasmtica, el flujo de protones a travs de la ATP sintasa induce la sntesis de ATP.
Uno de los inhibidores ms efectivos de esta enzima es la oligomicina.
El ciclo de ATP en la levadura se completa cuando el ATP que se sintetiza en la
mitocondria por medio de la ATP sintasa, se consume a nivel de la membrana
plasmtica, cuando la ATPasa de H+ lo hidroliza para bombear protones al exterior de
la clula.
El objetivo de esta prctica es correlacionar el consumo de glucosa por las
levaduras, con la variacin en pH extracelular, como una medida del bombeo de
protones que ocurre durante el proceso.

Material
Tres vasos de precipitados de 100 ml.
Pipetas de 5 y 10 ml.
Potencimetro.
Levadura (Saccharomyces cerevisiae)
200 mg/ml.
Solucin de glucosa (10%).
Solucin de dinitrofenol 40 mM en
etanol.
Solucin de azida de sodio 400 mM.

Experimento 1 (control)
1 .Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada.
2. Determinar el pH de la solucin y repetir la medicin dos veces ms con intervalos
de 3 minutos para obtener la lnea basal.
3. Adicionar 5 ml de glucosa a 10 %, agitar y medir el pH.
48
4. Determinar el pH de la solucin cada 5 minutos, 4 veces, y luego cada 10 minutos 2
veces ms.
EXPERIMENTO 2 (DINITROFENOL)
1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada.
2. Aadir por decantacin (no pipetear) 0.2 ml de la solucin de dinitrofenol 40 mM para
una concentracin final de 200 M.
3. Determinar el pH de la solucin y repetir la medicin dos veces ms con intervalos
de 3 minutos para obtener la lnea basal.
4. Incubar 5 minutos
5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control.

EXPERIMENTO 3 (AZIDA)
1. Diluir 5 ml de la levadura con 40 ml de agua destilada.
2. Aadir por decantacin (no pipetear) 0.5 ml de la solucin de azida de sodio 400
mM, concentracin final de 5 mM. Agitar con cuidado.
3. Determinar el pH de la solucin y repetir la medicin dos veces ms con intervalos
de 3 minutos para obtener la lnea basal.
4. Incubar 5 minutos.
5. Repetir los pasos 3 y 4 del experimento control.

ANLISIS DE RESULTADOS

Llenar la siguiente tabla

pH
TIEMPO (min) GLUCOSA DINITROFENOL AZIDA DE SODIO
0
5
10
15
20
30
40
1. Realizar una grfica de ejes cartesianos para cada uno de los experimentos; con los
valores de pH en funcin del tiempo.
2. Analizar el significado de los cambios de pH en el experimento control, con
dinitrofenol como desacoplante y con azida de sodio com inhibidor de la cadena de
transporte de electrones de la mitocondria.

Bibliografa
Manual de prcticas de laboratorio, Bioqumica y Biologa Molecular Departamento de
Bioqumica Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autnoma de Mxico. 2006
Nelson DL, Cox MM 2006. Lehninger: Principios de Bioqumica. Cuarta Edicin.
Editorial Omega.

49
SESION 28 Y 29 PRACTICA No. 14
AISLAMIENTO DE ADN PLASMIDICO POR LISIS ALCALINA.
Objetivo.- Aprender los fundamentos para el aislamiento y el anlisis de la molcula de
ADN.
FUNDAMENTO
Los plsmidos o vectores son molculas de ADN extracromosmico circular que se
replican y transcriben independientemente del ADN cromosmico. Se encuentran
normalmente en bacterias y en algunas ocasiones en levaduras. Su tamao puede ir
desde 1 hasta 250 kb, y en nmero de copias puede haber desde 1 hasta 100,
dependiendo del tipo de plsmido.
Los plsmidos usados en ingeniera gentica son llamados vectores. Son herramientas
importantes y normalmente son usados para multiplicar o expresar genes especficos.
El gen de inters es insertado en las copias de este plsmido, el cual adems contiene
genes que le dan una resistencia especifica a algn antibitico, y un sitio mltiple de
clonacin (polilinker); esta es una regin corta que contiene varios sitios en los que
puede cortarse por enzimas de restriccin, y permite la fcil insercin de fragmentos de
ADN. Posteriormente el plsmido es insertado en una bacteria mediante un proceso
llamado transformacin, estas bacterias son crecidas en grandes cantidades y listas
para lisarse (mediante lisis alcalina) para aislar el plsmido de inters.
MATERIAL
Soluciones:
Solucin I: Buffer GET (glucosa 20mM, tris base 25mM, EDTA 10mM)
Solucin II: mezcla ltica (SDS 1%, NaOH 0.2N)
Solucin III: acetato de sodio 3M pH 4.8
METODO:
De un cultivo de 10 ml centrifugar 10 minutos a 14000 rpm, descartar el sobrenadante.
Aadir 1 ml de buffer GET para re suspender y pasar a un tubo eppendorf de 1.5 ml.
Centrifugar a 14000 rpm por 2 minutos, descartar el sobrenadante.
Agregar 100 microlitros de solucin GET y resuspender, incubar 10 minutos a T. amb.
Aadir 5 ul de RNAsa y dar vrtex
Agregar 200 microlitros de solucin II e incubar en hielo por 10 minutos
Aadir 150 microlitros de solucin III e incubar en hielo por 20 minutos, centrifugar a
14000 rpm por 10 minutos
Pasar el sobrenadante a otro tubo y aadirle un volumen igual de isopropanol
Mezclar y centrifugar a 14000 rpm por 10 minutos
50
Descartar el sobrenadante
Agregar 500 microlitros de etanol 75% mezclar y centrifugar a 14000 rpm por 10
minutos
Descartar el sobrenadante y dejar secar
Re suspender en 40 microlitros de agua
Almacenar a -20C, correr en gel de agarosa al 1%

Preparacin de gel de agarosa 1%

Pesar 0.35 g de agarosa, pasarlo a un matraz y agregar 35 ml de buffer TAE 1X (Tris,


Acido actico, EDTA).
Calentar para disolver la agarosa (hasta que quede transparente la solucin).
Dejar enfriar un poco y aadir 4-5 gotas de bromuro de etidio.
Vaciar al molde, colocar el peine y dejar enfriar completamente.
Mezclar 3ul de DNA con 1microlitro de buffer de carga. Cargar la muestra en el pozo.
Dejar correr a 100 volts por aproximadamente 30 minutos.
Ver en el transiluminador y tomar foto.
ANLISIS DE RESULTADOS
Identificar en el gel el plsmido y correlacionar su tamao con los marcadores de pares
de bases.

Bibliografa
Russell, David W.; Sambrook, Joseph 2001. Molecular cloning: a laboratory manual.
Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory.

51