.

Tabla de Contenido

Contenido
1. ASPECTOS GENERALES................................................................................. 2
a) DEFINICIN................................................................................................ 2
b) PROPIEDADES ESTRUCTURALES................................................................2
c) ESTABILIDAD.............................................................................................. 3
Solventes y efecto de concentracin de antocianinas............................3
Influencia del pH..................................................................................... 4
Efecto de co-pigmentacin.....................................................................4
Interacciones con iones metlicos..........................................................5
2. ANTOCIANINAS EN FRUTAS Y VEGETALES.....................................................6
3. ANTOCIANINAS COMO NUTRACUTICOS.......................................................7
4. METODOS DE EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE ANTOCIANINAS..................8
Mtodos de extraccin........................................................................... 9
Mtodos de purificacin.........................................................................9
5. METODOS ANALITICOS PARA LA IDENTIFICACIN DE ANTOCIANINAS........10
Espectrometra de masas (MS).............................................................10
Resonancia magntica nuclear (RMN)..................................................11
6. METODOS ANALITICOS PARA LA CUANTIFICACIN DE ANTOCIANINAS.......12
HPLC con detector de arreglo de diodos (DAD)....................................12
 ANTOCIANINAS

1. ASPECTOS GENERALES

a) DEFINICIN

Las antocianinas son colorantes naturales pertenecientes al grupo de los

flavonoides. Estn presentes en casi todas las plantas y en todas sus
partes; Son responsables del color (rojo, rosa, azul o morado) de muchas
flores, vegetales y frutas. Adems de las caractersticas colorantes, las
antocianas poseen potente propiedad antioxidante (E. Marta KUSKOSKI;
2004).

b) PROPIEDADES ESTRUCTURALES

Los antocianos, pigmentos flavonlicos, tienen una estructura qumica

adecuada para actuar como antioxidantes, pueden donar hidrgenos o
electrones a los radicales libres o bien atraparlos y desplazados en su
estructura aromtica.

La diversidad estructural contribuye favorablemente a la existencia

natural de unos 300 antocianos con diferentes sustituciones
glucosdicas.

Figura 1.Estructura y sustituyentes de las principales antocianinas (Durst

& Wrolstad, 2001).

[Escriba texto] Pgina 2

 ANTOCIANINAS

c) ESTABILIDAD

Su estabilidad es afectada por varios factores tal como pH, temperatura

de almacenamiento, estructura qumica, concentracin, luz, oxigeno,
solventes, la presencia de enzimas, flavonoides, protenas e iones
metlicos.

Temperatura. La antocianina es destruida por el calor durante el

procesamiento y almacenamiento. Un incremento logartmico en la
destruccin de la antocianina ocurre con un incremento en la
temperatura. Timberlake (1986) observ que el equilibrio entre las
estructuras es endotrmico, en una direccin de izquierda a derecha:

Base quinoidal --- Cation flavilio --- Pseudobase carbinol ---

Chalcona.

A altas temperaturas el equilibrio cambia hacia chalconas. El retorno de

chalconas a flavilio es lento

La velocidad de degradacin de antocianinas se incrementa durante el

procesamiento y almacenamiento a medida que la Temperatura
aumenta.

Luz. Acelera su degradacin. Preservan mucho mejor su color cuando se

mantienen en la oscuridad.

Oxgeno. La remocin de oxgeno protege contra la degradacin trmica.

cidos orgnicos. Son inestables en presencia de cido ascrbico, que

acelera su degradacin.

Azcares. Disminuyen la estabilidad de las antocianinas.

Enzimas. La inactivacin de enzimas mejora la estabilidad de las

antocianinas.

Solventes y efecto de concentracin de antocianinas

El aumento de la concentracin de antocianinas promueve una ms alta

estabilidad del color.

Investigaciones recientes con sales de flavilio sintticas (FVs) en

soluciones de diferente naturaleza (acetonitrilo: agua, etanol,

[Escriba texto] Pgina 3

 ANTOCIANINAS

propilenglicol, dioxano y 2-butanona) han demostrado que los cambios

en el color depende del solvente y la concentracin de FVs. En solventes
prticos las FVs exhiben colorante rojo, mientras que en solventes
aprticos las soluciones son de color amarillo.

Influencia del pH

Los antocinicos sufren transformaciones estructurales reversibles con

un cambio en el pH. Con pH cido las antocianinas son muy estables,
pero esta estabilidad se reduce, cuando el pH se aproxima a la
neutralidad, llegando a destruirse completamente con pH superior a 7.
La acidez tiene un efecto protector sobre la molcula. La forma catin
flavilio colorida predomina a pH 1.0. A valores superiores a siete
presentan las formas quinoidales de color prpura que se degradan
rpidamente por oxidacin con el aire.

Las investigaciones acerca de la estabilidad de antocianinas y la

variacin de color con pH concluyen que los cambios en el color de estos
compuestos son ms importantes en la regin alcalina debido a su
inestabilidad.

Efecto de co-pigmentacin

La co-pigmentacin es la interaccin electrnica planar en los grupos

cromforo de las antocianinas. Los cambios producidos por el co-
pigmento en la regin visible del espectro del pigmento es
correlacionada con la transformacin de la antocianina en agua, estas
formas se producen por el ataque nucleoflico del agua.

El ion flavilio es casi planar y muestra una deslocalizacin electrnica,

que se extiende por todo el grupo cromforo, mientras que la forma
hemiacetal tiene dos anillos aromticos sin conjugar y un anillo central
el cual no es planar, porque tiene un carbono tetradrico, por lo tanto el
ion flavilio es la nica especie capaz de co-pigmentar, por su forma
planar.

La co-pigmentacin provoca un efecto hipercrmico . Debido a la baja

estabilidad de la co-pigmentacin, se requiere de grandes
concentraciones de copigmentos. La debilidad de la copigmentacin es
esencialmente de origen entrpico. De hecho, experimentos de variacin

[Escriba texto] Pgina 4

 ANTOCIANINAS

de la temperatura en sistemas diferente pigmento-copigmento, se

encontr un cambio de entropa negativa por el equilibrio de la
copigmentacin. El pigmento y copigmento en su estado inicial son
especies independientes, durante su asociacin es sostenida
fuertemente el complejo formado con una reduccin simultnea de los
grados de libertad, todo este proceso tiende a una oposicin de
copigmentacin.

La copigmentacin es usual en la naturaleza y contribuye a la profusin

de colores en las flores y algunos tejidos. Abe et al., (1977) propusieron
el trmino "copigmentacin intermolecular" para la asociacin dbil de
antocianinas con compuestos, modificando as el color y la estabilidad
del complejo formado; y "copigmentacin intramolecular para el enlace
fuerte que forman grupos de cidos orgnicos con las antocianinas.

La copigmentacin intermolecular de antocianinas con otros flavonoides

produce un incremento en la absorbancia a una longitud de onda visible
(efecto hipercrmico), as como un desplazamiento a longitudes de onda
mayores del mximo de absorbancia (efecto batocrmico); la
copigmentacin intramolecular es la responsable por la estabilidad del
color de antocianinas que poseen dos o ms grupos acilos aromticos. El
color se intensifica al incrementar el contenido de cidos orgnicos
como el cinmico y malnico (Araceli Castaeda-Ovando, 2009).

Los co-pigmentos pueden ser flavonoides, alcaloides, aminocidos,

cidos orgnicos, nucletidos, polisacridos, metales o de otra
antocianina (Araceli Castaeda-Ovando; 2009).

Por lo tanto, la magnitud del efecto de co-pigmentacin es el pH, debido

a valores de pH bajos, todas las molculas de antocianina dependientes
son en forma de flavilio, y a altos valores de pH, la antocianina es en su
forma pseudobase carbinol, que es incoloro. El efecto de co-
pigmentacin es evidente en condiciones dbilmente cido (pH 4-6),
donde existen antocianinas en sus formas incoloras (Araceli Castaeda-
Ovando; 2009).

Interacciones con iones metlicos

La variedad de colores en las flores inicialmente fue explicada por la

formacin de quelatos entre los metales y las sales de flavilio. A pesar

[Escriba texto] Pgina 5

 ANTOCIANINAS

del poco inters en la industria alimentaria de la complejacion

antocianina-metal, esta interaccin constituye una alternativa viable
para la estabilizacin del color, sobre todo si los metales involucrados no
implican un riesgo para la salud o incluso que son parte delos minerales
esenciales en la dieta (Araceli Castaeda-Ovando; 2009).

Algunos estudios sobre la estabilidad del color en las plantas, sugieren

que los colores azules son debido a una formacin de complejos entre
las antocianinas y algunos metales tales como Al, Fe, Cu y Sn (Araceli
Castaeda-Ovando; 2009).

2. ANTOCIANINAS EN FRUTAS Y VEGETALES

Frutas : Acai, cerezas, arndano, sauco,

frambuesa azul y negra, zarzamora, mora
azul, Grosella negra, uva azul y negra
,ciruela, fresas (frutillas), higos, granada,
manzana roja, sanda, pera roja, bayas de
goji, etc.

Verduras: Remolacha, col morada, pimiento rojo, rbano,

tomate, berenjena, zanahoria morada, lechuga morada, cebolla de
verdeo, etc.

Aunque tambin pueden encontrarse en:

Cereales : Maz morado (Zea may)

Semillas : Amapola

Figura 2: Contenido de antocianinas totales en algunas frutas

Taxonoma Nombre Concentraci Estnd Referencia

comn n (mg/100g ar

[Escriba texto] Pgina 6

 ANTOCIANINAS

fruta )
Vaccinium Arndano 256 Mv-3-glu Andersen (1987)
uliginosum L. alpino
Rubus Frambuesa 627 Cy-3-glu Moyer et al.
occidental L. negra 34 Cy-3-glu (2002)
V. parvifolium Arndano rojo 411 Cy-3-glu
R. nigrum cv Grosella negra "
Sambucus Cauco negro 200-1000 Cy-3-glu Bridle et al.
nigra Uva de vid 30-750 Cy-3-glu (1997)
V. vinifera Naranjo dulce 200 Cy-3-glu "
Citrus sinensis "
Mv-3-glu (Malvidina-3-glucosido), Cy-3-glu (Cianidina-3-glucosido)

ANLISIS QUMICO DE ANTOCIANINAS EN FRUTOS SILVESTRES COLOMBIANOS; LILIANA ANDREA

SANTACRUZ CIFUENTES; Bogot D.C., Mayo 20 de 2011

La ingesta de antocianinas en los seres humanos ha sido estimada en

180 a 200 mg / da en los EE.UU., que es mucho mayor que la ingesta
(25 mg / da) de los flavonoides. (http://www.jugoverde.net/beneficios-
de-las-antiocianinas.html)

3. ANTOCIANINAS COMO NUTRACUTICOS

El inters en los pigmentos antocinicos se ha intensificado
recientemente debido a sus propiedades farmacolgicas y teraputicas.

ANTIOXIDANTES. Es 20 veces ms potente que la vitamina C y

50 veces ms potente que la vitamina E.

Ayuda a tratar enfermedades como Obesidad, Diabetes, Cncer,

Colesterol, etc.

REPARADORAS. Acta en varios niveles, entre ellos:

1. ADN, lo protegen y restauran actuando a nivel atmico.

2. Cerebral, protegen y restauran los lpidos del tejido cerebral

3. Drmico, estimulan sntesis del colgeno y evitan la accin de

enzimas que lo degradan, como la elastasa, evitan que se oxide el
colgeno, y protegen la vitamina C (imprescindible para su
formacin).

[Escriba texto] Pgina 7

 ANTOCIANINAS

Ayuda a tratar enfermedades como: Esclerosis mltiple,

envejecimiento de la piel, lceras, etc.

ANTIINFLAMATORIAS.: Suprime la liberacin de:

1.Prostaglandinas EG2 2. Enzimas pro-inflamatoria

3. Histamina

Ayuda a tratar enfermedades como: Alergias, artritis/artrosis.

ANTIINFECCIOSAS. Por ser antibacterianas, antivirales y

antifngicas. incrementan la proliferacin de linfocitos.

Ayuda a tratar enfermedades como: infecciones respiratorias

(sobre todo en alergias).

CIRCULATORIAS. Mejoran el estado de los vasos sanguneos.

Esto es debido a que el estrs oxidativo y la inflamacin juegan
roles claves en la progresin de estas enfermedades y las
antocianinas pueden ayudar a contrarrestar estos efectos
mediante su capacidad antioxidante.

Las antocianinas previenen la oxidacin de las LDLs (Lipoprotenas

de baja densidad), la acumulacin de clulas espumosas en las
arterias, la hiperglucemia y la resistencia a la insulina, que son
factores de riesgo en la aparicin de enfermedades
cardiovasculares.

De tal manera ayuda a tratar enfermedades como: Vrices, Visin,

Ateroesclerosis, Enfermedades Cardiovasculares.

Formulaciones de Antocianinas

Existen pocas formulaciones de antocianinas, esto es debido a que se

encuentran de manera natural en los alimentos y recientes estudios
arrojan algunos de sus beneficios, no teniendo del todo claro cul
antocianina es la responsable de alguna propiedad deseable.

Adems algunos alimentos contienen antocianinas a un nivel bastante

elevado, de modo que se podra alcanzar dosis de estudios que evalan
los efectos de las antocianinas en la salud humana.

Sin embargo, hay que tomar en cuenta que los alimentos que contienen
antocianinas las pueden ir perdiendo por procesamiento como el

[Escriba texto] Pgina 8

 ANTOCIANINAS

congelamiento o el efecto del pH, ya que estas son ms estables en un

medio cido que en un medio neutro o alcalino.

Ej.: RESVERATROL, ACEITE DE OLIVA, POIFENOL, VITAMINA C; etc.

4. METODOS DE EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE

ANTOCIANINAS

Mtodos de extraccin

La extraccin de antocianina es comnmente realizada por una repetida

maceracin o molido con pequeas cantidades de HCl (0.1%-1.0%) en
metanol o etanol a temperatura ambiente o en casos complejo en frio
usando cidos dbiles (para evitar la degradacin del pigmento). La
adicin de agua (10%-15%) en algunos casos permite una extraccin
completa dependiendo de la planta o fruto.

El disolvente de extraccin ha sido el mtodo ms comn para

extraccin de diversos compuestos que se encuentran en las frutas,
incluyendo flavonoides. Los compuestos fenlicos se han extrado por
secado o liofilizacin, o slo en remojo en frutas frescas con disolvente
de extraccin posterior.

Las antocianinas son molculas polares, por lo tanto, los disolventes ms

comunes utilizados en las extracciones son mezclas acuosas de etanol,
metanol o acetona. Estas metodologas implican la co-extraccin de las
sustancias no-fenlicos tales como azcares, cidos orgnicos y
protenas que requieren procesos de purificacin posteriores (por
ejemplo, la extraccin en fase slida, SPE).

Entre los mtodos ms comunes son aquellos que utilizan metanol o

etanol como agentes de extraccin. De estos mtodos, la extraccin con
metanol es el ms eficiente, de hecho, se ha encontrado antocianina en
extracciones a partir de pulpa de uva, la extraccin con metanol es 20 %

[Escriba texto] Pgina 9

 ANTOCIANINAS

ms eficaz que con etanol, y 73 % ms eficaz que slo agua, y, sin

embargo, en industria alimentaria el etanol es el preferido debido a la
toxicidad del metanol. Especial cuidado se debe tomar para evitar
medios cidos fuertes porque las antocianinas aciladas podra ser
degradados (reaccin de hidrlisis).

Mtodos de purificacin

Los mtodos de extraccin de antocianinas propuestos hasta ahora no

son selectivos, ya que son capaces de co-extraer un gran nmero de
otros compuestos, tales como contaminantes, azcares o cidos
orgnicos los cuales pueden afectar la estabilidad o el anlisis del
pigmento. Por consiguiente, es necesario poner en prctica nuevas
tcnicas de purificacin con el fin de aislar las antocianinas de inters.
En este sentido, se ha propuesto una amplia variedad de tcnicas; de
extracciones en fase slida (SPE) y lquido-lquido (LLE) hasta para el uso
de tcnicas cromatogrficas sofisticadas como cromatografa en
contracorriente (CCC), la cromatografa lquida de media resolucin
(MPLC) y la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC).

SPE comnmente se lleva a cabo en cartuchos C 18 o Sephadex, en el

que las antocianinas son fuertemente unido a travs de sus grupos
hidroxilo y separados posteriormente de otros compuestos por el
aumento de la polaridad con diferente
disolventes. La CCC y la MPLC se utilizan como mtodos de purificacin
con el anlisis posterior por HPLC para elucidacin estructural, con la
ventaja de minimizar el tiempo de separacin de disolventes y la fase
mvil. El mtodo ms comn utilizado para la separacin de las
antocianinas es de HPLC con deteccin UV-Vis o detectores de matriz de
fotodiodos (PDA).

[Escriba texto] Pgina 10

 ANTOCIANINAS

5. METODOS ANALITICOS PARA LA IDENTIFICACIN DE

ANTOCIANINAS

La identificacin de las antocianinas tiene un papel crtico en la

taxonoma y estudios de adulteracin, adems de la evaluacin de la
calidad de los alimentos crudos y procesados.

En realidad la espectroscopa es la principal tcnica utilizada debido a su

simplicidad y bajo costo. Pero la dificultad para obtener compuestos de
referencia y las similitudes espectrales de las antocianinas representa un
importante inconveniente. Por lo tanto, la espectrometra de masas (MS)
y resonancia magntica nuclear (RMN) de 1H y 13C se han convertido en
la preferida.

Espectrometra de masas (MS)

El anlisis de antocianinas por MS se han llevado a cabo para diferentes

fines, entre ellos: elucidacin estructural, el estudio de las
transformaciones en rojo crianza y polimerizaciones y reacciones con
otra flavonoides. Recientemente, tcnicas acopladas tales como HPLC
acopladas a MS APCI -MS, FAB -MS y ESI MS se han convertido en
herramientas muy potentes para la identificacin de las antocianinas.

En las ltimas dos dcadas, numerosos mtodos de ionizacin se han

desarrollado para muestras no voltiles o termodinmicamente
inestables, tales como las antocianinas. Estas tcnicas evitan la
volatilizacin y la subsiguiente ionizacin y que suministran energa a la
muestra slida o lquida en diferentes formas, de manera que se
produce la formacin directa de los iones gaseosos. Como consecuencia,
es posible obtener muy simplificados espectros. Entre estas fuentes de
desorcin se encuentra FAB, ESI y MALDI, que se consideran fuentes de
ionizacin suave, porque causan baja fragmentacin y permiten las
determinaciones exactas del peso molecular.

La principal ventaja de esta tcnica, es que los anlisis se llevan a cabo

en aproximadamente 4 min. por muestra.

[Escriba texto] Pgina 11

 ANTOCIANINAS

Resonancia magntica nuclear (RMN)

La RMN es un mtodo poderoso usado para la elucidacin estructural de

antocianinas tales como las antocianinas aciladas con derivados
ramnsidos encontrados en algunas frutas como bayas negras y
compuestos menores en anlisis de vinos (Castaneda-Ovando et al.,
2009; Kosir y Kidric, 2002).

El uso de la espectroscopia RMN unidimensional y dos bidimensional 1H

y 13 C con mtodos de supresin de seal larga permite una
identificacin segura para las seales de resonancia de 1H y 13 C de
antocianinas individuales en metanol deuterado (CD3OD) (Kosir y Kidric,
2002).

La espectroscopa RMN es tambin ms simple y menos consumidora de

tiempo que la LC-MS. Estas tcnicas pueden servir como un
complemento para los mtodos ms comnmente usados.

RMN tambin ha sido muy til para identificar los productos de reaccin
de las antocianinas con otros compuestos tales como derivados del
cido cinmico, radicales peroxilo y flavonolas.

6. METODOS ANALITICOS PARA LA CUANTIFICACIN DE

ANTOCIANINAS

HPLC con detector de arreglo de diodos (DAD)

El anlisis de los extractos por HPLC-DAD se realiza para identificar y

cuantificar los pigmentos que contribuyen al color de planta, fruta o
verdura en forma individual. La identificacin se realiza con base en los
datos del espectro UV-Vis obtenido por el DAD de cada uno de los
compuestos separados. El detector ms apropiado y usado con mayor
frecuencia para el anlisis por cromatografa lquida es el de arreglo de
diodos (DAD), monitoreando a una longitud de onda de 450 nm donde
se presenta la mxima absorcin de estos compuestos. No obstante, la

[Escriba texto] Pgina 12

 ANTOCIANINAS

complejidad de muchas muestras requiere de mtodos ms sofisticados

para la identificacin de estos compuestos. La cromatografa lquida
acoplada a espectrometra de masas, HPLC-MS, presenta muchas
ventajas sobre el detector de arreglo de diodos, pues requiere una
cantidad menor de muestra, y adems suministra informacin del in
molecular y posibles fragmentaciones que contribuyen a la
determinacin de la estructura de las antocianinas.

Ejemplo de metodos analticos para la cuantificacin de

antocianinas

METODOLOGA

La metodologa para el estudio de los pigmentos de las cuatro frutas:

uva de rbol (Myrciaria aff cauliflora (Mart.)D.Bery), coral (Hyeronima
macrocarpa Mull.Arg), mora pequea (Rubus megalococcus Focke) y
motiln Hyeronima macrocarpa Mull.Arg), fue desarrollada en tres
etapas: primero la obtencin del extracto crudo enriquecido en
antocianinas, seguido por la identificacin y cuantificacin de los
pigmentos tipo antocianina, luego evaluacin de la actividad
antioxidante de los extractos crudos; y finalmente el estudio de la
estabilidad del color a diferentes pHs.

MATERIAL VEGETAL

Las frutas tropicales uva de rbol y coral objeto de este estudio se

recolectaron en la zona sur occidental del pas en Timbio (Cauca), el
motiln en la Unin (Nario) y la mora pequea en el Hatillo Albana
(Santander) y se seleccionaron de acuerdo a los parmetros de madurez
establecidos por su color. La identificacin taxonmica de las muestras
de estos frutos silvestres se realiz en el Instituto de Ciencias Naturales
de la Universidad Nacional de Colombia de la siguiente manera: uva de
rbol (Myrciaria aff cauliflora (Mart.)D.Bery) (COL 531920), coral
(Hyeronima macrocarpa Mull.Arg) (COL 531921),, mora pequea (Rubus
megalococcus Focke) (COL 531919) y motiln Hyeronima macrocarpa
Mull.Arg) (COL 531910). Aunque el coral y el motiln se clasificaron bajo
el mismo nombre son especies morfolgicamente diferentes, que
ameritan un estudio botnico profundo para poder definir su variedad, lo
cual no fue objeto de este trabajo.

[Escriba texto] Pgina 13

 ANTOCIANINAS

2.2 OBTENCIN DEL EXTRACTO ENRIQUECIDO EN ANTOCIANINAS

(ERA)

Para la mora pequea, se tom la fruta entera (295 g), de la uva de

rbol solo la cscara (134 g), y en el motiln y el coral se us la fruta sin
semilla (98 y 123 g 42 respectivamente). Estas partes de las frutas
fueron extradas separadamente con metanol/cido actico (19:1 v/v) (1
L) durante toda la noche a temperatura ambiente y en la oscuridad. En
cada caso, despus de que el disolvente se elimin al vaco, el residuo
se aplic sobre una columna de resina de Amberlita XAD-7 (Aldrich
Chemical Co., Milwaukee, WI) de 80 x 4 cm. La columna se lav con
agua, y los compuestos adsorbidos se eluyeron con 1 L de metanol/cido
actico (19:1, v / v), de acuerdo con el procedimiento descrito por
Degenhardt et al58.

Cada eluido se concentr al vaco y el residuo se liofiliz obtenindose

un extracto rico en antocianinas (ERA) en la mora (2,1 g), en la uva (1,8
g), en el coral (2,0 g) y en el motiln (3,0 g).

Con el fin de simplificar la composicin de los extractos (ERA) de coral y

motiln, un gramo de cada extracto se fraccion separadamente en una
columna de 45x40 cm, empacada con una resina Toyopearl HW-40F (150
g) (Tosoh Bioscience, Japn). Las fracciones se eluyeron con
metanol/agua/TFA (1:4:0.005,v/v/v,1L) a un flujo de 1.0 mL/min. Se
obtuvieron 34 fracciones para el coral y 71 para el motiln de 10 mL
cada una. Las fracciones se agruparon para el coral de la siguiente
manera: F1(1-5) F2(6-11), F3(12-16), F4(17-20), F5(21- 28), F6(29-32),
F7(33-34) y para el motiln: F1(1-7), F2(8-17), F3(18-24), F5(25-30),
F6(31-37), F7(38-45), F8 (46-51), F9(52-58), F10(59-64), F11(65-71). Se
seleccionaron las fracciones que tenan antocianinas, esto es para el
motiln la F6 (324 mg) y para el coral la F3 (351 mg).

ANLISIS POR CROMATOGRAFA LQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC-DAD).

Se us un cromatgrafo Agilent Technologies serie 1200, detector DAD

(barrido de 200 nm-700 nm), con una columna Zorbax-SB C18 5m 4.6
x 250mm (Phenomenex USA). Como eluyente, se usaron los solventes
acetonitrilo/agua/cido frmico en diferente proporciones, el solvente A
(3:87:10, v/v/v) y el solvente B (50:40:10 v/v/v), a un flujo de 0.2
mL/min. Se utiliz el siguiente gradiente lineal: de 6 a 20% de B por 10
minutos, 20 a 40% B por 10 minutos, 40 a 50% de B por 10 minutos, y

[Escriba texto] Pgina 14

 ANTOCIANINAS

de 50 a 6% de B por 5 minutos. Se utiliz un loop de inyeccin de 50

L.

Los extractos en conjunto con los estndares, se analizaron con el fin de

confirmar la presencia de las antocianinas; las antocianinas: delfinidina
3-glucsido y petunidina 3-rutinsido provenientes de Transmit
(Marburg, Alemania), cianidina 3-glucsido y cianidina 3-rutinsido de
Sigma (Aldrich); y la antocianina cianidina 3-rutinosido aislada y
purificada de la fruta tomate de rbol101.

La cuantificacin de las antocianinas presentes en cada uno de los

extractos se realiz por el mtodo de estndar externo utilizando los
patrones de cianidina-3-glucsido46, con un coeficiente de correlacin
de r2 = 0.994 y delfinidina-3-rutinsido aislada y purificada del tomate
de rbol, con un coeficiente de correlacin de r2= 0.999. Se elabor una
curva de calibracin de 5 puntos (5mg/mL, 10 mg/ mL, 20 mg/ mL, 40
mg/ mL y 80 mg/ mL) inyectando por triplicado cada una de las
concentraciones y los datos obtenidos de las muestras (ARE) se
interpolaron en la curva. Los resultados se expresaron en mg de
cianidina-3-glucosido y delfinidina-3-rutinosido/100 g de muestra,
respectivamente.

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

Obtencin de los extractos para actividad antioxidante.

La obtencin del extracto se realiz siguiendo el procedimieto con el

objeto de extraer tanto los compuestos hidroflicos como lipoflicos.
Segn este procedimiento, se liofilizaron las frutas: mora pequea (fruta
entera), uva de rbol (cscara), motiln y coral (fruta sin semilla) y se
pesaron 0.5 gramos de cada uno de los liofilizados; luego se extrajeron
los compuestos fenlicos por 1 hora a temperatura ambiente con 20 mL
de una mezcla de metanol:agua (50:50 v/v), seguido por otra extraccin
con 20mL de acetona:agua (70:30 v/v) y se centrifug a 4000 rpm por
15 minutos. Finalmente al sobrenadante se le adicionaron 50 ml de agua
destilada en un baln aforado obtenindose as cada uno de los
extractos que fueron usados en los anlisis de actividad antioxidante.

Coral y Motiln. Los perfiles obtenidos para las dos frutas, por HPLC-DAD
se presentan en la Figura 3 Con base en el patrn de fragmentacin se
identificaron cuatro antocianinas: delfinidina-3-rutinsido, petunidina-3-
rutinsido, cianidina-3-rutinsido y delfinidina-3-glucsido

[Escriba texto] Pgina 15

 ANTOCIANINAS

FIGURA: 3 Anlisis por HPLC DAD de a) Coral, b) Motiln. La

identificacin de cada pico corresponde con la tabla

[Escriba texto] Pgina 16

Tabla 3. Identificacin y cuantificacin de las antocianinas presentes en Coral y Motiln (Hyeronima
macrocarpa Mull.Arg)

Pico No Tiempo de Tiempo de Frmula Ion molecular Masa Iones Identificacin (mg/g fruta) (mg/g fruta)
retencin retencin Experimental exacta fragmento peso peso hmedo
Coral(min) Motiln(min) humedo
HPLC-ESI HPLC-ESI/ M+ (m/z) (m/z) (m/z) (coral) (motiln)
/MS-MS MS-MS
1 9,1 8,3 C21H21O12 465.0906 465.1033 303 [M-162] Delfinidina-3- 0,58 1,30a 2,870,07 a
+d
O-
glucopiransid
ob
2 10,6 9,5 C27H31O16 611.1623 611.1612 465[M-146] Delfinidina-3- 12,04 1,30 10,980,07 a
a
+ /303[M- O- rutinsidob
146-162] + e
3 14,4 13,8 C27H31O15 595.1636 595.1663 287[M-162- Cianidina- 3- 2,07 1,30 a 7,580,07 a
146] + f O-rutinsidob
4 17,9 17,4 C28H33O16 625.1599 625.1768 611/317[M- Petunidina3- 2,49 1,30a 8,210,07 a
162-146] + g O- rutinsidob
aReportado como delfinidina-3-rutinosido, b se confirmaron por coinyeccin con estndar Rut: rutinsido; Glu:
glucosido; se obtuvo por MS/MS a partir del correspondiente in molecular
d,e,f,g,

[Escriba texto] Pgina 17

ABREVIATURAS

ACP: Anlisis de componentes principales.

APCI: Ionizacin qumica a presin atmosfrica.

AT: Acidez titulable.

BHT: Butilhidroxitolueno.

CIE: Comisin Internacional de Iluminacin.

CIELAB: Sistema de color en el espacio L* a* b*.

DAD: Detector de arreglo de diodos

ESI: Electrospray.

FAB: Ionizacin de bombardeo con tomos rpidos

FAB-MS: Espectrometria de masas con interfase FAB

HPLC: Cromatografa lquida de alta eficiencia.

HPLC-DAD: Cromatografa lquida de alta eficiencia con detector de

arreglo de diodos.

HPLC0MS: Cromatografa lquida de alta eficiencia acoplada a

espectrometra de masas.

HPLC-APCI0MS: Cromatografa lquida de alta eficiencia acoplada a

espectrometra de masas con interfase APCI.

MS: Espectrometra de masas.

MeOH: Metanol

MTBE: ter ter0butilmetlico.

RGB: Sistema de color RGB (Red, Green, Blue).

RMN: Resonancia magntica nuclear

SS: Slidos solubles totales.

UV0Vis: Ultravioleta0visible

[Escriba texto] Pgina 18