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diagns.cas
para
la
determinacin
de
alrgenos
en
alimentos
Mgr.,
Bqca.
Patricia
Silvina
Knass
Romer
Labs
La:n
America
Adviser
Resumen
de
la
presentacin
Retiro de
Productos
Alrgenos alimentarios
= riesgo para la inocuidad alimentaria
Cual
es
el
escenario
para
el
analista?
Niveles umbral
Toma
de
Test
kits
muestra
Unidades
y
Calibracin
deniciones
Marcado Qu marcador
res
DNA
estamos utilizando?
Cules
son
las
tcnicas
disponibles?
Mtodos
inmunoqumicos:
o ELISA
o Disposi.vos
de
Flujo
lateral
(FLD)
o Mul.plex
Mtodos
de
biologa
molecular:
o PCR
o Mul.plex
Espectrometra
de
masas
Genricos/No
especcos
(limpieza)
o Protenas
o ATP
o Inspeccin
visual
Otros
mtodos
Seleccin
de
un
mtodo
para
detectar
alrgenos
Propsito
Tipo
de
muestra
Matriz
o
producto
Efecto
del
Procesamiento
Tiempo
de
Respuesta
Disponibilidad
de
recursos
ELISA
Deteccin
de
la
protena
especca
(u
otra
asociada)
por
medio
de
an:cuerpos
ELISA
Sndwich
es
ms
comn
en
mtodos
para
alrgenos
1
a
2
horas
para
el
anlisis
Cualita:vo
o
Cuan:ta:vo
Empleado
para
ingredientes,
productos
nales,
muestras
ambientales,
hisopos,
agua
de
enjuague.
Ventajas
y
Limitaciones
del
ELISA
Ventajas Limitaciones
Sensible (ppm) Entrenamiento /Seguir el
Cuantitativo o protocolo
semicuantitativo Muestreo
Anticuerpos que detectan Extraccin
protenas alergnicas o Matriz (polifenoles, pH,
marcadoras procesamiento, aceites)
Relativamente rpido Tipo de protena
Poco equipamiento Falta de matrices de
Nivel de habilidad: medio referencia
Necesidad de validacin
in house
Y
adems.
(cuando
monitoreamos
despus
de
la
limpieza)
Cuando
la
protena
alergnica
se
desnaturaliza
(detergentes,
procesos)
se
presentan
falsos
nega:vos.
En
presencia
de
leche
de
soja,
no
se
detecta
gluten
con
el
an:cuerpo
R5
cuando
se
extrae
con
EtOH
60%
La
prueba
inmunoqumica
puede
verse
afectada
por
la
presencia
de
residuos
de
detergentes
o
desinfectantes.
Mtodos
alterna.vos!!!!!!
FLD
(.ras)
Dispositivos basados en la tecnologa ELISA. (Cualitativos / Semi-
cuantitativos)
Se visualiza con la aparicin de una lnea de color
Muestras ambientales, verificacin de limpieza, screening de
alimentos.
Rpidos (10) / In Situ
PCR
Mtodo
cualita.vo
DNA,
primers,
dNTPs,
polimerasa,
termociclador
Desnaturalizacin
(95C)
Unin
del
primer
Sntesis
de
DNA
(DNA-
polimerasa
72C)
Siguiente
ciclo
Electroforesis
en
gel
de
agarosa
PCR
Mtodo para la deteccin del DNA especfico de la especie
(no la protena alergnica)
Es un mtodo cualitativo donde se amplifica el DNA
especfico y luego se detecta.
Es til cuando los resultados de ELISA son cuestionables
(protenas liofilizadas, para aceites problemas con la
extraccin acuosa-, lecitina de soja en leche en polvo)
Se requiere de habilidad y equipamiento ms costoso.
Real.me
PCR
Mtodo
cuan.ta.vo
Ciclo
umbral
Realtime PCR
PCR
en
Tiempo
Real
es
un
mtodo
cuan:ta:vo
Se
adiciona
una
sonda
especca
de
ADN
Cuando
la
sonda
encuentra
el
target,
se
elimina
el
quencher
y
se
emite
una
seal
uorescente.
Durante
la
reaccin
se
mide
la
uorescencia
en
el
termociclador.
La
cuan:cacin
se
lleva
a
cabo
a
par:r
del
ciclo
umbral
(Ct
value).
La
can:dad
original
de
DNA
se
calcula
con
estndares
internos.
Mar:n
Rder,
Stefan
Vieths,
Thomas
Holzhauser,
Sensi:ve
and
specic
detec:on
of
poten:ally
allergenic
almond
(Prunus
dulcis)
in
complex
food
matrices
by
Taqman
real-:me
polymerase
chain
reac:on
in
comparison
to
commercially
available
protein-based
enzyme-linked
immunosorbent
assay,
Analy:ca
Chimica
Acta,
Volume
685,
Issue
1,
24
January
2011,
Pages
74-83,)
Espectrometra
de
Masas
Detecta
protenas
y
pp:dos
Extraccin,
cleanup,
ionizacin,
separacin
de
las
protenas/pp:dos
ionizados,
deteccin
Alto
grado
de
sensibilidad
y
resolucin
Provee
informacin
de
la
composicin
proteica,
estructura
y
secuencia.
Deteccin
y
conrmacin
de
la
protena
en
un
solo
paso
Deteccin
y
cuan:cacin
de
pp:dos
sencilla.
Ventajas
y
Limitaciones
de
MS
Ventajas
Identificacin y Limitaciones
cuantificacin certera de Mucha experiencia
las protenas alergnicas Equipamiento costoso
Mtodo muy sensible Laborioso y gran inversin
Mtodo de eleccin para de tiempo
la confirmacin Se requiere de extraccin
y cleanup
No es til para los
procedimiento de rutina
hpp://www.intechopen.com/books/a-comprehensive-survey-of-interna:onal-soybean-research-gene:cs-
physiology-agronomy-and-nitrogen-rela:onships/proteomics-and-its-use-in-obtaining-superior-soybean-genotypes
Antes
de
los
mtodos
no
especcos.
Validacin
y
Vericacin
Los
procedimientos
de
limpieza
requieren
de
ambos:
de
validacin
y
vericacin
Efec.vidad
de
la
sani.zacin
Detecta
ATP
proveniente
de
fuentes
biolgicas
Hisopos
convencionales
de
ATP
(higiene)
Hisopos
de
alta
sensibilidad
(residuos
de
alimentos)
Ventajas:
rpido
(<
30
segundos)
Ms
econmico
que
ELISA
La
prueba
se
lleva
a
cabo
in
situ
(:empo
real)
For:cacin
diwcil
Extracto
de
la
protena
(que
se
detecta?)
Alrgeno
(alimento)
For:car
extracto
For:car
muestra
Cuando
analizar
alrgenos?
Inves:gacin
de
reclamos
Validacin
de
mtodos
de
limpieza
Validacin
de
materias
primas
(Anlisis
del
producto
terminado?)
Herramientas
diagns.cas
para
la
determinacin
de
alrgenos
en
alimentos
Mgr.,
Bqca.
Patricia
Silvina
Knass
Romer
Labs
La:n
America
Adviser