APLICACIONES DE LA CITOMETRA DE FLUJO EN LA PRCTICA CLNICA

ASOCIACIN BIOQUMICA ARGENTINA GRUPO RIOPLATENSE DE CITOMETRIA DE FLUJO

PATRONES
INMUNOFENOTPICOS
EN MDULA SEA
NORMAL

Dra. Daniela Lens.

Laboratorio de Citometra y Biologa Molecular.
Hospital de Clnicas. Universidad de la Repblica. Uruguay
 Utilidad de la citometra en
oncohematologa

Diagnstico

Clasificacin pronstica

Evaluacin de la efectividad del tratamiento

Reactivo/
Normal Regenera Neoplsico
tivo
Caracterizacin
inmunofenotpica

Cuan similar son las clulas leucmicas

a las clulas normales?
- Diagnstico

Cuanto difieren las clulas leucmicas

de las clulas normales?
- Clasificacin, pronstico, seguimiento
 Hematopoyesis

Mielopoyesis Los progenitores de las plaquetas,

hemates, granulocitos y monocitos realizan todo
su proceso de proliferacin y diferenciacin en la
mdula sea.
Linfopoyesis es la produccin de linfocitos y a
diferencia de los que ocurre con los dems tipos
celulares de la sangre, los linfocitos tambin
proliferan y maduran fuera de la mdula sea
(linfocitos T)
 Hematopoyesis

Produccin diaria: GR, GB, plaquetas

175 billones GR/da

70 billones granulocitos/da (N,Eo,Ba)
175 billones plaquetas/da

de produccin: 5-10 veces

Hematopoyesis
Diferenciacin de CD34+ HPC hacia
diferentes lneas hematopoyticas
Erythroid
precursors
Neutrophil
Basophil/MC precursors
precursors

pDC Monocytic
precursors precursors
Uncommitted
precursors

% cells
B-cell
precursors
Maturation stage
 CD34+HPC
CELL LINEAGE FREQUENCY

Erythroid 15% (5%-35%)

Megakaryocytic <1%
Neutrophil 31% (12-39%)
Eosinophil <1%
Basophil <1% (<1%-3%)
Monocytic 5% (3%-15%)
Mast cell <1% (<1%)

pDC 6% (1%-15%)

B-Lymphoid 23% (<1%-45%)

Total: 81%
Diferenciacin
Linfoide
 Linfopoyesis

A partir de un mismo progenitor linfoide

se generan distintas lneas celulares de
maduracin diferenciadas:

Serie linfoide B
Serie linfoide T
Clulas Natural Killer
Clula dendrtica plasmocitoide
 Diferenciacin linfoide B

Ag-independiente Ag-dependiente

Mdula sea (adulto): Generacin de Migracin de los linfocitos B

linfocitos B inmunocompetentes maduros de la MO a los rganos
(BCR) y autotolerantes linfoides secundarios
 Diferenciacin de linfocitos T

Migracin de los precursores T de Migracin de LT inmunocompetentes

la mdula al timo del timo a rganos linfoides
secundarios
 SUBCAPSULAR CORTICAL MEDULAR SANGRE PERIFRICA
Timocito I (<10%) Timocito I (80%) Timocito III (<10%)
inmaduro comn maduro Linfocito T TCR+
MDULA SEA CD8-
CD7+ CD2+ CD1a+ CD4- CD8-/+d
CLULAS
DEL Linfocito T
ESTROMA CD4+
Notch-1L TdT+ TdT+
Linfocito memoria
TdT+ T CD4+ Central (CCR7+)
CD7+ virgen /Perifrica (CCR7-)
c-kitL CD38+
CD2-/+ CD7+ CD7+ CD71+ CD45RA-
flt-3L CD38-/+ CD38-/+ CD38-/+ CD2+ CD45RA+ CD45RO+
CD71+ CD71+ TCR-/+ CD5+ CCR7+
CD1a-
CD27+
CD5+ CD5+ CD2+ CD28+
CD25-/+ CD25- CD71+ CD45+++ CD62L+
CD117+ CD117+ CD5+ sCD3+/TCR+
precursor CD27- Linfocito
precursor CD34+ CD34- CD4+
T/NK/CD CD45RO- T efector
CD34+ HLADR+ HLADR- CD8+
CD45+ CD45+ CD45++ CD8+
CD44+/- CD44- CyCD3+/sCD3+d CD45RA+
CD34+ CD34+ CyCD3+ CyCD3+ Linfocito CCR7-
CD117+ CD13-/+ nTdt+ nTdt+ CD4- CD28-
T CD8+
CD135+ CD33-/+ virgen CD62L-
CD38+ CD38+ TIMO CD45RO-/+d
HLADR+ HLA DR+
CD10- CD10+
CD45+/- CD45RA+
CD117+ Precursor Celula
CD dendrtica

CLULAS DEL ESTROMA GANGLIO LINFTICO

IL-12/IL-15
Precursor Torrente
NK/CD Precursor
NK CD34- CD34-
sanguneo
CD44hi CD117+ CD117-/+
CD34-
CD5- CD44hi CD161+ CD161+
CD56+dbil
CD34+ CD5- CD94- CD56++
CD16+
CD45RA+ CD34+ CD16-
CD94-/+
CD117- CD45RA CD94+
CD161- CD161-/+ Clula NK
Clula NK Clula NK
CD117+
intermedia CD56++ CD56+dbil
CD122+
 Precursores normales T/NK/DCp
en MO

Absence (<104) of CD7+CD34+ or CD7+TdT+

cells in normal BM

CD45
CD34

4
0 1 2 3 10 0 10 1 10 2 10 3 10
10 10 10 10 10

CD7 CD7
But: In regenerating BM CD34+/CD7+/cCD3- are present

Orfao et al. Univ de Salamanca

DIFERENCIACIN
LINFOIDE B
 Diferenciacin linfocitaria B

Large Small Immature Mature

Pro-B Pre-B I Pre-B II Pre-B II Pre-B II

CD34+ CD34+ CD34+ CD34- CD34- CD34- CD34- CD34-

CD22+ CD22+ CD22+ CD22+ CD22+ CD22+ CD22+ CD22+
CD10- CD10+ CD10+ CD10+ CD10+ CD10+ CD10+ CD10-
CD19- CD19- CD19+ CD19+ CD19+ CD19+ CD19+ CD19+
CD20- CD20- CD20- CD20+ CD20+ CD20+ CD20+ CD20+
CD79a+ CD79a+ CD79a+ CD79a+ CD79a+ CD79a+ CD79a+
TdT+ TdT+ TdT- TdT- TdT- TdT- TdT-
cyIg- cyIg+ cyIg+ cyIg+ sIgM+ sIgM+
Pre-BCR+ Pre-BCR- sIgM- sIgD- sIgD+

IGH DJ VDJ

IGK rearranged deleted (in Ig+ cells)

IG rearranged (in Ig+ cells)

Ghia et al, 1996; Lucio et al, 1999; LeBien et al, 2000
Van Lochem et al, Cytometry 2004
 Inmunofenotipo de LB normales
vs LB leucmicos

CD19+
B-CELLS
SSC

CD45-PO
SSC

CD19-PECy7

Lucio et al, Leukemia, 1999

Perfil fenotpico de los
precursores B
 Diferenciacin fenotpica de los
precursores B
CD20
CD45

CD10
CD34 CD19
CD21
TdT
CD22

sIg
CD24
cy CD23 CD38
CD53
CD9
CD37 CD5
CD81
I II III IV
 Limitaciones de la citometra

Muchos reactivos: paneles diferentes

Infinitas estrategias de anlisis para llegar a
conclusiones similares
Utilidad clnica de la informacin
suministrada?
Falta de estandarizacin: reproducibilidad?
Limitaciones tcnicas ej: Enfermedad mnima
residual, LCR
 Propuesta Euroflow
Utilizacin de un mayor nmeros de parmetros

Nuevos softwares de anlisis: Infinicyt

Generacin de nuevos productos

Protocolizacin total de la tcnica:

estandarizacin

Desarrollo de modelos diagnsticos cuyo fin es diagnosticar

y caracterizar la mayor parte de las entidades de OMS
Euroflow

protocolizacin total de la tcnica en

las diferentes hemopatas malignas

Generacin de bancos de datos

Compara el resultado de un paciente

determinado contra los de las diferentes
entidades

Informa a que entidad se asemeja ms y el

rango de error diagnstico estadstico
Clasificacin de neoplasias
hematolgicas

Clasificacin basada en:

- (Histo)morfologa
- Caractersticas de diferenciacin
- Alteraciones genticas definidas
 8- COLOR flow cytometry: BCP-ALL
CD19+ EuroFlow panel (450 bivariate plots)
B-CELLS
SSC

CD45-PO
SSC

CD19-PECy7

Lucio et al, Leukemia, 1999

 Diseccin automtica de la
diferenciacin de lnea B

Responsible scientists: V.H.J. van der Velden and E. Mejstrikova

 Diferenciacin B en MO Normal
vs MO regenerativa

Normal BM Normal vs Regenerating BM

Late maturation Late maturation

stages stages

Early maturation Early maturation

stages stages

CD19 Gated B-cells (excluding PC)

Responsible scientists: V.H.J. van der Velden and E. Mejstrikova

 LLA vs precursores normales
APS view 1

APS view 2

Case 1 Case 2 Case 3 Case 4

Responsible scientists: V.H.J. van der Velden and E. Mejstrikova Designed by: A. Orfao & Q Lecrevisse
Patrones de
maduracin
mieloide
Patrones inmunofenotpicos de
maduracin mieloide
Diferenciacin a neutrfilo
(tubo AML1)

van der Velde. ESCCA 2012

Patrones de maduracin de lnea
neutroflica ( tubo AML2)

van der Velde. ESCCA 2012

 Cambios fenotpicos durante la
diferenciacin a neutrfilo
BAND/
MYELOBLAST PROMYELOCYTE MYELOCYTE METAMYELOCYT
NEUTROPHIL
CD15

CD13
CD64 MPO
CD13
103
CD33 CD65

CD35

CD11b
102

CD16 CD10
101

CD34

CD117 CD54
HLA-DR
Diferenciacin monoctica
(tubo AML2)

van der Velde. ESCCA 2012

Diferenciacin monoctica
(tubo AML3)

van der Velde. ESCCA 2012

Diferenciacin monoctica

Myeloblast Monocyte
Diferenciacin eritroide
tubo AML3

van der Velde. ESCCA 2012

 Diferenciacin eritroide
Myeloblast Normoblast
Cambios fenotpicos durante la
diferenciacin megacarioctica

INMATURE MATURE

CD36
CD41
CD42
CD61

CD34
HLA-DR
CD13
CD117
CD33
CD45
Cambio fenotpico durante la
diferenciacin a basfilo

CD123

CD203c

CD34 c2D7 FceRI

HLA-DR
CD117
 Cambios fenotpicos durante la
maduracin de DC plasmocitoides
STAGE I STAGE II STAGE III STAGE IV

CD 123 PE
103
CD 36 FITC
HLA DR PERCP
CD 117 APC
BDCA4 PE
102
CD 33 APC BDCA 2 PE

CD 34 APC

101
Cambios fenotpicos durante la
diferenciacin a mastocito

CD117

CD203c
cytG4 (Tryptase)

cytB12 (Tryptase)
HLA-DR cytG3 (tryptase)

FceRI
CD34
Maduracin de
lneas mieloides
utilizando Euroflow
 Panel para la clasificacin de
LMA/SMD por EuroFlow

Pacific Pacific PerCP- APC-

Tube FITC PE PE-Cy7 APC Aim**
Blue Orange Cy5.5 H7

AML/
MDS

1 HLADR CD45 CD16 CD13 CD34 CD117 CD11b CD10 Diagnosis and
subclassification of AML and
PNH especially focused on
neutrophil lineage

2 HLADR CD45 CD35 CD64 CD34 CD117 IREM2 CD14 Diagnosis and
subclassification of AML
and PNH especially
focussed on monocytic
lineage

3 HLADR CD45 CD36 CD105 CD34 CD117 CD33 CD71 Diagnosis and
subclassification of AML
especially focused on
erythroid lineage

4 HLADR CD45 nuTdT CD56 CD34 CD117 CD7 CD19 Aberrant expression of
lymphoid-associated
markers and abnormal
lymphoid maturation

Responsible scientist: VHJ van der Velden

 Progenitores CD34+ y/o CD117+

Uncommitted precursors

B-cell vs Neutrophil Neutrophil vs Erythroid vs pDC Basophil vs MC

precursors Monocytic precursors precursors precursors
Maduracin normal a neutrfilo

Myeloblasts Promyelocytes
Neutrophils

Bands

Meta-
Myelocytes myelocytes
Maduracin normal a neutrfilo

Sequential markers: CD34- DR- CD117- CD13- CD11b+ CD16+ CD13+ CD10+
Maduracin a Neutrfilo en MO Normal
basada en anlisis de componentes
principales de 10 parmetros
BM 1 BM2 BM3

BM4 BM5

All
BM

BM6 BM7 BM8

Maduracin a monocito en MO normal
basada en anlisis de componentes
principales de 10 parmetros
BM 1 BM2 BM3

BM 4 BM5

All
BM

BM 6 BM7 BM8
Maduracin a monocito en MO
normal

HLADR CD64 CD36 CD14 IREM2

Maduracin a monocito en
MO Normal

HLADR CD64 CD36 CD14 IREM2

Maduracin Eritroide en MO Normal
basada en anlisis de componentes
principales de 10 parmetros

BM 1 BM2 BM3

BM 4 BM5

All
BM

BM 6 BM7 BM8
Maduracin eritroide en MO
normal

CD36-CD105+ CD71hi CD105-

Maduracin a neutrfilo en
MO Normal vs MO reactiva
Overlayed Normal
vs reactive BM
 Overlayed Normal Overlayed Normal
vs reactive BM vs MDS BM

+3SD +10SD

-3SD -10SD
 CONCLUSIONES

El conocimento de los patrones fenotpicos de maduracin de

las diferentes lneas es esencial para diferenciar poblaciones
normales / poblaciones regenerativas /poblaciones
neoplsicas independientemente de su estado de
maduracin
En los ltimos aos se ha avanzado considerablemente en el
conocimiento de los patrones fenotpicos de maduracin en
la hemopoyesis gracias a la citometra multiparamtrica ( 8 o
mas colores) y al desarrollo de nuevos software de anlisis
que incorporan la visualizacin de patrones de diferenciacin
tanto normales como patolgico.