ESTUDIOS DE POBLACIONES Y

SUBPOBLACIONES
LINFOCITARIAS POR CMF

Dra. Mnica Saracco

Instituto de
Investigaciones
Biomdicas en Retrovirus y
SIDA (ex CNRS)
 Aplicaciones Clnicas
Analisis de subpoblaciones Linfocitarias
Inmunodeficiencias congnitas
Inmunodeficiencias Adquiridas (HIV,farmacolgica)
Oncohematologa: Fenotipos de leucemias y linfomas, EMR.
Transplantes:
Transplantes Cross Match, reconstitucin, inmunosupresin,
Recuento de celulas progenitoras
Anlisis de Ciclo Celular y ploidas en tumores.
Recuento de reticulocitos.
reticulocitos
Activaciones plaquetarias.
Apoptosis
Sorting: Separacines clulares
Morfologa y Citometra
LINFOCITOS T LINFOCITOS B
CLULAS NK CITOQUINAS
 Ciclo de multiplicacin

El virus utiliza la molcula CD4 para entrar a la clula.

Inserta su informacin gentica y utiliza la maquinaria gentica celular para
multiplicarse y diseminar a otras clulas.
LAS CLULAS SUSCEPTIBLES PERTENECEN AL SISTEMA
INMUNOLGICO
 Desrregulacin Inmune

Alteraciones funcionales de clulas

CD4
Cambios en el Inmunofenotipo de
clulas HIV infectadas.
Disminucin progresiva de
Linfocitos T CD4+
 Pruebas de laboratorio
Diagnstico: Deteccin de anticuerpos
ELISA Y WESTERN BLOT (WB)
Cuando un ELISA es positivo debe confirmarse por WB

Anticuerpos

CD4

2 A 6 SEMANAS

Virus
 Pruebas de laboratorio
Paciente HIV positivo:
Carga viral en sangre
Recuento de linfocitos TCD4
(ambos sirven para decisiones teraputicas)
Estudios de resistencia al tratamiento

CD4

Virus
 Requerimientos en
Laboratorios
Bioseguridad para el
procesamiento de muestras
Contador hematolgico
Citmetro de flujo
Equipos para lisis automtica (no
indispensable)
FACS Count
PIMA
FACSCanto II
FACSCalibur
BD FACSAriaTM
Cell Sorter :
Nuevo Concepto
 Recoleccin de las Muestras
Tubos Vacutainer, con K3EDTA, 5ml de
sangre
Temperatura Ambiente
Procesamiento dentro de las 48hs de la
extraccin
Marcacin 50 ul de sangre con 5ul MoAb,
incubacin 15 minutos
Lisado de Glbulos Rojos
 CONCEPTO DE
CUANTIFICACIN
Medicin de clulas presentes en el
organismo normalmente, cuyo valor
relativo y/o absoluto tendr suma
importancia para la toma de decisiones
diagnsticas y/o teraputicas
 Metodologas
Plataforma nica Plataforma Doble
Puede utilizar uno o dos Puede utilizar uno o dos
tubos de marcacin tubos de marcacin
Gate en Linfocitos o Gate en Linfocitos o
CD45 vs. SSC
CD45 vs. SSC
Utiliza Beads (10000)
Siempre debe realizarse
permite realizar el clculo
el Hemograma para
matemtico de valor
absoluto poder informar los
valores absolutos
Subpoblaciones Linfocitarias
CMF
Seleccin de eventos

R1
LINFOCITOS T (CD3+) vs.
LINFOCITOS B (CD19+)
LINFOCITOS T (CD3+) vs.
CELULAS NK
Anlisis de 3 colores

R1
 Density Dot Plot Contour Plot

Los colores informan la Identificacin de las

frecuencia de los eventos poblaciones mediante
lneas de contorno
Recomendaciones de la CDC
Plataforma nica
Doble Plataforma con gate en CD45
Repeticin de por lo menos un MoAb
Controles Internos de Calidad
Controles Externos de Calidad
Coherencia interna de los resultados
Porcentaje y Variabilidad en los
Resultados
Gate de Linfocitos Recuperacin 95%,
Pureza >90% (mnima 85%)
La suma de CD3/CD4 y CD3/CD8
variabilidad +/- 5% mximo <10%
Las muestras con aumento de Linfocitos
() presentan la mayor variabilidad
La sumatoria de poblaciones B, T, NK
deber estar entre el 95%-105% (mnimo
90%-110%)
 OBTENCIN DE BUENOS
RESULTADOS

Evaluar estado de la
CD3 menor de 50% muestra
Evaluar metodologa de
marcacin y de lisis
CD3/CD4 + CD3/CD8 Evaluar presencia de
menor o mayor a dobles positivas o dobles
valores de CD3 negativas
Continuar estudio con
CD19/ CD56+/16+
VALORES DE REFERENCIA
VALORES EN ADULTOS
SEXO, EDAD
VALORES PEDIATRICOS desde
el nacimiento a los12 aos
 Control de Calidad I

Empleo de ensayos validados y

estandarizados para obtener resultados
reproducibles intra e inter-ensayo
Manuales de procedimientos (GLP):
procedimientos escritos para uso universal
en los distintos laboratorios integrantes de
la Red
 CONTROLES DE CALIDAD II
INTERNOS EXTERNOS
Flow-check CMF Q-ASI Program
(Canadiense)
4CL para Contador NE-QAS (Reino Unido)
Hematolgico CAP (USA)
GRCF (Argentina-
Frecuencia: 3 veces Uruguay)
por semana Frecuencia: 4 anuales
 PLATAFORMA NICA
Menos Tubos Encarece el estudio

Mayor objetividad en Menor

la medicin reproducibilidad

Utilizacin de un solo
equipo
 DOBLE PLATAFORMA
Requiere Hemograma Mas Econmico

Requiere CMF Mayor

reproducibilidad
Controles para ambos
equipos

N de Tubos depende
del protocolo utilizado
 PROTOCOLOS DE ANLISIS
Regin Morfolgica TRI-Test
FSC vs. SSC CD8/CD4/CD3

Regin en base a CD3/CD4/CD45

MoAb (CD45) vs, CD3/CD8/CD45
SSC
Multi-Chek
CD3/CD8/CD45/CD4
 COMPARACIN DE CMF Y
SOFTWARE
CMF CD3 CD4 CD8 CD19 CD56
SOFT

BD 1361 (1038-1717) 898 (662-1042) 437 (298-670) 234 (175-323) 187 (148-299)
SP

BD 1375 (1057-1724) 883 (654-1122) 408 (315-601) 229 (157-341) 195 (143-302)
DP

CL45 1367 (1080-1691) 894 (677-1076) 413 (307-623) 236 (164-330) 182 (154-280)

CLTT 1327 (1058-1658) 837 (650-1076) 420 (312-625)

 TEST ESTADSTICO
Los valores de correlacin (Rho de
Spearman) entre los distintos mtodos
para todos los tipos celulares oscilaron
entre 0.902 y 0.987
Muchas Gracias