PENGARUH KOMPOSISI FASA GERAK PADA PENETAPAN

KADAR ASAM BENZOAT DAN KAFEIN DALAM KOPI

KEMASAN MENGGUNAKAN METODE KCKT
(KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI)

Auliya Puspitaningtyas, Surjani Wonorahardjo, Neena Zakia

Jurusan Kimia FMIPA Universitas Negeri Malang
Email: k.auliya@ymail.com, s_wonorahardjo@yahoo.com, z_khia@yahoo.com

Abstrak: Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui pengaruh komposisi fasa gerak terhadap
penetapan kadar asam benzoat dan kafein, serta mengetahui kadar asam benzoat dan kafein
dalam kopi kemasan. Tahapan penelitian ada dua langkah pokok yaitu (1). Optimasi kondisi
analisis yang meliputi penentuan masing-masing maksimum asam benzoat dan kafein
menggunakan Spektrofotometer UV-Vis, standart asam benzoat dan kafein dianalisis dalam
berbagai komposisi fasa gerak menggunakan KCKT, dan pemilihan komposisi fasa gerak yang
baik untuk analisis asam benzoat dan kafein menggunakan KCKT; (2) Penetapan kadar asam
benzoat dan kafein dalam sampel, sebelumnya dilakukan beberapa tahapan yaitu pretreatment
sampel untuk memisahkan asam benzoat dan kafein dari masing-masing sampel, pembuatan
kurva kalibrasi larutan standart asam benzoat dan larutan standart kafein menggunakan
komposisi fasa gerak terpilih, dan analisis sampel menggunakan komposisi fasa gerak terpilih.
Fasa gerak terpilih yang digunakan adalah campuran metanol dan buffer asetat dengan
perbandingan 50:50 dan 60:40. Kadar asam benzoat pada komposisi fase gerak 50:50 sampel A
20,5 ppm dan sampel B 12 ppm, untuk komposisi fase gerak 60:40 sampel A 35 ppm dan sampel
B 41,5 ppm. Kadar kafein pada komposisi fase gerak 50:50 sampel A 6,5 ppm dan sampel B 11,5
ppm, untuk komposisi fase gerak 60:40 sampel A 22 ppm dan sampel B 37 ppm.

Kata kunci: fasa gerak, asam benzoat, kafein, kopi kemasan, KCKT

Abstract: This research is done to determine the effect of mobile phase composition on benzoic
acid and caffeine and determine benzoic acid and caffeine in instant coffee package. This study
conducted in the laboratory which consists of several steps: (1). Optimization of analysis
condition that comprise determining each maximum of benzoic acid and caffeine using UV-Vis
Spectrophotometer, benzoic acid and caffeine standard analyzed on various mobile phase
composition using HPLC, the best selection of mobile phase composition for benzoic acid and
caffeine using HPLC , (2) Determination benzoic acid and caffeine contains in samples,
previously done several steps, sample pretreatment for separating benzoic acid and caffeine from
sample, making the calibration curve for benzoic acid and caffeine solution standard, and
analysis of sample using selected mobile phase composition. The selected mobile phase is the
mixture of methanol and buffer acetate within comparison 50:50 and 60:40. The content of
benzoic acid at mobile phase composition 50:50 for sample A 20,5 ppm and sample B 12 ppm, at
mobile phase composition 60:40 for sample A 35 ppm and sample B 41,5 ppm. The content of
caffeine at mobile phase composition 50:50 for sample A of 6.5 ppm and sample B 11.5 ppm, at
mobile phase composition of 60:40 for sample A 22 ppm and sample B 37 ppm.

Key word: mobile phase, benzoic acid, caffeine, instant coffee package, HPLC

PENDAHULUAN
Jenis bahan pengawet yang sering digunakan dalam makanan untuk menghambat
pertumbuhan jamur, ragi, dan beberapa bakteri adalah asam benzoat. Bahan pengawet
ini biasanya digunakan dalam bentuk garam benzoat yang lebih mudah larut dalam air
dibanding bentuk asamnya yaitu natrium benzoat (PerMenKes No.772, 1988). Selain
bahan pengawet, beberapa minuman kemasan juga mengandung kafein yang berfungsi
untuk merangsang sistem saraf pusat sehingga dapat mengusir rasa kantuk dan lelah
secara sementara. Jenis minuman kemasan tersebut antara lain jenis minuman ringan,
minuman berenergi, teh kemasan, dan kopi kemasan.
Pada penelitian sebelumnya McDevitt et al (1998) menganalisis asam benzoat
dan kafein pada minuman ringan menggunakan spektrofotometri ultra violet (UV), dan
El-Ziney (2009) menganalisis kandungan asam benzoat yang terdapat pada beberapa
minuman ringan dan minuman berenergi dengan GC-MS (Gas Chromatography-Mass
Spectrometer). Metode spektrofotometri UV memiliki kelebihan antara lain sampel
dapat langsung dianalisis meskipun tanpa preparasi dan sampel tidak perlu dibuat
berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Sedangkan kelemahannya antara lain,
penentuan kadar sampel berdasarkan banyaknya sinar yang diserap oleh sampel
sehingga hasil yang diperoleh belum tentu sesuai dengan kadar yang sebenarnya. Selain
itu, banyak kemungkinan terjadi interferensi dari senyawa lain yang juga menyerap
sinar pada panjang gelombang UV tersebut, sehingga dapat menimbulkan bias pada
hasil analisis (Riyadi, 2009). Pada metode GC-MS, sampel yang akan dianalisis harus
memenuhi persyaratan antara lain sampel mudah menguap, mudah diuapkan, dan tidak
rusak karena panas (Anonymous, 2012).
Perlu adanya metode lain yang mampu menutupi kelemahan yang dimiliki oleh
metode spektrofotometri UV dan GC-MS. Salah satu metode yang dapat digunakan
yaitu metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi yang selanjutnya disingkat dengan
KCKT. Metode KCKT termasuk suatu teknik kromatografi kolom dengan fase gerak
berupa cairan dan fase diam berupa padatan yang terdapat pada kolom. Kelebihan yang
dimiliki oleh KCKT antara lain mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu
campuran dengan baik, memiliki kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi, dapat
menggunakan berbagai detektor, kolom dapat digunakan kembali, memisahkan zat yang
labil dan tidak mudah menguap, dilakukan pada suhu kamar, serta ideal untuk
pemisahan ion dan molekul besar (Johnson dan Stevenson, 1991).
Metode analisis KCKT dapat digunakan untuk analisis secara kualitatif maupun
kuantitatif senyawa-senyawa yang terdapat dalam sampel. Penelitian yang
menggunakan metode KCKT dilakukan oleh Ree, M dan Stoa, E (2011) untuk
menetapkan kandungan aspartam, asam benzoat, kafein, dan sakarin dalam minuman
ringan bebas gula. Fase gerak yang digunakan adalah campuran metanol dengan buffer
fosfat pH 3 (20:80), kolom XB-C18 (50 L x 4,6 mm), dengan panjang gelombang 220
nm dan 270 nm.
Penelitian lain juga dilakukan oleh Techakriengkrai, I dan Surakarntul, R (2007)
menggunakan metode KCKT untuk menganalisis asam benzoat dan asam sorbat pada
minuman ringan menggunakan fase gerak metanol dengan buffer ammonium asetat
(60:40), dan penelitian yang dilakukan oleh Saad, B dkk (2004) juga menggunakan
metode KCKT untuk menganalisis bahan pengawet pada makanan dengan fase gerak
metanol dengan buffer ammonium asetat (50:50).
Fase gerak yang digunakan oleh Techakriengkrai, I dan Surakarntul, R (2007)
dan Saad, B dkk (2004) berbeda dengan penelitian yang dilakukan oleh Ree, M dan
Stoa, E (2011). Perbedaan dari ketiga penellitian tersebut terletak pada jenis buffer yang
digunakan yaitu buffer ammonium asetat dan buffer fosfat, sedangkan pelarut yang lain
sama-sama menggunakan metanol. Techakriengkrai, I dan Surakarntul, R (2007) dan
Saad, B dkk (2004) menggunakan jenis fase gerak yang sama dengan perbandingan
komposisi yang berbeda. Hasil dari ketiga penelitian yang diperoleh tidak dapat
dibandingkan karena sampel yang digunakan berbeda. Dalam KCKT, fase gerak selain
berfungsi sebagai pembawa komponen-komponen campuran menuju detektor, fase
gerak merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses analisis (Hendayana,
2010).
Terhadap kopi kemasan yang digunakan sebagai sampel dilakukan ekstraksi
pelarut sebelum dianalisis menggunakan KCKT. Ekstraksi pelarut merupakan metode
pemisahan yang sering digunakan dalam laboratorium untuk mengisolasi satu atau lebih
komponen dari suatu campuran (Khopkar, 1990). Prinsip metode ekstraksi pelarut
didasarkan pada distribusi zat terlarut dalam dua pelarut yang tidak saling bercampur.
Ekstraksi terhadap kopi kemasan dilakukan untuk menghilangkan unsur lain yang
mungkin akan mengganggu proses analisis. Oleh karena itu dilakukan penelitian tentang
pengaruh komposisi fase gerak pada penentuan kadar asam benzoat dan kafein yang
terdapat pada kopi kemasan dengan metode KCKT menggunakan fase gerak campuran
metanol dan buffer ammonium asetat.

METODE
Rancangan Penelitian
Tahap penelitian meliputi dua langkah pokok yaitu: (1) Optimasi kondisi analisis
yang meliputi beberapa tahap yaitu (a) Penentuan masing-masing maksimum asam
benzoat dan kafein menggunakan Spektrofotometer UV-Vis, (b) Standart asam benzoat
dan kafein dianalisis dalam berbagai komposisi fase gerak menggunakan KCKT, (c)
Pemilihan komposisi fase gerak yang baik untuk analisis asam benzoat dan kafein
menggunakan KCKT; (2) Penetapan kadar asam benzoat dan kafein dalam sampel,
sebelumnya dilakukan beberapa tahapan yaitu (a) Pretreatment sampel untuk
memisahkan asam benzoat dan kafein dari masing-masing sampel, (b) Pembuatan kurva
kalibrasi larutan standart asam benzoat dan larutan standart kafein menggunakan
komposisi fase gerak terpilih (b) Analisis sampel menggunakan komposisi fase gerak
terpilih.

Prosedur Kerja
1. Ektraksi Asam Benzoat dan Kafein dalam Sampel Kopi
Ekstraksi asam benzoat dilakukan dengan mengambil sebanyak 150 mg kopi
bubuk kemasan dimasukkan ke dalam labu takar 250 mL dan ditambah dengan larutan
NaCl jenuh secukupnya, larutan tersebut dibuat basa dengan menambahkan larutan
NaOH 10%, selanjutnya ditambah larutan NaCl jenuh sampai tanda batas dan diaduk
konstan selama 2 jam kemudian disaring sehingga diperoleh filtrat yang bebas bubuk
kopi. Filtrat hasil saringan diambil sebanyak 25 mL dan dimasukkan dalam corong
pisah 100 mL untuk diekstraksi menggunakan kloroform, sebelumnya ditambah dengan
HCl sebanyak 1,25 mL. Ekstraksi dilakukan secara bertingkat dengan 18,5 mL; 12,5
mL; 10 mL; 7,5 mL kloroform. Fase organik dari hasil ekstraksi dimasukkan dalam
gelas kimia 250 mL yang telah berisi air sebanyak 50 mL, selanjutnya didestilasi untuk
menghilangkan fase organiknya (kloroform) sehingga diperoleh asam benzoat yang
terlarut dalam air.
Sedangkan untuk ekstraksi kafein, sebanyak 25 g kopi bubuk kemasan
dimasukkan dalam timbel, kemudian dimasukkan dalam rangkaian alat sohlet yang
telah berisi 300 mL metanol, selanjutnya diekstraksi selama 3 jam. Ekstrak kopi dalam
metanol disaring dengan pompa vakum menggunakan kertas saring Whatman 41.
Ekstrak kopi yang telah disaring diambil sebanyak 100 mL untuk dimasukkan dalam
gelas kimia 250 mL yang telah berisi 12,5 g MgO. Campuran tersebut selanjutnya
ditambah dengan 75 mL air dan diaduk konstan disertai pemanasan selama 10 menit.
Setelah itu, campuran disaring, residu sisa penyaringan dicuci dengan 125 mL dan 63
mL air panas secara bergantian. Filtrat dari kedua penyaringan dicampurkan dan
disaring kembali menggunakan pompa vakum. Selanjutnya, keseluruhan filtrat yang
dihasilkan ditambah dengan H2SO4 10% sebanyak 12,5 mL. Campuran tersebut
dipanaskan dan diuapkan sampai tersisa 1/3 volume awal, setelah itu disaring dalam
keadaan panas dan didinginkan. Setelah dingin, filtrat dimasukkan dalam corong pisah
250 mL dan diekstraksi dengan 7,5 mL kloroform. Lapisan organik hasil ekstraksi
dimasukkan dalam gelas kimia 500 mL dan ditambah dengan larutan NaOH 1% sampai
warnanya hilang, kemudian ditambah air dengan volume sama dengan volume larutan
NaOH 1% yang ditambahkan dan didestilasi untuk menghilangkan pelarut organiknya.
2. Pembuatan Larutan
a. Pembuatan Larutan Penyangga Amonium Asetat pH 4
Sebanyak 7,7 gram amonium asetat dimasukkan dalam labu ukur 1000 mL,
kemudian ditambah aquabides sampai kira-kira volume 900 mL dan ditambah dengan
asam asetat glasial sampai pH 4 yang diukur menggunakan kertas indikator universal.
Selanjutnya, campuran tersebut ditambahkan aquabides sampai batas.
b. Pembuatan Larutan Induk Asam Benzoat dan Kafein
Pembuatan larutan induk asam benzoat dan kafein masing-masing 100 ppm.
Larutan induk asam benzoat dibuat dengan menimbang sebanyak 10 mg asam benzoat.
Asam benzoat tersebut dimasukkan dalam labu ukur 100 mL, kemudian ditambah
aquabides sampai batas dan dikocok sehingga dihasilkan larutan induk asam benzoat
100 ppm. Larutan induk kafein dibuat dengan menimbang sebanyak 10 mg kafein.
Kafein tersebut dimasukkan dalam labu ukur 100 mL, kemudian ditambah aquabides
sampai tanda batas dan dikocok.
c. Pembuatan Larutan Standart Asam Benzoat dan Kafein
Larutan induk asam benzoat dan kafein 100 ppm digunakan untuk membuat
larutan standar. Larutan induk asam benzoat diencerkan dengan aquabides menjadi 5
ppm, 10 ppm, dan 20 ppm dengan cara mengambil 2,5 mL; 5 mL; dan 10 mL, kemudian
dimasukkan dalam 3 labu ukur 50 mL yang berbeda secara berturut-turut. Larutan induk
kafein diencerkan dengan aquabides menjadi 5 ppm, 10 ppm, 20 ppm dan 50 ppm
dengan cara mengambil 2,5 mL; 5 mL; 10 mL; dan 25 mL, dimasukkan dalam 4 labu
ukur 50 mL yang berbeda secara berturut-turut.
d. Pembuatan Larutan Sampel
Sebanyak 5 mL ekstrak asam benzoat dan kafein masing-masing diencerkan
dalam labu ukur 50 mL dengan aquabides sampai tanda batas. Larutan yang akan
dianalisis disaring terlebih dahulu menggunakan Cellulose Nitrate Membrane Filtrat
0,45 m.
3. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum (maks)
Penentuan maks dilakukan dengan menganalisis larutan standart asam benzoat
dan kafein menggunakan spektrofotometer UV-Vis. maks (panjang gelombang
maksimal) yang diperoleh digunakan untuk analisis larutan standart dan sampel pada
instrument KCKT Shimadzu.
4. Optimasi Kondisi Analisis dengan KCKT
Larutan standart asam benzoat dan kafein masing-masing 20 ppm dalam pelarut
aquabides disuntikkan sebanyak 100 L ke dalam kolom secara bergantian
menggunakan fase gerak campuran matanol dan buffer asetat pH 4,4 dengan berbagai
komposisi yaitu 10:90; 20:80; 30:70; 40:60; 50:50; 60:40; 70:30; 80:20; 90:10. Panjang
gelombang yang digunakan untuk mendapat kondisi optimum adalah panjang
gelombang maksimum asam benzoat dan kafein yang diperoleh pada tahap sebelumnya.
Komposisi yang memberikan hasil pemisahan terbaik berdasarkan waktu retensi dan
bentuk puncak digunakan untuk pembuatan kurva kalibrasi dan analisis penetapan kadar
asam benzoat dan kafein pada masing-masing sampel.
5. Penetapan kadar asam benzoat dan kafein
Kondisi analisis terpilih digunakan untuk menganalisis 100 L sampel
disuntikkan ke dalam kolom dan diamati waktu retensi puncak-puncak yang dihasilkan
oleh sampel. Apabila puncak-puncak tersebut mempunyai waktu retensi yang kurang
lebih sama dengan waktu retensi puncak bahan baku pembanding asam benzoat dan
kafein, maka dapat disimpulkan bahwa pada sampel terdapat zat-zat tersebut.

Analisis Data
Kadar asam benzoat dan kafein ditentukan melalui persamaan garis yang
diperoleh dari kurva kalibrasi. Nilai luas area setiap sampel yang dianalisis
menggunakan KCKT disubstitusikan ke dalam persamaan garis, sehingga diperoleh
kadar asam benzoat dan kafein.

HASIL
1. Ekstraksi Asam Benzoat dan Kafein dalam Sampel Kopi
a. Ekstraksi Asam Benzoat
Fase organik hasil ekstraksi bertahap dikumpulkan dalam gelas kimia 250 mL
yang telah berisi air sebanyak 50 mL. Campuran air dan fase organik tersebut
selanjutnya didestilasi pada suhu 60C untuk menghilangkan kloroform, setelah
kloroform dalam campuran tersebut menguap seluruhnya destilasi dihentikan. Larutan
sisa destilasi didinginkan, setelah dingin dilakukan analisis menggunakan KCKT.
b. Ekstraksi Kafein
Fase organik hasil ekstraksi dimasukkan dalam gelas kimia 500 mL dan
ditambah dengan larutan NaOH 1% sampai warnanya memudar sekitar 50 mL,
kemudian ditambah air dengan volume yang sama dengan volume NaOH 1% yang
ditambahkan yaitu 50 mL, kemudian didestilasi untuk menghilangkan fase organik. Sisa
hasil destilasi tersebut didinginkan dan dianalisis menggunakan KCKT.
2. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Hasil dari pengukuran menggunakan spektrofotometer menunjukkan bahwa
asam benzoat terdeteksi pada panjang gelombang 222 nm dan kafein terdeteksi pada
panjang gelombang 272 nm. Panjang gelombang yang diperoleh selanjutnya digunakan
untuk analisis larutan standart dan sampel pada instrument KCKT Shimadzu.
3. Komposisi Fase Gerak pada Instrumen KCKT (Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi) Shimadzu
Data waktu retensi dan luas area komposisi fase gerak terpilih yang diperoleh
dari standart asam benzoat dan kafein disajikan pada Tabel 1 dan 2.

Tabel 1. Data Waktu Retensi dan Luas Area Komposisi Fase Gerak Terpilih Standart Asam
Benzoat 200 ppm pada 222 nm

Asam Benzoat
Variasi fase gerak
Waktu retensi (menit) Luas Area
50 : 50 5,452 17002267
60 : 40 4,130 17105220
Tabel 2. Data Waktu Retensi dan Luas Area Komposisi Fase Gerak Terpilih Standart Kafein 200
ppm pada 272 nm

Kafein
Variasi fase gerak
Waktu retensi (menit) Luas Area
50 : 50 3,955 13115831
60 : 40 3,457 13191438

4. Pembuatan Kurva Kalibrasi

Data hasil pengukuran larutan standart asam benzoat dan kafein untuk membuat
kurva kalibrasi disajikan pada Tabel 3 dan 4.

Tabel 3. Data Hasil Pengukuran Larutan Standart Asam Benzoat untuk Membuat Kurva Kalibrasi

Konsentrasi Luas Area Standart Asam Benzoat

(x) ppm 50 : 50 60 : 40
5 465512 384563
10 848356 816085
20 1509538 167319

Tabel 4. Data Hasil Pengukuran Larutan Standart Kafein untuk Membuat Kurva Kalibrasi

Konsentrasi Luas Area Standart Kafein

(x) ppm 50 : 50 60 : 40
5 393458 324281
10 703796 702109
20 1322745 1317473

Data yang dihasilkan selanjutnya digunakan untuk pembuatan kurva kalibrasi asam
benzoat dan kurva kalibrasi kafein, sehingga diperoleh persamaan garis regresi pada
masing-masing kondisi, persamaan regresi garis tersebut disajikan pada Tabel 5.

Tabel 5. Persamaan Garis Regresi untuk Asam Benzoat dan Kafein Berdasarkan Kurva Kalibrasi

Perbandingan Asam Benzoat (222 nm) Kafein (272 nm)

Fase gerak Persamaan Regresi r Persamaan Regresi r
50:50 y = 69104x + 13492 0,998 y = 61944x + 83984 1
60:40 y = 85961x - 44554 1 y = 65545x + 16599 0,997

5. Hasil Kadar Asam Benzoat dan Kafein dalam Sampel Kopi Kemasan
Sampel yang digunakan adalah dua macam kopi bubuk kemasan yang telah
mendapat perlakuan sehingga diperoleh ekstrak asam benzoat A dan B, serta ekstrak
kafein A dan B. Hasil analisis dengan KCKT adalah waktu retensi dan luas area. Data
luas area disubstitusikan ke persamaan garis regresi, selanjutnya dikalikan dengan
faktor pengenceran sehingga diperoleh konsentrasi asam benzoat dan kafein dalam
masing-masing sampel yang disajikan pada Tabel 6, 7, 8 dan 9.

Tabel 6. Data Konsentrasi Ekstrak Asam Benzoat dalam Sampel Kopi Kemasan A

Konsentrasi (ppm)
Variasi fase gerak
Persamaan Regresi Faktor Pengenceran
50:50 0,41 20,5
222
60:40 0, 7 35
Tabel 7. Data Konsentrasi Ekstrak Asam Benzoat dalam Sampel Kopi Kemasan B

Kadar Asam Benzoat (ppm)

Variasi fase gerak
Persamaan Regresi Faktor Pengenceran
50 : 50 222 0,24 12
60 : 40 0,83 41,5

Tabel 4.12 Data Konsentrasi Ekstrak Kafein dalam Sampel Kopi Kemasan A

Konsentrasi (ppm)
Variasi fase gerak
Persamaan Regresi Faktor Pengenceran
50;50 0,13 6,5
272
60:40 0,44 22

Tabel 4.13 Data Konsentrasi Ekstrak Kafein dalam Sampel Kopi Kemasan B

Kadar Kafein (ppm)

Variasi fase gerak
Persamaan Regresi Faktor Pengenceran
50;50 0,23 11,5
272
60:40 0,74 37

PEMBAHASAN
1. Ekstraksi Asam Benzoat dan Kafein dalam Sampel Kopi
a. Ekstraksi Asam Benzoat
Bubuk kopi yang akan diekstraksi dilarutkan terlebih dahulu dalam larutan NaCl
jenuh yang disertai dengan pengadukan secara konstan selama 2 jam dengan tujuan
menjenuhkan larutan sampel agar asam benzoat yang terkandung dalam sampel terikat
dalam larutan sebagai natrium benzoat. Larutan selanjutnya ditambah larutan HCl agar
sifat larutan yang semula basa menjadi netral dan mengubah natrium benzoat yang
terlarut dalam larutan kembali ke bentuk semula yaitu asam benzoat. Tahap ekstraksi
dilakukan secara bertahap menggunakan kloroform dengan tujuan hasil ekstraksi lebih
maksimal. Fase organik yang dihasilkan dari ekstraksi ditambahkan air untuk mencuci
fase organik tersebut, selanjutnya dilakukan destilasi pada suhu 30oC untuk
menghilangkan fase organik (kloroform) dari campuran sehingga hanya tersisa fase air.
Suhu destilasi merupakan setengah dari titik didih kloroform, hal tersebut dilakukan
agar penguapan terjadi secara perlahan sehingga kloroform terpisah dari fase air dengan
baik. Fase air inilah yang dianalisis menggunakan KCKT.
b. Ekstraksi Kafein
Ekstraksi kafein dilakukan dengan metode soxhlet dengan pelarut yang berfungsi
untuk melarutkan kafein yang terkandung dalam sampel. Kafein bersifat polar sehingga
digunakan pelarut polar juga yaitu metanol agar kafein yang terdapat dalam sampel
terlarut dalam pelarut tersebut. Ekstrak kopi hasil soxhlet ditambah dengan MgO dan air
kemudian diaduk konstan selama 10 menit agar pencampuran merata sehingga zat
selain kafein yang terkandung dalam ekstrak kopi tersebut berikatan dengan MgO,
sehingga diperoleh larutan berwarna coklat orange. Saat pencampuran selesai,
campuran disaring untuk memisahkan antara residu dan dan filtrat.
Residu hasil penyaringan dibilas menggunakan air sebelum dibuang, tujuannya
agar filtrat yang masih terdapat dalam residu tersebut ikut terbawa air dan bercampur
dengan filtrat hasil penyaringan yang awal. Filtrat yang terkumpul ditambah dengan
H2SO4 10% untuk membuat larutan menjadi bersifat asam karena larutan tersebut
bersifat basa akibat adanya Mg(OH)2 yang terbentuk dari pelarutan MgO dalam air pada
tahap sebelumnya, kemudian diuapkan sampai tersisa 1/3 dari volume awal untuk
menghilangkan kandungan air dan asam berlebih. Sisa larutan yang diuapkan kemudian
diekstraksi menggunakan kloroform sehingga akan diperoleh fase organik yang akan
mendapat perlakuan selanjutnya. Fase organik hasil ekstraksi ditambah dengan larutan
NaOH 1% sampai warnanya memudar dan ditambah air sebanyak volume NaOH 1%
yang ditambahkan, setelah itu larutan didestilasi pada suhu 30oC untuk
menghilangkan fase organik (kloroform) dari campuran sehingga hanya tersisa fase air.
Suhu destilasi merupakan setengah dari titik didih kloroform, hal tersebut dilakukan
agar penguapan terjadi secara perlahan sehingga kloroform terpisah dari fase air dengan
baik. Fase air inilah yang dianalisis menggunakan KCKT.

2. Komposisi Fase Gerak pada Penetapan Kadar Asam Benzoat dan Kafein
Menggunakan KCKT (Kromatografi Cair Kinerja Tinggi)
Berdasarkan hasil analisis larutan standar asam benzoat dan kafein menggunakan
beberapa perbandingan komposisi fase gerak diperoleh komposisi fase gerak yang baik
untuk analisis sampel kopi kemasan menggunakan KCKT. Komposisi fase gerak baik
yang dimaksud didasarkan pada waktu retensi, puncak yang terbentuk, dan luas area
yang dihasilkan untuk asam benzoat dan kafein sebagaimana telah dijelaskan
sebelumnya.
Komposisi fase gerak yang terpilih dari beberapa komposisi fase gerak yang
digunakan untuk analisis yaitu 50:50 dan 60:40 pada panjang gelombang 222 nm untuk
asam benzoat dan pada panjang gelombang 272 nm untuk kafein dengan waktu retensi
masing-masing sebagaimana terdapat pada Gambar 5.3 dan 5.4. Komposisi fase gerak
60:40 lebih polar dibandingkan dengan komposisi fase gerak 50:50, kepolaran tersebut
berpengaruh terhadap waktu retensi yang dihasilkan untuk asam benzoat dan kafein.
Waktu retensi saat analisis menggunakan komposisi fase gerak 60:40 lebih cepat
daripada menggunakan fase gerak 50:50. Kepolaran fase gerak berpengaruh juga
terhadap hasil pemisahan, senyawa polar yang dipisahkan akan lebih banyak terbawa
oleh komposisi fase gerak yang lebih polar.
Waktu retensi asam benzoat lebih lama daripada waktu retensi kafein
dikarenakan kafein lebih polar dibandingkan dengan asam benzoat sehingga asam
benzoat tertahan lebih lama di fase diam. Komposisi tersebut menghasilkan
kromatogram yang lebih baik untuk asam benzoat dan kafein dibandingkan dengan
komposisi fase gerak yang lain yang menghasilkan kromatogram baik untuk salah satu
senyawa saja. Komposisi fase gerak terpilih sesuai dengan penelitian yang telah
dilakukan oleh Techakriengkrai, I dan Surakarntul, R (2007) yang menggunakan
komposisi fase gerak 60:40, serta penelitian Saad, B dkk (2004) yang menggunakan
komposisi fase gerak 50:50. Kromatogram asam benzoat dan kafein pada komposisi
fase gerak 50:50 disajikan pada Gambar 1.

mV
/5.452

Detector A Ch2:222nm

500

250

-250
3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 m in
Gambar 1. Kromatogram Menggunakan Komposisi Fase Gerak 50:50 (a) Asam benzoat, (b) Kafein

Kromatogram asam benzoat dan kafein pada komposisi fase gerak 60:40 disajikan pada
Gambar 2.
mV
/4.130

Detector A Ch2:222nm
500

250

-250

3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 m in

Gambar 2. Kromatogram Menggunakan Komposisi Fase Gerak 60:40 (a) Asam benzoat, (b) Kafein

3. Analisis Kadar Asam Benzoat dan Kafein dalam Kopi Kemasan dengan KCKT
Berdasarkan kromatogram asam benzoat yang dianalisis menggunakan
komposisi fase gerak 50:50 diperoleh data luas area untuk sampel A adalah 42.047 dan
sampel B adalah 30.732, dari data tersebut dapat diketahui konsentrasi masing-masing
sampel dengan persamaan regresi asam benzoat pada komposisi fase gerak 50:50 yaitu
y = 69104x + 13492, maka diperoleh masing- masing konsentrasi untuk sampel A 0,41
ppm dan sampel B 0,24 ppm. Kromatogram asam benzoat yang dianalisis menggunakan
komposisi fase gerak 60:40 diperoleh data luas area untuk sampel A adalah 15.684 dan
sampel B adalah 26.915, dari data tersebut dapat diketahui konsentrasi masing-masing
sampel dengan persamaan regresi asam benzoat pada komposisi fase gerak 60:40 yaitu
y = 85961x - 44554, maka diperoleh masing-masing konsentrasi untuk sampel A 0,7
ppm dan sampel B 0,83 ppm.
Berdasarkan kromatogram kafein yang dianalisis menggunakan komposisi fase
gerak 50:50 diperoleh data luas area untuk sampel A adalah 92.181 dan sampel B
adalah 45.466, dari data tersebut dapat diketahui konsentrasi masing-masing sampel
dengan persamaan garis regresi asam benzoat pada komposisi fase gerak 50:50 yaitu y =
61944x + 83984, maka diperoleh masing-masing konsentrasi untuk sampel A 0,13 ppm
dan sampel B 0,44 ppm. Kromatogram kafein yang dianalisis menggunakan komposisi
fase gerak 60:40 diperoleh data luas area untuk sampel A adalah 98.680 dan sampel B
adalah 65.107, dari data tersebut dapat diketahui konsentrasi masing-masing sampel
dengan persamaan regresi kafein pada komposisi fase gerak 60:40 yaitu y = 65545x +
16599, maka diperoleh masing-masing konsentrasi untuk sampel A 0,16 ppm dan
sampel B 0,74 ppm.
Konsentrasi masing-masing sampel yang telah diperoleh melalui persamaan garis
selanjutnya dihitung berdasarkan banyaknya pengenceran yang dilakukan sebelum
sampel tersebut dianalisis menggunakan KCKT, hal tersebut bertujuan untuk
mengetahui konsentrasi asam benzoat dan kafein sebenarnya yang terkandung dalam 5
mL sampel yang telah diencerkan sebanyak 50 kali. Konsentrasi asam benzoat pada
analisis menggunakan komposisi fase gerak 50:50 adalah 20,5 ppm untuk sampel A dan
12 ppm untuk sampel B, sedangkan konsentrasi asam benzoat yang dianalisis
menggunakan komposisi fase gerak 60:40 adalah 35 ppm untuk sampel A dan 41,5 ppm
untuk sampel B. Konsentrasi kafein pada analisis menggunakan komposisi fase gerak
50:50 adalah 6,5 ppm untuk sampel A dan 22 ppm untuk sampel B, sedangkan
konsentrasi kafein yang dianalisis menggunakan komposisi fase gerak 60:40 adalah 22
ppm untuk sampel A dan 37 ppm untuk sampel B.

PENUTUP
Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan serta analisis data, maka diperoleh
kesimpulan sebagai berikut: (1) Fase gerak yang digunakan adalah campuran methanol
dan buffer asetat dengan perbandingan 50:50 dan 60:40. Komposisi fase gerak yang
memiliki tingkat kepolaran lebih tinggi mampu memisahkan asam benzoat dan kafein
lebih cepat, serta menghasilkan kadar asam benzoat dan kafein lebih banyak yaitu
komposisi fase gerak 60:40 (2) Kadar asam benzoat pada komposisi fase gerak 50:50
sampel A 20,5 ppm dan sampel B 12 ppm, untuk komposisi fase gerak 60:40 sampel A
35 ppm dan sampel B 41,5 ppm. Kadar kafein pada komposisi fase gerak 50:50 sampel
A 6,5 ppm dan sampel B 11,5 ppm, untuk komposisi fase gerak 60:40 sampel A 22 ppm
dan sampel B 37 ppm.

Saran
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan serta kesimpulan, maka didapatkan
saran-saran berikut sebagai bahan pertimbangan untuk penelitian selanjutnya: (1)
Penggunaan metode selain ekstraksi pelarut untuk pretreatment dapat digunakan dalam
penelitian selanjutnya (2) Fase gerak selain methanol dan buffer asetat pH 4 dapat
digunakan pada penelitian selanjutnya untuk analisis menggunakan KCKT, serta
sebagai perbandingan hasil yang diperoleh pada penelitian sebelumnya.

DAFTAR RUJUKAN
El-ziney, M. G. 2009. Analysis of Benzoat and Sorbate in Saudi Dairy and Food
Product with Estimation of Daily Exposure. Journal of Food Technology, 7 (4):
127-134.
Johnson, E., and Stenvenson, R. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Terjemahan dari
Basic Liquid Chromatography, oleh Padmawinata. Bandung: Penerbit ITB
Khopkar, S.M. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. Terjemahan Saptorahardjo. Jakarta:
Universitas Indonesia Press.
McDevitt, V. L. 1998. Analysis of Soft Drinks: UV Spectrophotometry,
Liquid Chromatography, and Capillary Electrophoresis. Journal of Chemical
Education, 75 (5): 625-629.
Peraturan Menteri Kesehatan Nomor 772 Tahun 1988 tentang Bahan Pengawet
Makanan. 1988. Jakarta: Menteri Kesehatan.
Ree, M & Stoa, E. 2011. Simultaneous Determination of Aspartame, Benzoaic Acid,
Caffeine, and Saccharine in Sugar-Free Beverages using HPLC. Concordia
College Journal of Analytical Chemistry, (1): 73-77.
Riyadi, W. 2009. Perbedaan Spektrometri dan Spektrofotometri, (Online),
(http://wahyuriyadi.blogspot.com/2008/10/perbedaan-spektrometri-dan.html),
diakses 30 Desember 2012.
Saad, B., Bari, Md. F., Saleh, M. I., Ahmad, K., & Talib, M. K. M. 2004. Simultaneous
Determination of Preservatives (Benzoic Acid, Sorbic Acid, Methylparaben and
Propylparaben) in Foodstuffs Using High-Performance Liquid Chromatography.
Journal of Chromatography. 1073: 393-397.
Techakriengkrai, I., & Surakarnkul, R. 2007. Analysis of Benzoic Acid and Sorbic Acid
in Thai Rice Wines and Distillates by Solid-Extraction and High Performance
Liquid Chromatography. Journal of Food Composition and Analysis. 20: 220-
225.