EJERCICIO DE CINTICA ENZIMTICA

Cintica de la enzima GST

Para el ensayo se utiliz a una concentracin de 20 ug/ml de enzima (se

prepar en buffer de actividad)
Mezcla de reaccin:Volumen total 1 ml. Se usaron 50 ul de enzima en el
ensayo, 100 ul de GSH, 100 ul de CDNB y 750 ul de buffer fosfato de sodio
pH 6.5 (buffer de actividad)
Se midi la absorbacia a 340 nm por 3 min
Se utiliz el sustrato GSH a una concentracin de 4 mM en todas las
mediciones. Se vari la concentracin del sustrato CDNB.
El coeficiente de extincin molar de la enzima es 9.6 mM cm-1

Las concentraciones de CNDB proporcionadas se muestran en la siguiente tabla.

Concentracin de CDNB
Tiempo 0.2 mM 0.4 mM 0.8 mM 1.6 mM 2.0 mM
min
0.000937 0.030680 0.037489 0.054502 0.113919 0.099777
5 85 34 41 76 27
0.167604 0.045625 0.059895 0.084813 0.155574 0.136538
19 23 78 18 23 91
0.334270 0.057814 0.082017 0.113063 0.185705 0.169252
83 67 78 08 16 61
0.500937 0.070312 0.101650 0.140523 0.225776 0.201851
53 84 72 55 07 63
0.667604 0.082839 0.120846 0.164296 0.253062 0.235712
19 6 01 26 51 25
0.834270 0.094981 0.138955 0.191099 0.287368 0.265979
86 74 49 38 72 43
1.000937 0.106260 0.156283 0.213088 0.312143 0.292240
53 44 47 45 95 1
1.167604 0.115588 0.173338 0.236300 0.341982 0.324186
19 85 29 89 77 15
1.334270 0.125584 0.190109 0.260462 0.364203 0.349977
86 08 15 63 53 61
1.500937 0.134613 0.207238 0.282195 0.392643 0.377459
53 1 41 64 45 51
1.667604 0.144346 0.221173 0.298833 0.421844 0.400235
19 9 26 71 95 91
1.834270 0.154647 0.235648 0.318874 0.442553 0.425661
86 78 1 4 57 44
2.000937 0.163165 0.247737 0.336906 0.470366 0.455472
53 61 33 31 63 29
2.167604 0.171366 0.265390 0.355092 0.491310 0.475738
07 7 2 87 03 6
2.334270 0.179772 0.277227 0.374849 0.509287 0.494608
73 13 14 34 62 96
2.500937 0.188622 0.291228 0.389426 0.531022 0.514492
4 69 51 85 98 02
2.667604 0.197568 0.302762 0.406291 0.552353 0.538607
07 46 43 25 98 09
2.834270 0.204187 0.317092 0.423502 0.571459 0.552917
73 67 24 84 43 56
3.000937 0.211510 0.328222 0.439285 0.592857 0.579157
4 05 12 44 19 36

El primer clculo realizado fue la conversin de las absorbancias a

concentraciones de producto, mediante la frmula E*1*[C]. Los datos obtenidos se
muestran en la siguiente tabla.

Concentracin de CDNB
Tiempo 0.2 mM 0.4 mM 0.8 mM 1.6 mM 2.0 mM
min
0.00093 0.00319 0.00390 0.00567 0.01186 0.01039
75 592 514 733 664 347
0.16760 0.00475 0.00623 0.00883 0.01620 0.01422
419 263 914 471 565 28
0.33427 0.00602 0.00854 0.01177 0.01934 0.01763
083 236 352 74 429 048
0.50093 0.00732 0.01058 0.01463 0.02351 0.02102
753 425 862 787 834 621
0.66760 0.00862 0.01258 0.01711 0.02636 0.02455
419 913 813 419 068 336
0.83427 0.00989 0.01447 0.01990 0.02993 0.02770
086 393 453 619 424 619
1.00093 0.01106 0.01627 0.02219 0.03251 0.03044
753 88 953 671 499 168
1.16760 0.01204 0.01805 0.02461 0.03562 0.03376
419 051 607 468 321 939
 1.33427 0.01308 0.01980 0.02713 0.03793 0.03645
086 167 304 152 787 6
1.50093 0.01402 0.02158 0.02939 0.04090 0.03931
753 22 733 538 036 87
1.66760 0.01503 0.02303 0.03112 0.04394 0.04169
419 614 888 851 218 124
1.83427 0.01610 0.02454 0.03321 0.04609 0.04433
086 914 668 608 933 973
2.00093 0.01699 0.02580 0.03509 0.04899 0.04744
753 642 597 441 652 503
2.16760 0.01785 0.02764 0.03698 0.05117 0.04955
407 07 481 884 813 61
2.33427 0.01872 0.02887 0.03904 0.05305 0.05152
073 626 783 681 079 177
2.50093 0.01964 0.03033 0.04056 0.05531 0.05359
74 82 63 53 489 292
2.66760 0.02058 0.03153 0.04232 0.05753 0.05610
407 005 775 201 687 491
2.83427 0.02126 0.03303 0.04411 0.05952 0.05759
073 955 044 488 702 558
3.00093 0.02203 0.03418 0.04575 0.06175 0.06032
74 23 98 89 596 889

A partir de las concentraciones de producto elabor una grfica de la cintica de la

enzima GST
 Cintica de la enzima GST
0.07

f(x) = 0.02x + 0.02

0.06 f(x) = 0.02x + 0.01
R = 0.99
R = 0.99
0.2 mM
0.05 Linear (0.2
f(x) = 0.01x + 0.01 0.4 mM
R = 0.99 Linear (0.4
0.04
0.8 mM
Concentracin de CDNB f(x) = 0.01x + 0.01 Linear (0.8
0.03 R = 0.99 1.6 mM
Linear (1.6

0.02 f(x) = 0.01x + 0 2.0 mM

R = 0.99 Linear (2.0

0.01

0
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5

Tiempo

Posteriormente elabor una tabla, utilizando las concentraciones de CDNB y las

concentraciones de producto que se obtuvieron del grfico anterior.

Concentraci (Velocidad m)
n de CNDB Pendientes
0.2 0.0062
0.4 0.01
0.8 0.0132
1.6 0.0163
2 0.0164
A continuacin obtuve las inversas, para la concentracin utilizando la frmula
1/concentracin de CNDB y para la inversa de pendiente 1/velocidad m. Los
resultados se muestran en la siguiente tabla.

Inversa de Inversa de
concentracin pendiente
5 161.2903226
2.5 100
1.25 75.75757576
0.625 61.34969325
0.5 60.97560976

Estos datos los utilic para obtener la grfica de Lineweaver-Burk que se muestra
a continuacin, con lo cual obtuve los datos de m y b para poder despejar la
frmula 1/V=Km/Vmax(1/[S])+1/Vmax (y=mx+b).

Grfica de Lineweaver-Burk
180
160
f(x) = 22.42x + 47.6
140
R = 1
120
100 Inversa de pendiente
V. inicial Linear (Inversa de
80
pendiente)
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5 6

Concentracin de sustrato
Al despejar la frmula, los datos obtenidos fueron:

V.max=1/b

V.max= 1/47.60= 0.0210

Km=m*V.max

Km=22.41*0.0210=0.4706