LAPORAN RESMI KIMIA ANALITIK IB

ACARA 3

SPEKTROFOTOMETRI UV VIS Derivatisasi Analit

Oleh:

Cicilia Putri Septiyarini 652015001

Yabez Yada Elroi S. 652015018

Achmad Yoga Chunaifi 652015025

Program Studi Kimia

FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA

UNIVERSITAS KRISTEN SATYA WACANA

SALATIGA
Nama/ Nim : Cicilia Putri Septiyarini /652015001

Yabez Yada Elroi S. /652015018

Ahmad Yoga Chunaifi/652015025

Judul : SPEKTROFOTOMETRI UV VIS Derivatisasi Analit

Pendahuluan

Derivatisasi penting untuk zat yang tidak memiliki gugus kromofor.Derivatisasi

merupakan reaksi suatu senyawa yang bersangkutan.Tujuan derivatisasi yaitu menghasilkan
senyawa yang tadinya tidak bisa dideteksi menjadi bisa dideteksi (senyawa non-kromofor
senyawa berkromofor).Suatu reaksi harus mempunyai syarat-syarat, yaitu produk yang
dihasilkan harus menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak sehingga dapat dianalisis
dengan Spektroskopis Visibel.
Salah satu contohnya ialah pengukuran protein terlarut menggunakan metode
biuret.Metode biuret didasarkan pada kompleksasi Cu2+ dengan gugus fungsional dalam
ikatan peptida pada protein.Pembentukkan kompleks Cu2+-protein membutuhkan dua ikatan
peptida dan menghasilkan produk kelat berwarna violet yang diukur dengan spektrofotometer
pada daerah tampak.Tanpa penambahan kompleks Cu2+, protein tidak dapat terukur pada
spektrofotometer.
Faktor-faktor yang mempengaruhi derivatisasi diantaranya: 1) rasio analit dengan agen
penderivat, 2) kondisi lingkungan, misalnya suhu, pH, dll 3) sifat fisika kimia. Pada
percobaan ini dilakukan derivatisasi metode biuret dengan variasi waktu dan fraksi mol.
Spektofotometer ada dua jenis, yaitu spektofotometer Ultra Violet dan
spektofotometer visible. Spektofotometer UV panjang gelombangnya antara 180-350 nm,
sedangkan spektofotometer visible panjang gelombangnya antara 350-800 nm.
Spektofotometer UV/vis menggunakan sinar tampak (Hart 2003). Pada praktikum ini
digunakan spektofotometer UV/vis.
Dalam suatu campuran, pengukuran konsentrasi dalam suatu sampel (analyte) dapat
dilihat dalam campuran sehingga dapat membuat pengerjaan ini menjadi lebih mudah atau
lebih akurat. Tetapi yang sering menjadi kendala yaitu spektra derivatif tidak dapat
mengurangi atau menghindarkan adanya gangguan dari rasio serapan pengganggu yang lain
(signal-to-noise ratio ).Untuk suatu larutan yang mengandung dua komponen yang
menyerap, x dan y, serapan/absorbansi (A) diukur pada dua panjang gelombang.Ketelitian
yang tinggi didapatkan dengan memilih panjang gelombang yang serapannya maksimal
karena dengan pergeseran sedikit pada kurva serapan tidak menyebabkan perubahan
absorbansi yang terlampau jauh.Pada metode spektrofotometri derivatif, jumlah komponen
dalam campuran dapat mencapai 8 komponen dengan syarat selisih panjang gelombang
maksimum antara komponen minimal 5 nm (Fatah, 2008).
Spektrofotometri adalah suatu metode analisis yang berdasarkan pada pengukuran
serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombang yang
spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dan detector vacuum
phototube atau tabung foton hampa. Alat yang digunakan adalah spektrofotometer, yaitu sutu
alat yang digunakan untuk menentukan suatu senyawa baik secara kuantitatif maupun
kualitatif dengan mengukur transmitan ataupun absorban dari suatu cuplikan sebagai fungsi
dari konsentrasi. Spektrometer menghasilkan sinar dari spectrum dengan panjang gelombang
tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau
diabsorbsi ,(Harjadi, 1990).
Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai
fungsi panjang gelombang.Sedangkan pengukuran menggunakan spektrofotometer ini,
metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri, (Basset, 1994).
Metode spektrofotometri derivatif telah diaplikasikan secara luas di dalam kimia analisis
kuantitatif, analisis lingkungan, farmasetik, klinik, forensik, biomedik, dan industri. Metode
ini merupakan metode manipulatif terhadap spektra pada spektrofotometri UV-VIS dan
merupakan salah satu analisis multi komponen yang dapat dilakukan apabila:
1. Hasil preparasi sampel tidak memungkinkan mendapatkan senyawa tunggal
2. Tidak diinginkan pemisahan dalam preparasi sampel
3. Spektrum zat tersebut mungkin tersembunyi dalam suatu bentuk spektrum besar yang
saling tumpang tindih dengan mengabaikan proses pemisahan zat yang bertingkat-
tingkat.
4. Senyawa yang akan ditentukan kadarnya memiliki absorbansi rendah dan memiliki
pengaruh dapat meningkatkan nilai absorbansi
Spektrometri UV-Vis adalah salah satu metoda analisis yang berdasarkan pada
penurunan intensitas cahaya yang diserap oleh suatu media.Berdasarkan penurunan intensitas
cahaya yang diserap oleh suatu media tergantung pada tebal tipisnya media dan konsentrasi
warna spesies yang ada pada media tersebut.Spektrometri visible umumnya disebut kalori,
oleh karena itu pembentukan warna pada metoda ini sangat menentukan ketelitian hasil yang
diperoleh. Pembentukan warna dilakukan dengan cara penambahan pengompleks yang
selektif terhadap unsur yang ditentukan, (Fatimah, 2005).
Spektrofotometri menyiratkan pengukuran jauhnya penyerapan energi cahaya oleh
suatu sistem kimia itu sebagai suatu fungsi dari panjang gelombang radiasi, demikian pula
pengukuran penyerapan yang menyendiri pada suatu panjang gelombang tertentu ,
(Underwood, 1986).

Tujuan :

1. Menentukan panjang gelombang maksimum(max)dan Absorbansi dari BSA , Biuret

dan campuran BSA+Biuret menggunkan spektrofotometri UV/VIS,

2. Menentukan pengaruh waktu pemanasan terhadap besaran nilai absorbansi dan,

3. Menentukan pengaruh fraksi mol terhadap absorbansi.

Metode :

Alat bahan yang dibutuhkan:

Neraca analitik Kuvet

Spektrofotometer
Labu ukur Aquades
Pipet volume CuSO4.5H2O
Pilius KNaC4H4O6
Tabung reaksi NaOH
Waterbath BSA
a. Pembuatan perekasi biuret

1. Ditimbang tembaga (II) sulfat sebanyak 0,15 gram dan Kna tartrat 0,6 gram dan
dilarutkan dalam 50 ml aquades

2. Ditambahkan 30 ml NaOH 10% dan digenapkan dengan aquades hingga 100 ml

3. Dihomogenkan.

b. Pembuatan larutan BSA

1. Ditimbang 5 milligram BSA , dilarutkan dalam 12,8 ml akuades

2. Dihomogenkan

c. Penentuan panjang gelombang maksimum

1. Dimasukan pereaksi biuret kedalam kuvet

2. Dilakukan scanning untuk mengukur ABS larutan pada panjang gelombang 400-
800 nm

3. Diulangi percobaan dengan menggunkan larutan BSA dan campuran Biuret:BSA

(1:1) pada panjang gelombang 400-800 nm

4. Ditentukan pergeseran panjang gelombang dan panjang gelombang maximum

d. Variasi waktu

1. Dibuat campuran biuret dan induk BSA (1:1) (v/v) yang akan digunakan untuk
penentuan waktu optimum

2. Larutan divortex

3. Dipanaskan larutan pada suhu 370C selama 10 menit

4. Larutan didinginkan hingga suhu ruang dan dibaca absorbansnya pada panjang
gelombang 605nm

5. Blanko yang digunakan terdiri atas 3ml pereaksi biuret dan 1ml akuades
 6. Diulangi percobaan dengan waktu pemanasan 20 menit ; 30 menit dan pada suhu
ruang dengan waktu inkubasi 30 menit

7. Absorbansi juga diukur pada t=0

8. Ditentukan pengaruh waktu terhadap absorbansi dan waktu optimum untuk

digunakan pada percobaan seanjutnya

e. Variasi waktu mol

1. Diukur absorbansi campuran pereaksi biuret dan BSA (1:1) (1:2) (1:4) (v/v) pada
panjang gelombang 605nm dengan waktu optimum 10 menit

2. Ditentukan pengaruh fraksi mol terhadap absorbansi

3. Dihitung fraksi mol Cu:Albumim (1:1) (1:2) (1:4)

Hasil:

Tabel 1 (Penentuan panjang gelombang maximum( max))

sampel ABS

biuret 650 0,225

BSA 400 0,081

Biuret : BSA 605 0,169

 Tabel 2 (Variasi waktu (biuret:BSA)(1:1))

W
ak
tu
(
m m
en a % A
it) x

6
0 6 0,
0 5

6
0 8 0,
10 5

6
0 9 0,
20 5

6
0 9 0,
30 5

In
ku
ba
si
30
m 6
en 0 0,
it 5

Bl 6
an 0 9 0,
ko 5


Tabel 3 (Variasi fraksi mol)

Bi
ur
et:
B m
S a % A
A x

6
1: 0 8 0,
1 5

6
1: 0 8 0,
2 5

6
1: 0 8 0,
4 5

Bl 6
an 0 9 0,
ko 5

 Perhitungan Fraksi mol Cu: n BSA (berbagai perbandinan)

0,15Gram 4
=6 10 mol
Mol CuSO4.5H2O = 249,5

molCuSO 4.5 H 2O
Mol Cu = volumetotalbiuret

Fraksi mol Cu: n BSA 1:1

6 104 mol
nCu= =0,0002
3 ml

n Cu : n BSA

0,0002:0,0002

1:1

Fraksi mol Cu : n BSA 1:2

4
6 10 mol
nCu= =0,0002
3 ml

n Cu : n BSA

0,0002:0,0004

1:2

Fraksi mol Cu : n BSA 1:4

 4
6 10 mol
nCu= =0,0003
2 ml

n Cu : n BSA

0,0003 : 0,0012

1:4

Pembahasan

Pada praktikum kali ini bertujuan untuk memahami kerja alat spektrofotometer
ultraviolet- visible untuk mengetahui panjang gelombang Biuret, BSA dan
campuran keduanya, mengetahui pengaruh waktu terhadap absorbansi yang di
hasilkan dan pengaruh fraksi mol terhadap absorbansi.

Reagen Biuret biasanya digunakan untuk menentukan kadar protein dalam sampel
yang sering disebut Metode Biuret . Reagen Biuret ini dibuat dengan cara mereaksikan
CuSO4.5H2O dengan Natrium Kalium Tartrat dan NaOH. Biasanya Pada percobaan ,
digunakan larutan standar Bovine Serum Albumine (BSA) karena BSA mengandung asam
amino yang sangat kompleks sehingga dapat diketahui kadar protein yang terkandung di
dalamnya dengan mudah menggunakan metode biuret. Tetapi pada percobaan kali ini hanya
dilakukan derivatisasi metode biuret dengan variasi waktu dan fraksi mol.

Pada penentuan panjang gelombang maksimum menggunkan pereaksi Biuret

dengan spektrofotometri Uv-Vis dihasilkan panjang gelombang maksimum
650nm dengan absorbansi 0,225. Untuk panjang gelombang BSA didapat 400nm
dengan absorbansi 0,081 dan terahkir adalah pengukuran panjang gelombang pada
campuran Biuret + BSA dengan perbandingan 1:1 adalah 605nm dengan
absorbansi 0,169.(scan kurva panjang gelombang max terdapat pada lampiran)
Panjang gelombang campuran Biuret+BSA (1:1) dijadikan sebagai panjang
gelombang maksimum untuk percobaan selanjutnya yaitu untuk penentuan
pengaruh waktu terhadap absorbansi dan pengaruh fraksi mol terhadap absorbansi.
 Pada penentuan waktu terhadap absorbansi, hasil yang diperoleh semakin lama
waktu pemanasan maka hasil absorbansi semakin kecil dan transmittan semakin
besar (tabel 2). Hubungan absorbansi dengan transmittan adalah berbalik. Pada
waktu 0 menit(tanpa pemanasan) hasil absorbansi yang dihasilkan tinggi tetapi
saat ada perlakuan pemanasan absorbansi yang di dapatkan semakin menurun.
Pengaruh lama pemanasan pada larutan campuran Biuret+BSA ada 3
kemungkinan, yang pertama adalah semakin lama pemanasan maka akan
memudarkan intesitas warna larutan, sehingga warna yang diserap pada
spektrofotometri menghasilkan absorbansi yang kecil. Penurunan absorbansi
secara kualitatif menyatakan penurunan intensitas warna.Kedua adalah
konsentrasi larutan menurun. Konsentrasi berbanding lurus dengan absorbansi
menurut hukum lambertberr yaitu :

Yang ketiga adalah larutan standar Bovine Serum Albumine (BSA) yang sering
digunakan untuk uji biuret , mengandung asam amino (protein) kompleks,
mengalami denaturasi saat adanya perlakuan pemanasan, sehingga absorbansi
semakin rendah dengan semakin lama perlakuan pemanasan.

Dilakukan juga inkubasi larutan campuran BSA+ BIURET pada suhu ruang
selama 30menit, hal ini bertujuan untuk untuk proses penjagaan dan pemeliharaan
 larutan dengan kondisi tertentu agar larutan tetap terjaga. Setelah inkubasi
absorbansi larutan konstan 0,169. Hal ini karena larutan tidak terkontaminasi.

Waktu yang optimal adalah pada waktu pemanasan 10 menit yang menghasilkan
absorbansi yang tinggi. Penentuan waktu ini digunakan untuk percobaan
selanjutnya yaitu pengaruh fraksi mol terhadap absorbansi.

Penentuan fraksi mol (tabel 3) terhadap absorbansi dilakukan dengan berbagai

macam variasi perbandingan volume biuret:BSA dengan waktu pemanasan selama
10 menit(waktu optimum,menghasilkan absorbansi yang tinggi) panjang
gelombang yang digunakan tetap sama yaitu 605 nm. Hasil yang didapat adalah
semakin banyak larutan BSA yang dilarutkan dalam biuret, maka semakin tinggi
absorbansi yang diperoleh. Penentuan fraksi mol perbandingan mol Cu: mol BSA
hanya untuk mengetahui apakah perbandingan yang dibuat saat praktik sudah
sesuai dengan perhitungan.

Kesimpulan

1. Panjang gelombang max pereaksi Biuret adalah 650 nm.

Panjang gelombang max larutan BSA adalah 400 nm.

Panjang gelombang max Biuret+BSA (1:1) adalah 605 nm.

2. Pengaruh waktu pemanasan terhadap absorbansi yaitu semakin lama waktu

pemanasan, maka nilai absorbansi yang dihasilkan semakin rendah. Sedangkan
semakin sedikit waktu pemanasan yang dilakukan, maka nilai absorbansi yang
dihasilkan semakin tinggi.

3. Semakin banyak BSA yang dilarutkan dalam Biuret maka absorbansi yang didapat
semakin tinggi.

 Daftar pustaka

Basset, J. 1994. Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik. Jakarta: EGC

Chadijah, Sitti. 2012. Dasar-dasar Kimia Analitik. Makassar: UIN Press.

Dekstrometorfan Hidrobromida Dalam Tablet Obat Batuk. Jakarta: UGM

El-Sayed AA, El-salem NA. Recent development of derivative spektrophotometryand

their analytical applications. Anal Sci(2005)

Fatah, A.M. 2008. Pemanfaatan Spektrofotometri Derivatif Untuk Penetapan

Kadar

Hamdani,syarif dkk, 2012, Panduan Praktikum Kimia Analisis STFI,

STFI,Bandung.

Harjadi. 1990. Ilmu Kimia Analitik Dasar. Jakarta: PT. Gramedia.

Irfan, Anshory.2000. Ilmu Kimia. Erlangga : Jakarta

Khopkar. 1990. Konsep Dasar Kimia Analitik. UI Press. Jakarta.

Khopkar, S. M. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: Universitas Indonesia.

Nugroho, Rachmad. 2008. Diktat Analisis Kualitatif. Malang: FMIPA UM

Skujins S, Varian AG. Apliaction of UVViaible Derivative Spektrophotometry.

1986.http://www.varianinc.com/media/sci/aps/uv31.pdf.
Underwood, A. L. 1990. Analisis Kimia Kiantitatif Edisi ke Enam. Jakarta: Erlangga.

 Lampiran

1. Scan Kurva panjang gelombang Biuret

2. Scan kurva panjang gelombang max BSA

3. Scan kurva panjang gelombang max campuran Biuret+BSA (1:1)