METODOS DE MICROBILOGIA DE LECHE Y ALIMENTOS

recuento de hongos-levaduras

En la actualidad, los mtodos recomendados para el recuento total de hongos filamentosos y

levaduras son los clsicos mtodos de recuento en placa a partir de diluciones decimales
seriadas de la muestra. Es posible realizar un recuento simultaneo de de hongos filamentosos y
levaduras ya que, dada la naturaleza filamentosa de los hongos ambos forman colonias
diferentes.

Se han decrito muchos medios de cultivo para dicho recuento, pero ninguno de ellos permite el
recuento de todos los de hongos filamentosos y levaduras ni en todos los alimentos. La norma
ISO 21527 recomienda el uso del agar Diclorn Rosa de Bengala con Cloranfenicol
(DRBC; Dichloran-Rose Bengal Chloramphenicol agar) en muestras de alimentos con una
actividad de agua alta y el Diclorn 18% Glicerol (DG18; Dichloran 18% Glycerol agar) en las
que tengan una actividad de agua inferior o igual a 0,95
FUNDAMENTO El mtodo se basa en inocular una cantidad conocida de muestra, en un
medio de cultivo selectivo especfico, aprovechando la capacidad de este grupo microbiano
de utilizar como nutrientes a los polisacridos que contiene el medio. La hidrlisis de estos
compuestos se efecta por enzimas que poseen estos microorganismos. La sobrevivencia de
los hongos y levaduras a pH cidos se pone de manifiesto al inocularlos en el medio de
cultivo acidificado a un pH de 3.5. As mismo, la acidificacin permite la eliminacin de la
mayora de las bacterias. Finalmente, las condiciones de aerobiosis y la incubacin a una
temperatura de 25 1 C da como resultado el crecimiento de colonias caractersticas para
este tipo de microorganismos.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad,

conteniendo 90.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 agua peptonada al
0.1%, estril a . 3 tubos de 16 x 150 mm, conteniendo 9.0 mL de solucin amortiguadora
de fosfatos de pH 7.2 agua peptonada al 0.1%, estriles con tapn de algodn a . 4 tubos
22 x 175 mm con 20.0 mL de agar papa dextrosaa . 4 tubos 22 x 175 mm con 20.0 mL de
agar extracto de malta a .

SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES

Solucin colorante de lactofenol azul de algodn b

. Colorantes para tincin de Gram b .

Solucin estril de cido tartrico al 10.0 % a . MATERIAL Y EQUIPO

Vaso de licuadora estril o bolsa para Stomachera .

Motor para licuadora o Stomachera .

Pipetas graduadas estriles de 1 mL con tapn de algodn a .Pipetas graduadas estriles

de 10 mL con tapn de algodn a .

Pipetas Pasteur estriles a, b

Propipetaa, b

Cajas de Petri estriles (una se utiliza para pesar la muestra) a .

Utensilios estriles para la manipulacin de muestras: cuchillos, cucharas, tenedores, etc.

A

Incubadora con termostato que pueda ser mantenido a 251C a .

 Bao de agua con control de temperatura y circulacin mecnica mantenida a 451C a

. Portaobjetos, cubreobjetos, diurex b .

Microscopio ptico b . Asa bacteriolgica y asa micolgicab .

Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y
lente amplificador

PROCEDIMIENTO

1. Pesar 10.0 g de muestra en una caja Petri estril y pasarla a un matraz

Erlenmeyer que contenga 90.0 mL de una solucin amortiguadora de fosfatos
de pH 7.2 agua peptonada al 0.1%.

2. Homogeneizar la muestra con la solucin anterior en un vaso de licuadora

estril o pasarla a una bolsa de Stomacher y homogeneizar durante 10.0 seg
en el caso de la licuadora a velocidad mnima, 30.0 seg en el Stomacher a
una velocidad normal. Esta es la dilucin primaria.
3. De la suspensin o solucin anterior, tomar 1.0 mL y transferirlo a un tubo
de ensayo que contenga 9.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos de pH
7.2, agitar y repetir esta operacin tantas veces como diluciones sean
necesarias. Se debe utilizar una pipeta estril para cada dilucin.

Mtodo de analis de Staphylococcus

FUNDAMENTO La presente tcnica para la deteccin de Staphylococcus aureus,
consiste en los siguientes pasos:

1. Aislamiento selectivo, se utiliza un medio selectivo slido, el cual inhibe el

desarrollo de gneros diferentes al Staphylococcus, pero adems permite
reconocer el desarrollo caracterstico del microorganismo buscado.

2. Recuperacin de la cepa, este paso permite restaurar las clulas daadas de

Staphylococcus aureus.

3. Identificacin bioqumica, en este punto se identifica el gnero y especie de

Staphylococcus aureus enterotoxignico.

Estas pruebas bioqumicas (de acuerdo a la Norma Oficial) son: presencia de la

enzima coagulasa y presencia de la enzima termonucleasa. La caracterizacin
bioqumica de Staphylococcus aureus toxignico en estas pruebas es la
siguiente:

Presencia de coagulasa positiva

Presencia de termonucleasa positiva

La determinacin del Staphylococcus aureus mediante extensin del inculo en

superficie, es adecuado para el anlisis de alimentos en los que se espere
encontrar ms de 100 clulas de Staphylococcus aureus/g 10 clulas de
Staphylococcus aureus/ mL de alimento. El aspecto cuantitativo en la
investigacin de Staphylococcus aureus es de suma importancia, no slo desde
el punto de vista econmico, sino en el de salud pblica; la Norma establece un
lmite mximo de 106 UFC/g de alimento para que ste pueda ser consumido.
Desde este punto de vista y de acuerdo con la tcnica mencionada, la
sensibilidad mnima de deteccin en el recuento en placa, utilizando el mtodo
de extensin de superficie es de: 100 UFC/g de alimento para muestras slidas
10 UFC/mL para alimentos lquidos.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

4 cajas de Petri con 20.0 mL de agar Baird Parker a .

7 tubos de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo infusin cerebro corazn (BHI) b .

1 caja de Petri con 20.0 mL de agar DNA c .

7 tubos de 13 x 100 mm con 3.0 mL cada uno de caldo manitol c .

(opcional) 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad conteniendo 90.0 mL

de agua peptonada al 0.1% o una solucin amortiguadora de fosfatos 0.1 M de
pH 7.2 a .

3 tubos 16 x 150 mm conteniendo 9.0 mL de agua peptonada al 0.1% o una

solucin amortiguadora de fosfatos 0.1 M de pH 7.2 a .

SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES

Colorantes para Tincin de Gram b

Parafina o aceite mineral estrilc (slo si se siembra en caldo manitol)

Colorante azul de orto-toluidina 0.1M, (solamente que el medio de cultivo no

contenga este indicador) d .

HCl 1N, en caso de no contar con la orto toluidina d

MATERIAL Y EQUIPO

Pipetas graduadas estriles de 1 mL con tapn de algodn a, c. (se debe

utilizar una pipeta para cada dilucin)

Pipetas Pasteur estriles a, b. c. d .

Pipetas graduadas estriles de 10 mL con tapn de algodn. a. (en caso que la

muestra sea lquida.

Propipeta. a, b, c, d

Varillas de vidrio de 3.5 mm de dimetro aproximadamente y 20 cm. de largo,

dobladas en ngulo recto (forma de L), estriles (se debe utilizar una por
dilucin). a

Utensilios estriles para manipular las muestras: cuchillos, cucharas, pinzas,

tijeras, esptulas y separador de huevo. A

Vaso de licuadora estril o Bolsa para Stomacher a . Motor para licuadora o

Stomacher a . Asa bacteriolgicab .

Portaobjetosb .

Microscopio ptico b

. Balanza granataria a .
 Horno para esterilizar material de vidrio. Autoclave Bao de agua a ebullicind
Incubadora a 35 2Cd

Autoclave

Bao de agua a ebullicind

Incubadora a 35 2Cd

A. MICROORGANISMOS AEROBIOS MESFILOS

El anlisis de los alimentos y piensos para determinar la existencia, tipo
y nmero de microorganismos es bsico para la microbiologa de
alimentos. Sin embargo ninguno de los mtodos utilizados
habitualmente permite determinar el nmero exacto de
microorganismos que existe en un determinado alimento. Son cuatro los
mtodos bsicos utilizados para investigar el nmero total de
microorganismos:
1.- Recuento en placa (SPC) para la determinacin del nmero de clulas
viables
2.- Mtodo del nmero ms probable (NMP) de grmenes como clculo
estadstico del nmero de clulas viables
3.- Tcnicas de reduccin de colorantes para el clculo del nmero de
clulas viables con capacidad reductora
4.- Recuento microscpico directo (DMC) tanto para clulas viables como
para las no viables El recuento en placa es el mtodo ms utilizado para
la determinacin del nmero de clulas viables o unidades formadoras
de colonias (u.f.c.) en un alimento.
Los recuentos totales deben hacerse en funcin de uno de los siguientes
factores:
- mtodo de muestreo utilizado
- distribucin de los microorganismos en la muestra
- naturaleza de la microflora del alimento
- naturaleza del alimento - antecedentes del alimento
- adecuacin nutricional del medio de cultivo
- temperatura y medio de incubacin
- pH, aw, potencial de oxidacin reduccin del medio
- tipo de diluyente utilizado
- nmero relativo de microorganismos en la muestra Los recuentos de
microorganismos viables se basan en el nmero de colonias que se
desarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida
de alimento e incubadas en unas condiciones ambientales determinadas.
Estos recuentos no pueden considerarse como recuentos totales ya que
solo son susceptibles del contaje aquellos microorganismos capaces de
crecer en las condiciones establecidas. Se puede conseguir una amplia
gama de condiciones variando la temperatura, la atmsfera, la
composicin del medio y el tiempo de incubacin. El intervalo de
temperaturas en el que crecen los microorganismos es muy amplio: de
34 C a > 90 C. En funcin de esto se encuadra a los microorganismos
en tres grupos:
a) los que crecen bien a 7 C o por debajo de esta temperatura cuya
temperatura: psicrtofos

b) los que crecen entre 20 30 C, con una temperatura ptima de

crecimiento est entre 30 40 C: mesfilos

c) los que crecen por encima de los 45 C: termfilos

Recuento de aerobios mesfilos

En este grupo se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras
capaces de desarrollarse a 30 C en las condiciones establecidas. En
este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de
microorganismos. Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las
condiciones de manipulacin, las condiciones higinicas de la materia
prima. Un recuento bajo de aerobios mesfilos no implica o no asegura
la ausencia de patgenos o sus toxinas, de la misma manera un
recuento elevado no significa presencia de flora patgena. Ahora bien,
salvo en alimentos obtenidos por fermentacin, no son recomendables
recuentos elevados. Un recuento elevado puede significar:

- Excesiva contaminacin de la materia prima

- Deficiente manipulacin durante el proceso de elaboracin

- La posibilidad de que existan patgenos, pues estos son mesfilos

- La inmediata alteracin del producto El recuento de mesfilos nos

indica las condiciones de salubridad de algunos alimentos.

B. MOHOS Y LEVADURAS

Los hongos son organismos eucariticos, cuya pared celular contiene

quitina y - glucanos. Son unicelulares o filamentosos, de reproduccin
sexual o asexual, saprfitos mutualistas o parsitos. En funcin de la
temperatura de crecimiento se dividen en:

- termfilos: 20 50 C (40 50 C)

- termolatentes: mximo 50 C, mnimo por debajo de 20 C

- mesfilos: 10 40 C (20 35 C)

- psicrfilos: por debajo de 10 C (por debajo de 20 C)

Los hongos engloban los mohos y las levaduras. Los mohos son
multicelulares filamentosos cuyo crecimiento en un alimento se
reconoce por su aspecto aterciopelado. Las levaduras crecen en
agregados de clulas independientes, cuando crecen en los alimentos
forman colonias caractersticas.

Los alimentos que ms fcilmente son contaminados por micotoxinas y

las micotoxinas ms frecuentes son:

1.- Semillas oleaginosas y alimentos derivados

2.- Aceites vegetales no refinados 3.- Cereales y alimentos derivados

4.- Frutos secos

5.- Zumos de frutas

6.- Legumbres

7.- Bebidas alcohlicas

8.- Leche y productos lcteos

9.- Carne y productos crnicos

E. ESCHERICHIA COLI

Escherichia coli es un coliforme fecal. Los coliformes fecales son un

grupo de microorganismos seleccionados por incubacin de los inculos
procedentes de un caldo de enriquecimiento de coliformes a
temperaturas superiores a las normales (44 +/-0,5 C) y son muy
indicativos de una posible contaminacin de origen fecal del alimento.
Se definen por la produccin de cido y de gas en caldo EC a 44 46 C
(44,5 45,5 C). Las cepas enterohemorrgicas de E. coli no crecen a
44,5 C en la formulacin convencional de EC, pero lo hacen cuando el
porcentaje de sales biliares se reduce del 0,15 al 0,112%. Slo unas
pocas cepas son patgenos verdaderos, enteropatgenos; o patgenos
oportunistas. Es muy resistente en suelo y agua. Muere a 60 C en 15
minutos, y con 0,5 p.p.m. de cloro. Vive en el tracto intestinal del
hombre y animales, por eso su presencia en un alimento indica
contaminacin directa o indirecta de origen fecal. Es indicador de
posibles patgenos entricos en el agua, moluscos, productos
lcteos,.....

Mtodos normalizados ISO 7251 Directiva general para el

recuento de Escherichia coli presuntivos. Tcnica del NMP Esta
directiva se basa en la siembra de tres tubos de enriquecimiento
selectivo de doble concentracin con una cantidad determinada de la
muestra problema si es lquida o una cantidad determinada de la
suspensin madre para otros productos. A continuacin se siembran tres
tubos de enriquecimiento selectivo de concentracin simple con una
cantidad determinada de la muestra problema si es lquida o una
cantidad determinada de la suspensin madre para otros productos.
Despus y en las mismas condiciones se siembran tres tubos de
enriquecimiento selectivo de concentracin simple con la primera
dilucin decimal obtenida de la muestra problema o de la suspensin
madre. Los tubos se incuban a 35 37 C segn acuerdo durante 24 48
horas, y se realiza el examen en busca de tubos con gas. A partir de
cada tubo que muestra desprendimiento de gas se inocula un tubo con
medio selectivo lquido EC. La reaccin es positiva cuando se produce
desprendimiento de gas recogido en la campana de Durham, como
 consecuencia de la fermentacin de la lactosa en presencia de sales
biliares a 45 C. Se hacen las lecturas a las 24 y 48 horas. A partir del
nmero de tubos positivos en medio selectivo EC se siembra una nueva
serie de tubos con agua de triptona. Incubacin a 45 C, 24 48 horas y
se examina la produccin de indol. A partir de los tubos positivos a la
produccin de gas en medio selectivo y a la produccin de indol en agua
de triptona, se calcula el nmero ms probable de E. coli por mililitro o
gramo de muestra de ensayo.

NF V 08-053 Mtodo de rutina para el recuento de Escherichia

coli -glucuronidasa positivos Este mtodo se basa en la siembra en
profundidad con el medio agar PTX o PTG, en una placa de Petri con una
cantidad determinada de la muestra problema si es lquida o una
cantidad determinada de la suspensin madre para otros productos. En
las mismas condiciones, siembra de diluciones decimales obtenidas de la
muestra o de la suspensin madre. Incubacin de las placas a 44 C
durante 18 24 horas. Clculo del nmero de Escherichia coli por
mililitro o por gramo de muestra a partir del nmero de colonias
caractersticas obtenidas en las placas de Petri.

G. SALMONELLA

El gnero Salmonella pertenece a la familia de las enterobacterias y constituye

un grupo muy complejo de microorganismos patgenos para el hombre,
pudiendo afectar a diversos animales. Comprende dos especies:

- Salmonella enterica dividida en seis subespecies

- Salmonella bongori

Todas ellas se pueden identificar por caractersticas fenotpicas fciles de ver.

Mtodos normalizados

ISO 6579 Directiva general concerniente a los mtodos de

investigacin de Salmonella. Este mtodo se basa en las investigacin
de Salmonella en cuatro etapas sucesivas: . Preenriquecimiento en medio
no selectivo: Siembra de la muestra en agau de peptona tamponada e
incubacin a 37 C (35 C) durante 16 20 horas . Enriquecimiento en medios
selectivos lquidos: Con el cultivo del preenriquecimiento siembre en verde
malaquita con cloruro de m,agnesio e incubacin a 42 C 24 horas, y en caldo
selenito cistina e incubacin a 37 C 24 horas y 24 horas suplementarias. .
Aislamiento e identificacin: A partir de los cultivos anteriores se siembran dos
medios slidos, agar rojo fenol verde brillante y otro medio selectivo a eleccin.
Ambos se incuban a 37 C 24 horas y si es necesario 48 horas. . Confirmacin:
Resiembra de las presuntas colonias de Salmonella y confirmacin en los
medios de ensayos bioqumicos y serolgicos apropiados.

V 08-052 Mtodo de rutina para la investigacin de Salmonella Este

mtodo se basa en las investigacin de Salmonella en cuatro etapas
sucesivas: . Preenriquecimiento en medio no selectivo: Siembra de la muestra
en agua de peptona tamponada e incubacin a 37 C durante 16 20 horas .
Enriquecimiento en medios selectivos lquidos: Con el cultivo del
preenriquecimiento siembra en caldo verde malaquita con cloruro de magnesio
e incubacin a 42 C 24 horas, y en caldo selenito cistina e incubacin a 37 C
18 24 horas. . Aislamiento e identificacin: A partir de los cultivos anteriores
se siembra en un medio slido selectivo a eleccin. Se incuba a 37 C 24 horas
y si es necesario 48 horas y se examinan las caractersticas de las colonias. .
Confirmacin: Resiembra de las presuntas colonias de Salmonella y
confirmacin en los medios de ensayos bioqumicos y serolgicos apropiados.

TERMODURICOS

METODO Cuenta en placa de bacterias

FUNDAMENTO

La tcnica se basa en contar las unidades formadoras de colonias o UFC

presentes en un gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada colonia
que desarrolla en el medio de cultivo de eleccin despus de un cierto tiempo
de incubacin a la temperatura adecuada, proviene de un microorganismo o de
un agregado de ellos, de la muestra bajo estudio; ese microorganismo o
microorganismos son capaces de formar la colonia, es decir una UFC. las
colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las diluciones
decimales necesarias de la muestra, antes de ponerla en el medio de cultivo; la
tcnica para realizar este procedimiento se describe en Preparacin y dilucin
de muestras de alimentos para su anlsis microbiolgico.

NOTAS

El medio de cultivo no debe fundirse ms de una vez, y debe mantenerse en

bao de agua regulado a 45 C, durante el tiempo suficiente para que alcance
esta temperatura, y hasta su utilizacin.

El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al

diluyente, hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no
debe exceder de 20 minutos.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, con 90 mL de solucin

amortiguadora de fosfatos o agua peptonada a .
 4 a 6 tubos de ensayo de 16 x 150 con tapn de rosca, con 9 mL de solucin
amortiguadora de fosfatos o agua peptonada a .

6 a 12 tubos de 22 x 175 con 20 mL c/u (o un matraz con 130 250 mL) de

agar triptona-glucosa-extracto de levadura (agar para cuenta estndar) fundido
y mantenido en bao de agua a 45 1.0 C (para tcnica de vertido en placa)
a.

6 a 12 cajas de Petri con 20 mL c/u de agar tripotna-glucosa-extracto de

levadura (agar cuenta estndar) estriles o el medio requerido en la tcnica a .

MATERIAL Y EQUIPO

Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de 1.0C,

provista con termmetro calibrado a .

Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal

cuadriculada y lente amplificador b .

Registrador mecnico o electrnico b

Microscopio ptico b

Bao de agua con termmetro, que mantenga la temperatura a 45 1.0 C a

Utensilios estriles (cuchillo, tenedor, cuchara, pinzas) para tomar muestra a

Pipetas bacteriolgicas de 10 mL, estriles, con algodn en el extremo

superior (las necesarias, de acuerdo con las diluciones) a .

Pipetas bacteriolgicas de 1 mL, estriles, con algodn en el extremo

superior (las necesarias, de acuerdo con las diluciones) a .

Varillas de vidrio estriles (en escuadra o L) a .

Pipetas Pasteur estriles a 8 a 12 cajas Petri estriles