Instituto Politcnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas.

1.-Materia: Mtodos de Anlisis

2.- Prctica: Separacin de protenas por electroforesis

en gel de poliacrilamida

3.-Alumno: Lpez Morales Pedro Daniel

4.- Grupo: 4IM1

5.-Seccin: 1

6.-Profesora: Carolina Acua Gonzlez

7.- Fecha de realizacin: 21 & 24/Octubre/2016

07/Noviembre /2016

8.- Fecha de entrega: 14/Noviembre/2016

 Separacin de protenas por electroforesis en gel de
poliacrilamida.

Fundamento.

La electrolisis del agua es el proceso en el que

corrientes elctricas continuas o pulsatorias
pasan a travs del agua, sus molculas se
alinean y se separan los tomos de hidrogeno y
oxgeno. La etimologa de la palabra refiere a dos
trminos: electro: que significa electricidad, y lisis
que significa rotura. En la descomposicin de
agua han de intervenir sustancias ionizadas
denominadas electrolitos.

H2O 2H+O

La electroforesis es una tcnica de separacin de molculas de una muestra por

aplicacin de un campo elctrico. Las molculas disueltas se desplazan o migran
en un campo elctrico a una velocidad determinada pos su relacin carga-masa.
Por ejemplo, si dos molculas tienen masa y formas iguales, la de mayor carga
neta se desplazara ms rpido al electrodo. La separacin electrofortica de
protenas se suele efectuar en geles de poliacrilamida. Cuando una mezcla de
protenas se aplica a un gel y se le pasa una corriente elctrica. Las protenas ms
pequeas migran ms rpido a travs del gel que las protenas ms grandes. Los
geles se moldean entre dos hojas de vidrio mediante polimerizacin de una
solucin de monmeros de acrilamida en cadenas de poliacrilamida y al mismo
tiempo se crean enlaces cruzados que forman una matriz semislida. El tamao
del poro de un gel se puede variar mediante ajustes en las concentraciones de
poliacrilamida y del reactivo que forma enlaces cruzados. La velocidad a la cual
una protena se mueve a travs del gel depende del tamao del poro del gel y de
la fuerza del campo elctrico. Mediante el ajuste apropiado de estos parmetros,
es posible a separar las protenas de tamaos muy variables.

La seroalbmina es una protena monmera no glicosilada de 585 aminocidos,

con un peso molecular de 66 kDa, su punto isoelctrico est alrededor de pH 4,6.
Su estructura globular se mantiene por medio de 17 puentes disulfuro que crean
una serie secuencial de 9 anillos dobles se encarga de transportar sustancias de
naturaleza qumica muy diversa, como cidos grasos, aminocidos, esteroides,
metales, y numerosos frmacos. Facilitando la transferencia de muchas de ellas
 desde la circulacin sangunea a rganos como el hgado, el rin, el intestino y el
cerebro.

La lactoalbmina es una protena soluble que se encuentra en fase dispersa en

estado coloidal, rica en aminocidos azufrados y de fcil digestin. Es una
protena globular pequea que est constituida por 123 aminocidos y posee un
peso molecular prximo a 14 kDa. El punto isoelctrico de la holo--lactoalbmina
se ha reportado en el rango entre 4.2 y 4.8 siendo el valor ms utilizado en la
literatura el de 4.5.

La ovoalbmina es la principal protena de la clara del huevo. Pertenece a la

superfamilia protenica de las serpinas. La ovoalbmina de los huevos de gallina
posee cerca de 385 aminocidos. Es una fosfoglicoprotena con un peso
molecular aproximado de unos 42.7 KDa y su punto isoelctrico es de 4.6

Objetivos.
Efectuar la separacin de protenas de varias muestras mediante
la electroforesis en gel de poliacrilamida.
Determinar el tamao ptimo de poro de gel, para la mejor
separacin de cada una de las muestras.
Mediante el mtodo de Ferguson, determinar cul es la protena
de mayor tamao molecular y de mayor carga neta.

Resultados Experimentales
1.-

Tabla 3. Caractersticas de los electroferogramas a diferentes %T

Caracterstica %T 5.5 7.5 10 12.5

Longitud del gel antes de teir, cm, (l) 7.5 7.6 7.2 7.0
Longitud del gel despus de teir, cm, (l') 8.0 7.8 7.5 7.7
Distancia recorrida por el colorante, cm, 5.9 6.5 6.2 6.0
(f)
Suero 7 10 10 14
No de bandas en: Leche 4 8 9 8
Clara 2 9 9 10
Mediante la siguiente formula se calcul la movilidad electrofortica relativa (M):
Dnde: l: Longitud del gel antes de teir (cm)
M=( )*( )
l: Longitud del gel despus de teir (cm)
f: Distancia recorrida por el colorante ( cm)

: Valores promedio de distancias recorridas
por la protena.
 Tabla 4 Movilidad electrofortica relativa promedio
%T Muestra/ Valores de m de la protena Valor Movilidad log (Mx100)
Protena seleccionada (cm) promedio de electrofortica
m(cm) relativa ()
5.5 Suero/ 6.3 6.3 6.4 6.3 1.001 2.0000
Seroalbmina
Yogurt/ 5.4 5.4 5.5 5.4 0.858 1.9333
Lactocasena
Clara/ 3.7 3.7 3.7 3.7 0.588 1.7690
Conalbmina
7.5 Suero/ 6.0 6.0 6.0 6.0 0.8880 1.9484
Seroalbmina
Yogurt/ 5.0 5.0 5.0 5.0 0.7495 1.8747
Lactocasena
Clara/ 3.2 3.2 3.2 3.2 0.4896 1.6898
Conalbmina
10 Suero/ 4.4 4.4 4.4 4.4 0.6823 1.8329
Seroalbmina
Yogurt/ 4.3 4.3 4.3 4.3 0.6668 1.8239
Lactocasena
Clara/ 2.5 2.5 2.5 2.5 0.3877 1.5896
Conalbmina
Suero/ 3.7 3.7 3.7 3.7 0.5606 1.7486
12.5 Seroalbmina
Yogurt/ 4.5 4.5 - 4.5 0.6818 1.8335
Lactocasena
Clara/ 2.4 2.5 2.4 2.43 0.3681 1.5650
Conalbmina

Grfico de Ferguson
2.5 Clara de Huevo

Suero
2
Yogurt

Lineal (Clara de Huevo)

1.5
Log(Mx100)

Lineal (Suero)

Lineal (Yogurt)
1
y = -0.0371x + 2.212
R = 0.9915
0.5 y = -0.0241x + 2.0624
R = 0.989
y = -0.0291x + 1.9154
0
R = 0.9531
4.5 5.5 6.5 7.5 8.5 9.5 10.5 11.5 12.5 13.5
%AT
Tabla 5. Regresin lineal de la grfica de Ferguson.

Muestra Ecuacin de la recta R2

Clara -0.0231x + 1.9154 0.9531
Suero -0.0371x + 2.212 0.9915
Yogurt -0.0241x + 2.0624 0.989
Se elimino el punto de 1.8336 de Yogurt de tamao de poro no. 12.5 ya que al
momento de graficar nos alteraba el resultado

En cada ecuacin de la recta obtenida cada variable representa

Y=mx+b donde

m=Tamao molecular relativo de la protena b= Carga relativa de la protena

Por ejemplo en la clara sera

m= 0.0231 igual a su tamao molecular de la protena

b= 1.9154 igual a su carga relatica de la protena

As para cada una de las dems protenas

Fotografa del electroferograma

Tamao de Poro no 10

4.- Concluya acerca del tamao molecular relativo de las proteronas y su

cargas elctricas relativas al pH del regulador de trabajo (8.7 a 9.1)
Al comparar las 3 ecuaciones obtenidas por el grfico de Ferguson, se puede
comparar sus pendientes , y ver que el tamao molecular relativo de las
molculas es mayor en la conoalbumina, despus seroalbmina y la casena, al
compararlos con los pesos moleculares (PM) tericos quedan ordenados de la
misma forma Conalbmina (78000Da), Seroalbmina (67000Da), y Casena
(25000Da).
5.- Diga cul %T recomienda para la separacin de las protenas de cada
muestra y Por qu?

Muestra %T recomendado
Suero 10
Yogurt 12.5
Clara 7.5 y 10
Ya que se tuvo mejor resolucin en la bandas nmero 10 para clara y suero para
nmero 7.5 para clara y en 12.5 para yogurt (casena), como el nmero de bandas
presentes en estos geles.

6.-Escriba la reaccin completa para la copolimerizacin de la acrilamida y a

bisacrilamida por radicales libres, Qu funcin tienen el TEMED y el
persulfato de amonio?

Los geles de poliacrilamida actan a modo de tamiz molecular retardando el

movimiento de macromolculas grandes mientras que permiten a molculas ms
pequeas moverse libremente, potenciando de esta forma la separacin. El
entramado de los geles de poliacrilamida se genera mediante la polimerizacin, a
travs de radicales libres, de monmeros de acrilamida en presencia de pequeas
cantidades de bis-acrilamida(N,N,N,N'-metilen-bis-acrilamida). Se forman
enlaces cruzados entre los 2 polmeros de acrilamida, de manera que se generan
geles con tamao de poro determinado tanto por la concentracin total (%T) como
por la concentracin relativa de acrilamida y de bisacrilamida. La reaccin de
polimerizacin se inicia por un sistema redox de catlisis. El TEMED cataliza la
formacin de radicales libres que dirigen la reaccin a partir del in persulfato que
se aade en forma de APS y que acta como iniciador. Se trabaj con diferentes
concentraciones de gel separador, de 5.5%, 7.5%, 10% y 12.5%, esto es debido a
que a diferente tiempo varia la concentracin final de la bisacrilamida en el medio.

El gel empacador se adicion hasta el borde de las placas, se coloc el peine y se

dej polimerizar; en los pozos se adicionaron 25 L de las muestras de Clara de
Huevo, Suero y Yogurt posteriormente.
7.- Mencione una aplicacin de la electroforesis preparativa y una
electroforesis analtica.

-Electroforesis preparativa: Se puede aplicar en la preparacin y purificacin de

(por extraccin de bandas del gel) molculas y fragmentos de DNA y RNA.

-Electroforesis analtica: Permite realizar algunos tipos de diagnsticos, conocer la

composicin de un preparado proteico heterogneo, monitorear un proceso de
purificacin, estimar peso molecular, utilizada tambin en mtodos pticos,
mtodos radio qumicos, ensayos biolgicos.

8.- Defina velocidad de migracin y movilidad electrofortica. Explique la

diferencia.

La velocidad de migracin (v) de la partcula es directamente proporcional al

producto de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial elctrico (E) e
inversamente proporcional al coeficiente de friccin (f) relativo a la talla y forma de
la molcula, o sea, a la resistencia que le ofrece el medio. La velocidad de
migracin electrofortica depende de la densidad de carga de la molcula
(relacin carga / peso), del voltaje aplicado y de la porosidad del gel de
electroforesis. La movilidad electrofortica (Me) es un caso particular de la
velocidad de migracin de un in, cuando se aplica un campo elctrico de 1 V/cm.
Su signo es igual al de la carga de la partcula. La movilidad, (u), se define como la
velocidad que toma la partcula por unidad de campo, o como la movilidad
depende del coeficiente de friccin, que a su vez es funcin de ciertos parmetros
fsicos de las molculas, el valor de u puede dar informacin acerca del tamao y
forma de la partcula.
9.- Defina el trmino electroferograma

Un electroferograma es un grfico realizado con los resultados de un

anlisis por electroforesis. Se pueden realizar electroferogramas con
resultados derivados de: Pruebas genealgicas de ADN, pruebas de
paternidad, secuenciacin de ADN, huella gentica
Grafico que representa la respuesta del detector frente al tiempo de
electroforesis.

10.- Qu se desprende del nodo y del ctodo?

La fuerza inica (m) determina el potencial electrocintico ya que reduce la carga

neta de los grupos con cargas efectivas. Se ha determinado que la movilidad de
las partculas cargadas es inversamente proporcional a la raz cuadrada de la
fuerza inica, a baja m se eleva la velocidad de migracin y es menor la difusin,
de manera que la zona de separacin es ms ancha y mayor la resolucin. 1 Con
el aumento de la m, se incrementa el desprendimiento de calor y la evaporacin.
En la electroforesis, los efectos de absorcin de agua, no-homogeneidad del
material, intercambio inico con grupos cargados del soporte y electroendsmosis,
pueden influir sobre la movilidad y la calidad de la separacin. La
electroendsmosis generalmente ocurre porque grupos cargados del soporte se
ionizan en soluciones tampn neutras o cidas y los contraiones libres hidratados

(H 3O+) migran hacia el ctodo, esto provoca un movimiento relativo del solvente
respecto al soporte slido y que las molculas no cargadas sean transportadas
hacia el ctodo a pesar de no tener grupos ionizados.

Se despende de resultado siendo el ctodo Hidrogeno y tanto en el nodo

Oxigeno.

2H2O 2H2+ O2

Discusin

Se realiz una separacin de protenas mediante una electroforesis utilizando gel

de poliacrilamida. Esta tcnica separa por la carga, tamao y forma de la protena.
Se prepar un soporte el cual est conformado por gel separador y gel
empacador, el primer gel nos ayuda a distribuir las protenas a travs del soporte
mientras que el gel empacador permite que las protenas se compacten. Se llev a
cabo una reaccin de polimerizacin.

El gel empacador se adicion hasta el borde de las placas, se coloc el peine y se

dej polimerizar; en los pozos se adicionaron 25 L de las muestras de Clara de
Huevo, Suero y Yogurt en nuestro caso de coloc una mustra de 15 L ya que
nuestro gel quedo con los pozos mal hechos. Se inici la electroforesis aplicando
un voltaje de 100 Voltios hasta aumentar a 200 Voltios en un tiempo de 65
minutos, conforme aumenta el voltaje aumenta la velocidad de migracin.

Las muestras aplicadas tenan azul de bromofenol, este colorante nos permiti
observar que la muestra cay en el pozo correspondiente adems evita que las
protenas salgan del gel tambin es un indicador de pH que nos indica que las
protenas de fijaron al gel, el azul de bromofenol debe ser una molcula cargada y
de tamao pequeo que avanza ms rpido que la protena en el gel. Al termino
del corrimiento, el gel se pas a un recipiente que contena el TCA, para
desnaturalizar a las protenas, posteriormente de coloco en un recipiente que
contena azul de Coomasie G-250.

Al terminar la tincin de los geles, se observ que conforme aumentaba la

concentracin se obtenan bandas mejores definidas, a una concentracin de
5.5% se observaron manchas muy difusas, mientras que a una concentracin de
12.5% las bandas se podan distinguir mejor. Por lo tanto, a mayor concentracin
de poliacrilamida las bandas se van definiendo ms. El tamao del poro puede ser
ajustado para optimizar la separacin de la muestra de inters. As que, en geles
con un porcentaje alto de acrilamida son ptimos para la separacin de protenas
de tamao pequeo, mientras que geles de porcentajes menores (<10%T) son los
indicados para la separacin de protenas grandes.

De manera general, se esperaba que las medidas de l (longitud del gel despus
de teir) fueran mayores a l (longitud del gel antes de teir) y que estas dos
medias fueran mayores a f (distancia recorrida por el colorante). En los datos
registrados en la tabla 3, se observa que este comportamiento se cumple en
todas las concentraciones de acrilamida (desde 5.5% hasta 12.5%)

En el no. de bandas obtenidas, se esperaba que a mayor concentracin de

poliacrilamida existiera mayor nmero de bandas, este comportamiento solo se
cumpli en cada una de las protenas como en algunas se mantena constante
pero nunca disminua.

En la tabla 4 la movilidad electrofortica relativa, se observ que el valor de m

(distancia recorrida por la protena elegida de cada muestra), disminua conforme
aumentaba la concentracin de gel, este comportamiento se observ en las tres
muestras empleadas. Esto es lo esperado, ya que, la protena recorre ms
distancia si los poros del gel son ms grandes (recordemos que a mayor
concentracin de gel el tamao del poro es ms pequeo). Se calcul la movilidad
electrofortica relativa debido a que se emplearon 4 diferentes geles, ya que
ayuda a comparar las diferentes concentraciones. Los resultados obtenidos
mostraron que conforme aumente la concentracin de poliacrilamida la movilidad
en cada protena disminuye.

Debido al dato obtenido donde la medida de f fue mayor que la medida de l, se

elaboraro la grafica de Ferguson, tomando en cuenta el factor de hinchamiento.
Con la grfica de Ferguson, se puede determinar el tamao relativo de la protena
(que corresponde al valor absoluto de la pendiente) y la carga neta relativa de la
protena (que corresponde al valor de la ordenada al origen). Tomando en cuenta
el factor de hinchamiento para construir la grfica de Ferguson, se obtuvo que el
valor de la pendiente del suero fue mayor a la del yogurt y esta fue mayor a la de
la clara, es decir, Suero>Yogurt>Clara, con esto se puede decir que la protena
del suero es la de mayor tamao molecular.

En cuanto a los valores de ordenada de origen, los cuales no corresponden al

valor de la carga, slo hacen referencia de qu molculas tienen ms carga, se
obtuvo que la mayor ordenada al origen fue la del suero, despus la del yogurt y
finalmente la de menor valor fue la de la clara de huevo, es decir,
Suero>Yogurt>Clara. Por lo tanto, la protena con mayor carga neta relativa es la
del suero seguido por la del yogurt, y la menor carga relativa corresponde a la de
la muestra de clara de huevo. En la segunda grfica de Ferguson, se mostr el
mismo comportamiento, es decir, la de mayor carga neta fue la del suero, seguido
por la carga neta del yogurt y la de menor carga neta fue la de la clara de huevo
(S>Y>C).

Con la carga relativa comparamos las cargas netas de una protena con otra. De
manera general a mayor carga neta la movilidad ser mayor. Si el pH fuera igual al
pI de las protenas, estas no se moveran en el gel, la solucin B que es Tris- HCl
nos dio el pH de trabajo. Esta sustancia a un intervalo de pH entre 8.7 y 9,2
funciona como regulador.

Todas las protenas utilizadas tienen carga neta negativa por lo cual su migracin
en geles nativos se dirigen hacia el nodo y no se desnaturalizan en el pH
trabajado debido a que se encuentran en un rango de pH regulado. Por lo tanto,
con respecto al pI, como se trabaj a pH alcalino, las protenas migraron al polo
positivo (nodo). Entre ms este el pI a la izquierda del pH de trabajo habr mayor
nmero de cargas negativas.

Conclusiones.

A mayor carga neta habr ms movilidad.

El tamao ptimo de gel para el el yogurt de 12.5%T, para
suero fue de 10.0%T y para la clara 7.5% y 10.0%T
 A mayor concentracin de poliacrilamida habr mayor
nmero de bandas, que estarn ms definidas.
A mayor concentracin de gel la movilidad electrofortica
disminuye, ya que una concentracin alta de gel ocasiona
un tamao de poro ms pequeo y viceversa.
Es recomendable concentraciones bajas de poliacrilamida
para protenas de tamao molecular muy grande, y
concentraciones altas para protenas de tamao
molecular pequeo.

Anexo.
Gel

a) Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerizacin de la acrilamida

por accin de un agente entrecruzador ('cross-linking'), la bis-acrilamida en
presencia de un iniciador y un catalizador. Como iniciador se suele utilizar
TEMED (N,N,N,N'-tetrametilnediamina) y como catalizador el in persulfato
(S2O8 -) que se aade en forma de persulfato amnico. En algunas situaciones,
como por ejemplo en el isoelectroenfoque en el que la presencia de persulfato
puede interferir con la electroforesis se emplean riboflavina y TEMED.

b) Las soluciones de acrilamida se desgasifican pues el oxgeno es un inhibidor

de la polimerizacin. Adems, durante la polimerizacin se libera calor que
podra provocar la formacin de burbujas en el seno del gel.

c) La velocidad de polimerizacin viene determinada por la concentracin de

persulfato (catalizador) y TEMED (iniciador).

d) La porosidad del gel la determina las proporciones relativas de

poliacrilamida y bis-acrilamida, siendo menor el poro cuanta ms bisacrilamida
vs. acrilamida se use.

e) El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina el rango de

separacin del gel. Habitualmente los geles se denominan en funcin del % de
acrilamida/bisacrilamida que contienen. As, la mayora de las protenas se
separan bien en el rango de 5 a 10%. Un menor porcentaje (mayor tamao de
poro) es mejor para separar protenas de gran tamao.
Bibliografa.

Lodish Harvey, 2005, Biologa celular y molecular, Editorial

Mdica Panamericana, 5ta. Edicin, Mxico; 87 pp.
Bastian Peter, 2001, Electrotecnia, Ediciones AKATAL,
Madrid, Espaa; 506 pp.
Electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida.
Anlisis de protenas de hojas de Arabidopsis thaliana.
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Consultado: 11/Noviembre/2016.
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http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/Seminario-
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Consultado: 11/Noviembre/2016.
Estabilizacin de holo--lactoalbmina en presencia de
polioles:
http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0
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Sero-albmina humana, preparacin y utilizacin.
http://www.espatentes.com/pdf/2137251_t3.pdf
Consultado: 11/Noviembre/2016.