Laboratorio de Bioqumica, No.

3, Enero 2013
Prof.: Rodrigo Torres Saez

Extraccin e Identificacin de Protenas

David Leonardo Ruiz Rivera1, Sidne Stefany Rodrguez1
1
Universidad Industrial de Santander.

Realizado 23-30/01/2013; Entregado 06/02/2013; Prctica No. 3; Grupo: H1; Subgrupo: Blue.

Resumen
En esta prctica se utiliz el mtodo de Biuret y de absorcin ultravioleta (280nm) para la
cuantificacin de protenas presentes en la harina que se aislaron de acuerdo a su grado de
solubilidad en diferentes solventes como NaCl, EtOH y NaOH. Para cada uno de los mtodos se
realiz una curva estndar para determinar el contenido de protenas en los diferentes extractos.

Palabras claves: Cuantificacin de protenas, Biuret, absorcin ultravioleta.

1. INTRODUCCIN
Absorcin en el Ultravioleta.
Las protenas pueden ser extradas y clasificadas
de acuerdo a su solubilidad en diferentes solventes Se mide la absorbancia a 270-280 nm originada
y se pueden clasificar como: albminas, fundamentalmente por los anillos aromticos de
globulinas, prolaminas y glutelinas. Esta triptfano y tirosina.
clasificacin se realiz debido a la extraccin de
harina en agua, alcohol y en medios alcalinos y
poder cuantificar la concentracin de protena
usando mtodos espectrofotomtricos.

2. MARCO TERICO

Mtodo de Biuret:

Se basa en la formacin de un complejo coloreado

entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces
peptdicos en medio bsicodando un color
purpreo que se cuantifica
espectrofotomtricamente (540nm).
La intensidad de coloracin es directamente
proporcional a la cantidad de protenas (enlaces
peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de
manera que pocas sustancias interfieren. La Objetivos
sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se Extraer los tipos de protenas presentes en la
recomienda para la cuantificacin de protenas en harina de trigo de acuerdo a su solubilidad en
preparados muy concentrados. diferentes solventes.
Determinar cuantitativamente el contenido
2+ Complejo Cu protena( purpura) de protenas mediante los mtodos derivados
Protena +Cu
colorimtricos (Biuret) y de absorcin.

1
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2. Materiales y Mtodos
4 tubos para centrfuga.
4 balones aforados de 25 mL.
(10 mg
mL )
( 0,1 mL )=C ( 5 mL )
2

mg
Tubos de ensayo. C2 =0,2
Pipeta de 5 mL, de 2 mL y pera. mL
Espectrofotmetro de ultravioleta

Centrfuga. Tabla 1. Absorbancia para los patrones preparados

Termostato. en el mtodo Biuret
Balanza analtica. Muestr Concentraci Absorbanci
Harina. a n mg/ml a
Solucin patrn de protena 10 mg/mL y Blanco 0 0,001
1 0,20 0,045
1 mg/mL.
2 0,60 0,137
Reactivo de Biuret 3 1,0 0,209
4 1,4 0,283
5 1,8 0,354
Solucin de NaCl 1% p/v.
6 2,4 0,421
Solucin de Etanol (C2H5OH) 75%. 7 3 0,498
Solucin de NaOH 0,1 N.
En base a estos resultados se realiz la curva de
Para la realizacin de la prctica se tom 2 g de calibracin correspondiente a este mtodo:
harina en un tubo de ensayo al cual se adicion 10
mL de H2O, se agit durante 10 min y se introdujo Grfico 1. Curva de calibracin del mtodo Biuret
en la centrfuga a 3500 rpm. El sobrenadante se para la cuantificacin de protenas.
extrajo; se repiti el proceso con agua para
obtener una cantidad considerable de
sobrenadante y luego se diluy a 25 mL con agua Curva de calibracin para mtodo de Biuret.
destilada. Este extracto contiene las Albminas.
Posteriormente se continuo con la extraccin en 0.6
el pellet con otras soluciones de NaCl al 1%, 0.5
Etanol 75%, y NaOH 0,1 N. De dichas f(x) = 0.17x + 0.03
extracciones se guardo el sobrenadante que se 0.4 R = 0.98
empleo para determinar su concentracin 0.3
mediante mtodos espectrofotomtricos. Absorbancia
0.2
3. Resultados y Discusin 0.1
0
Mtodo Biuret: 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5
Las absorbancias de las soluciones patrones estn Concentracin [mg/mL]
consignadas en la tabla 1, y se relacionan al valor
real de concentracin de las soluciones patrones
de protena mediante la siguiente expresin: Las concentraciones para las protenas extradas se
determinan mediante la extrapolacin en la curva
C1V 1=C 2V 2 de calibracin tomando la ecuacin de la recta:

||1,733C0.0035
La concentracin del patrn de protena es 1
mg/mL y un volumen final de 5 mL se tiene que:

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Abs= Absorbancia C= Concentracin mg

(1 mL )( 0,2mL )=C ( 5 mL )
2

mg
C2 =0,04
mL
Tabla 2 .Valores de concentracin de las protenas
extradas por mtodo Biuret.
Concentra
Solven Tipo de Absorban cin Tabla 4. Absorbancia para los patrones preparados
te protena cia
[mg/mL] en el mtodo de absorcin en U.V
Muestra Concentracin Absorbancia
Agua Albuminas 0,09 0,0499
mg/ml
NaCl Globulinas 0,189 0,1070 Blanco 0 0,001
Etanol Prolaminas 0,418 0,2391 1 0,04 0,036
NaOH Glutelinas 0,232 0,1318 2 0,08 0,055
3 0,12 0,103
Clculos 4 0,16 0,116

(0,0499 mg
mL )
( 10 mL )=C (25 mL )
2
5
6
0,2
0,24
0,154
0,181
7 0,3 0,215
mg
C2 =0,0199
mL
En base a estos resultados se realiz la curva de
calibracin correspondiente a este mtodo:
Tabla 3. Cantidad de protena en 25 ml de
solucin Grfico 2. Curva de calibracin del mtodo UV para
Concentraci la cuantificacin de protenas.
Concentracin
Protena n
[mg/ml] mg en 25 ml
Curva de calibracin para la absorcin U.V.
Albuminas 0,0499 0,0199
0.25
Globulinas 0,1071 0,0428
Prolaminas 0,2391 0,0956 0.2 f(x) = 0.72x + 0
Glutelinas 0,1318 0,0527 R = 0.99
0.15
Mtodo de absorcin en U.V: Absorbancia
0.1
Las respectivas absorbancias de las soluciones
patrones son observadas en la tabla 4, y las cuales 0.05
se relacionan al valor real de concentracin de las
soluciones patrones de protena mediante la 0
siguiente expresin: 0 0.1 0.2 0.3 0.4
C1V 1=C 2V 2
Concentracin [mg/mL]
La concentracin del patrn de protena es 1
mg/mL y un volumen final de 5 mL se tiene que:

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Prolaminas 0,273 0,109

Las concentraciones para las protenas extradas se Glutelinas 0,252 0,101

determinan mediante la extrapolacin en la curva
de calibracin tomando la ecuacin de la recta:
4. ANLISIS DE RESULTADOS
||0,7 219C0,004 8
Segn las concentraciones obtenidas en ambas
extracciones, se observ que las fracciones
proteicas obtenidas por el mtodo de UV visible es
Abs= Absorbancia C= Concentracin mayor debido a una mejor extraccin.

Tabla 5. Valores de concentracin de las protenas 4. CONCLUSIONES

extradas
Se observ que las protenas en solucin presentan
Solven Tipo de Absor Concentracin
te protena bancia cambios de solubilidad en funcin del pH, la
[mg/mL] fuerza inica y las propiedades dielctricas del
Agua Albuminas 0,208 0,281 disolvente y as obtener fracciones proteicas como
albuminas, globulinas, prolaminas y glutelinas.
NaCl Globulinas 0,195 0,263
Etanol Prolaminas 0,202 0,273 Usando el mtodo de Biuret y de absorcin se
NaOH Glutelinas 0,187 0,252 logr cuantificar las fracciones proteicas obtenidas
por solubilidad.

Clculos
5. BIBLIOGRAFA
mg
( 0, 281
mL )
( 10 mL )=C 2( 25 mL ) Lehninger, Albert., Nelson, David L., Cox,
Michael M.,(1993) Principios de Bioqumica.
Segunda Edicin, Ediciones Omega, Barcelona,
mg Espaa.
C2 =0,112
mL
Campbell, Mary K. y Farrell Shawn O., (2004)
Bioqumica. Cuarta Edicin, Thomson Editores,
Tabla 6. Cantidad de protena en 25 ml de Mexico.
solucin
Concentra
Mtodo de cuantificacin de protenas
Concentraci
cin n http://www.uco.es/organiza/departamentos/bioqui
Protena
mica-biol-mol/pdfs/27%20M%C3%89TODOS
[mg/ml] mg en 25 ml %20PARA%20LA%20CUANTIFICACI
Albuminas 0,281 0,112 %C3%93N%20DE%22PROTE
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Globulinas 0,263 0,105