1.

Introduction

Wogonin (5,7-dihidroksi-8-methoxyflavone, Gambar 1) adalah salah satu flavonoid utama

diekstrak dari akar Scutellaria baicalensis Gerogi (Scutellariae radix), tanaman berbunga yang
telah lama dikenal sebagai obat tradisional di negara-negara Asia Timur.

Wogonin telah banyak diteliti untuk antioksidan, anti-inflamasi, dan antikanker-nya.

Dengan meningkatnya bukti potensi antikanker dan sifat toksikologi ,wogonin telah diakui
sebagai senyawa utama yang menjanjikan untuk pengembangan obat antikanker baru.

Berbagai penelitian menunjukkan bahwa wogonin diberikannya efek antikanker melalui

modulasi jalur molekuler beberapa. Wogonin menginduksi apoptosis pada sel karsinoma
hepatoseluler SK-HEP-1 melalui aktivasi caspase 3 dan ekspresi protein alternatif p21. Wogonin
juga dapat menginduksi apoptosis dengan mengaktifkan jalur signaling AMPK dan p53 di sel
glioblastoma manusia. siklus penangkapan G1cell diinduksi oleh wogonin melalui pengaturan
jalur signaling Wnt / -catenin dan menonaktifkan CDK8 di sel karsinoma kanker kolorektal
manusia. Inaktivasi GSK-3 dan downregulation dari Np63 oleh wogonin meningkatkan efek
apoptosis pada sel karsinoma nasofaring manusia. Wogonin menghambat angiogenesis tumor
melalui degradasi protein HIF-1 dalam empat baris sel tumor manusia, termasuk MCF-7,
MDA-MB-231, HepG2, dan HCT116. Selain itu, wogonin menghambat sel kanker invasi mulut
manusia dengan mengurangi aktivitas metaloproteinase matriks dan urokinase-plasminogen
activator. Wogonin telah dilaporkan mendorong apoptosis dan menangkap siklus sel pada kanker
payudara melalui modulasi jalur sinyal Akt-dependent. Selain itu, wogonin memberikan efek
apoptosis sel melalui mekanisme yang diperantarai Ca + 2 dan jalur Bax / Bcl-2.
 Meskipun peningkatan data tak henti-hentinya dari target , penjabaran in vitro ke in vivo
dari temuan ini masih minim karena kurangnya studi farmakokinetik. Studi farmakokinetik
senyawa alami memainkan peran penting, tidak hanya dalam penilaian kemampuan obat dan
optimasi tahap utama, tetapi juga dalam memberikan petunjuk orientasi desain model kinetik
yang relevan untuk mengungkap target baru dan jalur molekuler yang mendasari efek
farmakologis agen alami ini.

Penanganan studi sebelumnya dengan farmakokinetik plasma wogonin sebagai salah satu
bahan aktif obat tradisional diberikan secara oral. Karena kompleksitas persiapan ini dan potensi
interaksi antara konstituen yang berbeda, sulit untuk menilai secara penuh farmakokinetik
wogonin ini. Selain itu, untuk pengetahuan kita, tidak ada metode LC-MS / MS untuk
kuantifikasi wogonin pada biosamples tikus yang berbeda termasuk plasma, sampel jaringan,
feses, urin dan empedu. Oleh karena itu, dalam penelitian ini, metode LC-MS / MS untuk
penentuan wogonin pada matriks biologi tikus dikembangkan dan berhasil diterapkan untuk
farmakokinetik, jaringan distribusi, ekskresi dan studi ikatan protein plasma dari wogonin

2. Results and Discussion

2.1 Validation of Analytical Method
Kurva kalibrasi wogonin dalam sampel biologis tikus adalah linear, selama rentang dari 4
sampai 4.000 ng / mL (0, 4, 10, 40, 200, 1.000, 2.000, 4.000 ng / mL) dengan batas
bawah kuantifikasi (LLOQ ) 4 ng / mL. R2 untuk semua kurva standar >0,994. relatif
standar deviasi dari presisi adalah masing-masing 6,6%, 5,4%, dan 3,3% pada 10, 200,
dan 2000 ng / mL. Akurasi ditentukan untuk intra dan inter-day semua dalam 100%
10% dari nilai yang sebenarnya. Selain itu, tidak ada efek matriks signifikan teramati
setelah pengenceran. Dengan demikian, pengoptimalan metode LC-MS / MS ini telah
terbukti sensitif, selektif, dan cepat untuk penentuan wogonin dalam plasma tikus dan
berbagai jenis sampel jaringan.
2.2 Pharmacokinetics Study
profil rata-rata konsentrasi plasma-waktu ditunjukkan pada Gambar 2, dan ringkasan dari
parameter farmakokinetik wogonin pada tikus setelah pemberian secara intravena (10, 20
dan 40 mg / kg) dan secara intragastrik (/ kg 100 mg) masing-masing ditunjukkan pada
Tabel 1 dan 2. Setelah pemberian i.v. wogonin pada tikus; waktu paruh eliminasi sekitar
14 menit. AUC0- meningkat secara tidak proporsional dari 112,13 mg / L menit
untuk 10 mg / kg untuk 758,19 mg / L menit untuk 40 mg / kg Setelah i.g dosing pada
 100 mg / kg, kadar plasma dari wogonin memuncak sekitar 28 menit dengan nilai Cmax
dari 300 ng / mL. Bioavailabilitas oral Wogonin mutlak hanya 1,10%.
Gambar 2. profil rata-rata konsentrasi plasma-waktu dari wogonin pada tikus setelah
menerima dosis tunggal i.v. pada tingkat konsentrasi yang berbeda (10, 20 dan 40 mg / kg
wogonin, n = 6)(A) dan profil konsentrasi plasma-waktu (mean SD) dari wogonin
pada tikus dengan i.g.dose 100 mg / wogonin kg; (B) (n = 6).

Tabel 1. Parameter farmakokinetik untuk wogonin pada tikus setelah pemberian intravena
(i.v.) wogonin pada tingkat dosis yang berbeda (mean SD, n = 6).

Tabel 2. Parameter farmakokinetik untuk wogonin pada tikus setelah pemberian

intragastrik (i.g.) 100 mg / kg wogonin (mean SD, n = 6).

2.3 Tissue Distribution Study

 Distribusi ke jaringan dinilai pada tiga titik waktu yang berbeda (10, 60 dan 120 menit)
setelah pemberian intravena 20 mg /kg wogonin pada tikus dan hasilnya ditujukkan
secara skematis pada Gambar 3. Hasil menunjukkan bahwa wogonin menjalani distribusi
secara cepat dan luas ke semua jaringan yang diperiksa. Tingkat wogonin di ginjal dan
hati nyata lebih tinggi daripada jaringan lain. Hal ini dapat diperhatikan kehadiran
wogonin di testis pada tingkat terdekat dengan orang-orang yang terdeteksi di dalam
hati,jaringan perut dan limpa menunjukkan bahwa wogonin bisa melewati secara efektif
blood- testis barrier (BTB). Proses distribusi wogonin ke jaringan sangat cepat, dan rata-
rata jaringan untuk rasio plasma (Kp) dari wogonin pada tikus setelah pemberian
intravena meningkat dengan waktu ditunjukkan pada Gambar 4.
Gambar 3. Konsentrasi wogonin di jaringan tikus pada 10, 60 dan 120 menit setelah
menerima i.v.dosis tunggal wogonin pada 20 mg / kg. (Rata-rata SD, n = 6, kecuali
untuk testis / ovarium dimana n = 3).

Gambar 4. Rasio jaringan dengan konsentrasi plasma (Kp) pada 10, 60 dan 120 menit
setelah menerima i.v. dosis tunggal wogonin pada 20 mg / kg. (Rata-rata SD, n = 6,
kecuali untuk testis / ovarium dimana n = 3).

2.4 Excretion Studies

 Kumulatif ekskresi wogonin dalam tinja, urin dan empedu setelah pemberian dosis
tunggal i.v. (20 mg / kg) diselidiki. Data ekskresi wogonin dalam tinja, urin dan empedu
(Gambar 5) menunjukkan bahwa hanya masing-masing 21% (16,33% 3,46%, 4,13%
1,30% dan 0,41% 0,17%, ) dari dosis obat yang diberikan diekskresikan sebagai bentuk
tak berubah.
2.5 Protein Binding Study
Equilibrium Dialysis dianggap sebagai metode referensi untuk menilai tingkat ikatan
protein plasma dengan obat dimana ikatan yang tidak spesifik tidak berdampak pada
penentuan fraksi bebas. Tingkatan ikatan protein dievaluasi dengan menggunakan tiga
tingkat konsentrasi (0,1, 0,5 dan 2,0 mg / mL) dari wogonin dalam plasma tikus yang
masing-masing 90,26% 1,72%, 94,03% 2,12% dan 90,42% 5,41%.
Gambar 5. Persentase kumulatif dari dosis yang diekskresikan dalam tinja (a), urine (b)
dan empedu (c) setelah pemberian intravena 20 mg / kg wogonin. (Mean SD, n = 6).

pengetahuan farmakokinetik Padat dari senyawa alami dengan target yang sulit dipahami
dapat memainkan peran penting dalam desain yang tepat dan pilihan model farmakologis in vitro
untuk mengevaluasi mekanisme molekuler secara kinetik yang relevan . Dalam makalah ini,
metode LC-MS / MS yang cepat, sensitif, dan spesifik untuk penentuan wogonin pada plasma
tikus, berbagai jenis jaringan, feses, urine dan empedu telah dilaporkan. Metode ini cukup untuk
studi farmakokinetik plasma, jaringan distribusi dan ikatan protein dengan wogonin pada tikus
memuaskan dan dapat diterapkan dengan modifikasi untuk studi farmakokinetik yang lebih rinci
pada flavonoid lainnya. Dosis dalam penelitian ini dipilih berdasarkan studi toksikologi
sebelumnya menggunakan Sprague Dawley-tikus (NOAEL = 40 mg / kg, intravena).

Sebuah metode non-kompartemen digunakan untuk menghitung parameter farmakokinetik

wogonin. Setelah i.v. dosis tunggal, wogonin dengan cepat dieliminasi dari plasma. Profil
farmakokinetik wogonin tampaknya nonlinear dengan peningkatan yang tidak proporsional pada
paparan sistemik terhadap peningkatan dosis. profil ini dapat dijelaskan dengan kejenuhan
beberapa jalur clearance wogonin pada dosis tinggi tercermin dari penurunan sekitar 50% di CL
(mungkin karena kejenuhan UDP-glucuronosyltransferases (UGT) , enzim yang bertanggung
jawab untuk metabolisme wogonin , yang secara tidak proporsional meningkatkan konsentrasi
wogonin dalam plasma, akibat dari dosis yang tidak proporsional meningkatkan nilai AUC0-.

Bioavailabilitas oral yang diamati rendah pada wogonin (1,10%) dihasilkan dari senyawa
yang kelarutannya rendah , dan tinggi usus dan first pass effect di hati. Penelitian ini juga
meneliti jaringan distribusi dari wogonin pada tikus setelah menerima i.v. dosis tunggal. Hasil
penelitian menunjukkan bahwa proses distribusi sangat cepat mencapai semua jaringan yang
diperiksa dengan tingkat tertinggi terdeteksi di ginjal menunjukkan peran potensial dari ginjal
dalam clearance ekstra-hepatik wogonin. Selain itu, tingkat di hati tinggi diamati sesuai dengan
studi metabolisme sebelumnya melaporkan bahwa wogonin mengalami glucuronidation luas,
reaksi metabolisme Tahap II terjadi terutama di hati, dengan wogonin7-D-glukuronat sebagai
metabolit utama. wogonin7-D-glukuronat kadar plasma yang ditemukan menjadi 100 kali lipat
lebih tinggi daripada molekul tidak berubah . Kehadiran wogonin di otak dapat terlihat. Namun,
karena tingkat wogonin dan Kp di otak rendah, kontaminasi darah tidak dapat dikesampingkan.
Tingkat wogonin di testis hamper sama dengan yang di hati, perut, dan limpa, menunjukkan
bahwa wogonin efektif bisa menyeberangi Blood-Testis Barrier (BTB) itu. Temuan ini
menunjukkan bahwa wogonin mungkin dapat membantu dalam pengobatan meningkat kanker
testis .

Jalur utama ekskresi dari bentuk yang belum berubah dari wogonin adalah pada tinja
dengan dosis terekskresi kumulatif sekitar 16% dan dosis kumulatif biliairy sangat rendah
(0,41%), menunjukkan bahwa wogonin menjalani ekskresi intestinal . Sekitar 80% dari dosis
yang disuntikkan tetap dihitung. Secara bersama-sama dengan hasil metabolisme, temuan ini
menunjukkan bahwa wogonin terutama diekskresikan sebagai bentuk terkonjugasi nya. Studi
ekskresi wogonin lebih lanjut, metabolit dan pengaruh potensial dari isi usus yang diperlukan
untuk sepenuhnya memastikan profil ekskresi wogonin. kemampuan ikatan Protein dengan obat
dalam plasma darah merupakan faktor yang sangat penting yang mempengaruhi konsentrasi
bebas di darah dan jaringan distribusi. Wogonin menunjukkan tingkat ikatan protein tinggi (lebih
dari 90%) dengan plasma tikus, mengurangi substancially paparan bebas senyawa.

efikasi obat yang diberikan ketika mencapai tingkat eksposur yang tepat dan waktu target
(s) . Setelah dosis i.v. pada konsentrasi tertinggi, konsentrasi wogonin dalam plasma di bawah
100 M di sekitar 7 menit, under10 pM di sekitar 20 menit dan di bawah 1 pM di 60 menit,
dengan fraksi terikat rendah (10%). nilai kp disediakan untuk jaringan yang berbeda pada titik
waktu yang berbeda. Data yang diberikan dalam pekerjaan ini harus diambil dengan
pertimbangan memilih dosis yang tepat untuk studi farmakologi in vitro, tergantung pada target
potensial dieksplorasi.

3. Experimental

3.1. Kimia dan Reagen

Wogonin (> 99,0%, kemurnian) disediakan oleh Departemen Obat Kimia, China Pharmaceutical
University (Nanjing, Cina). Repaglinide (> 98,0%, kemurnian), wogonin standar internal (IS),
disediakan oleh National Institute for the Control of Pharmaceutical dan Biological
Products (Beijing, China). HPLC metanol diperoleh dari Tedia Company (Fairfield, CA,
USA). HPLC kelas amonium asetat dibeli dari Nanjing Chemical Reagent Co, Ltd (Nanjing,
Cina). air deionisasi dimurnikan menggunakan sistem Milli-Q (Millipore, Milford, MA, USA).
Semua reagen lain dari kelas analitis diperoleh dari sumber komersial konvensional.
3.2. Percobaan hewan

Sprague Dawley-tikus (200 20 g) yang disediakan oleh Experimental Animal Center of

Zhejiang province (Hangzhou, Cina). Hewan ditempatkan di bawah kondisi yang terkendali
(suhu 22 2 C, kelembaban 50% 5%, 12 h gelap / siklus cahaya) dengan diet standar dan
diaklimatisasi selama 7 hari, sebelum percobaan. Tikus-tikus dipuasakan 12 jam sebelum
pemberian wogonin tetapi dengan akses bebas ke air. Protokol penelitian disetujui oleh Animal
Ethics Committee of China Pharmaceutical University (Nanjing, Cina).
3.3. LC-MS / MS Analisis

Sistem LC-MS / MS terdiri dari LC-20AD sistem seri HPLC Shimadzu (Shimadzu,
Kyoto, Jepang) dan sistem Thermo Scientific TSQ Quantum MS / MS (Thermo Fisher Scientific,
Waltham, MA, USA) dengan electrospray ionization (ESI). Data dianalisis dengan
Xcalibur 2.0 software (Thermo Fisher Scientific). Pemisahan dilakukan pada Hedera ODS-2
kolom (2,1 150 mm, 5 m, Hanbon, Jiangsu, Cina) disimpan pada 40 C. Fase gerak terdiri dari
metanol (fase gerak A) dan air (yang mengandung 5 mmol / L amonium asetat, ponsel fase B)
dengan tingkat ditetapkan pada 0,3 mL / menit. Kurva elusi gradien termasuk 0-1,5 min, 45% B;
penurunan linear sampai 5% B dalam jarak 0,5 menit; 5% B selama 3,5 menit; peningkatan
linear untuk 45% B dalam 0,3 menit. 45% B untuk 3,2 menit; 9.00 min, berhenti.
LC-MS / MS dilakukan dalam reaksi positif dan dipilih pemantauan modus (SRM). ion
terdeteksi berada di m / z 285,1 270,1 untuk wogonin dan m / z 453,0 230.0 untuk standar
internal (repaglinide). Parameter dari spektrometer massa dioptimalkan sebagai berikut: semprot
tegangan 4.0 kV; Suhu kapiler 350 C; selubung gas (N2) 35 Arb; gas tambahan (N2) 5 Arb dan
gas tabrakan (Ar) 1.0 mTorr.

3.4. Pharmacokinetic Studies

Dua puluh empat tikus secara acak dibagi menjadi empat kelompok, masing-masing enam
tikus (tiga laki-laki, tiga perempuan), dan menerima pemberian intravena wogonin tunggal
masing-masing 10, 20 dan 40 mg / kg, atau administrasi intragastrik 100 mg / kg. Setelah
pemberian dosis, sampel darah dikumpulkan dalam tabung heparin pada 5, 10, 20, 30, 45, 60 dan
120 menit untuk yang kelompok i.v., dan pada 10, 20, 30, 45, 60, 90 dan 120 menit untuk yang
kelompok i.g. Plasma diisolasi dari sampel darah dengan sentrifugasi dan kemudian disimpan
pada suhu -70 C sampai analisis.

sampel plasma (100 uL) ditambah dengan 20 uL standar internal (repaglinide, 200 ng /
mL) dan diekstraksi dengan 600 uL etil asetat oleh vortexing selama 10 menit. Fase organik dan
air dipisahkan dengan sentrifugasi pada 12.000 g selama 3 menit. Fase organik atas dipindahkan
ke tabung lain dan diuapkan sampai kering pada 50 C. residu dilarutkan dalam 100 mL
asetonitril dan di vortex. Alikuot 10 uL larutan disuntikkan ke sistem LC-MS / MS untuk
analisis.

3.5. Tissue Distribution Study

Kelompok lain delapan belas tikus yang i.v. diberikan dosis tunggal 20 mg / kg wogonin
melalui vena ekor. Jaringan (jantung, hati, limpa, paru-paru, ginjal, lambung, otak, usus kecil,
testis / ovarium, kulit, otot dan lemak) segera diambil pada 10 atau 60 atau 120 menit setelah
pemberian dosis (enam tikus per titik waktu, tiga laki-laki dan tiga perempuan) dan dibilas dalam
garam dingin untuk menghilangkan darah dan konten lainnya. Sampel darah dikumpulkan ke
dalam tabung heparin sebelum eksisi jaringan. Setiap sampel jaringan dihomogenisasi (Tissue
sampel: rasio garam dari 1: 3, w / v). Sampel jaringan disimpan pada -70 C sampai analisis
lebih lanjut. Proses persiapan untuk analisis adalah sama seperti yang dijelaskan di atas untuk
plasma.

3.6. Excretion Studies

Enam tikus (tiga laki-laki dan tiga perempuan) yang bertempat di kandang metabolik
terpisah dan menerima dosis intravena tunggal wogonin pada 20 mg / kg melalui vena ekor. Urin
dan feses sampel dikumpulkan pada 0-2 jam, 2-4 jam, 4-8 jam, 8-12 jam, 12-24 jam, dan 24-36
jam pasca pemberian dosis. Enam tikus (tiga laki-laki, tiga perempuan) yang i.v. dosis pada 20
mg / kg wogonin setelah saluran empedu kanulasi. Sampel empedu dikumpulkan di 0,0-0,5 jam,
0,5-1 jam, 1-2 jam, 2-4 jam, 4-6 jam, 6-8 jam, dan 8-12 interval h. Tinja ditimbang dan homogen
(tinja: rasio air 1: 4, w / v) dan volume urin dan empedu sampel diukur sebelum disimpan pada
suhu -70 C. Sampel kemudian dikenakan prosedur yang sama seperti yang dijelaskan untuk
sampel plasma.

3.7. Plasma Protein Binding Test

Sebuah metode dialysis equilibrium dimodifikasi [34] diterapkan dalam penelitian ini
untuk menentukan ikatan protein plasma wogonin dalam plasma tikus. Di luar bag filter adalah
penyangga fosfat (0,02 mol / L, pH 7.40) dicampur dengan NaCl (0,15 mol / L), sedangkan di
dalam bag filter adalah plasma tikus (500 uL). Tiga kelompok (n = 3) disusun dengan konsentrasi
wogonin luar bag filter ditetapkan pada 0,1, 0,5 dan 2 mg / mL. Sistem dialisis diinkubasi pada
suhu 4 C selama 72 jam untuk mencapai keseimbangan. Yang dihasilkan plasma dan
penyangga dialisat segera pulih dan dianalisis dengan LC-MS / MS setelah persiapan sampel
seperti dijelaskan di atas. Tingkat pengikatan wogonin dalam percobaan dialysis equilibrium
dinyatakan sesuai dengan persamaan:

di mana fb adalah fraksi dibatasi, Chamber 1 adalah konsentrasi senyawa dalam

kompartemen plasma dan Chamber 2 adalah konsentrasi senyawa dalam kompartemen buffer
fosfat.

3.8. Pharmacokinetic and Statistical Analysis

Parameter farmakokinetik dihitung dengan menggunakan software farmakokinetik DAS 2.1.1

(Matematika Farmakologi Komite Profesional Cina) dengan metode non-kompartemen. waktu
paruh eliminasi (t 1/2) ditentukan dengan regresi linear dari bagian terminal (tiga poin terakhir)
dari kurva konsentrasi plasma-waktu. daerah di bawah kurva konsentrasi plasma-waktu dari nol
ke terukur titik konsentrasi plasma terakhir (AUC0-t) dihitung dengan linear yang Metode
trapesium. Ekstrapolasi dari waktu nol hingga tak terbatas (AUC0-) dihitung sebagai berikut:

AUC0- = AUC0-t + Ct/ke

di mana Ct adalah konsentrasi plasma terukur terakhir dan Ke adalah terminal laju eliminasi
konstan. Absolute bioavailabilitas oral (F) dari wogonin dihitung menurut berikut persamaan:

F (%) = (AUC ig doseiv)/(AUC iv doseig) 100

di mana AUCig dan AUCiv adalah nilai-nilai AUC setelah pemberian intragastrik dan intravena
wogonin, dan Div dan Dig adalah dosis yang diberikan untuk pemberian intravena dan
intragastrik dari wogonin. Data disajikan sebagai rata-rata dengan standar deviasi mereka(Mean
SD).

4 Conclusions
 Dalam penelitian ini, metode LC-MS / MS sepenuhnya divalidasi berhasil
diterapkan untuk mengetahui karakteristik farmakokinetik wogonin pada
tikus, termasuk kinetika plasma, jaringan distribusi, ekskresi dan sifat ikatan
protein plasma . Di luar peningkatan pengetahuan profil farmakokinetik
untuk wogonin, penelitian ini akan memberikan kontribusi untuk penelitian
lebih lanjut.