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Eletroforese

A eletroforese em gel uma tcnica na qual molculas carregadas so


separadas de acordo com a sua carga ou massa medida que so foradas
a mover-se atravs de uma matriz de gel por aplicao uma corrente
eltrica. Proteins are commonly separated in this manner using
polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) to identify individual proteins in
complex samples or to examine multiple proteins within a single sample.
As protenas so geralmente separados desta maneira usando eletroforese
em gel de poliacrilamida (PAGE) para identificar protenas individuais em
amostras complexas ou para examinar vrias protenas dentro de uma nica
amostra.
Acrilamida misturada com bisacrilamida forma uma rede de polmero
reticulado em que o agente de polimerizao, persulfato de amnio (APS),
adicionado. TEMED (N,N,N,N'-tetramethylenediamine) catalyzes the
polymerization reaction by promoting the production of free radicals by APS.
TEMED (N, N, N, N'-tetrametilenodiamina) catalisa a reao de
polimerizao, atravs da promoo da produo de radicais livres pelos
APS.

Figura 1- imagem representativa das reaes do gel de poliacrilamida.

Numa eletroforese 2D, realiza-se primeiramente uma IEF( focagem


isoeltrica ) o qual separa as protenas de acordo com o seu ponto
isoeltrico (pi), para uma migrao numa fita ao longo de um gradiente de
pH, com aplicao de uma corrente eltrica depois de colocada a amostra
na extremidade da fita com pH mais baixo(nodo +) e adio de uma
soluo tampo com afinidade aos analitos. O movimento da protena na
fita pra quando esta atinge o pH igual ao seu ponto isoeltrico.
Na tcnica SDS PAGE as amostras so previamente aquecidas com tampo
de amostra, contendo Tris, SDS, glicerol, DTT e azul bromofenol.
As amostras so aquecidas em dodecilo sulfato de sdio (SDS), antes da
eletroforese que por ser um detergente inico provoca a desnaturao e ao
ligar-se s protenas torna-as negativamente carregadas. Assim, quando
aplicada corrente todas as protenas ligadas ao SDS numa amostra iro
migrar atravs do gel em direo ao eltrodo com carga positiva.
Figura 2- Efeito desnaturante do SDS

A adio de glicerol vai dar uma maior densidade amostra, possibilitando


que a amostra permanea nos poos do gel aquando a sua aplicao, sem
que a amostra contamine os outros poos. Geralmente, um agente redutor
tal como ditiotreitol (DTT) adicionado para clivar ligaes dissulfureto. O
Tris permite manter o pH da amostra semelhante ao pH do gel de forma a
no haver alteraes de solubilidade das protenas, visto que o pH influncia
a solubilidade. O corante azul de bromofenol permite visualizar as amostras
quando estas esto a ser separadas.
No final da eletroforese para que se possa visualizar a separao da
amostra faz-se colorao com CBB (Coomassie brilliant blue) ou nitrato de
prata.

Figura 3- Representao das duas dimenses da eletroforese 2D.

Depois de realizada SDS PAGE pode realizar-se a tcnica Western blot que
utiliza anticorpos para identificar alvos proteicos especficos ligados a uma
membrana; the specificity of the antibody-antigen interaction enables a
target protein to be identified in the midst of a complex protein mixture. a
especificidade da interao anticorpo-antignio permite uma protena alvo a
ser identificado no meio de uma mistura de protenas complexa. Western
blotting can produce qualitative and semi-quantitative data on a protein of
interest. Aps a eletroforese, as molculas separados so transferidos ou
transferidas para uma segunda matriz, geralmente uma membrana de
nitrocelulose ou de difluoreto de polivinilideno (PVDF). Next, the membrane
is blocked to prevent any nonspecific binding of antibodies to the surface of
the membrane. Em seguida, a membrana bloqueada para evitar qualquer
ligao no especfica de anticorpos superfcie da membrana. Existem
vrios mtodos de deteo mas o utilizado neste caso foi o mtodo de
deteo indireta. Neste mtodo um anticorpo primrio adicionado em
primeiro lugar para se ligar ao antignio. This is followed by a labeled
secondary antibody that is directed against the primary antibody. Isto
seguido por um anticorpo secundrio marcado, que dirigido contra o
anticorpo primrio. Labels include biotin, fluorescent probes such as
fluorescein or rhodamine, and enzyme conjugates such as horseradish
peroxidase or alkaline phosphatase.

Figura 4- Mtodo indireto de deteo de


protenas. adicionado um anticorpo primrio
que se liga ao antignio e de seguida um
secundrio dirigido contra o anticorpo
primrio.

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