Professional Documents
Culture Documents
13057/biotek/c010201
ABSTRACT
A study has been conducted to screen and multiply calluses and buds of
tobacco transformed with the Soybean Mosaic Virus (SMV) coat protein
gene and to induce them to plantlet formation by using MS medium with
phytohormon treatments. The multiplication of calluses and buds was
carried out by sub-culturing on MS medium using 0.3 mg/L NAA+1 mg/L
BAP, followed by induction of plantlet formation on MS medium
supplemented with NAA and BAP at varied concentration. The results
showed that tobacco calluses transformed with SMV coat protein gene was
multipliable on MS medium supplemented with NAA at a concentration of
0.3 mg/mL and BAP at 1 mg/L concentration. In this experiment kanamycin
was used at a concentration of 100 g/mL which resulted in the viability
level of 84%. On MS medium supplemented with 0.3 mg/L NAA, 0.1 mg/L
Alamat korespondensi: BAP, and 100 g/mL kanamycin, induction of calluses to plantlet formation
Jl. HOS Cokroaminoto 17,
reached 20% level.
Yogyakarta 55256.
Tel/Fax: +62-274-618044.
e-mail: ettym@umy.ac.id, Keywords: multiplication, induction, selection, tobacco, SMV coat protein
ettym@eudoramail.com gene.
pertumbuhan tanaman. Daun belang dengan secara in vitro pada aras molekular maupun
warna hijau muda sampai kuning, luas daun pengujian dilapangan berupa ketahanan
tidak merata, daun menjadi kering dan keriput, terhadap virus. Faktor yang mempengaruhi
sehingga menurunkan mutu daun dan nilai keberhasilan kultur in vitro antara lain: keadaan
jualnya menjadi rendah. Mosaik tembakau dapat aseptis, lingkungan fisik seperti cahaya dan
menurunkan produksi hingga 60% (Semangun, temperatur, sumber eksplan, komposisi media
1991). dan ZPT (zat pengatur tumbuh) (Pierik, 1987).
Berbagai cara pengendalian penyakit akibat Kultur in vitro tembakau transgenik cp-SMV
virus telah dilakukan, namun hasilnya kurang pada medium MS yang ditambah NAA kadar 0,3
memuaskan. Pada saat ini banyak peneliti mg/L dan BAP kadar 1 mg/L dapat
menggunakan teknik rekayasa genetik untuk menghasilkan kalus dan tunas (Agung-Astuti et
mengembangkan tanaman transgenik yang tahan al., 2002). Selanjutnya hasil penelitian
terhadap virus yang disebut sebagai CP-Mediated Estuningsih (1999) menunjukkan bahwa kultur in
Resistance (CP-MR),, yaitu: ketahanan tanaman vitro tembakau akan menghasilkan planlet pada
yang disebabkan oleh ekspresi gen coat protein medium MS yang ditambah dengan NAA 3
(Beachy, 1998). Dilaporkan oleh Power-Abel et mg/L dan BAP 1 mg/L.
al., (1986) tembakau transgenik cp-TMV yang Tujuan penelitian ini adalah (i)
resisten terhadap TMV ternyata tidak memperbanyak kalus dan tunas tembakau hasil
menunjukkan adanya gejala penyakit, meskipun transformasi gen cp-SMV; (ii) menginduksi
diinokulasi dengan Tomato Mosaic Virus(ToVM) menjadi planlet pada medium MS dengan
maupun SMV. Demikian juga tomat yang perlakuan ZPT; dan (iii) menyeleksi transforman
diinfeksi gen cp-TMV ternyata tahan terhadap terhadap ketahanan kanamisin. Dari hasil
ToVM (Nelson, 1988). penelitian ini diharapkan diperoleh kalus, tunas
Untuk mendapatkan tanaman kedelai yang dan planlet tembakau hasil transformasi yang
tahan terhadap penyakit Mosaik, perlu selanjutnya dapat dikembangkan dengan
dikembangkan tanaman transgenik dengan serangkaian penelitian dan pengujian. Apabila
penyisipan gen cp-SMV. Isolasi virus SMV isolat telah dihasilkan tanaman tembakau atau kedelai
lokal dari Yogyakarta dan amplifikasi gen coat transgenik tahan virus maka pada akhirnya
protein SMV telah dilakukan dan berhasil diklon dapat dikembangkan bibit tahan virus secara
pada plasmid pCP 19-1, kemudian dipindah ke massal melalui kultur in vitro untuk memenuhi
vektor pRT 101 dan pCV002, lalu ditransformasi kebutuhan petani, sehingga penurunan produksi
ke bakteri Agrobacterium (Sismindari dan Sujadi, akibat serangan virus dapat dikendalikan.
1996). Selanjutnya Agrobacterium yang
mengandung cp-gen tersebut telah berhasil
ditransformasikan ke daun tembakau dengan BAHAN DAN METODE
metode leaf disc transformation dan membentuk
kalus tunas pada medium MS yang ditambah Bahan dan alat
NAA kadar 0,3 mg/L dan BAP kadar 1 mg/L Bahan yang digunakan pada penelitian terdiri
dengan penanda kanamisin untuk seleksi dari: bakteri Agrobacterium yang mengandung
(Agung-Astuti et al., 2002). plasmid rekombinan cp-SMV isolat lokal dari Dr.
Tujuan jangka panjang penelitian ini adalah Sismindari, Apt. Kalus tembakau transgenik cp-
untuk mendapatkan tanaman kedelai yang tahan SMV koleksi Ir. Agung-Astuti, M.Si. Medium MS
terhadap infeksi virus SMV dengan mekanisme dengan NAA dan BAP untuk multiplikasi dan
CP-MR. Untuk mengetahui bekerjanya sistem induksi kultur in vitro. Alat-alat yang digunakan
ekspresi gen cp-SMV isolat lokal, maka perlu terdiri dari: alat gelas untuk kultur in vitro,
ditransformasi ke tembakau sebagai tanaman dissetting set, laminar air flow, autoklaf,
model, karena tembakau sudah biasa digunakan timbangan analitik, dan mistar.
dalam penelitian transformasi, sehingga relatif
mudah diperoleh transformasi genetik dan
regenerasi tanaman transgeniknya dalam kultur Cara kerja
in vitro.
Untuk mengembangkan tembakau transgenik Multiplikasi kalus
yang tahan virus, maka harus dilakukan Kalus tembakau hasil transformasi dimulti-
multiplikasi kalus dan induksi planlet, sebelum plikasi pada medium MS sesuai prosedur Goerge
aklimatisasi serta serangkaian pengujian baik dan Sherington yang ditambah NAA kadar 0,3
AGUNG-ASTUTI dkk. Tembakau hasil transformasi gen coat protein SMV 33
Multiplikasi
Induksi tunas
Kalus transforman
gen cp SMV
Planlet tembakau
hasil screening
Hasil multiplikasi menunjukkan bahwa 84% dan seleksi kanamisin 100 g/mL diamati,
eksplan mampu hidup pada medium MS hasilnya disajikan pada Gambar 2 dan Gambar 3.
ditambah NAA kadar 0,3 mg/L dan BAP kadar 1 Dari Gambar 2 dan 3 diketahui bahwa
mg/L dengan kanamisin 100 g/mL sebagai beberapa eksplan tanaman tembakau mengalami
marker seleksi. Hal ini disebabkan gen cp-SMV pertambahan tinggi dan jumlah daun yang
telah dikonstruksi pada plasmid pCV002 yang sangat nyata. Hal ini menunjukkan adanya
mempunyai resistensi terhadap kanamisin, dan perkembangan kalus tembakau hasil
pada saat transformasi terjadi integrasi ke sel transformasi gen cp-SMV secara in vitro melalui
tembakau melalui T-DNA bakteri Agrobacterium, organogenesis,, yaitu: terbentuk kalus yang baru
sehingga kalus tembakau yang mengandung gen dan tunas atau daun. Eksplan yang dikulturkan
cp-SMV mampu hidup pada medium MS yang mengalami morfogenesis organ adventif secara
ditambah kanamisin (Sheng dan Citovsky, 1996; tidak langsung. Eksplan membentuk kalus
Sismindari dan Sudjadi, 1996). terlebih dahulu, kemudian dirangsang pada
Pertambahan tinggi eksplan dan jumlah daun medium baru, selanjutnya sel kalus akan
selama multiplikasi pada medium MS dengan berdiferensiasi dan bermorfogenesis membentuk
NAA kadar 0,3 mg/L dan BAP kadar 1 mg/L tunas dan daun (Mantell et al., 1985).
AGUNG-ASTUTI dkk. Tembakau hasil transformasi gen coat protein SMV 35
Induksi planlet dan seleksi tembakau hasil sedang 12% mengalami pencoklatan (browning)
transformasi gen cp-SMV atau pemucatan (filtrifikasi) dan 4% mengalami
Kalus dan daun tembakau hasil trans-formasi kontaminasi oleh bakteri. Penurunan persentase
yang diperoleh dari multiplikasi kalus pada induksi planlet disebabkan adanya resistensi
medium MS diinduksi dengan variasi berbagai terhadap kanamisin. Sel yang tidak mengandung
kadar NAA dan BAP. Rerata berat segar eksplan gen cp-SMV dengan penanda kanamisin akan
dan persentase planlet tersaji pada Tabel 1. Dari mengalami pencoklatan, pemucatan atau
tabel tersebut tampak bahwa medium MS yang kematian, sebab kanamisin akan mengubah
diinduksi dengan variasi berbagai kadar NAA konformasi ribosom, sehingga ikatan aminoasil
dan BAP menunjukkan tidak adanya pengaruh tRNA pada mRNA tidak mantap dan transfer
secara nyata terhadap berat segar eksplan. asam amino menjadi tidak sempurna akibatnya
Namun kadar NAA 0,3 mg/L dan BAP 0,1 mg/L metabolisme terganggu dan terjadi kematian
mampu menginduksi planlet tertinggi, 80%. (Prescot et al., 1999).
Auksin merupakan ZPT yang secara in vitro
berperan dalam pembentukan akar. NAA 0,3
mg/L dapat memacu pembentukan akar, KESIMPULAN DAN SARAN
selanjutnya ditambah dengan BAP 0,1 mg/L
mampu meng-imbangi adanya sitokinin endogen Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa:
dalam eksplan sehingga merangsang (i) kalus tembakau hasil transformasi gen cp-
pembentukan tunas dan planlet. Kadar auksin SMV dapat dimultiplikasi pada medium
dan sitokinin yang tinggi menyebabkan MS+NAA 0,3 mg/L+BAP 1 mg/L+kanamisin
terbentuknya kalus. 100 ug/mL dengan persentase hidup sebesar
84%; (ii) eksplan mengalami morfogenesis organ
adventif secara tidak langsung dengan
Tabel 1. Rerata berat segar eksplan dan persentase membentuk kalus yang akan berdiferensiasi dan
planlet tembakau hasil transformasi gen cp-SMV umur bermorfogenesis membentuk tunas dan daun;
8 minggu. (iii) kalus tembakau hasil transformasi gen cp-
SMV yang dapat didiinduksi menjadi planlet
Medium MS dengan Rerata Persentase
sebesar 20% pada medium MS ditambah NAA
perlakuan kadar berat segar planlet
NAA+BAP (mg/L) (g) (%) kadar 0,3 mg/L dan BAP kadar 0,1
0,1+0,1 1,75 a 40 mg/L+kanamisin 100 g/ml.
0,1+0,5 1,72 a 0 Penelitian selanjutkan disarankan untuk
0,1+1,0 1,58 a 40 memfokus pada: (i) deteksi gen cp-SMV pada
0,3+0,1 2,81 a 80 kalus dan tunas tembakau hasil transformasi; (ii)
0,3+0,5 1,85 a 20 penelitian in vitro untuk mempersiapkan planlet
0,3+1,0 1,67 a 0 agar dapat diaklimatisasi; (iii) pengujian
1,0+0,1 1,66 a 20 ketahanan bibit tembakau transgenik cp-SMV
1,0+0,5 1,71 a 0
terhadap penyakit TMV; dan (iv) penelitian
1,0+1,0 1,72 a 20
2,0+0,1 1,48 a 0
kultur in vitro kedelai untuk selanjutnya
2,0+0,5 1,49 a 0 ditransformasi dengan gen cp-SMV.
2,0+1,0 1,98 a 0
3,0+0,1 1,81 a 0
3,0+0,5 1,85 a 0 DAFTAR PUSTAKA
3,0+1,0 1,80 a 0
Keterangan: angka yang diikuti dengan huruf sama Agrios, G.N. 1988. Plant Pathology. 3th ed. New York:
menunjukkan tidak ada beda nyata menurut uji F Academic Press.
jenjang 5%. Agung-Astuti, D. Sunarwati, dan Sismindari. 2002.
Transformasi Gen Coat Protein SMV ke Daun Tembakau
melalui Agrobacterium. Prosiding Seminar Nasional Inovasi
Selanjutnya planlet diseleksi menggunakan Teknologi Dalam Mendukung Pengembangan Agribisnis. 2002
medium MS ditambah NAA kadar 0,3 mg/L dan Beachy, RN. 1998. Virus-resistant Transgenic Plants. In:
BAP kadar 0,1 mg/L dengan kanamisin 100 Biotechnology in Plant Disease Control. New York: Wiley-
Liss.
g/ml. Hasil seleksi transforman terhadap Estuningsih, S.P. 1999. Budidaya Tembakau Temanggung yang
ketahanan kanamisin menunjukkan bahwa Berciri Srintil Secara In Vitro. [Tesis S-2]. Yogyakarta:
planlet yang terinduksi sebanyak 20%, Program Pasca Sarjana UGM.
pembentukan kalus dan tunas sebesar 64%; Mantell, S.H., J.A. Matthews, and R.A. McKee. 1985. Principle
of Plant Biotechnology An Introduction To Genetic
36 Bioteknologi 1 (2): 31-36, Nopember 2004
Engineering in Plants. London: Blackwell Scientific Prescot, L.M., J.P. Harley, and D.A. Klein. 1999. Microbiology.
Publications. New York: McGraw-Hill Book Co.
Nelson, R.S. 1988. Virus tolerance, plant growth and field Semangun, H., 1991. Penyakit-penyakit Tanaman Perkebunan di
performance of transgenic tomato plant expressing coat Indonesia. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.
protein from TMV. Bio/Technology 6: 403-409. Sheng, J. and V. Citovsky. 1996. Agrobacterium-Plant Cell
Pierik, R.I., 1987. In Vitro Culture of Higher Plant. Netherlands: DNA Transport: Have Virulence Protein, Will Travel. The
Martinus Nijhoff Pub. Plant Cell 8: 1699-1710.
Power-Abel, P., R.S. Nelson, B.D.N. Hoffmann, F. Roger, and Sismindari dan Sujadi. 1996. Kloning Gen Coat Protein SMV
R.N. Beachy. 1996. Delay of desease development in dengan pendekatan PCR. Jurnal Perlindungan Tanaman
transgenic plant that express the TMV coat protein gene. Indonesia 2: 36-39
Science 232: 738-743 Somaatmadja, S. 1988. Kedelai. Bogor: Badan Penelitian dan
Pengembangan Pertanian P3TP.