Cultivo in vitro de tejidos vegetales

Tatiana Vega
Investigador Asistente CIC - Area Gentica - Fac. Ciencias Agrarias
JTP Area Biologa Fac. Cs. Bioquimicas y Farmaceuticas
UNR
 Cultivo de tejidos vegetales

Conjunto de tcnicas de laboratorio en el que se obtienen

plantas completas a partir de una porcin reducida de
tejido separado de la planta
 Totipotencia
Potencialidad inherente de las clulas vegetales de
regenerar una planta completa, bajo los estmulos
adecuados - Haberlandt (1900s)

directa
Formacin de rganos Organognesis
indirecta

directa
Formacin de embriones Embriognesis
somatica indirecta
Explanto

Planta completa
Va indirecta: con formacin de callo

Grafi G. et al., 2011. doi: 10.3389/fpls.2011.00053

Organognesis directa: sin formacion de callo
formacin de meristemoides
Embriognesis somtica

Fernando J. et al., 2002. http://dx.doi.org/10.1590/S1516-89132002000300005

Embriognesis somtica en zanahoria. A partir de clulas del floema
se obtienen los embriones somticos que son un excelente sistema de
propagacin clonal. Los bioreactores permiten el cultivo a gran escala
de los mismos.
Produccin de semillas artificiales via embriognesis somtica

Induccin de la embriognesis somtica (a-d); seleccin de embriones

somticos (e); inmersin de los embriones en alginato de sodio (f);
acomplejamiento con nitrato de calcio (g); lavado (h); semilla sinttica (i)
a) Partes de una semilla
sinttica .b,c y d) Obtencin
de plantas de Arachis pintoi
(2n=3x=30) mediante
semillas sintticas (las
barras verticales indican 3
mm)
 Aplicaciones
Estudios bsicos de procesos fisiolgicos en sistemas de clulas
indiferenciadas, o en determinados rganos o grupos de clulas.

En este caso lo que se persigue es la obtencin de callos (cmulos de

clulas indiferenciadas) o de rganos determinados como ovarios o
tallos.

Helianthus annuus
Vega T., 2004

Nicotiana tabacum
Source: Wikimedia commons
 Aplicaciones
Obtencin de plantas con sanidad controlada. En caso de la
infeccin por virus que se dispersan por el sistema vascular, es
comn el cultivo de meristemas para obtener nuevas plantas
completas no infectadas.
 Aplicaciones
Para las especies que se multiplican por esquejes, bulbos o tubrculos
Tcnica: cultivo de meristemas
Algunas caracteristicas del tejido meristemtico:

-Sistema vascular poco diferenciado

-Elevada actividad metablica
-Elevadas concentraciones de auxinas

Existen virus que dejan sectores tejidos sin infectar y

slo unos pocos invaden los tejidos meristemticos
Varios factores pueden afectar el desarrollo
in vitro de una planta a partir de un meristema:

- medio de cultivo empleado

- estado fisiolgico del explanto
- concentracin de hormonas endgenas
- contaminaciones internas o externas producidas
durante el desarrollo del cultivo
- tamao y localizacin del explanto
Desarrollo del cultivo:

- Fase I. Etapa de iniciacin

- Fase II. Etapa de multiplicacin.
- Fase III. Etapa de acondicionamiento para el
transplante a tierra.
- Transplante.
Camara de cultivo
Aclimatacion
Anlisis de las plantas obtenidas :

-ISEM (observacin directa por microscopio)

-ELISA (hasta 10 ng/ml)
-PCR (hasta 10 pg/ml)
Produccin de plantas de ajo libre de virus
INTA EEA. Entre Ros, Argentina.
Produccin de plantas de ajo libre de virus
INTA EEA. Entre Ros, Argentina.
Produccin de plantas de ajo libre de virus
INTA EEA. Entre Ros, Argentina.
 Aplicaciones
Micropropagacin. Es posible obtener plantas completas a partir
de yemas o pices terminales, o la obtencin de embriones a
partir de clulas somticas que pueden ser utilizados en la
produccin de semillas sintticas.
La micropropagacin consiste
en la propagacin de un
genotipo a gran escala a travs
del empleo de tcnicas de
cultivo de tejidos.

Posibilita la produccin de
plantas de calidad uniforme a
escala comercial, a partir de un

genotipo selecto y con una tasa

de multiplicacin ilimitada.
Ejemplo: Etapas de la micropropagacin en plantas de paraso gigante, Melia azedarach var.
gigantea L. (Olmos et al., 2002. In Vitro Cell Dev Biol Plant 38:617-622): A) Huerto semillero de
paraso gigante con ejemplares de seis aos de edad B) Etapa 0: plantas utilizadas como
donantes de meristemas. C) Etapa 1: Establecimiento del cultivo: D) Etapa de Multiplicacin:
vstagos luego de 30 das sobre medio de multiplicacin E) Explantos provenientes de la etapa
de multiplicacin con problemas de vitrificacin y presencia de calloF) Vstago enraizado en
medio de MS con la concentracin salina reducida a la mitad durante 2 das, seguido por el
subcultivo en medio basal durante 30 das hasta estar listo para pasar a la etapa de
aclimatizacin.
 Aplicaciones
Produccin de hbridos sintticos. En el caso de cruzamientos
interespecficos, en los que no se produce semilla por aborto
temprano de los embriones. Fue una de las primeras
aplicaciones de estas tcnicas.
Aplicaciones

http://agritech.tnau.ac.in/
 Aplicaciones

http://www.angenetik.fu-berlin.de/gerdemann_protoplastenfusion_eng.html
 Aplicaciones
Obtencin de plantas doble haploides. Generalmente a partir del
cultivo de anteras.
http://agritech.tnau.ac.in/
 Aplicaciones
Conservacin e intercambio de germoplasma. El cultivo y
criopreservacin de meristemas es la tcnica de eleccin para el
intercambio de material y la conservacin a mediano y largo
plazo.

Produccin de compuestos qumicos de inters comercial

 Aplicaciones
Transgnesis. Dentro de un protocolo de transformacin, ya sea
por infeccin con Agrobacterium o por bombardeo con
micropartculas, las etapas de regeneracin y seleccin in vitro
son de importancia crtica.
Mejoramiento gentico se basa en la existencia de
variabilidad gentica para los caracteres que se desea
mejorar y la reproduccin sexual para la incorporacin de
los mismos.

Transformacin Mtodo no sexual para la

transferencia de genes. Traspasa la barrera entre reinos.
1983 Primeros experimentos de transformacion en
Tabaco y Petunia
Hoy esta tecnologa se aplica a unas 120 especies.

Aplicaciones de inters agropecuario

-obtencin de plantas con resistencia a estreses biticos

(virus, insectos, hongos y bacterias) y a estreses
abiticos (salinidad, sequa, etc.)
-tolerancia a herbicidas para facilitar el control de
malezas
-modificacin de la calidad nutricional de los cultivos
Requerimientos para la obtencin de plantas
transgnicas

disponer del transgen a introducir

metodologa eficiente para su transferencia al genoma
vegetal
Inducir el desarrollo de plantas mediante distintas
tcnicas de cultivo de tejidos
identificar las plantas que porten y expresen el o los
transgenes en los niveles deseados
estudiar el comportamiento de los individuos
transgnicos y su descendencia
Mtodos de transformacin: biobalistica o Gene Gun
A, B, C: expresin
transitoria del gen
uidA en embriones
inmaduros 24 h
post-bombardeo. D y
E: embriones
inmaduros bajo
seleccin en
higromicina. F:
regeneracin de los
callos transgnicos
bajo seleccin.
Transformacin mediada por Agrobacterium
Transformacin mediada por Agrobacterium
http://5e.plantphys.net/article.php?id=216
Construccin del vector
Construccin del vector
Estructura de las protenas Cry de Bacillus thuringiensis

Tomado de: de Maagd et al., Trends in Plant Sci., 1999

Dominio I: insercin en la membrana y formacin de poros.

Dominio II y Dominio III: reconocimiento y unin al receptor.
Resistencia mediante EPSPS insensible a glifosato

Tomado de Coruzzi and Last, Biochemistry and Molecular Biolgy of Plants, 2000.
Golden Rice: produccin de de -caroteno en arroz
Golden Rice: produccin de de -caroteno en arroz
Control

Lnea z11b

Tomado de: Ye et al., Science, 2000.

 Eventos transgnicos aprobados en Argentina

http://www.isaaa.org

http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/event/default.asp?EventID=159

http://www.isaaa.org/gmapprovaldatabase/approvedeventsin/default.asp?CountryID=AR&Country=Argentina
http://en.biosafetyscanner.org/schedaevento.php?evento=104
Cultivo in vitro

CIM: medio de induccin de

callo:
MS + 2,4-D

SIM: medio de induccion de

vastagos (shoots):
MS + AIA + KIN + Gln
bibliografia general en espaol:

- Capitulo 2 del libro "Cultivo de Tejidos en la Agricultura: Fundamentos y

Aplicaciones. William M. Roca , Luis A. Mroginski (eds.) Centro Internacional de
Agricultura Tropical (1991).

link: http://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/cultivo_de_tejidos.htm

- Biotecnologia y Mejoramiento Vegetal II. Levitus G., Echenique V., Rubinstein

C., Hopp E., Mroginski L. (Eds.) INTA ediciones (2010).
http://intainforma.inta.gov.ar/wp-content/uploads/2010/09/bio_WEB.pdf
De este libro, los capitulos mas generales son I1, I2, I4, IV1, IV2, IV3 y V9