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Estudo Comparativo entre Metodos de Contagem de Plaquetas

Tayne Anderson Cortez Dantas', Isabelle Ribeiro Barbosa', Joaquim Otaviano da Costa Neto',
Maria das Gra~as Moreira Araujo2, Rosinete Guedes Carvalho de Miranda2, Tereza Maria Dantas de Medeiros)

I - Farmaceutico-Bioqufmico
2 - Farmaceutica-Bioqufmica. Laborat6rio de Anci/ises C1fnicas do Hospital Universitcirio Onofre Lopes,
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
3 - Professora-Adjunta da disciplina Hematologia C1fnica, Departamento de Ancilises
C1fnicas e Toxicol6gicas (DACT). Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN)

Trabalho realizado no Laborat6rio de Hematologia/DACT/UFRN como parte


experimental de Trabalho de Conclusao de Curso de alunos do Curso de Farmacia da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte - Habilita~ao Farmaceutico-Bioquimico Analista Clfnico.

Summary

Estudo comparativo entre metodos de contagem de Comparative study between platelets count methods
plaquetas The platelet count can be conducted by electronic or manual
A contagem de plaquetas pode ser realizada por metodos manu- methods. The purpose of this study was to compare the methods
ais ou eletr6nicos. Com 0 objetivo de comparar os metodos manual of manual and automated platelet counts. We examined 81 blood
e automatizado de contagem de plaquetas, foram examinadas 81 samples (48 with normal values of platelets and 33 with throm-
amostras de sangue (48 com valores norma is de plaquetas e 33 com bocytopenia) of individuals attending in the Clinical Laboratory
plaquetopenia) de individuos atendidos no Laborat6rio de Analises Analyses of Hospital Universitario Onofre Lopes and in Clinical
Clfnicas do Hospital Universitario Onofre Lopes e no Laborat6rio Analyses Integrate Laboratory, both from Universidade Federal do
Integrado de Analises Clinicas, ambos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Each sample was submitted to the platelet
Rio Grande do Norte. Cada amostra foi submetida a contagem de count by automated methods (Cell Dyn 3500) and manual. The
plaquetos pelos metodos automatizado (Cell Dyn 3500) e manual. A automated counting was done in whole blood. The manual counting
contagem automatizada foi realizada em sangue total e a contagem of the Neubauer chamber was held in whole blood and plasma
manual em camara de Neubauer utilizando sangue total e plasma obtained after 30, 60 and 120 minutes of spontaneous sedimenta-
obtido ap6s 30, 60 e 120 minutos de sedimenta~ao espontanea tion. There wasn't significant difference between counts of platelets
diluidos na propor~ao 1:200. Os resultados obtidos mostram que in whole blood, obtained by the automated method and the manual
nao houve diferen~a significativa entre as contagens em sangue method, independent of the told area (1 mm2 or 1/5mm2) and of
total, obtidas pelo metodo automatizado e pelo metodo manual, the sample type (normal and with thrombocytopenia). Considering
independente da area contada (lmm2 ou 1/5mm2) e do tipo da the platelet count in the normal samples in the central reticulum
amostra (normal e plaquetopenica). Entre as amostras com valores of Neubauer chamber (1 mm2), there was significant difference
normais de plaquetas, observou-se diferen~a significativa entre as between counts obtained by automated and manual methods in
contagens obtidas pela automa~ao e contagem manual em plasma plasma after 120 minutes of sedimentation. The manual method
obtido ap6s 120 minutos de sedimenta~ao. 0 metodo manual que that gets closer to the results obtained by the automation is the one
mais se aproximou dos resultados obtidos pela automa~ao foi 0 realized in total blood through Rees-Ecker method, being able to
realizado em sangue total com a contagem de plaquetas efetuada be accomplished in 1/5 of a mm2 or 1mm2 in the center of the
em 1mm2 ou em apenas 1/5 mm2 do reticulo central da camara de counting chamber, with a safe result emission and a reduction of
Neubauer, com emissao de resultados precisos e com 0 beneficio da time waste, which is a benefit.
diminui~ao de tempo gasto para a realiza~ao do mesmo.

Palavras-chave: Contagem de plaquetas, metodo manual,


metodo automatizado
a vantagem de proporcionar grande propor<;ao de 1mg para cada mL de
Introdufiio
numero de celulas por campo, alem sangue. Cada amostra foi submetida a

r!
investiga<;ao laboratorial dos da op<;aode poder diminuir 0 grau de contagem de plaquetas pelos metodos
a disturbios da hemostasia dilui<;ao para amostras severa mente automatizado e manual (em sangue
inclui a avalia<;ao do numero plaquetopenicas (5). total e no plasma obtido apos 30,
de plaquetas e testes de fun<;ao pla- Esse estudo teve como objetivo 60 e 120 minutos de sedimenta<;ao
quetaria. A contagem de plaquetas e a compara<;ao dos metodos manual espontanea) (Figura 1).
um importante metodo utilizado na e automatizado de contagem de pla- Inicialmente, todas as amostras fo-
investiga<;ao c1fnica para evitar riscos quetas utilizando amostras de sangue ram analisadas pelo metodo automa-
de sangramento. No sangue periferico total e de plasma rico em plaquetas, tizado utilizando contador automatico
de indivfduos saudaveis, 0 numero a fim de observar 0 metodo manual Cell-Dyn 3500 (Abbott). As analises
de plaquetas esta entre 150 - 400 mais adequado e segura para que foram realizadas no Laboratorio de
x 109jL, podendo ser modificado em possa ser usado nos laboratorios que Analises Cllnicas do HUOLjUFRN. Apos
resposta a uma variedade de estfmu- nao dispuserem de automa<;ao. a contagem automatizada as amostras
105 (1, 2, 3). a
foram submetidas contagem manual
A contagem manual de plaquetas em camara de Neubauer realizada
ainda e usada rotineiramente em la- no Laboratorio de Hematologia do
boratorios de pequeno porte, sendo No periodo de janeiro a abril de Departamento de Analises Clfnicas e
tambem necessaria em laboratorios 2004 foram examinadas 81 amostras Toxicologicas da Universidade Federal
bem equipados, para analise de san- de sangue de indivfduos de ambos do Rio Grande do Norte. Todas as con-
gues com grande propor<;ao de pla- os sexos, sem faixa eta ria definida, tagens foram realizadas ate 4 horas
quetas gigantes. Fora esta exce<;ao, atendidos no Laboratorio de Analises apos a coleta do sangue.
a contagem de plaquetas feita em Clfnicas do Hospital Universitario No metodo manual, foi realizada
contadores total mente automatizados Onofre Lopes (HUOL) e no Laboratorio inicialmente a contagem de plaquetas
tem precisao bastante superior a das Integrado de Analises Clfnicas (LIAC), no sangue total diluindo 0 sangue na
contagens manuais (4). ambos da Universidade Federal do Rio propor<;ao de 1: 200 com 0 diluidor
Os metodos de contagem manual Grande do Norte. de Rees-Ecker (1) e procedendo a
de plaquetas mais comumente empre- As amostras foram obtidas por contagem contagem das plaquetas
gados utilizam camara de Neubauer pun<;aovenosa e colocadas em tubos (objetiva x40) nos 25 quadrados do
com dilui<;ao do sangue de 1: 100 contendo anticoagulante EDTA na retfculo central (lmm2) da camara de
ou 1:200. 0 metoda de Rees-Ecker
utiliza uma solu<;ao tamponada de
citrato-formaldefdo com azul de cresil
brilhante. Essediluente fixa e preserva
os eritrocitos, bem como as plaque-
tas, prevenindo a sua desintegra<;ao.
Nesse metodo, as plaquetas visua-
lizadas ao microscopio otico comum
saG pequenas e altamente refrateis
coradas em azul brilhante e com forma
redonda, oval ou alongada (1).
o uso de metodos de contagem
de plaquetas que tem como amostra
plasma rico em plaquetas, alem de
tornar facil a identifica<;ao de plaque-
tas suspensas no plasma (nao saG
visualizados os eritrocitos), atraves
de microscopio optico comum, tem
Neubauer e em cinco quadrados do alizada com base na planilha do Excel sedimenta<;ao (p = 0,0105).
reticulo central (quatro dos cantos ex- by Microsoft e no programa estatistico Quanto as contagens realizadas
ternos e 0 do centro), correspondendo Statistica for Windows by Statsoft, em 1/5 da area do reticulo central
a 1/5mm2. 0 numero de plaquetas por Inc. Versao 5.1, edi<;ao 97. da camara de Neubauer, a analise
mm3 de sangue foi obtido mediante a estatistica (ANOVA) tambem mostrou
seguinte formula: Resultados e diferen<;a estatisticamente significati-
Discussiio va (p = 0,0004) entre as contagens.
Plaquetas contadas X inverso da Aplicando-se 0 teste de Tukey
dilui<;aoX inverso da area conta- As amostras foram classificadas verificou-se que as diferen<;asocorrem
da X inverso da profundidade da em dois grupos de acordo com os entre os valores das contagens de
camara = nO de plaquetasjmm3 valores obtidos na contagem por au- plaquetas obtidas no sangue total e
toma<;ao: as realizadas no plasma apos 30, 60
Em seguida, as amostras foram Grupo 1: 48 amostras com 0 e 120 minutos de sedimenta<;ao (p
deixadas a temperatura ambiente por numero normal de plaquetas (fai- = 0,0046, P = 0,0043 e p = 0,0142,
3D, 60 e 120 minutos para obten<;ao xa compreendida entre 150.000 a respectivamente) .
do plasma rico em plaquetas. A con- 400.000/mm3) Na mesma Figura, nota-se uma
tagem de plaquetas foi realizada di- Grupo 2: 33 amostras com pla- tendencia a redu<;ao do numero de
luindo 0 plasma obtido nos diferentes quetopenia (valores da contagem de plaquetas com 0 aumento do tempo
tempos de sedimenta<;ao em solu<;ao plaquetas inferior a 150.000/mm 3) de sedimenta<;ao para a obten<;ao do
salina-formol 1% (6) na propor<;ao A Figura 2 apresenta os valores plasma, nas contagens realizadas em
de 1: 200 e realizada a contagem em medios da contagem de plaquetas 1mm2 do reticulo central da camara.
camara de Neubauer (objetiva x40) das 48 amostras nao plaquetopenicas. Nas contagens realizadas em 1/5mm2
nos 25 quadrados do retlculo central Os valores medios obtidos no plasma da area observa-se a mesma tenden-
(lmm2) e em cinco quadrados do foram inferiores aos das contagens cia, com exce<;ao dos valores obtidos
reticulo central (quatro dos cantos ex- realizadas em sangue total, tanto pela no plasma apos 120 minutos de se-
ternos e 0 do centro), correspondendo automa<;ao como pelo metoda manu- dimenta<;ao, que se apresentam mais
a 1/5mm2 0 numero de plaquetas por al, independente da area contada (1 elevados, porem inferiores aos obtidos
mm3 de sangue foi obtido mediante a mm2 ou 1/5 mm2). nas contagens em sangue total e pela
seguinte formula: Para as contagens realizadas em automa<;ao.
todo reticulo central da camara, a A precisao e a acuracia dos me-
Plaquetas contadas X inverso da analise de variancia (ANOVA) rea- todos eletronicos de contagem de
dilui<;ao X volume plasmatico* lizada entre os valores obtidos por plaquetas, em compara<;ao com os
/10 = nO de plaquetasjmm3 automa<;ao e pelo metoda manual metodos manuais, sao maiores em
(*) Volume plasmatico = (sangue total e plasma apos 30, 60 e virtude do maior numero de celulas
100 - valor do hematocrito 120 minutos de sedimenta<;ao) mos- contadas (7). A contagem automati-
trou que ha diferen<;aestatisticamente zada de plaquetas se mostra precisa
A analise estatfstica foi baseada significativa (p = 0,0219). e exata em individuos norma is. En-
em calculo da media e desvio-padrao Utilizando 0 teste de Tukey de tretanto, a contagem em pacientes
das variaveis analisadas. 0 teste t de compara<;6es multiplas, verificou-se trombocitopenicos e controversa (2).
Student foi usado para comparar as que estas diferen<;as estao entre as A Figura 3 mostra os valores
medias das contagens nas diferentes contagens realizadas pelo metoda medios de plaquetas das 33 amos-
areas da camara de Neubauer. Para automatizado e a contagem manu- tras de sangue com plaquetopenia.
compara<;ao entre os metodos reali- al no plasma apos 120 minutos de Independente da area contada, os
zou-se a analise de variancia (ANOVA) sedimenta<;ao (p = 0,0491), entre valores medios obtidos pela automa-
e, quando necessario, aplicou-se 0 as contagens manuais realizadas no <;aoe pelo metoda manual em sangue
teste de Tukey. Em todos os casas foi sangue total e no plasma apos 60 mi- foram superiores aos observados nas
considerado 0 nivel de significancia nutos de sedimenta<;ao (p = 0,0373) contagens de plaquetas dos plasmas
de 5%. A parte computacional foi re- e no plasma apos 120 minutos de apos 30, 60 e 120 minutos de sedi-
mentac;ao espontanea. A analise de
variancia (ANOVA) realizada entre 300.000
as contagens por automac;ao e pelo
250.000
metoda manual (sangue total e plas-
ma apos 30, 60 e 120 minutos de
~S 200.000
sedimentac;ao espontanea) mostrou . Automatico
que nao ha diferenc;a estatisticamente E<l>
150.000 OSangue total
6- DPlasma 30
significativa entre as contagens em
0::'" 100.000 DPlasma 60
1 mm2 e 1/5 mm2 (p = 0,8261 e p =
OPlasma 120
0,8624, respectivamente). 50.000
Semelhante ao observado nas
amostras sem plaquetopenia, as con- 0
1mm' 1/5 mm'
tagens de plaquetas no plasma obtido
em diferentes tempos de sedimen-
tac;ao foram inferiores as contagens Figura 2. Representa~oo gr6fica dos valores medios de plaquetas das 48 amostras de sangue
do sangue total e automac;ao com sem plaquetopenia
tendencia a diminuir a medida que
aumenta 0 tempo de sedimentac;ao.
120.000
A importancia da contagem precisa
e exata de plaquetas e crucial para se 100.000
indicar ou nao a transfusao de pla-
80.000
quetas em pacientes plaquetopenicos, ~~
Automatico
principalmente quando as contagens
tl'";::> 60.000 o Sangue total
estao abaixo de 30.000/mm3 (2, 8). 0'
OPlasma 30
As plaquetopenias persistentes tem 0::'" 40.000 o Plasma 60
que ser minuciosamente investigadas, OPlasma 120
20.000
considerando a possibilidade de doenc;a
grave (9). A contagem de plaquetas e 0
uma das muitas variaveis que deter- 1mm' 1/5 mm'

minam 0 risco de uma hemorragia. Os


analisadores hematologicos automati- Figura 3. Representa~oo grafica dos valores medios de plaquetas das 33 amostras de sangue
cos empregam inovac;5es tecnologicas com plaquetopenia
possibilitando contagens mais precisas
450.000
de plaquetas (10).
400.000
A acuidade e precisao na contagem
350.000
automatizada de plaquetas dependem ~
S 300.000
da habilidade do sistema em separar - 250.000
as plaquetas de interferentes como E<I>
;:3 200.000
partfculas que tem as mesmas pro- g'
p:; 150.000
priedades ffsicas como fragmentos de 100.000
eritrocitos e de blastos, degranulac;5es 50.000
de leucocitos (especialmente eosinofi- 0
105), bacterias e microcitose acentua- I 3 5 7 9 11 13 15 17 1921 2325272931 33 35 37 39 41434547

da. Estes interferentes favorecem uma Amastras

falsa plaquetocitose (8, 9).


A presenc;a de plaquetas gigantes,
agregac;ao plaquetaria e/ou satelitis- Figura 4. Distribui~oo gr6fica das contagens de plaquetas pelos metodos automatizado e
mo plaquetario (frequentemente indu- manual (1 mm2) em sangue total de 48 amostras noo plaquetopenicas
-
0,9869). Esses resultados mostram
240.000
que a contagem de plaquetas no
200.000 sangue total pelo metoda manual em
camara de Neubauer e uma tecnica
'"
S 160.000 simples e segura para a contagem de
S
---....'"
l
plaquetas.
120.000
(1)
;:l Lasmar et al. (9) realizaram um
0"'

p:;
l
80.000 estudo a fim de comparar os metodos
manual e automatizado. Os autores
40.000 submeteram 65 amostras de sangue
a contagem automatizada e em segui-
0
da a contagem manual pelo metoda
de Rees Ecker. Foi observado que a
diferen<;a entre os dois metodos e
I -+-- Automayiio -- Metodo manual I menor quando ha plaquetopenia, 0
Figura S. Distribui<;ao gr6fica das contagens de plaquetas pelos metodos automatizado e que permite inferir que uma plaque-
manual (1 mm2) em sangue total de 33 amostras plaquetopenicas topenia inicialmente determinada pela
automa<;ao geralmente e confirmada
pelo metodo manual sem grandes
discrepancias de resultados.
400.000
A contagem de plaquetas no
350.000
plasma e bastante reprodutivel,
.., 300.000 embora a grande duvida seja saber
a
---a
250.000 se diferentes condi<;5es de obten<;ao
'" 200.000
....
oj da amostra (plasma rico em plaque-
(1)
tas), tais como tempo e velocidade
~ 150.000
de centrifuga<;ao e/ou sedimenta<;ao
p:;
100.000 (separa<;ao de plasma), local de re-
50.000 tirada da amostra no plasma, alem
0 da propor<;ao de hemacias/plasma
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 (hemat6crito), interferem na exatidao
Amootras dos resultados (5).
As Figuras 6 e 7 mostram a distri-
1-- Plasma 30 --- Plasma 60 -+- Plasma 120 I bUi<;aodas contagens de plaquetas no
Figura 6. Distribui<;aogr6fica das contagens de plaquetas pelo metodo manual em plasma plasma de amostras nao plaquetope-
de 48 amostras de sangue sem plaquetopenia apos 30,60 e 120 minutos de sedimenta<;ao nicas e plaquetopenicas, respectiva-
espontanea contadas em todo 0 retlculo central do camara de Neubauer (1mm2). mente, ap6s 30, 60 e 120 minutos de
sedimenta<;ao espontanea, realizadas
em todo 0 reticulo central da cama-
zido por EDTA) e coagulos de fibrina 33 amostras plaquetopenicas, res- ra de Neubauer. Observa-se que ha
indetectaveis, resultam em uma falsa pectivamente. uma proximidade dos valores das
plaquetopenia (9). A analise estatfstica mostra que contagens nos diferentes plasmas. A
As Figuras 4 e 5 mostram a dis- nao ha diferen<;a significativa entre analise estatfstica mostrou que nao ha
tribui<;ao das contagens de plaquetas os valores das contagens pelo metoda diferen<;a significativa entre os valores
obtidas pelos metodos automatizado automatico e manual em sangue total, obtidos nas contagens dos diferentes
e manual em sangue total (em todo para as amostras plaquetopenicas plasmas, tanto nas amostras plaque-
o reticulo central da camara), em 48 (p = 0,9992), assim como para as topenicas (p = 0,9564) quanta nas
amostras nao plaquetopenicas e em amostras nao plaquetopenicas (p = nao plaquetopenicas (p = 0,7924).
Oliveira et al., (2) realizaram es- 240.000
tudo comparativo em 295 amostras
sangufneas, tendo como parametro 200.000
de referencia a contagem automa-
tizada, com a finalidade de avaliar
Me 160.000
-e
os metodos diretos manuais de ~'"
Q)
120.000
contagem de plaquetas em camara ;:l
0"
l
de Neubauer segundo metodologias p:; 80.000
de Maspes-Jamra e de Rees-Ecker,
quanta a precisao e exatidao. 40.000

Os autores observaram que 0


0
metodo de Maspes-Jamra a partir
da obtenc.;ao do plasma rico em
Amostras
plaquetas apos 3 horas de sedi-
mentac.;ao espontanea demonstrou I-+- Plasma 30 ---- Plasma 60 --6- Plasma 120 I
resultados aceitaveis. Entretanto, Figura 7. Distribui~ao gr6fica das contagens de plaquetas pelo metodo manual em plasma
a interpretac.;ao de seus resu Itados de 33 amostras de sangue com plaquetopenia apos 30, 60 e 120 minutos de sedimenta~ao
deve levar em conta os graus de espontanea contadas em todo 0 retrculo central da camara de Neubauer (1 mm2)
inexatidao obtidos principalmente
para plaquetopenicos.
No presente estudo, as amostras
foram submetidas a contagem manu- 450.000
al, utilizando a diluic.;aode 1:200 em 400.000
soluc.;aode Rees Ecker, para 0 sangue 350.000
total, e salina-formol 1%, para as M 300.000
contagens no plasma. Essa diluic.;ao ....
250.000
proporciona um menor numero de
is'"
Q)
;:; 200.000
0"
plaquetas por campo 0 que facilita e l
p:; 150.000
agiliza 0 processo para a realizac.;ao
100.000
das contagens manuais.
50.000
Quando foram comparados os
0
valores obtidos nas contagens em 1 1 3 5 7 9 11 13 15 17 1921 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 434547
mm2 e em 1/5 mm2 do reticulo central
Amostras
J mm2 2
da camara de Neubauer a analise --- --115 mm I p=0,6194
estatistica (teste t de Student) nao Figura 8. Distribui~ao gr6fica das contagens de plaquetas em sangue total de 48 amostras sem
detectou diferenc.;asignificativa entre plaquetopenia realizadas em 1mm2 e em 1/5 mm2 do retrculo central da camara de Neubauer
os valores das contagens em sangue
total, quer seja nas amostras plaque-
topenicas (p = 0,8628), quer seja nas Em laboratorios que nao dis- resultados obtidos pelas contagens
amostras com valores considerados poem de automac.;ao e conveniente em sangue total pelo metoda de
normais (p = 0,6194) (Figuras 8 e 9). a padronizac.;ao de uma tecnica que Rees-Ecker utilizando 1/5 da area
De modo semelhante, no plasma dinamize a rotina laboratorial. Uma do reticulo central e confiavel, pois
nao houve diferenc.;aestatisticamen- alternativa para tornar a contagem quando comparados com as conta-
te significativa entre as contagens de plaquetas menos laboriosa seria gens em 1 mm2 e com os resultados
realizadas em 1 mm2 e em 1/5 mm2, a realizac.;ao das contagens em 1/5 da automac.;ao nao houve diferenc.;a
independente do tempo de sedimen- mm2 do reticulo central da camara significativa, tanto para as amostras
tac.;aopara obtenc.;ao dos mesmos e de Neubauer. normais quanta para as amostras
da c1assificac.;aodas amostras. o estudo realizado mostra que os plaquetopenicas.
realizadas em 1 mm2 e em 1/5 mm2
do reticulo central da camara, tanto
240oo0
no sangue total como nos diferentes
200000 plasmas das amostras nao plaque-
topenicas. 0 mesmo foi observado
} 160000
para as amostras plaquetopenicas.
'" 120000
;S 0 metodo manual que mais se apro-
"
;:l
0" xima dos resultados obtidos pela
os
ii: 80000
automac;ao e 0 realizado em sangue
40000 total pelo metodo de Rees-Ecker,
podendo ser realizado em 1 mm2
ou em apenas 1/5 mm2 do reticulo
central da camara de Neubauer,
--+-1 mm2 -1/5 mm21 com emissao de resultados precisos
e com 0 beneficio da diminuiC;ao de
Figura 9. Distribuic;:oo grafica das contagens de plaquetas em sangue total de 33 amostras com
tempo gasto.
plaquetopenia realizadas em 1mm2 e em 1/5 mm2 do retlculo central da camara de Neubauer

Agradecimentos
Considerando a contagem de pla- Os autores agradecem it chefia do
quetas nas amostras nao plaqueto- Laboratorio de Analises Clinicas do
Nao houve diferenc;a estatisticamen- penicas, em todo 0 reticulo central Hospital Universitario Onofre Lopes
te significativa entre as contagens de da camara de Neubauer, observou-se por permitir a coleta de amostras e
plaquetas em sangue total, obtidas diferenc;a significativa entre 0 me- aos tecnicos de laboratorio pelo auxflio
pelo metoda automatizado e pelo todo automatizado e as contagens e colaboraC;ao. iJ
metodo manual tanto para as amos- obtidas no plasma apos 120 minutos
tras normais quanta para as amos- de sedimentac;ao espontanea.
Correspondencias para:
tras plaquetopenicas, independente Nao houve diferenc;a estatisticamen-
Tereza Maria Dantas de Medeiros
da area contada. te significativa entre as contagens
tdantas@ufrnet.br

Referencias Bibliogrdficas
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