TIPOS DE MUTACIONES Y SU DETECCIN

Las distintas mutaciones que causan una enfermedad monognica concreta

son a menudo heterogneas. Por tanto, en casos diferentes de una misma
enfermedad suelen estar implicadas diferentes mutaciones.

Reaccin en Cadena de Polimerasa (PCR)

La reaccin en cadena de la polimerasa o PCR (polymerase chain reaction) es
una tcnica que conlleva la amplificacin in vitro de una secuencia especifica
de DNA.
La PCR es uno de los pasos iniciales en muchas tcnicas que en la actualidad
se emplean de forma sistemtica en la identificacin de mutaciones gnicas,
como son la secuenciacin automatizada tipo Sanger y la amplificacin
mltiple de sondas ligadas o MLPA, las cuales se describen ms adelante.
La tcnica de PCR requiere una mezcla de reaccin que contiene: una solucin
amortiguadora, un cofactor enzimtico como el cloruro de magnesio, una DNA
polimerasa DNA-dependiente termoestable (Taq poli merasa), una mezcla
equimolar de desoxirribonucletidos trifosfato de adenina, guanina, citosina y
timina, as como dos molculas de oligonucletidos de cadena sencilla de 16 a
24 nucletidos de longitud o cebadores, los cuales delimitan el fragmento que
se desea amplificar, ya que contienen la secuencia complementaria a los
extremos de la secuencia gnica de inters.
La reaccin de PCR se lleva a cabo por medio de una serie de cambios de
temperatura programados de forma automtica en un equipo denominado
termociclador, los cuales permiten los pasos requeridos para la amplificacin
del fragmento de inters. El ciclo de temperaturas se repite entre 25 a 35
veces y dado que en cada ciclo se produce el doble de la cantidad de copias de
DNA que existan originalmente, al final de la reaccin se obtienen billones de
molculas de la regin de DNA de inters a partir de cada molcula de DNA
original (235 = 3.4 x 1010 copias al final de la PCR).

Fragmentos de restriccin de longitud polimrfica (RFLP) por PCR y ensayo de

restriccin (PCR-RFLP)
La determinacin de los fragmentos de restriccin de longitud polimrfica, RFLP
(restriction fragment lenght polymorphism) por PCR y ensayo de restriccin, es
una de las tcnicas ms sencillas para el reconocimiento de mutaciones
puntuales, deleciones o inserciones pequeas previamente identificadas en
una secuencia de DNA.
Esta tcnica utiliza a las endonucleasas de restriccin de origen bacteriano, las
cuales tienen la capacidad de escindir los enlaces fosfodister de una molcula
de DNA de doble cadena al reconocer una secuencia palindrmica especfica de
entre 6 a 8 nucletidos de longitud. El sitio de restriccin puede estar presente
o ausente en la secuencia de DNA normal o bien generarse o perderse por la
presencia de una mutacin, lo que determina el patrn de restriccin de los
RFLP. Para la implementacin de esta tcnica, la mutacin conocida debe
localizarse en un sitio de restriccin reconocido por la enzima seleccionada. Es
importante conocer el patrn de restriccin o corte presente tanto en la
secuencia normal, como en la mutada para la interpretacin de los genotipos
con base a los RFLP resultantes.
El ejemplo de enfermedad que
podra diagnosticarse
certeramente a travs de la
tcnica de PCR-RFLP, sera una
forma sindromtica de
craneosinostosis coronal
autosmica dominante o
Sndrome de Muenke
condicionada en el 100% de los
casos por un estado
heterocigoto para la mutacin
puntual c.749G>C de sentido
errneo (p.Pro250Arg) que
ocurre en el gen FGFR3
(4p16.3).

Secuenciacin
La secuenciacin de DNA es el mtodo que permite conocer el orden preciso
que guardan los nucletidos en una secuencia especfica de DNA.
Han existido diferentes mtodos para obtener la secuencia nucleotdica de una
regin genmica y en la actualidad existen metodologas con capacidad para
obtener secuencias de millones de nucletidos en una sola reaccin. Sin
embargo, la tcnica desarrollada por Sanger en su versin automatizada es
considerada como el estndar de referencia para definir un cambio a nivel de
DNA y por ende para el diagnstico certero de mltiples trastornos
mendelianos que se caracterizan por una heterogeneidad allica amplia donde
predominan las mutaciones puntuales, o pequeas inserciones/deleciones, tal y
como ocurre en los sndromes de cncer de mama y ovario familiar ligados a
los genes BRCA1 y BRCA2, la esclerosis tuberosa, la poliquistosis renal del
adulto, la hipercolesterolemia familiar, neurofibromatosis tipo I, hemofilias tipos
A y B, los sndromes de Marfan, Wiskott-Aldrich, CHARGE, Fabry, Hunter, entre
otros.
El mtodo de secuenciacin tipo Sanger se basa en la interrupcin de la
sntesis de una nueva cadena de DNA por mtodos qumicos utilizando como
molde una cadena sencilla de la regin de la cual se desea obtener la
secuencia.
La secuenciacin automatizada se considera el estudio diagnstico de primera
lnea en el sndrome de Rett, un trastorno del neurodesarrollo dominante ligado
al cromosoma X. Las pacientes cursan con una prdida progresiva de las
habilidades motoras y del lenguaje, presencia de conductas estereotipadas
como movimientos anormales y repetitivos en manos, crisis convulsivas,
detencin del crecimiento y del permetro ceflico.
La identificacin de una mutacin en el gen MECP2 (Xq28) por estudio
molecular, es la nica manera de establecer de forma certera el diagnstico de
esta entidad, en especial en pacientes con las formas atpicas. El 80% de las
mutaciones responsables de los casos con la forma clsica del sndrome se
logran identificar a travs del estudio de secuenciacin automatizada de los
exones 2, 3 y 4 del gen MECP2, aunque en realidad en el exn 3 y 4 es donde
ocurren > 95% de las mutaciones responsables de las formas clsicas y
atpicas.

La automatizacin del procedimiento de secuenciacin de DNA ha permitido

que un genotipo patognico pueda ser identificado en pocas horas, en especial
cuando la mutacin se ha caracterizado previa mente en una familia, ya sea en
un individuo afectado o en un portador, lo cual permite su aplicacin al
diagnstico prenatal molecular de entidades mendelianas.
La secuenciacin automatizada tipo Sanger no es capaz de identificar estados
heterocigotos para deleciones y duplicaciones muy grandes. Por ello es
importante conocer el espectro de mutaciones descritas en el trastorno
mendeliano a diagnosticar en el paciente y reconocer esta limitante de la
tcnica cuando se interpretan los resultados y as evitar la asignacin de un
genotipo errneo y un asesoramiento gentico inadecuado. En enfermedades
monognicas en donde predominan deleciones o duplicaciones grandes se
deben utilizar otras metodologas moleculares como la MLPA.

Amplificacin mltiple de sondas ligadas (MLPA, multiplex ligation-

dependent probe amplification)
La amplificacin mltiple de sondas ligadas o MLPA es una variante de la PCR
en la cual se pueden amplificar diferentes secuencias de DNA en una misma
reaccin utilizando un solo par de cebadores y bajo las mismas condiciones de
ciclos de temperatura. Por esta tcnica se pueden amplificar regiones gnicas
cercanas o adyacentes con la finalidad de determinar con certeza la dosis
gnica en muestras de DNA de pacientes afectados de deleciones o
duplicaciones grandes en estado heterocigoto, homocigoto o hemicigoto. La
capacidad de amplificar varias sondas en la misma reaccin, permite delimitar
con mayor precisin los puntos de rotura y reunin de las deleciones o
duplicaciones, as como la extensin de dichos rearreglos.
La MLPA permite el anlisis mediante electroforesis capilar de hasta 45 sondas
diferentes amplificadas en una sola reaccin. Cada secuencia del DNA blanco
(p. ej., un exn) es reconocida por una sonda conformada por dos mitades,
denominadas sonda 5 y sonda 3. Si existe una complementaridad de las dos
sondas con la muestra de DNA templado, se forma un enlace fosfodister entre
ambas mediante la accin de una ligasa. Los extremos de ambas sondas
poseen una secuencia artificialmente diseada que es complementaria a un
solo par de oligonucletidos o cebadores universales que permiten su
amplificacin por PCR, siempre y cuando las sondas 5 y 3 se hayan ligado. Los
cebadores universales permitirn la amplificacin de todas las sondas bajo las
mismas condiciones. La distincin entre las diferentes sondas ligadas y
amplificadas correspondientes a cada una de las regiones blanco del DNA
templado, se basa en el tamao en pares de bases de cada sonda ligada y
amplificada. Lo anterior, se logra al aadir, en la sonda 3, una secuencia
artificial o stuffer cuya longitud vara para cada sonda. As, cada sonda
especfica de un exn o regin gnica tendr un tamao especfico y ser
fcilmente identificable mediante anlisis electrofortico.
La tcnica de MLPA puede ser complementaria al estudio de secuenciacin
para incrementar la certeza diagnstica en algunas entidades mendelianas, ya
que la secuenciacin automatizada y el estudio de MLPA identifican el genotipo
responsable en casi 90% de las pacientes con las formas clsicas.