Professional Documents
Culture Documents
Outubro/2014
Documentos 175
Biotcnicas da Reproduo em
Bovinos
Minicursos ministrados durante o 3 Simpsio
Biotcnicas da Reproduo em Bovinos no
Laboratrio de Reproduo Animal do Campo
Experimental Santa Mnica
1a edio
1a impresso (2014): 40 exemplares
ISSN 1516-7453
1. Superovulao. 2. Estimulao ovariana hormonal. 3. Embries bovinos colheita,
seleo, classificao. 4. Protocolo de superovulao. 5. Aspirao de folculos ovarianos
guiada por ultrassonografia. 6. Produo in vitro de embries - PIVE. 7. Maturao de
ocitos. 8. Fertilizao in vitro. 9. Cultivo in vitro. 10. Criopreservao. 11. Vitrificao. I.
Serapio, Raquel Varela. II. Quinto, Carolina Capobiango Romano. III. Ttulo. IV. Srie.
CDD 636-08926
Embrapa 2014
Autores
Dinmica folicular
Durante a onda de crescimento folicular, trs fases esto presentes. O
recrutamento corresponde ao incio do crescimento de vrios folculos,
desencadeado pelo hormnio folculo estimulante (FSH). A segunda
fase corresponde seleo e dominncia: um folculo cresce mais do
que os outros, e se torna dominante. A presena de um folculo maior
inibe o crescimento dos demais folculos. O crescimento folicular nesta
fase depende do FSH e de pulsos basais de LH. O folculo dominante
produz alta concentrao de estrgeno (17b estradiol). A terceira fase
a ovulao, que desencadeada pelo pico de LH liberado pela hipfise.
A ovulao somente ocorre se, no momento em que o folculo dominan-
te produz alta concentrao de estrgeno, no existam nveis elevados
de progesterona. Ou seja, caso um corpo lteo funcional esteja presen-
te, no haver liberao de pico de LH nem a ovulao. Os folculos da
onda que no ovularem (incluindo os folculos dominantes), entraro em
atresia processo de degenerao das estruturas. Portanto, normal-
mente apenas um folculo ovula por ciclo estral, liberando um ocito. O
ciclo estral da vaca compreende 2 a 3 ondas de crescimento folicular,
porm somente uma terminada na ausncia de nveis elevados de
progesterona (GINTHER et al., 1989; AERTS e BOLS, 2010).
Superovulao
Os protocolos de superovulao visam promover o crescimento e ovu-
lao de todos os folculos recrutados. Para tanto, a onda folicular
sincronizada, e altas doses de FSH so administradas aos animais antes
que se estabelea a dominncia. Assim, os efeitos inibitrios do folculo
dominante sobre o crescimento dos demais folculos so bloqueados,
e os efeitos deletrios da atresia sobre a qualidade dos ocitos ovula-
dos so evitados. Portanto, o hormnio folculo estimulante em altas
concentraes promove o crescimento simultneo de vrios folculos
com caractersticas fisiolgicas semelhantes daqueles selecionados para
ovularem. A divergncia folicular impedida, e os folculos tercirios
que seriam fadados a atresia se tornam folculos ovulatrios (CARVA-
LHO et al., 2008).
11 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos
Protocolo de Superovulao
O Protocolo apresentado foi adaptado para animais mestios Gir-Holan-
ds, e utilizado com sucesso nas condies do CESM.
A sonda de Foley estril deve ser inserida via intracervical com o auxlio
de um mandril, e posicionada no corpo uterino. O balo deve ser inflado
com ar, at fixar a sonda no local desejado. O mandril retirado, e uma
sonda um Y acoplada sonda de Foley, compondo o sistema fechado
de colheita de embries (Figura 1). Em suas outras extremidades, so
fixados o frasco de DPBS, e o copo coletor de embries.
Literatura Complementar
GONALVES, P. B. D.; FIGUEIREDO, J. R.; FREITAS, V. J. F. Biotcni-
cas Aplicadas Reproduo Animal. So Paulo: Varela, 2002. 340 p.
Referncias
AERTS, J. M. J.; BOLS, P. E. J. Ovarian follicular dynamics. A review
with emphasis on the bovine species. Part II: antral development, exo-
genous influence and future prospects. Reprod. Dom. Anim, v. 45, p.
180-187, 2010.
Procedimento
A fmea doadora de ocitos devidamente contida no tronco, e sua
higienizao realizada, lavando com gua e sabo a regio perineal e
a cauda. Com agulha descartvel 19 G, realizada anestesia epidural
no espao sacrococcgeo, com 40 mg a 80 mg (2 a 4 mL) de cloridrato
de lidocana, que varia com o tamanho e temperamento do animal.
Literatura Complementar
GONALVES, P. B. D.; FIGUEIREDO, J. R.; FREITAS, V. J. F. Biotcni-
cas Aplicadas Reproduo Animal. So Paulo: Varela, 2002. 340 p.
Referncias
BLONDIN, P.; SIRARD, M. A. Oocyte and follicular morphology as
determining characteristics for developmental competence in bovine
oocytes. Mol. Reprod. Dev., v. 41, p. 54-62, 1995.
GALLI, C.; CROTTI, G.; NOTARI, C.; TURINI, P.; DUCHI, R.; LAZZARI,
28 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos
HASHIMOTO, S.; TAKAKURA, R.; KISHI, M.; SUDO, T.; MINAMI, N.;
YAMADA, M. Ultrasound-guided follicle aspiration: the collection of
bovine cumulus-oocyte complexes from ovaries of slaughtered or live
cows. Theriogenology, v. 51, p. 757-765, 1999.
Obteno de ocitos
Podem ser obtidos de doadoras vivas, atravs da aspirao folicular,
ou, a partir da puno de ovrios de fmeas abatidas em abatedouros.
32 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos
Meios utlizados:
PBS + Soro Fetal Bovino (SFB)
MEIO DE LAVAGEM (TCM199 com sais de Hanks, tampo HEPES,
antibitico penicilina e estreptomicina- e soro fetal bovino)
MEIO DE MATURAO (TCM199 com sais de Earle suplementado
com l-glutamina, antibitico penicilina e estreptomicina-, bicarbo-
nato de sdio, piruvato de sdio, hormnios FSH, LH e estradiol- e
soro fetal bovino).
Procedimentos:
I Preparao da placa de maturao
Em uma placa de Petri fazer gotas de 100 l de meio de maturao
e recobr-las com leo mineral.
necessrio que a placa de maturao permanea na estufa in-
cubadora por pelo menos duas horas antes da transferncia dos
ocitos para mesma, para a estabilizao do meio.
35 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos
II - Rastreamento de ocitos
O fluido folicular ser submetido lavagem e filtrao, com auxlio
de filtro apropriado, capaz de reter os ocitos.
O material retido no filtro ser transferido para placa de Petri estril
e descartvel, onde sero rastreados os ocitos.
A manipulao das estruturas desta etapa em diante ser realizada
com auxlio do estereomicroscpio, no interior da capela com fluxo
laminar.
As estruturas encontradas sero transferidas para outra placa con-
tendo duas gotas de meio de lavagem, onde permanecero para que
em seguida sejam selecionados de acordo com a qualidade.
III - Seleo
A seleo baseada em caractersticas do cumulus e do citoplasma
do ocito como descrito na Tabela 1 e Figura 7.
Sero selecionados ocitos classificados como grau I, II e III.
IV - Maturao in vitro
Os ocitos selecionados sero lavados em gota de meio de matu-
rao e em seguida transferidos para gotas de 100 l de meio de
maturao contidas em placa de Petri recobertas com leo mineral,
previamente estabilizadas.
A maturao dos ocitos ser realizada em gotas de por um perodo
de 22 a 24 horas, em estufa incubadora com temperatura de 39,5
C, 5% de CO2 em ar atmosfrico e 95% de umidade.
Tabela 1. Critrios adotados no CESM para a classificao morfolgica dos ocitos recuperados.
Qualidade Descrio
Grau I Ocitos com mais de trs camadas de clulas compactas do cumulus, e
citoplasma regular.
Grau II Ocitos com uma a trs camadas de clulas do cumulus, citoplasma regular ou
apresentando granulaes finas.
Grau III Ocitos apresentando menos de trs camadas do cumulus ou parcialmente
desnudos, citoplasma irregular.
Grau IV Desnudos (ocitos sem clulas do cumulus) ou em degenerao (com cumulus
expandido e citoplasma heterogneo apresentando granulaes severas).
36 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos
Figura 7. Complexos cumulus-ocito bovinos. Ocitos grau I (a,b,c,e), grau II (d,f), grau III (g) e grau IV (h,i).
Meios utlizados:
SPTL
PERCOLL
FERT-TALP
Procedimentos:
I - Preparao da placa de fecundao
- Em uma placa de Petri preparar gotas de 10 l de meio de fecunda-
o, recobr-las com leo mineral e equilibrar em estufa incubadora por
duas horas, antes do incio do perodo de fecundao.
38 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos
II Preparao do Smen
II. I - Swim-up
Adicionar 1 mL de SPTL em um tubo de fundo cnico de 15 mL,
tampar, sem vedar, a rosca dos tubos e manter em estufa incuba-
dora para estabilizar o meio.
Descongelar a palheta de smen em banho-maria a 37 C por 30
segundos. Em seguida, verter o contedo da palheta cuidadosamen-
te no fundo do tubo contendo SPTL e mant-lo apoiado dentro de
um bcker em posio inclinada. Lembrar de retirar uma pequena
amostra de smen para analisar a motilidade e vigor do smen an-
tes da incubao em estufa.
Manter o tubo Falcon com o smen por 1 hora em estufa incubado-
ra nas mesmas condies da maturao.
Aps 1 hora, remover o sobrenadante e transfer-lo para um novo
tubo Falcon previamente aquecido.
Remover uma segunda amostra de smen para analisar motilidade e
vigor.
Centrifugar o tubo Falcon com o smen por 8 minutos a 1.200
RPM em centrifuga sorolgica.
Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet com meio FERT-
-TALP (previamente equilibrado na em incubadora) para um volume
final de 100 l.
Deixar o tubo na incubadora enquanto se processa a contagem
espermtica.
II. II - Mini Percoll
Preparar um tubo cnico com capacidade de 1,5 ml com gradien-
te de Percoll, pela adio de 250 l de Percoll 90% e, sobre esta
camada, depositar 250 l de gradiente Percoll 45%, vagarosa-
mente, de maneira que as duas camadas no se misturem.
Equilibrar a temperatura e atmosfera do gradiente de Percoll em
incubadora por aproximadamente 1h antes do uso.
Aps o descongelamento do smen, o contedo da palheta deve
ser depositado sobre as camadas de Percoll previamente aqueci-
das (no deixar o smen se misturar com as camadas de Percoll).
Centrifugar o tubo em uma microcentrfuga a 8.000 RPM, por 7
minutos.
39 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos
V final = n x motilidade/1.000 x 50 L
Meios utilizados:
SOF suplementado com SFB, BSA, aminocidos, piruvato, lactato e
glutamina
Procedimentos:
I Preparao da placa de cultivo
Em uma placa de petri preparar gotas de 100 L de meio de cultivo
(SOF), recobr-las com leo mineral e manter em estufa incubadora
por pelo menos duas horas antes do incio do cultivo.
II - Desnudamento Parcial de ocitos
Fazer o desnudamento parcial das estruturas contidas na gota de
fecundao com o auxlio de uma pipeta de 100 L, de forma a
manter algumas clulas aderidas aos ocitos para que a partir des-
tas se forme a monocamada.
III Cultivo in vitro
Retirar os possveis zigotos parcialmente desnudos das gotas de
fecundao e lavar por no mnimo duas vezes em meio SOF, previa-
mente estabilizado.
Transferir de 15 a 20 estruturas para gotas de meio de cultivo.
IV - Avaliao da taxa de clivagem
Em um perodo de 48 aps o incio do cultivo, ser realizada a troca
de 50% do volume de cada gota onde se encontram os embries.
Para tal, ser necessria a estabilizao do meio SOF por pelo me-
nos duas horas de antecedncia.
Aps a troca do meio, ser realizada a avaliao de quantas estru-
turas se dividiram e o nmero de clulas presente em cada uma.
42 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos
Figura 8. Blastocistos produzidos in vitro no dia 7 (I e II) e 9 (III e IV) aps a fecundao. Nas figuras I e II, esto presentes
blastocistos e blastocistos expandidos, e nas figuras III e IV, blastocistos eclodidos.
Figura 9. Blastocisto corado com HOECHST 33342 para contagem do nmero total de clulas (esquerda). direita, o mesmo
embrio, com as clulas em processo de morte programada (apoptose) coradas pelo ensaio TUNEL.
44 Biotcnicas da Reproduo em Bovinos
Criopreservao de embries
Importncia
A criopreservao de embries uma biotcnica que torna possvel o
controle racional das atividades da biologia da reproduo. A parada
do desenvolvimento embrionrio no estdio de blastocisto permite a
programao de diversas etapas subsequentes, otimizando o destino
destes embries. Dentre os aspectos de controle, o manejo de recep-
toras seria o mais evidente. Em qualquer programa de transferncia de
embries, ou temos um nmero pequeno de receptoras ou o excesso
delas, por ser muito improvvel a estimativa precisa do nmero de blas-
tocistos que ser produzido (KHURANA & NIEMANN, 2000).
Tcnica
O conceito de criopreservao envolve o armazenamento de tecidos
biolgicos vivos a baixas temperaturas. A criopreservao um proce-
dimento amplamente utilizado para conservao de linhagens celulares,
espermatozides e fragmentos de tecidos (SANTIN, et al., 2009).
Procedimento de vitrificao
1. O procedimento aqui especificado baseado na tcnica desenvolvi-
da por Vajta et al. (1999), com pequenas modificaes. Descreve-
remos o uso de palhetas esticadas e abertas (Open Pulled Straws
OPS) para envase dos embries.
2. Selecionar blastocistos e blastocistos expandidos no stimo dia de
desenvolvimento (D7).
3. Lavar os embries em meio base (SOF suplementado com 20% de
SFB), aquecido a 37 C.
4. Transferir os embries para meio base acrescido de 7,5% etilenoGli-
col e 7,5% de DMSO por 3 minutos.
5. Transferir os embries para meio base acrescido de 16,5% EG
e 16,5% DMSO. Deixar os embries por tempo mximo de 40
segundos.
6. Envasar os embries, individualmente, em OPS, em um volume
mximo de 2 l da soluo, e, submerg-los, imediatamente, em
nitrognio lquido, onde sero armazenados.
Literatura Complementar
GONALVES, P. B. D.; FIGUEIREDO, J. R.; FREITAS, V. J. F. Biotcni-
cas Aplicadas Reproduo Animal. So Paulo: Varela, 2002. 340 p.
Referncias
AHUMADA, C. J.; SALVADOR, I.; CEBRIAN-SERRANO, A.; LOPERA,
R.; SILVESTRE, M. A. Effect of supplementation of different growth
factors in embryo culture medium with a small number of bovine
embryos on in vitro embryo development and quality. Animal, v. 7, p.
455-462, 2013.
LONERGAN, P.; KHATIR, H.; PIUMI, F.; RIEGER, D.; HUMBLOT, P.;
BOLAND, M. P. Effect of time interval from insemination to first cle-
avage on the developmental characteristics, sex ratio and pregnancy
rate after transfer of bovine embryos. J. Reprod. Fertil., v. 117, p.
159-167, 1999.
SLIMANE, W.; VAIMAN, D.; GODARD, S.; VAIMAN, A.; CRIBIU, E.;
RENARD, J. P. A repetitive probe for FISH analysis of bovine interphase
nuclei. Genet. Sel. Evol., v. 32, p. 217-225, 2000.
VAJTA, G.; RINDOM, N.; PEURA, T. T.; HOLM, P.; GREVE, T.; CALLE-
SEN, H. The effect of media, serum and temperature on in vitro survi-
val of bovine blastocysts after Open Pulled Straw (OPS) vitrification.
Theriogenology, v. 52, p. 939-948, 1999.