Dysregulation of lipolysis and lipid

metabolism in visceral and

subcutaneous adipocytes by high-fat
diet: role of ATGL, HSL, and AMPK

Desregulao da liplise e metabolismo lipdico nos adipcitos viscerais e

subcutneos por dieta rica em gordura: papel da ATGL, HSL, e AMPK

Mandeep P. Gaidhu , Nicole M. Anthony , Prital Patel , Thomas J. Hawke ,

Rolando B. Ceddia

American Journal of Physiology - Fisiologia Celular Publicado 25 de maro de

2010 Vol. 298 . No 4,C961-C971 DOI: 10,1152 / ajpcell.00547.2009

Abstrato
Este estudo investigou os mecanismos moleculares pelos quais uma dieta rica
em gordura (DFH) dysregulates liplise e metabolismo lipdico no epiddimo do
rato (visceral, VC) e (subcutnea, SC) adipcitos inguinais. Oito semanas de
alimentao HFD aumento da lipase adiposo triglicrides contedo (ATGL) e
gene comparativa expresso identificao-58 (CGI-58), enquanto que a lipase
hormono-sensvel (HSL) fosforilao e contedo perilipin foram severamente
reduzida. Os adipcitos a partir de ratinhos HFD provocou aumento basal mas
embotada liplise estimulada por epinefrina e aumento do teor de diacilglicerol
em ambos os depsitos de gordura.Consistente com a sinalizao do receptor
adrenrgico prejudicada, HFD tambm aumentou fosfolipase A-especfica
adiposo dois expresso em ambos os depsitos de gordura. A inibio do
receptor prostanide E-3 aumentaram a liplise em adipcitos de controlo
basal, mas no conseguiu alterar profundamente os efeitos da DH sobre a
liplise em ambos os depsitos de gordura. Em HFD adipcitos viscerais,
activao de guanilato ciclase por forscolina aumentou HSL fosforilao e
superou a resposta lipoltica de clulas de controlo. No entanto, nos adipcitos
subcutneos HFD, forscolina induzida liplise sem fosforilao HSL detectvel,
sugerindo ativao de uma lipase alternativa em resposta a supresso induzida
por HFD de HSL no VC e adipcitos SC. HFD tambm basal poderosamente
inibida, epinephrine-, e induzida por forscolina AMP quinase (AMPK) activao
expresso bem peroxissoma do receptor gama activado por proliferador de
coactivador-1, actividade de sintase de citrato, e palmitato de oxidao em
ambos os depsitos de gordura. Em resumo, proporcionado novo evidncia de
que o receptor adrenrgico defeituoso sinalizao combinada com a regulao
positiva de ATGL e supresso da HSL e da AMPK sinalizao mediar alteraes
induzidas HFD da liplise e a utilizao de lpidos no VC e adipcitos SC, o que
pode jogar um papel importante na mobilizao de lpidos defeituoso e
metabolismo visto na obesidade induzida por dieta.

TECIDO ADIPOSO BRANCO (WAT) desempenha um papel importante na regulao

toda a homeostase energtica do corpo. Uma de suas principais funes a
liberao de cidos gordos (FAS), em condies de balano energtico negativo
ou exerccio prolongado para fornecer energia para os tecidos perifricos. O
mecanismo molecular envolvido em triacilglicerol (TAG) decomposio e
liberao FA funciona de forma ordenada e regulada, conferindo-wat a
capacidade de responder a vrias condies de alimentao e as demandas de
energia do corpo. Importante, condies que levam a excessos e obesidade
perturbar regulao normal da liplise WAT. Na verdade, a liplise basal tem
sido repetidamente relatado como elevada, ao passo que a liplise induzida por
catecolaminas suprimida em seres humanos e roedores obesos ( 26 ). O
mecanismo clssico para explicar esta condio centrado no facto de a WAT
largamente expandida de indivduos obesos torna-se resistente insulina,
prejudicando os principais efeitos lipognicas e antilipolticos desta hormona
( 4 , 37 , 40 ). A obesidade desenvolve sob condies de excesso de energia
crnica, indicando que viscerais (VC) e subcutnea (SC) adipcitos deve ser
capaz de lidar com grandes quantidades de lpidos a ser entregue ao
WAT. Neste contexto, a capacidade dos adipcitos para lidar com o excesso de
lpidos atravs de alteraes no metabolismo FA pode desempenhar um papel
importante nas respostas adaptativas do WAT obesidade. importante
ressaltar que a obesidade invariavelmente acompanhada pelo aumento dos
nveis circulantes de cidos graxos no esterificados (AGNE) ( 4 - 6 , 40 ),
indicando que a regulao do armazenamento de energia e mobilizao de FAs
de VC e adipcitos SC est com defeito.Embora existe literatura que descreve
as diferenas entre VC e depsitos SC gordura em relao aos provocando
taxas de lipolticos distintos ( 9 , 30 , 42 ), os mecanismos celulares e
moleculares responsveis por essas caractersticas especficas de depsito
continuam a ser elucidado. Isto particularmente importante porque a
acumulao excessiva de VC tecido adiposo (obesidade visceral), que tem sido
fortemente correlacionados com o desenvolvimento de resistncia insulina e
diabetes tipo 2 ( 4 , 25 ). Neste cenrio, desvendar os mecanismos moleculares
envolvidos na desregulao da liplise e metabolismo lipdico em VC e WAT SC
na obesidade pode ser de grande relevncia teraputica.
Liplise no WAT dos seres humanos e roedores regulado de uma forma passo
a passo por adiposo triglicrides lipase (ATGL), lipase hormono-sensvel (HSL) e
lipase monoacilglicerol (MAGL) ( 4 , 27 , 28 ). O modelo atual que ATGL inicia
a liplise por clivagem o primeiro FA da TAG e, em seguida, HSL e MAGL agir
sobre diacyglycerol (DAG) e monoacilglicerol, respectivamente, lanando dois
FAs adicional e uma molcula de glicerol ( 27 ). Portanto, a activao
orquestrada de ATGL, HSL, e MAGL parece ser necessrio para a liplise
completa a ocorrer nos adipcitos. A ligao de agonistas para os receptores
beta-adrenrgicos, acoplados a adenilato ciclase atravs da protena G
estimuladora, leva a um aumento no AMPc e activao da protena quinase A
(PKA) ( 4 , 15 ). Em HSL rato, PKA fosforila os resduos de serina 563, 659 e 660
( 2 , 4 , 39 ), levando a translocao de HSL para a gotcula de lpido e a grande
melhoria da liplise. Fosforilao de um perilipin, uma protena associada com a
gotcula de lpido, por PKA tambm foi demonstrado ser necessrio para a
activao de HSL e para a liplise induzida por catecolaminas a ocorrer. Por
outro lado, a quinase celular sensor de energia activada por AMP protena
(AMPK) foi demonstrada para fosforilar serina-565 de HSL, que impede a
fosforilao de PKA mediada desta enzima e prejudica a liplise estimulada
pelas catecolaminas ( 19 ). Neste contexto, AMPK tem sido proposto para
reduzir a libertao de CC para a circulao, o que pode ajudar a prevenir
lipotoxicidade nos tecidos perifricos, assim como reduzir o dispendioso
processo de re-esterificao de CC na WAT ( 3 , 17 , 20 ). ATGL actividade
tambm estimulada pelas catecolaminas, mas o mecanismo (s) molecular
subjacente a este efeito desconhecido.Embora ATGL pode ser fosforilada em
resduos de serina 404 e 428 por uma quinase ainda no identificado, isso no
parece afetar a atividade desta lipase. H provas convincentes de que a
protena do gene comparativa identificao-58 (CGI-58) aumenta drasticamente
 a hidrlise TAG mediada por ATGL sem afetar a atividade HSL ( 29 ). Em
condies basais, CGI-58 tambm est localizada para a gotcula de lpido em
associao com perilipin A ( 21 , 29 , 38 ). Aps a estimulao hormonal, PKA
fosforila perilipin A a resduos de serina 492 e 517, resultando na dissociao
CGI-58 ( 22 ). Uma vez dissociada, CGI-58 interage com ATGL e potencialmente
ativa esta lipase TAG ( 21 , 29 , 38 ). De facto, a adio de CGI-58 de extractos
contendo ATGL aumenta a actividade de hidrolase de TAG por ~ 20 vezes
( 29 ). A literatura atual sugere que em roedores magros ATGL e HSL so os
principais lipases para TAG e da DAG, respectivamente, e conta para -95% da
atividade lipase em WAT murino ( 38 ). Portanto, estes passos moleculares que
regulam a liplise pode ser potencialmente afetada pela obesidade e tambm
ser claramente regulamentada no VC contra SC WAT. No entanto, muito pouco
se sabe sobre como a obesidade induzida por dieta afeta HSL e ATGL contedo /
atividade, bem como basal e liplise induzida por catecolaminas no VC e WAT
SC. Alm disso, embora a AMPK tem sido implicada em jogar um papel na
regulao da actividade de HSL e ATGL ( 3 , 17 , 20 ), a sua aco sobre estes
grandes lipases no foi abordado no WAT sob a obesidade induzida por
dieta. Portanto, o presente estudo foi desenhado para enfrentar os efeitos da
obesidade induzida por HFD no metabolismo lipdico dentro do adipcito,
especificamente, os papis da AMPK, HSL, e ATGL em depsitos de gordura
subcutnea e visceral. Fornecidas provas de que a desregulao da liplise e
metabolismo lipdico em VC e adipcitos SC de camundongos alto teor de
gordura da dieta mediada pelo receptor adrenrgico com defeito sinalizao
combinada com regulao positiva de ATGL e supresso do HSL e sinalizao
AMPK. Estes resultados do uma nova viso sobre a importncia da
regulamentao especfica do depsito da liplise e tambm abordar os
mecanismos moleculares subjacentes adaptaes disfuncionais que ocorrem
dentro do adipcito com respeito ao metabolismo lipdico em condies de
obesidade induzida por dieta e resistncia insulina.
MATERIAIS E MTODOS
Reagentes.
A epinefrina, albumina FA-livre de soro bovino (BSA), kit de determinao de
glicerol livre, kit de glucose-oxidase, cido palmtico, e feniletilamina foram
obtidos da Sigma. [1- 14 C] cido palmtico foi da GE Healthcare Radiochemicals
(Quebec City, Quebec, Canad). [- 32 P] ATP e [9,10- 3 H] triolena foram da
American Radiolabeled Chemicals (St. Louis, MO). RNeasy Kit de Lpido A
extraco foi de Qiagen. Superscript II e Taq polimerase foram da Bio-Rad
Canad. Kit de ADNase foi de Ambion. Padro e alto teor de gordura Chow foi
obtido a partir LabDiets (Richmond, IN). Todos os anticorpos foram de Cell
Signaling Technology (Beverly, MA), a menos que indicado de outra maneira. Os
anticorpos especficos contra fosfo-fosforilao carboxilase-acetil-CoA (ACC) era
da Upstate (Charlottesville, VA). Perilipin era da American Research Products
(Belmont, MA). Todos os outros produtos qumicos eram do grau mais elevado
disponvel.
Animais e isolamento de adipcitos primrios.
Oito semanas de idade C57BL / 6J machos foram mantidos num 12: 12-h ciclo
de luz / escuro a 22 C e alimentados ad libitum com rao laboratorial
normalizada para um perodo de aclimatao de 1-semana. Posteriormente, os
animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos: controle e HFD. Os
animais de controlo receberam uma dieta de rao padro contendo 25% de
quilocalorias da gordura (TestDiet; Cat. LabDiet nenhum 5015), enquanto o
grupo HFD foi alimentado com uma dieta contendo 60% de quilocalorias da
gordura (TestDiet; Cat LabDiet no 58Y1.) Para 8 sem. Uma dieta de rao
padro foi utilizada com a finalidade de comparar os efeitos de uma HFD com
aqueles ratinhos alimentados com uma dieta que suporta o crescimento e
desenvolvimento normais. As bolsas de gordura inguinal e epiddimo foram
usados como representante da SC e VC WAT. Aps o perodo de estudo de 8
semanas, SC e VC almofadas de gordura foram cuidadosamente removidos e
usados para isolamento de adipcitos como previamente descrito ( 36 ) com
modificaes menores ( 18 ). Resumidamente, VC e gordura SC almofadas de
animais HFD controle e foram extrados, pesados, em seguida, finamente
picada e cuidadosamente com microtesoura. O tecido triturado foi transferido
para frascos de plstico, contendo tampo de Krebs-Ringer (KRB) suplementado
com HEPES 30 mM e colagenase (0,5 g / ml). O tecido foi incubado durante 25-
30 min a 37 C com agitao suave (120 golpes orbitais / min). Posteriormente,
o tecido digerido foi filtrada atravs de uma malha de nylon, e as clulas foram
recolhidas em tubos de plstico de 50 ml. As clulas foram cuidadosamente
lavadas por trs vezes com livre de colagenase KRB-HEPES suplementado com
3,5% de BSA (KRBH-BSA a 3,5%), ressuspensas em KRBH-BSA a 3,5%, e deixou-
se equilibrar durante 30 min antes do uso em experimentos. Os procedimentos
descritos neste documento foram adotadas para evitar adipcitos lise e obter
clulas de gordura que so viveis e responsivo estimulao. Isto
confirmado por ~30- a aumentos de 40 vezes em clulas de controlo expostas
epinefrina. Para distribuir igual nmero de adipcitos em todas as condies de
tratamento, os dimetros das clulas e os nmeros foram medidos como
descrito por DiGirolamo e fina ( 13 ). O protocolo experimental foi aprovado
pelo Comit de tica da Universidade de York animal Care.
medies de plasma.
O sangue foi recolhido de ratinhos num estado alimentado, no final do perodo
de estudo de 8 semanas e rapidamente centrifugadas a 4 C durante 10 min. A
fraco de soro foi recolhido e armazenado a -80 C para anlise posterior. A
glucose foi medida usando o kit de glucose-oxidase a partir de Sigma, e no
esterificados CC (NEFAs) foram medidos usando um kit de Wako Chemicals. A
insulina no plasma foi medida utilizando um kit de ELISA da Millipore.
Determinao da liplise, oxidao palmitato, absoro e incorporao
triacilgliceris.
A liplise foi determinada depois de adipcitos (1 x 10 5 clulas) foram
incubadas com agitao constante (80 golpes orbitais / min) durante 75 min na
ausncia ou na presena de adrenalina (100 nM) ou forscolina (10 ^ M)
( 3 ). Para experincias utilizando o antagonista do receptor EP3 L826266, as
clulas foram pr-incubadas com 10 uM do inibidor durante 2 h antes da
estimulao com epinefrina. Aps incubao, uma aliquota dos meios de
comunicao (400 ul) foi recolhida e analisada para a liberao de glicerol. A
oxidao de palmitato por adipcitos isolados (~ 1 x 10 6clulas) foi medida em
KRBH contendo 4% de BSA, na presena de 0,2 mM de cido palmtico e 0,2 uCi
/ ml de marcado com [1- 14 C] cido palmitico, durante 1 h. A 14 CO 2 libertado
foi recolhido para a medio da oxidao, e lipdios foram extrados das clulas
para medir a incorporao de palmitato em tags ( 17 , 18 ). Para a medio da
absoro de palmitato, clulas de gordura (1 10 3 ) foram incubadas durante
20 min na ausncia ou na presena de insulina (100 nM) e subsequentemente
ensaiadas quanto absoro de cido palmitico, tal como descrito
anteriormente ( 17 , 18 ).
atividade da citrato sintase.
Actividade de sintase de citrato foi ensaiada com adaptaes do mtodo
descrito por Alp et ai. ( 1). O tecido adiposo foi homogeneizada em tampo (Tris
25 mM-HCl, EDTA 1 mM, pH 7,4) e centrifugou-se, e o infranadante foi
recolhido. Uma alquota contendo 20 ug de protena foram adicionados ao
tampo de ensaio (Tris 50 mM-HCl, pH 8,1, DTNB 0,2 mM, 0,1 mM de acetil-CoA,
o oxaloacetato 0,5 mM), e a absorvncia foi medida ao longo de 15 minutos
num espectrofotmetro a 412 nm. O controlo de ensaio continha todos os
componentes, excepto a amostra, e o seu valor foi subtrado de todas as
condies.
A anlise de PCR quantitativa.
O ARN total foi isolado a partir de adipcitos, utilizando o kit RNeasy, seguindo-
se tratamento com DNase para remover ADN genmico de transio. O kit de
sntese de ADNc a partir de iScript Bio-Rad Canad foi utilizado para preparar
ADNc para utilizao em PCR em tempo real. Os iniciadores foram concebidos
utilizando o software PrimerQuest (IDT) com base em sequncias de sondas
disponveis no banco de dados Affymetrix (NetAffx Analysis
Center,http://www.affymetrix.com/analysis ) para cada determinado gene. As
reaces de PCR em tempo real foram efectuadas em condies de
amplificao como se segue: 95 C (3 min); 40 ciclos de 95 C (10 s), 65 C
(15 s), 72 C (30 s); 95 C (15 s), 60 C (15 s), 95 C (15 s). Quantitative PCR
foi realizada utilizando o Sistema de Deteco em tempo real CFX96 Bio-
Rad. Todos os genes foram normalizados para a p-actina e GAPDH como genes
de controlo, e os valores so expressos como vezes aumenta em relao dieta
de controlo. Sequncias de iniciadores so apresentadas na Tabela 3 .
A anlise de Western blot.
Para amostras de tecido inteiro, os depsitos de gordura foram extrados e
imediatamente congelados em azoto lquido. Tecido (~ 100 mg) foi
posteriormente homogeneizada em um tampo composto por Tris 25 mM-HCl e
NaCl 25 mM (pH 7,4), MgCl 1 2 , 2,7 mM de KCl, e os inibidores da protease e da
fosfatase (0,5 mM Na 3 VO 4 , NaF 1 mM, leupeptina 1 ^ M, pepstatina 1 ^ M,
cido ocadaico 1 uM, e PMSF 20 mM). Para adipcitos isolados, as clulas foram
estimuladas com forscolina (10 ^ M) ou epinefrina (100 nM) durante 30 min
antes de lise com tampo tal como descrito acima. Para assegurar solubilizao
suficiente de protenas associadas a gotculas lipdicas em basal e estimulada
condies, ns validado nosso protocolo de extraco de protena utilizando um
tampo alternativo (1% de SDS, EDTA 1 mM, benzamidina 1 mM, NaF 20 mM e
inibidores de protease e fosfatase) para extrao de protenas adipcito e
 obteve resultados semelhantes sob estimulao adrenrgica. Os
homogeneizados e lisados foram centrifugados, o infranadante foi recolhida, e
uma alquota foi usada para medir a protena pelo mtodo de Bradford. As
amostras foram diludas 1: 1 (vol / vol) com 2 tampo de Laemmli, aqueceu-
se a 95 C, e submetida a condies de SDS-PAGE ( 18 ). Todos os anticorpos
primrios foram utilizados numa diluio de 1: 1000 com a excepo de fosfo-
AMPK (1: 500) e perilipin (1: 2000).
contedo diacilglicerol e atividade triacilglicerol lipase.
Nveis de diacilglicerol (DAG) foram quantificados por um mtodo enzimtico
modificado ( 34 ).Resumidamente, 100 mg de tecido gordo de controlo e
ratinhos HFD foi homogeneizado, e os lpidos foram extrados pelo mtodo de
Bligh e Dyer ( 8 ). Uma vez que os lpidos foram secos sob atmosfera de N 2 de
gs, contedo DAG foi avaliada como descrito anteriormente pelo nosso
laboratrio ( 17 ). Atividade TAG lipase foi medido conforme estabelecido pela
Fredrikson et al. (16 , 17 ) e realizada anteriormente no nosso
laboratrio. Resumidamente, os tecidos foram homogeneizados em 2 volumes
de tampo de homogeneizao e centrifugou-se durante 45 minutos (4 C,
11000 g ). Uma alquota de 100 ug de o infranadante rica em protena foi
incubada com tampo de ensaio contendo uma concentrao final de 5 mM no
marcado triolena e 0,5 uCi / ml de marcado com [9,10- 3 H] triolena a 37 C
durante 10 min. A reaco foi terminada com a adio de 3,25 ml de tampo de
extraco e 1,05 ml de uma soluo a 0,1 MK 2CO 3 , uma soluo de cido
brico 0,1 M. Os tubos foram centrifugados (800 g ), e 1 ml da fase superior
contendo a libertada [1- 14 C] cido oleico foi extrada e contadas para a
radioactividade.
Analise estatistica.
Os dados so expressos como mdia SE. A significncia estatstica foi
definida como P <0,05 e foi calculado usando um t -test ou anlise de varincia
(ANOVA), com comparaes de Tukey-Kramer post hoc. As anlises estatsticas
utilizadas para cada conjunto de dados so anotados nas legendas das figuras.

RESULTADOS
massa corporal, massa gorda, o dimetro dos adipcitos, e as medies de
plasma.
Os ratinhos no grupo DH tinha uma mdia de 36% maior do que a massa
corporal, os animais de controlo que foi acompanhado por um aumento de 3.0-
e 2,8 vezes na epididimal e massa almofada de gordura inguinal,
respectivamente ( Tabela 1 ). Este foi compatvel com um aumento 1.67- e
1,59 vezes em dimetros de adipcitos a partir do epiddimo e almofadas de
gordura inguinal do grupo HFD, respectivamente ( Tabela 1 ). Quando
comparado com ratinhos de controlo, o grupo HFD tinham nveis plasmticos
significativamente mais elevados de NEFAs, glucose e insulina (1.36-, 1.13-, e
2,26 vezes, respectivamente), indicando que estes animais eram um modelo
adequado para obesidade induzida por dieta e a resistncia insulina ( Tabela
2 ).
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Tabela 1.
O peso corporal, massa gorda, eo dimetro dos adipcitos

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Mesa 2.
Os nveis plasmticos de NEFAs, glicose e insulina dos murganhos em um
estado alimentado

Efeitos da HFD no HSL, a fosforilao da AMPK e ACC e teor de protena AMPK,

ACC, HSL, ATGL e perilipin em Wat.
Para avaliar os efeitos de HFD sobre os principais mecanismos moleculares que
regulam a liplise em WAT, examinamos fosforilao de HSL em resduos chave
serina, bem como o teor de protena ATGL e perilipin. Uma vez que a AMPK
tambm tem sido implicado na regulao da actividade de HSL, a fosforilao e
o contedo desta cinase e do seu substrato ACC directa foram determinados. A
fosforilao da HSL na serina-563, -565, -660 e revelou que estas variveis
foram potentemente suprimida na VC e SC tecido adiposo de ratinhos HFD,
apesar de no haver mudana no contedo de protena total de HSL ( Fig.
1 ). Perilipin foi diminuiu em ambos os depsitos de gordura dos ratos DH,
embora este efeito foi mais pronunciado em VC comparativamente com o
tecido adiposo SC. Por outro lado, o contedo de ATGL foi significativamente
aumentada em ambos os depsitos de gordura ( Fig. 1 ). A fosforilao e
contedo de AMPK e ACC foi reduzida na VC e SC tecido adiposo de ratinhos
HFD em relao aos animais de controlo ( Fig. 1 ).
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FIG. 1.
A fosforilao do AMP quinase (AMPK), acetil-CoA carboxilase (ACC), e lipase
(HSL) hormono-sensvel, e teor de protena de AMPK, ACC, HSL, perilipin, e
lipase adiposo triglicridos (ATGL) em tecido adiposo branco (WAT ).Aps 8
semanas em cada controlo (Con) ou dieta rica em gordura (HF), visceral (VC) e
subcutnea (SC) depsitos de gordura foram extradas e processados para
anlise de Western blot. p-actina foi utilizado como um controlo de carga. Blots
so representativas de n = 4-6 para cada condio.

contedo DAG e da atividade lipase TAG em VC e SC depsitos de gordura.

Desde fosforilao HSL foi suprimida em VC e tecido adiposo SC, olhamos para
o contedo DAG e da atividade TAG lipase nestes depsitos de gordura de ratos
HFD controle e. DAG contedo aumentado em 2,5 vezes em VC ( Fig. 2 A ) e de
2,9 vezes em SC ( Fig. 2 B ) almofadas de gordura de ratos HFD. TAG
actividade de lipase aumentou 1,4 e 2 vezes em VC e WAT SC a partir de ratos
da dieta HF, respectivamente ( Fig. 2 C ).
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FIG. 2.
Diacilglicerol (DAG) contedo no VC ( A ) e SC ( B ) tecidos adiposos de Con e
ratos da dieta HF para 8 semanas.Triacilglicerol actividade de lipase (TAG) no
tecido adiposo de murganhos Con e dieta HF ( C ). Os dados foram compilados a
partir de 4 a 6 ratinhos de cada condio. No pareado t -test ou ANOVA de
duas vias com o teste de Tukey-Kramer post hoc foi utilizada para anlises
estatsticas. * P <0,05 contra todas as outras condies; # P<0,05 contra todas
as outras condies; $ P <0,05 versus demais condies.

Liplise e fosforilao da AMPK, ACC, e HSL no VC e SC adipcitos expostos a

forscolina e adrenalina.
Como esperado, os adipcitos de ratos de controlo expostas a adrenalina
aumento da liberao de glicerol de 0,52 0,04 para 14,16 0,44 nmol 75
min 10 -5 clulas e de 0,26 0,03 para 10,49 1,12 nmol 75 min 10 -

5 clulas em VC e adipcitos SC, respectivamente ( Fig. 3 , B e C). Quando

tratado com forscolina, libertao de glicerol a partir de VC e adipcitos SC dos
ratinhos de controlo atingiu 12,82 0,48 e 15,61 1,02 nmol min 75 10 -
5 clulas, respectivamente ( Fig. 3 , B e C ). HFD ratinhos tinham aumentado
liplise basal em VC e adipcitos SC por 2.3- e 2,9 vezes, respectivamente, ao
passo que a liplise estimulada por epinefrina foi reduzido em ambos os
depsitos de gordura de animais DH ( Fig. 3 , B e C ).Tratamento de HFD VC
adipcitos com forskolin aumento da liplise para nveis superiores aos dos
adipcitos VC de controlo ( Fig. 3 B ); No entanto, apenas 83% da resposta
lipoltica foi recuperado em clulas subcutneas HFD por este agente ( Fig.
3 C ). Para avaliar os potenciais mecanismos pelos quais HFD induzidas estas
alteraes na liplise, ns olhamos principais protenas envolvidas na regulao
desta via. Como esperado, a fosforilao da AMPK, ACC, e HSL serina-563 e
-660 no VC e adipcitos SC a partir de ratinhos de controlo foi aumentada em
resposta forscolina e epinefrina ( Fig. 3 A ). Em adipcitos HFD VC, a
fosforilao da AMPK forskolin- e epinefrina-induzida e ACC foi anulado. Embora
forskolin foi capaz de aumentar HSLSer563 / 660 fosforilao de volta aos nveis de
controle, o efeito adrenalina sobre esta varivel permaneceram suprimidos nos
adipcitos HFD VC ( Fig. 3 A ). Em clulas de gordura SC HFD, fosforilao da
AMPK e ACC em resposta forscolina e epinefrina tambm foi
prejudicada. Alm disso, contrariamente s observaes em adipcitos VC,
fosforilao de HSL em clulas de gordura SC dos ratinhos HFD foi to baixa que
no poderia ser detectado por anlise de Western blot sob condies basais ou
forskolin-, estimulada por epinefrina ( Fig. 3 A ) , apesar do facto de que o
contedo total de HSL era inalterado e estas clulas provocou uma resposta
lipoltica significativa quando expostos a estes agentes ( Fig. 3 C ).
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FIG. 3.
Determinao da AMPK, ACC, e HSL Ser563 / 660 fosforilao sob basal (B;
veculo), forscolina (F; 10? M), e adrenalina (E; 100 nm), em condies de VC
( A ) e SC ( B ) adipcitos de Con e ratinhos dieta HF. Blots so representativos
de 3 expericias independentes. Liberao de glicerol foi medido sob basal,
forskolin (Forsk), e epinefrina (Epi) estimulada por condies em VC ( C ) e SC
( D adipcitos de ratos Con e HF). Dados compilados a partir de 3 experimentos
independentes com quadruplicado para cada condio. ANOVAs de duas vias
foram utilizados para anlises estatsticas. * P <0,05 contra todas as outras
condies; # P <0,05 contra todas as outras condies; $ P <0,05 versus
demais condies; P <0,05 contra todas as outras condies; # P <0,05
contra todas as outras condies.

Efeitos da L826266 especfico inibidor do receptor EP3 em VC e liplise SC

adipcitos.
Numa tentativa para desvendar os mecanismos pelos quais HSL foi inibida sob
condies basais e estimuladas com epinefrina, que bloqueou o receptor
prostanide E-3 (EP3) com o medicamento em ambos os L826266 VC e
adipcitos SC a partir de ratos de controlo e HFD. O inibidor do receptor EP3
aumento da liplise basal de 0,52 0,04-0,97 0,10 nmol 75 min 10 -
5 clulas e de 0,26 0,03-1,60 0,27 nmol min 75 10 -5 clulas em VC e
adipcitos SC a partir de animais de controlo , respectivamente. No entanto,
isso no afectou a liplise basal em VC (1,18 0,07-1,48 0,14 nmol min 75
10 -5 clulas) e SC (0,76 0,11-0,72 0,09 nmol 75 min 10 -5 clulas) a
partir de adipcitos animais de HFD. Da mesma forma, L826266 no tm
qualquer efeito sobre a resposta a adrenalina de VC e SC adipcitos a partir de
qualquer ratos HFD de controlo ou.
Efeito da HFD na absoro de palmitato, incorporao em triacilgliceris,
oxidao e atividade da citrato sintase.
Desde repartio TAG estava com defeito com HFD e foi regulados
diferencialmente em VC contra adipcitos SC, tambm avaliou se os parmetros
envolvidos no metabolismo lipdico foram alteradas em ambos os depsitos de
gordura. Como esperado, a insulina provocou um aumento de 1,4 vezes na
absoro de palmitato por adipcitos VC a partir de ratinhos de controlo ( Fig.
4A ). No entanto, a absoro pelos adipcitos palmitato de VC a partir de
ratinhos HFD diminuiu em 26% e 37% sob condies basais e estimuladas por
insulina em relao ao controlo adipcitos VC, respectivamente ( Fig. 4 A ). Em
adipcitos SC de ratinhos HFD, em supresso tanto basal e palmitato absoro
estimulada por insulina (17% e 28%, respectivamente) tambm foi observada
em comparao com as clulas de gordura de controlo SC. Apesar de uma
reduo na absoro de palmitato, a incorporao de palmitato para TAG
aumento acima dos controlos por 1,7 vezes na VC ( Fig. 4 C ) e cerca de 1,5
vezes em SC ( Fig. 4 D ) adipcitos a partir de ratinhos HFD.Palmitato de
oxidao foi diminuda em ambos VC e adipcitos SC a partir de ratinhos HFD
por -64% e 75%, respectivamente ( Fig. 5 , A e B ). Em linha com estas
mudanas, a atividade da citrato sintase tambm foi reduzida em 46% no VC e
em 63% nos adipcitos SC de ratos HFD (Fig. 5 C ).
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FIG. 4.
Absoro de palmitato na VC ( A ) e SC ( B ) adipcitos isolados de Con e
ratinhos com uma dieta HF durante 8 semanas sob condies basais e
estimuladas por insulina e incorporao de palmitato para lpidos na VC ( C ) e
SC ( D ) clulas de gordura. Os dados foram compilados a partir de 2 a 3
experimentos independentes, com triplicatas para cada condio. ANOVAs de
duas vias ou desemparelhados t -Testes foram utilizados para anlises
estatsticas. * P <0,05 em relao Con; # P <0,05 contra todas as outras
condies; $ P <0,05 em relao Con basais e Con condies estimuladas por
insulina.
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FIG. 5.
Oxidao de palmitato na VC ( A ) e SC ( B ) adipcitos isolados a partir de
ratinhos con e HFD e actividade da sintase do citrato de ( C ). Os dados so
representativos de 3 experincias independentes, com um mnimo de
triplicados para cada condio. Two-way ANOVA ou desemparelhados t -Testes
foram utilizados para anlises estatsticas. * P <0,05 em relao Con; # P <0,05
contra todas as outras condies.

Anlise da expresso gnica em VC e SC depsitos de gordura por PCR

quantitativa.
Ns utilizamos PCR quantitativo para determinar se a expresso de genes
envolvidos na regulao do metabolismo lipdico e liplise foram alterados de
VC e SC tecido adiposo de ratinhos HFD. Os nveis de ARNm de a-1 isoforma
de AMPK foram diminudos em VC e tecido adiposo SC de HFD em comparao
com animais de controlo, enquanto que a expresso da isoforma 2-
permaneceram inalterados ( Tabela 3 ). Alm disso, os nveis de ARNm de
outras protenas envolvidas no metabolismo oxidativo, tais como ACC,
 cytochrome- C subunidade VIII oxidase (Cox8), peroxissoma activado pelo
proliferador do receptor- (PPAR?), E PGC-1 foram diminuiu em ambos VC
(~57, 67 , 72, e 57%, respectivamente) e SC (~43, 73, 52, e 54%,
respectivamente) a partir de tecidos adiposos HFD ratinhos ( Tabela
3 ). Expresso de CGI-58 foi significativamente upregulated em ambos os
depsitos de gordura atingindo 1,7 vezes no VC e 1,8 vezes em SC tecidos
adiposos de ratos HFD. A expresso de adiposo fosfolipase A 2 (AdPLA2 ) em VC
e tecidos adiposos SC foi significativamente aumentada com DH por 1,9 e 2,3
vezes, quando comparada com ratinhos de controlo, respectivamente.
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Tabela 3.
A anlise de PCR quantitativa da expresso do ARNm

DISCUSSO
Aqui, ns fornecemos evidncias romance que o basal aumentou, mas
embotado liplise estimulada pela epinefrina com a obesidade induzida por HFD
mediada por sinalizao prejudicada receptor adrenrgico, a supresso da
fosforilao HSL, e upregulation do contedo ATGL e CGI-58 expresso. A
fosforilao de HSL em resduos de serina 563 e 660, que necessrio para a
liplise mediada por PKA ( 2 ), foi suprimida por potentemente HFD em ambos
os tecidos de gordura SC e VC. Desde funes ATGL essencialmente como uma
lipase TAG ( 38 ,47 ), sobre-regulao de contedos ATGL em combinao com
o aumento da expresso da sua coativador CGI-58 dever ter promovido
repartio TAG e formao de DAG. Isto suportado pelos nossos dados
indicam que a actividade de lipase aumentada TAG em WAT de ratinhos
HFD. Supresso Por outro lado, induzida HFD de HSL fosforilao / atividade
prejudicada colapso da DAG, facilitando assim a sua acumulao no WAT. Isto
evidenciado pelos nossos resultados que o contedo DAG foi significativamente
aumentou de 2,5 e 2,9 vezes no VC e WAT SC, respectivamente. Isso tambm
est de acordo com estudos prvios em camundongos knockout HSL mostrando
que, na ausncia desta lipase, acmulo de DAG em WAT ocorre ( 23 ).
Ignorando a ativao adrenrgica-receptor-mediada das adenilato ciclase com
forscolina totalmente resgatado supresso induzida HFD da fosforilao HSL em
serina-563 e -660 resduos nos adipcitos viscerais. Curiosamente, em
adipcitos subcutneos HFD, liplise foi parcialmente resgatados por forscolina
e esta ocorreu na ausncia de qualquer induo de fosforilao detectvel
HSL. Estudos em camundongos HSL-nulo mostrar liplise residual, indicando
que este processo prejudicada pela atividade HSL falta, embora no
inteiramente dependentes desta lipase. Estudos de outros laboratrios apoiar
estas concluses, onde silenciamento HSL usando pequeno ARN interferente
liplise estimulada por forscolina diminuda em 53%, ao passo que derrubar de
ATGL resultou na reduo de -90% na libertao de glicerol em adipcitos
diferenciados humanos ( 7 ). Em linha com estas observaes, descobrimos que
o contedo ATGL e a expresso da sua coativador CGI-58 foram ambos
aumentaram HFD, que compatvel com o aumento da liplise no HFD
adipcitos viscerais e subcutneos expostos a forscolina. importante notar
que, apesar de forscolina aumentou substancialmente a liplise em adipcitos
de HFD subcutneas, que ainda estava limitado a ~83% dos valores obtidos
com as clulas de controlo expostas a este agente. Isto indica que, apesar de
uma resposta lipoltica induzida por forscolina potente poderia ser obtido
atravs de regulao positiva de ATGL e CGI-58, a falta de fosforilao HSL /
activao limitada a capacidade de HFD adipcitos subcutneos para responder
totalmente a este agente. Esse comportamento reforado por nossos achados
que HSL Ser563 / 660 foi igualmente fosforilada na HFD e controlar adipcitos
viscerais expostos a forscolina. Digno de nota, a resposta lipoltica de adipcitos
HFD ultrapassado (1,67 vezes) que as clulas de controlo tratadas com CR de
forscolina, apesar de no se observou nenhuma fosforilao adicional de HSL.
A exposio de VC e adipcitos SC a partir de ratinhos HFD forscolina para
controlo e demonstrou tambm que as etapas a sinalizao mediada por
receptores adrenrgicos desempenham um papel importante na determinao
das diferenas bem caracterizadas nas taxas de lipolticas entre VC e SC
depsitos de gordura ( 4 ). Isto evidenciado pelo fato de que os valores
absolutos da liplise sob estimulao basal e adrenalina em clulas de gordura
HFD VC controle e foram consistentemente mais elevados do que os valores
obtidos com os adipcitos SC. No entanto, por estimulao com forscolina,
controlo SC liplise foi 1,22 vezes maior do que em adipcitos de controlo
Vc. Estes resultados demonstram que os adipcitos SC tm o potencial para
provocar respostas lipolticas de sinalizao que so passos semelhantes ou
mesmo superiores aos adipcitos de VC, mas os primeiros mediadas pela
activao de receptores adrenrgicos parecem manter uma taxa inferior
lipoltico em adipcitos SC de ratos magros.
Alm HSL fosforilao, o contedo de perilipin tambm foi reduzida em ambos
os depsitos de gordura com a DH. Em HFD VC WAT nveis perilipin eram
dificilmente detectveis, enquanto que em SC WAT o contedo desta protena
foi menor do que o controle, embora ainda abundantemente presentes. Perilipin
contedo reduzido foi demonstrada para alterar a repartio normal dos lpidos
neutros em clulas de gordura. Na verdade, tem sido previamente reportado
que a liplise basal elevada, enquanto que a liplise estimulada por
isoproterenol gravemente atenuada em ratinhos nulos perilipin ( 44 ). Com
base nestas observaes, foi proposto que perilipin exerce um papel importante
na preveno de lipases de aceder lojas lpido neutro, em condies basais, ao
passo que a sua presena necessria para a liplise mediada por PKA
(10 , 44 ). Na ausncia de estimulao adrenrgica, HSL est localizado
principalmente no citoplasma, ao passo que perilipin na superfcie da gotcula
de lpido ( 43 ). Aps estimulao -adrenrgico, PKA activada fosforila HSL,
bem como perilipin ( 31 , 41 ). HSL, em seguida, transloca-se para a gotcula de
lpido e colocaliza com lder perilipin a melhoria na hidrlise de lpidos neutros
( 41 , 43 , 45 ), indicando que a interaco de HSL perilipin e essencial para
os efeitos de PKA mediadas sobre a liplise ( 10 , 32 ) . Nossos dados so
consistentes com essas observaes, uma vez que a reduo induzida por HFD
no contedo perilipin coincidiu com 3.8- e 3.0-fold aumentos na liplise basal
em VC e clulas de gordura SC, respectivamente, enquanto que a liplise
epinefrina estimulada foi igualmente e de forma potente embotados em HFD
adipcitos a partir de ambos os depsitos de gordura.
Outra via que desempenha um papel importante na regulao da liplise
envolve prostaglandinas, particularmente prostaglandinas
E 2 (PGE 2 ). PGE 2 nveis so relatados para ser regulada positivamente em
tecido adiposo a partir de seres humanos obesos e age sobre o receptor EP3,
que sinaliza a G i -coupled receptores de protena para reduzir os nveis de
AMPc intracelular e inibe potencialmente a liplise ( 46 ). No tecido adiposo,
PGE 2 sintetizado por fosfolipase A adiposo 2 (AdPLA 2 ) e segregada por
adipcitos ( 14 ). Recentemente, foi demonstrado que a ablao das
AdPLA 2 em ratinhos gera um fentipo que previne a obesidade induzida por
DFH e eleva a liplise, principalmente por meio de uma diminuio da PGE 2 de
produo e teor em WAT ( 24 ). Nos ratos HFD, encontramos um aumento
significativo na AdPLA2 expresso em VC e SC WAT, que compatvel com o
aumento da PGE 2 nveis observados em indivduos obesos ( 14 ). Portanto, a
hiptese de que overactivation do receptor EP3 devido a secreo de
prostaglandina elevada pelos adipcitos HFD poderia ser responsvel pela
deficincia na sinalizao do receptor adrenrgico e embotados liplise induzida
por catecolaminas no VC e adipcitos SC de ratos HFD. Pr-incubao com o
antagonista do receptor EP3 L826266 aumento da liplise basal em capital de
risco e controle de SC adipcitos.No entanto, isso no altera o efeito inibidor
potente do DFH na liplise induzida por epinefrina. As razes subjacentes a esta
no so claras, embora pode ser que depois de 8 semanas de HFD, o receptor
EP3 foi hyperactivated e incubao aguda com L826266 foi incapaz de superar
o efeito supressor poderoso do HFD prolongado neste caminho. tambm
importante notar que a 3 do receptor p-adrenrgico altamente expresso em
tecido adiposo de rato ( 4 , 33 ) e a utilizao de um agonista selectivo para
este receptor pode ter induzida uma resposta lipoltica distinta em VC e
adipcitos SC de ratinhos HFD . Isto particularmente importante considerando
que a distribuio de isoformas dos receptores p-adrenrgicos em WAT difere
entre roedores e humanos ( 4 ). Portanto, as investigaes futuras utilizando
agonistas e antagonistas dos receptores p-adrenrgicos especficos de
isoformas so necessrios para desvendar os papis da p-isoformas distintas da
liplise em condies de HFD quer na ausncia ou presena do antagonista do
receptor EP3.
Embora a activao AMPK tem sido demonstrado que exerce um efeito
antilipoltico em WAT, o seu efeito sobre os processos metablicos em condies
de HFD ainda no foi avaliado. Aqui, ns fornecemos evidncias romance que
tanto fosforilao e contedo da AMPK e sua ACC substrato foram fortemente
reduzidos em ambos os VC e tecido SCfat de camundongos HFD.Embora este
parece ser consistente com o facto de que a liplise basal elevada, HFD
completamente abolida fosforilao de PKA em HSL alvo serina-563 e -660, com
uma reduo concomitante na actividade da AMPK. Por conseguinte, a inibio
da liplise induzida por catecolaminas no pode ser atribuda activao
exacerbada desta cinase por HFD. De facto, inferior a fosforilao da ACC e
HSL Ser565 , alvos a jusante de AMPK ( 3 , 19 ), est em consonncia com a
activao reduzida desta cinase em VC e SC depsitos de gordura dos ratos
HFD. Alm disso, j anteriormente demonstrado que a curto e longo prazo de 5
aminoimidazole-4-carboxamida-1-- D -ribofuranoside (AICAR) induzida por
ativao da AMPK reduz FA esterificao ( 17 , 18 ). No presente estudo,
mostra-se que uma reduo da AMPK sinalizao com HFD provoca o efeito
oposto, visto que FA incorporao em lpidos foi aumentada, enquanto que a
actividade de sintase de citrato e de oxidao de palmitato foram reduzidos,
que tambm compatvel com a facilitao de armazenamento de lpidos num
estado do excedente de energia crnica. Alm disso, conveniente que, em
condies de HFD a produo de citrato reduzida, uma vez que as clulas so
expostas a uma abundncia de AF e no h necessidade para a via de sntese
de novo de lpido para ser activado. HFD no s reduziu AMPK fosforilao, mas
tambm promoveu a resistncia insulina em ambos os depsitos de
gordura. Isto foi claramente demonstrado pelo facto de que a captao de
palmitato-estimulada de insulina foi inibida pela HFD em VC e SC
adipcitos. Neste cenrio, insuficincia de sinalizao AMPK devem ter
contribudo para a libertao de CC pelo WAT, uma vez que o efeito anti-
lipoltico desta cinase foi atenuada.
At o momento, no h estudos tm demonstrado se a via oxidativa FA nos
adipcitos alterada em condies de obesidade induzida por dieta. Aqui, ns
fornecemos evidncias de que a capacidade oxidativa de ambos VC e adipcitos
SC foi marcadamente reduzida em clulas de gordura de ratos HFD. Embora
este talvez, em parte, atribuda captao palmitato reduzida em adipcitos de
ratos HFD, alteraes na expresso de genes envolvidos no metabolismo
oxidativo tambm foram alteradas. Expresso gnica de PGC-1 e PPARa, que
so reguladores crticos da biognese mitocondrial e gasto de energia ( 35 ),
foram significativamente reduzidos em ambos os VC e WAT SC. Mais
importante, foi demonstrado recentemente que a AMPK e um outro sensor de
energia, o NAD + dependente de tipo III deactylase SIRT1, so necessrias para
a activao PGC-1 ( 11 ). Portanto, a supresso crnica de AMPK como visto na
WAT de ratinhos HFD consistente com uma reduo da capacidade do
presente tecido para regular positivamente o metabolismo oxidativo. Alm
disso, estudos recentes do nosso laboratrio indicaram que a activao de
AMPK AICAR-induzida durante 15 h expresso aumentada do gene de PGC-1 e
PPARa, que conduziram metabolismo lipdico para a dissipao de energia em
vez de armazenamento ( 17 ). Embora a WAT no tem capacidade oxidativa
elevada, estas diferenas no metabolismo de CC pode ter um impacto
importante sobre o metabolismo do corpo inteiro de lpidos, porque o tecido
gordo faz-se uma grande proporo de massa corporal (15-20% e 20-30% em
indivduos saudveis homens e mulheres, respectivamente), em particular em
indivduos obesos (mais do que 40%) ( 12 ). Embora no haja evidncia de que
a FA oxidao em adipcitos aumenta medida que um meio de lidar com a
carga lipdica em excesso em obesidade, os nossos dados sugerem que a
diminuio da oxidao de AG em WAT pode contribuir ainda mais para a
acumulao de massa de gordura em ambos os depsitos de gordura visceral e
subcutneo sob condies de HFD.
Em resumo, os nossos resultados indicam que perturba a obesidade induzida
por sinalizao atravs HFD principais componentes da cascata lipoltica no TAB
( Fig. 6 ). Especificamente, HSL e perilipin so reprimidos, enquanto ATGL e
CGI-58 est regulada. Isso culmina em aumento basal mas severamente
embotada liplise induzida por catecolaminas e acmulo de DAG em VC e
depsitos SC gordura. Alm disso, o comprometimento da atividade da AMPK e
regulao negativa da PGC-1 e PPARa resultou em esterificao elevada e
reduzida capacidade de oxidar FA no VC e adipcitos SC ( Fig. 6 ). No total,
estas alteraes de regulao molecular da liplise e metabolismo FA dar dicas
sobre as adaptaes metablicas disfuncionais que ocorrem com HFD na WAT e
pode ajudar ainda mais a nossa compreenso dos mecanismos defeituosos que
contribuem para a obesidade e suas alteraes metablicas associadas.
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FIG. 6.
Resumo dos efeitos de DH sobre a liplise dos adipcitos e o metabolismo. As
setas representam o aumento ou a regulao negativa da actividade, teor de
protena, e / ou expresso. Linhas sem setas indicam a inibio. Sob HFD, o
efeito de catecolaminas no -adrenrgico (-AR) cascata de sinalizao sejam
arredondados atravs da activao reduzida do receptor de protena G
estimuladora acoplado (G s ). Isto reduz a activao da protena quinase A (PKA)
e inibe a fosforilao da lipase sensvel a hormona (HSL). HFD tambm regula
positivamente a expresso de tecido adiposo fosfolipase A 2 (AdPLA 2 ), que tem
sido demonstrado que o aumento de prostaglandina E 2 (PGE 2 de produo), o
ligante primrio para o receptor 3 E-prostanide (EP3). Desde EP3 est
acoplado a uma protena G inibidora (L i ), a activao deste receptor adicional
inibe PKA sob condies HFD.Aumento do teor de gene e ATGL comparativa
identificao da 58 expresso (CGI-58) tambm ocorre com HFD para facilitar a
repartio TAG, embora subsequente diminuio da HSL resultados
fosforilao / actividade na acumulao de DAG. Diminuies na perilipin HFD-
induzida (Peri) contedo tambm parece contribuir para a liplise disfuncional
nestas clulas. Reduo do teor de AMPK e fosforilao por HFD est em linha
com ACC reduzida e suprimiu oxidao. A capacidade oxidativa dos adipcitos
diminuda com DH, o que compatvel com supresso de reguladores de
biognese mitocondrial, tais como peroxissoma activado pelo proliferador do
receptor- (PPARy) coactivador-1 (PGC-1) e expresso PPARa. AC, adenilil
ciclase; AA, cido araquidnico; PC, fosfatidilcolina; PM, membrana
plasmtica; FA, cido gordo; MAG; monoacilglicerol; MAGL, lipase MAG; Mito,
mitocndrias.

SUBVENES
Esta pesquisa foi financiada por uma subveno de funcionamento do Instituto
Canadense de Pesquisa em Sade (CIHR) e por concesses de infra-estrutura da
Fundao Canadense para a Inovao (CFI) e do Fundo de Investigao Ontrio
(ORF) atribudo RB Ceddia. RB Ceddia tambm um receptor da concesso
New Investigator CIHR e o Prmio de Investigao precoce do Ministrio da
Investigao e Inovao Ontario. MP Gaidhu e NM Anthony so suportados por
Doutorado e Mestrado CIHR canadenses graduao Bolsas, respectivamente.

DIVULGAO
 Os autores declaram no haver nenhum conflito ou dualidade de interesse em
relao a este trabalho.

AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a Merck Frosst para o presente tipo de L826266.
Copyright 2010, a American Physiological Society

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