Les Méthodes Moléculaires de Diagnsotic

Post-Graduation
en
Immunologie animale
2016
Mthodes molculaires de
diagnostic
Bernard China
11/03/2016
1
TABLE DES MATIERES
Lextraction de lADN ........................................................................................................................4
Prparation d'ADN plasmidique ......................................................................................................5
Contrle de l'extraction ....................................................................................................................5
Le phnomne de restriction modification. ..........................................................................................8
Rle biologique ................................................................................................................................8
Proprits ..........................................................................................................................................9
Nomenclature .................................................................................................................................10
Exemples d'enzymes de type II ......................................................................................................11
Utilisation en gntique ..................................................................................................................11
La ligation ..........................................................................................................................................12
Mcanisme .....................................................................................................................................12
Fonctions cellulaires .......................................................................................................................13
LAMPLIFICATION GENETIQUE PAR PCR ...............................................................................14
Applications ...................................................................................................................................16
Facteurs affectant la migration .......................................................................................................16
Gel d'agarose ..................................................................................................................................17
Analyse du gel ................................................................................................................................20
Dtermination du poids molculaire ..............................................................................................21
Les alternatives aux bromure dthidium .......................................................................................22
Les bioanalyseurs .......................................................................................................................23
La PCR-ELISA ..............................................................................................................................24
Les puces ADN............................................................................................................................25
Principe...........................................................................................................................................26
Utilisation .......................................................................................................................................27
Fabrication ......................................................................................................................................28
LA PCR QUANTITATIVE ............................................................................................................30
La PCR en temps rel .....................................................................................................................30
Refrences ......................................................................................................................................36
Les techniques damplification isothermiques ...................................................................................37
Strand displacement amplification ou SDA ...................................................................................37
Nucleic acid sequence-based amplification ou NASBA ................................................................41
Molecular Beacon dans le NASBA ................................................................................................43
Les Avantages de la NASBA ........................................................................................................43
Transcription Mediated Amplification (TMA) ..............................................................................44
TMA Detection ..........................................................................................................................46
HELICASE DEPENDENT AMPLIFICATION ............................................................................48
LOOP MEDIATED AMPLIFICATION ou LAMP (Notomi et al., 2000) ....................................49
INTRODUCTION ......................................................................................................................49
2
La mthode LAMP .....................................................................................................................50
Optimalisation des conditions du LAMP ...................................................................................53
Dtection des produits de LAMP ...............................................................................................54
Avantages DU LAMP ................................................................................................................56
Strand Invasion Based Amplification (SIBA) ................................................................................57
Le squenage de lADN ...................................................................................................................59
Historique .......................................................................................................................................59
Mthode de Maxam et Gilbert .......................................................................................................60
La mthode de Sanger ....................................................................................................................62
Squenage de gnome entier ........................................................................................................65
Autres mthodes ...........................................................................................................................66
Notes et rfrences .........................................................................................................................68
Les principales mthodes de squenage de nouvelle gnration..................................................70
Le pyrosequencing .....................................................................................................................70
Procedure ........................................................................................................................................70
References ......................................................................................................................................71
Le systme illumina ou le sequencage par synthese ..................................................................72
Sequenage par semiconducteur dions .............................................................................................74
Historique .......................................................................................................................................74
Technologie ....................................................................................................................................75
La chimie de sequencage............................................................................................................76
La detection du signal ................................................................................................................76
Caracteristiques du sequencage par detectin dions ...................................................................76
points forts ......................................................................................................................................77
Limitations .....................................................................................................................................77
References ......................................................................................................................................78
3
LEXTRACTION DE LADN
Lorsquon veut faire un test molculaire, la premire tape consiste le plus souvent extraire lADN.
Une extraction classique consiste principalement en trois tapes : la lyse des cellules, llimination des
protines et des ARN et la prcipitation de lADN.
La lyse. Selon le type de matrice, le tampon de lyse sera adapt. Il contient en gnral un dtergent
comme le SDS (dodcylsulfate de sodium) qui va solubiliser les membranes ; un agent cahotropique
comme le NaOH et ventuellement des enzymes supplmentaires. Ainsi, pour lyser les tissus riches en
protines, on ajouter des protases comme la protinase K ou pour lyser des bactries gram positif, on
ajoutera du lysozyme qui va sattaquer au peptidoglycane.
Llimination des protines. Dans une mthode manuelle, on va raliser des extractions au
phnol/Chloroforme pour extraire les protines. Les protines dnatures vont venir se placer
linterface entre la phase organique et la phase aqueuse. Dans une mthode en kit, le lysat sera pass sur
une colonne qui contient soit une membrane soit des billes qui ont une affinit pour lADN, par exemple
des billes de silice. Il en rsulte que lADN mais aussi lARN sera retenu par la colonne et les protines
ne seront pas retenues. La colonne est lave lalcool pour enlever les protines qui se seraient attaches
de faon non spcifique la colonne. Ensuite, lADN est lu en augment la force ionique de la phase
mobile.
Llimination des ARN. LARN et lADN ont des proprits physico-chimiques semblables et donc on
ne pas les sparer par des mthodes physiques classiques. LARN sera donc limin en ajoutant de le
RNAse la solution. Il est noter que pour la plupart des manipulations, la prsence dARN dans la
prparation nest pas un rel problme.
Prcipitation de lADN. Ensuite, lADN peut tre prcipit par salting out . Il sagit dajouter la
solution aqueuse du sel (NaCl, Actate de sodium), les ions forms vont accapars les molcules deau
qui ne seront plus disponibles pour maintenir lADN est solution et celui-ci va prcipiter. Pour accentuer
le phnomne, on ajoute de lthanol ou de lisopropanol pour diminuer la polarit du milieu et favoriser
la prcipitation. En plus, on peut placer le tout au froid (-20C pendant 20 min) pour encore un peu plus
favoriser la prcipitation. Il suffira alors de centrifuger le tout 10 000 g pendant 15 min pour voir lADN
former un culot dans le fond du tube. Il est alors possible dliminer le sel en lavant le culot avec de
lthanol 70%.
Remarque. Il est possible partir dune culture bactrienne de faire une extraction rapide qui est
souvent suffisante pour raliser une amplification gntique. Il sagit de faire bouillir les cellules 10
min et de centrifuger 10 000 g pendant 5 minutes. LADN se trouve alors en solution alors que les
dbris cellulaires se retrouvent dans le culot qui est limin.
4
PREPARATION D'ADN PLASMIDIQUE
Pour les bactries, il est possible de sparer spcifiquement lADN plasmidique de lADN
chromosomique.
La prparation d'ADN plasmidique partir de bactries est l'une des techniques les plus courantes de
la biologie molculaire, galement connue sous les noms abrgs de miniprep, midiprep et maxiprep
en fonction du volume de la culture bactrienne utilise. Le principe de l'extraction est connu sous le
nom de lyse alcaline. Cette mthode permet de prparer slectivement l'ADN du plasmide contenu
dans les bactries, tout en liminant l'ADN du chromosome bactrien. Le principe de cette mthode
consiste effectuer la lyse des cellules au moyen d'un dtergent (dodcyl sulfate de sodium) en
prsence de soude, pH 13. ce pH trs alcalin, l'ADN est dnatur, cest--dire que les deux brins
de la double-hlice sont spars. On neutralise ensuite rapidement la solution, ce qui provoque la
renaturation brutale (rappariement des brins du duplex d'ADN). L'ADN chromosomique, trs long
(~10 paires de base), ne parvient pas se rapparier compltement et forme des enchevtrements
insolubles. L'ADN plasmidique, court (~10 paires de base), parvient se reformer et reste en
solution. On spare alors les espces par centrifugation. Les protines prcipites, sont galement
limines avec le dtergent et l'ADN chromosomique. L'ADN plasmidique est alors concentr par
prcipitation l'alcool.
Diffrentes variantes ou amliorations de cette mthode existent notamment dans un grand nombre
de kits commerciaux. Ces derniers contiennent souvent des petites colonnes de rsine
chromatographique changeuse d'ion, permettant d'amliorer la puret de l'ADN obtenu. Pour
liminer les ARN, on ajoute frquemment des ribonuclases qui vont hydrolyser slectivement ces
acides nucliques, en laissant l'ADN intact.
CONTROLE DE L'EXTRACTION
Contrle qualitatif. Aprs extraction, il est possible de vrifier si lADN est de bonne qualit par
lectrophorse en gel dagarose. En effet, sur un gel dlectrophorse aprs coloration au bromure
dthidium et rvlation sous UV, on peut vrifier si lADN gnomique extrait forme une seule bande
de haut poids molculaire (environ 50 kb) ou sil forme un smear (une traine). Si un smear est
visible cela tmoigne du fait que lADN est dgrad (Figure 1).
5
ADN ADN
non dgrad
50 kb
Sm
1 kb
Figure 1. Schma du rsultat de llectrophorse en gel dagarose dADN extrait. A gauche un

ADN non dgrad, droite un ADN dgrad.
LADN plasmidique quant lui existe sous trois formes, super enroul (CCC= closed covalently
circular), ouvert si un brin est coup (Open circular= OC) et linaire (si les deux brins sont coups).
En lectrophorse en gel dagarose, un, plasmide prsentera donc 3 bandes (Figure 2).
OC
Linaire
CC
Figure 2. Electrophorse dADN plasmidique
Contrle quantitatif. LADN bicatnaire absorbe la lumire 260 nm alors que les protines
absorbent la lumire 280 nm. Il est possible de faire un dosage de lADN au spectrophotomtre en
appliquant la loi de Beer Lambert.
La loi de Beer-Lambert, aussi connue comme la loi de Beer-Lambert-Bouguer et chez les
francophones parfois mme simplement comme la loi de Bouguer, est une relation empirique reliant
l'attnuation de la lumire aux proprits du milieu qu'elle traverse et l'paisseur traverse.
6
La loi de Beer-Lambert tablit une proportionnalit entre la concentration d'une entit chimique en
solution, l'absorbance de celle-ci et la longueur du trajet parcouru par la lumire dans le milieu
considr. La loi de Beer-Lambert n'est cependant valable que sous certaines conditions : la lumire
doit tre monochromatique, la concentration des solutions doit tre faible (de lordre de 104 mol.L1),
les solutions doivent tre homognes et le solut ne doit pas ragir sous laction de la lumire
incidente.
L'absorption d'un faisceau de lumire monochromatique dans un milieu homogne et isotrope est
proportionnelle la longueur du trajet optique suivi par cette radiation et la concentration, en solution,
ou la pression partielle, en phase gazeuse, des espces absorbantes.
La loi de Beer-Lambert peut s'exprimer ainsi :
Ou encore :
est la transmittance de la solution (sans unit).

A est labsorbance ou densit optique une longueur d'onde (sans unit).
est l'absorptivit molaire (aussi appel coefficient d'extinction molaire), exprime en
Lmol1cm1. Elle dpend de la longueur d'onde, la nature chimique de l'entit et la
temprature.
est la longueur du trajet optique dans la solution traverse, elle correspond l'paisseur de
la cuvette utilise (en cm).
C dsigne la concentration molaire de la solution (en mol.L1). Dans le cas d'un gaz, C peut
tre exprime comme une densit (units de longueur rciproque au cube, cm3).
Cette quation est trs utile pour la chimie analytique. En effet, si et sont connus, la
concentration d'une substance peut tre dduite de la quantit de lumire transmise par elle.
Pour effectuer par spectrophotomtrie directe le dosage dune solution pure dacides nucliques, on
utilise labsorbance des rayons ultraviolets 260 nm. On considre dans les calculs quune mole de
nuclotides polycondenss reprsente 309 grammes. Il faut se placer autant que possible dans des
conditions standard de mesure : cuve de 1 cm, solution 1 M (309 mg/mL), temprature ambiante,
[Na+] 0,3 M, rapport A260/A280 1,80.
NB. Quand le rapport ADN bicatnaire (260 nm), protines (280 nm) est suprieur 1,8 on
considre que lADN est pur.
Dans ces conditions le coefficient dextinction de lADN double brin est de 6200 A260.M-1.cm-1,
cest dire quune unit dabsorbance 260 nm (A260) reprsente 50 g/mL.
7
Dans ces conditions le coefficient dextinction de lADN simple brin est de 8350 A260.M-1.cm-1,
cest dire quune unit dabsorbance 260 nm (A260) reprsente 37 g/mL.
Dans ces conditions le coefficient dextinction de lARN est de 7700 A260.M-1.cm-1, cest dire
quune unit dabsorbance 260 nm (A260) reprsente 40 g/mL
(https://fr.wikipedia.org/wiki/Loi_de_Beer-Lambert).
LE PHNOMNE DE RESTRICTION MODIFICATION.

Comment les bactries, dpourvues de systme immunitaire, se dfendent-elles contre
les virus (appels aussi phages) qui les infectent ? C'est le Suisse Werner Arber, qui apporte le
premier la rponse cette question. En 1962, il dcouvre que des enzymes bactriennes sont capables
de couper l'ADN du phage au niveau de zones bien dtermines (diffrentes en fonction des
enzymes), appeles sites de restriction, qui correspondent de courtes squences de 4 8 nuclotides.
En 1970, l'Amricain Hamilton O. Smith (n en 1931) purifie la premire enzyme de restriction
partir de la bactrie Haemophilus influenzae. L'anne suivante, son compatriote Daniel
Nathans (1928-1999) l'utilise pour dcouper l'ADN du virus SV40. En faisant des diffrentes
enzymes de restriction de vritables ciseaux molculaires, qui permettent de couper l'ADN volont,
ces trois chercheurs ont dot la biologie molculaire d'un de ses outils les plus indispensables. Pour
cette vritable invention du gnie gntique, ils recevront, en 1978, le prix Nobel de physiologie
ou mdecine.
Une enzyme de restriction est une protine qui peut couper un fragment d'ADN au niveau d'une
squence de nuclotides caractristique appele site de restriction. Chaque enzyme de restriction
reconnat ainsi un site spcifique. Plusieurs centaines d'enzymes de restriction sont actuellement
connues, on en retrouve naturellement dans un grand nombre d'espces de bactries.
Ces enzymes, naturellement prsentes chez les bactries, sont devenues des outils important en gnie
gntique.
ROLE BIOLOGIQUE
Les enzymes de restriction sont produites par des bactries et constituent un mcanisme de dfense
contre les infections par les bactriophages, des virus spcifiques des bactries. Lorsque le virus
injecte son ADN dans le micro-organisme, celui-ci est coup par l'enzyme de restriction au niveau de
ses sites spcifiques. La destruction du gnome du virus bloque ainsi l'infection. Le nom d'enzyme
de restriction provient de ce mcanisme, en effet la prsence de ces enzymes dans les bactries
restreint l'infectiosit des bactriophages.
Pour viter que l'enzyme de restriction ne coupe l'ADN de son propre gnome, la bactrie fabrique
aussi une deuxime enzyme appele mthylase qui reconnat galement le site de restriction. La
8
mthylase ne coupe pas l'ADN, mais le modifie en lui rajoutant un groupement mthyle sur un ou
plusieurs nuclotides du site. Cette mthylation empche la coupure par l'enzyme de restriction.
Les ADN mthyltransfrases (MTases) qui assurent le transfert d'un groupe mthyle de la S-
adnosylmthionine soit aux rsidus d'adnine ou cytosine, se retrouvent la fois chez les procaryotes
et les eucaryotes. La mthylation doit tre envisage lorsque la digestion de restriction d'ADN
endonuclases En effet, le clivage peut tre bloque ou altre quand une base particulire dans le
site de reconnaissance est mthyl.
Chez les procaryotes, les MTases le plus souvent ont t identifis comme des lments des systmes
de restriction / modification qui agissent pour protger l'ADN de l'hte du clivage par l'endonuclase
de restriction correspondante. La plupart des souches de laboratoire de E. coli contiennent trois
methylases d'ADN site-spcifiques.
La mthylase Dam-mthylation en position N6 de l'adnine dans la squence GATC.
La mthylase DCM-mthylation la position C5 de la deuxime cytosine dans les squences CCAGG
et CCTGG.
Mthylase EcoKI-mthylation de l'adnine dans la squence AAC (N6) GTGC et GCAC (N6) GTT.
Une partie ou la totalit des sites pour une endonuclase de restriction peut tre rsistant au clivage
quand l'ADN est isol de souches exprimant des mthylases Dam DCM si le site de reconnaissance
de la mthylase chevauche le site de reconnaissance d'endonuclase. Par exemple, l'ADN plasmidique
isol d' E.coli dam+ est compltement rsistant au clivage par Mbol, qui clive des sites GATC.
Ce mcanisme de dfense, appel systme de restriction/modification, associe systmatiquement ces
deux enzymes, l'une de coupure et l'autre de protection.
PROPRIETES
Les enzymes de restrictions appartiennent la classe des endonuclases, c'est--dire des enzymes
capables de cliver les liaisons phosphodiester entre deux nuclotides l'intrieur de la chane d'un
acide nuclique, et plus spcifiquement appartiennent la classe des endodsoxyribonuclases
puisque spcifique l'ADN. Les endonuclases diffrent des exonuclases, puisqu'elles peuvent
cliver les brins d'acide nuclique de manire interne, alors que les exonuclases n'attaquent la
molcule d'acide nuclique qu'au niveau de ses extrmits.
Les enzymes de restriction sont capables de reconnatre spcifiquement et uniquement une courte
squence de l'ADN de 4 10 paires de bases, et de cliver les deux brins du duplex d'ADN au site
reconnu. Cette proprit a depuis longtemps t utilise en biologie molculaire, puisqu'elles
permettent de fragmenter l'ADN en segments de taille rduite en coupant des sites dfinis.
Les enzymes de restriction peuvent tre utilises pour tablir une carte gntique (appele carte de
restriction ) d'une molcule d'ADN. La carte de restriction donne l'ordre des sites de restriction le
9
long de cette molcule, et la taille des fragments produits. Cette technique de caractrisation des
acides nucliques, trs utilise voici une vingtaine d'annes, est supplante par le squenage direct,
devenu bien moins coteux et ralis de faon routinire.
Elles peuvent tre galement utilises pour faire produire des cellules hte (par exemple la bactrie
Escherichia coli ) une protine exogne. Les enzymes de restriction jouent un rle crucial dans ce
processus car elles permettent, en coupant le brin un endroit prcis et de manire asymtrique,
l'intgration d'un brin d'ADN spcifique codant pour une protine prcise dans un plasmide dans le
but de l'exprimer dans une bactrie. Cette intgration peut tre faite, profitant de l'asymtrie cre par
l'enzyme de restriction, en jouant sur l'homologie de squence au site de clivage == site d'intgration.
Selon la relation spatiale entre la squence reconnue et le lieu de coupure, il est possible de distinguer
trois types d'enzymes de restriction.
Les enzymes de type I et de type III reconnaissent une squence d'ADN spcifique et coupent en un
endroit alatoire, d'une distance d'environ 1 000 paires de bases (pb) pour le type I et de 25 pb pour
le type III plus loin que le site de restriction. Ces 2 types ont galement une activit mthylasique en
plus de leur activit endonuclasique, ce qui les diffrencie du type II.
Les enzymes de type II, les plus utilises, reconnaissent une squence spcifique et coupent en un
endroit spcifique de cette squence. Quelques exemples de ces enzymes figurent ci-dessous.
De manire gnrale, les enzymes de restriction sont bloques par le monoazide d'thidium.
NOMENCLATURE
La nomenclature des enzymes de restriction est prcise. Leur nom comporte 3 ou 4 lettres
correspondant entre autres la bactrie partir de laquelle on a extrait cette enzyme:
La premire lettre est en majuscule cela correspond la premire lettre du genre de la bactrie
La seconde et troisime lettre sont en minuscule et correspondent aux deux premires lettres
de l'espce bactrienne
La quatrime lettre correspond la souche bactrienne, elle est crite en majuscule mais
n'est pas prsente dans toutes les enzymes de restriction
Enfin un chiffre romain donne le numro d'ordre de caractrisation de l'enzyme
Ainsi on a EcoRI : Enzyme de restriction d'Escherichia (genre) coli (espce) souche RY317 la
premire tre caractrise (I)
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EXEMPLES D'ENZYMES DE TYPE II
Enzyme Source Sequence reconnue Coupure Extrmits (aprs coupure)

Eco RI Escherichia coli 5'GAATTC 5'---G AATTC---3' Cohsives
3'CTTAAG 3'---CTTAA G---5' 5-extension
BamHI Bacillus amyloliquefaciens 5'GGATCC 5'---G GATCC---3' Cohsives
3'CCTAGG 3'---CCTAG G---5' 5-extension
HindIII Haemophilus influenzae 5'AAGCTT 5'---A AGCTT---3' Cohsives
3'TTCGAA 3'---TTCGA A---5' 5-extension
TaqI Thermus aquaticus 5'TCGA 5'---T CGA---3' Cohsives
3'AGCT 3'---AGC T---5' 3-extension
AluI Arthrobacter luteus 5'AGCT 5'---AG CT---3' Franches
3'TCGA 3'---TC GA---5'
PstI Providencia stuartii 5'CTGCAG 5'---CTGCA G---3' Cohsives
3'GACGTC 3'---G ACGTC---5' 3-extension
SmaI Serratia marcescens 5'CCCGGG 5'---CCC GGG---3' Franches
3'GGGCCC 3'---GGG CCC---5'
Le N et le M dans la squence de MstII peuvent tre remplacs par une des 4 bases et son
complment. La squence de restriction du MstII est un exemple de palindrome imparfait puisqu'il
comporte un nombre impair de paires de bases.
UTILISATION EN GENETIQUE
Les digestions enzymatiques se font gnralement dans un microtube mis au bain-marie

temprature convenablement rgle (gnralement 37 C) sur un portoir flottant
(https://fr.wikipedia.org/wiki/Enzyme_de_restriction)
11
LA LIGATION
Si les enzymes de restrictions sont utilises sont utilises pour cliver lADN bicatnaire, lADN
ligase est utilise pour lier des molcules dADN entre elles.
En biologie molculaire, les ADN ligases sont des enzymes de la classe des ligases qui catalysent la
formation d'une liaison phosphodiester entre deux segments d'ADN. Les ADN ligases interviennent
dans plusieurs processus cellulaires essentiels du mtabolisme de l'ADN : dans la rplication de
l'ADN, pour la suture des fragments d'Okazaki et dans la rparation de l'ADN et dans la
recombinaison homologue.
L'ADN ligase permet de former une liaison entre le groupement 5'-phosphate d'un segment d'ADN
et le groupement 3'-OH du segment prcdent sur le mme brin. En gnral, ces deux segments sont
associs au brin d'ADN complmentaire qui sert de matrice pour la suture des brins. Certaines ADN
ligases (ADN ligase IV) sont capable de faire de la suture d'ADN prsentant des cassures double-
brin.
La formation de la liaison phosphodiester ncessite un cofacteur, en gnral l'ATP (parfois le
NAD+) qui est hydrolys en AMP (ou NMN) lors de la raction.
Les ADN ligases sont des enzymes qui jouent un rle essentiel en biologie molculaire et en gnie
gntique, comme l'un des outils majeurs de production d'ADN recombinant. L'ADN ligase permet
en particulier de suturer les fragments d'ADN produits par des enzymes de restriction.
Figure 3. Suture par l'ADN ligase d'extrmits gnres par une enzyme de restriction
MECANISME
Les ADN ligases catalysent la suture de deux brins d'ADN en trois tapes successives de transfert
de nuclotide, avec deux intermdiaires covalents1. Tout d'abord, l'ATP (ou le NAD+) ragit avec
une lysine du site actif de l'enzyme, avec transfert d'un groupement adnylate sur le groupement
NH2 de la lysine :
(i) Appp + NH2-ligase Ap-NH-ligase + PPi
L'adnylate est ensuite transfre par l'enzyme sur le groupement 5'-phosphate du segment d'ADN
suturer. On a un deuxime intermdiaire covalent, ADN-adnylate :
(ii) Ap-NH-ligase + 5'p-ADN App-ADN + ligase-NH2
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Le 3'-OH de l'autre segment d'ADN attaque ensuite la liaison phosphoanhydride entre l'AMP et le
groupement 5' phosphate :
(iii) ADN-OH3' + AppADN ADN-p-ADN + AMP
FONCTIONS CELLULAIRES
Des ADN ligases interviennent dans un grand nombre de mcanismes biologiques, souvent la
dernire tape de processus impliquant une synthse d'ADN. Les ADN polymrases qui
synthtisent l'ADN peuvent allonger un brin, mais sont incapables de relier des segments entre eux
par une liaison phosphodiester, cette tape ncessitant l'action d'une ligase. De nombreux processus
cellulaires font intervenir la synthse d'un brin d'ADN :
La rplication. Sur le brin lent (lagging strand), la synthse est discontinue et passe par la
production de fragments d'Okazaki qui doivent tre suturs les uns aux autres pour faire un
brin d'ADN continu.
La rparation par excision de base et la rparation par excision de nuclotides. Ces deux
mcanismes passent par l'excision de la rgion d'ADN endommag qui ensuite synthtis
nouveau par une ADN polymrase. L'ADN ligase suture l'ADN nouveau avec la partie
intacte de l'ADN prexistant.
La recombinaison. Lors du processus de recombinaison, il se produit un change de brin
entre deux duplexes d'ADN qui aboutit la formation d'une jonction de Holliday. La
coupure de cette jonction par une rsolvase ncessite ensuite une suture des brins pour
reformer deux duplexes spars.
La rparation des cassures double-brin par jonction d'extrmits non homologues (non-
homologous end-joining) implique l'action d'une ADN ligase spcifique, capable de
ligaturer des extrmits d'ADN double brin. Cette ligase intervient aussi dans le processus
de la recombinaison V(D)J qui permet la formation du rpertoire d'anticorps.
https://fr.wikipedia.org/wiki/ADN_ligase
13
LAMPLIFICATION GENETIQUE PAR PCR
En 1983, un processus simple dans le concept damplification du nombre de fragments dADN

prsents dans un chantillon fut dvelopp par Mullis (1990). En 1989, cette technique fut dcrte
" dveloppement scientifique majeur " de lanne (Guyer et Koshland., 1990). Ce processus est
appel " Polymerase Chain Reaction " (PCR). Trs rapidement, la PCR est devenue la mthode de
choix pour lamplification de lADN. La technique est base sur la rptition dun processus en
trois tapes (Figure 4).
Figure 4 : Principe de la PCR .Il sagit dune raction en trois tapes. (i) La dnaturation de lADN double brin en
ADN simple brin par la chaleur (ii) lhybridation ou lhybridation des amorces (primers) par diminution de la
temprature sous leur temprature dhybridation (iii) llongation des amorces par une ADN polymrase thermostable.
Ce processus peut subir une " cyclisation " qui de traduit par une augmentation exponentielle du nombre de molcules
dADN amplifies.
La dnaturation de lADN double brin en ADN simple brin, lhybridation des amorces lADN
simple brin et lextension enzymatique des amorces par une ADN polymerase thermostable qui
synthtise un brin dADN complmentaire celui ser- vant de cible pour les amorces
oligonuclotidiques. Ce processus peut tre cyclis grce lutilisation de la polymrase
thermostable qui rsiste ltape de dnaturation. Il en rsulte une amplification de type exponentielle
du fragment dADN bord par les deux amorces. Ainsi, lutilisation dune enzyme thermostable, la
Taq polymerase isole de la bactrie thermophile Thermus aquaticus, a permis une semi-
automatisation du processus damplification qui est depuis largement utilis dans les laboratoires
de recherche. Les points faibles de la PCR sont : la susceptibilit aux contaminations par de lADN
tranger qui peut tre amplifi avec lchantillon et la prsence dinhibiteurs. En effet, si on travaille
partir de matrices complexes comme la nourriture, le sang ou les matires fcales, il est possible
que ces chantillons contiennent des inhibiteurs de la raction de PCR quil faudra liminer avant la
PCR. Les facteurs qui inhibent lamplification des acides nucliques par la PCR sont prsents avec
lADN isol de sources diverses. Les inhibiteurs agissent principalement une ou plusieurs des
trois tapes essentielles : ils interfrent avec la lyse de la cellule ncessaire lextraction dADN, ils
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interfrent en dgradant ou en capturant lADN et ils inhibent lactivit de la polymrase. Bien
quun grand nombre dinhibiteurs ait t rapports, leurs modes daction restent pour la plupart
obscurs. Ces effets peuvent avoir des implications importantes pour les investigations cliniques ou
de sant publique, surtout si les tudes impliquent des analyses daliments ou partir de
lenvironnement. Les inhibiteurs classiques regroupent diffrents composs des fluides corporels et
des ractifs rencontrs en clinique ou en mdecine lgale. L'inhibition peut tre totale ou partielle et
peut se manifester par une raction totalement inefficace ou par une rduction de la sensibilit de
la dtection. Dans certains cas, linhibition peut donner naissance des faux ngatifs si on omet
dincorporer un contrle interne de PCR. Ces inhibiteurs incluent des produits chimiques organiques
et inorganiques, des dtergents, des antibiotiques, des tampons, des enzymes, des polysaccharides,
des graisses et des protines. Il est possible de se dbarrasser des inhibiteurs en utilisant une mthode
de prparation de lADN base sur la chromatographie daffinit (billes magntiques ou colonnes)
ou en utilisant aprs une prparation dADN grossire (boiling) une rsine fixant les inhibiteurs
(Chelex 100).
La PCR a fait progressivement son apparition dans les laboratoires de diagnostic microbiologique.
Lanalyse comprend diverses tapes : la prparation de lADN qui peut tre directe partir de
laliment ou plus classiquement aprs pr-enri- chissement. Les techniques dextraction varient de la
plus simple (pas dextraction, on pique une colonie directement dans le mlange de PCR), la plus
pousse (utilisations de trousses dextraction bases sur une chromatographie daffinit). Les cots
de ces diverses mthodes ne sont pas non plus les mmes, une extraction par trousse peut varier entre
1 et 4 euros. La seconde tape est de raliser la raction de PCR qui inclut : une ADN polymrase
thermostable (de nombreuses variantes sont commercialises avec des performances variables), des
nuclotides ( une concentration finale de lordre de 200 mM), le tampon de lenzyme, du MgCl2
(entre 1,5 et 3 mM en concentration finale) qui sert de cofacteur lenzyme, des amorces
oligonuclotidiques (entre 15 et 30 mers une concentration finale de lordre de 200 nM), de
lADN (environ 10 ng) et deau. Le choix des amorces est particulirement important. Il faut partir
d'une squence dADN, mais les banques de squences (GenBank, EMBL,) sont de mieux en
mieux fournies. De plus, des logiciels informatiques sont disponibles pour slec- tionner les
meilleures amorces (Oligo, Primer3,). Ils tiennent compte des facteurs suivants : absence de
structures secondaires, absence de complmentarit entre amorces, temprature dhybridation proche.
Le choix de la squence est aussi important : gne de virulence ou gne de maintenance (house
keeping gene).
La raction de PCR se droule dans un thermocycler qui est compos dun bloc chauffant dont la
temprature est rgle le plus souvent par effet Peltier. Ceci permet au bloc de varier sa temprature
trs rapidement. Lefficacit de la PCR dpend aussi de la qualit du thermocycler. Dans le cadre du
projet europen QLK1-CT- 1999-00226 "validation and standar- disation of diagnostic polymerase
chain reaction for detection of food- borne pathogens " dont le laboratoire est partenaire, une tude
sur six thermocyclers a t ralises. Les performances des 6 thermocyclers sont trs diffrentes
surtout en termes de diffrence entre la temprature atteindre et la temprature rellement atteinte
dans les tubes ainsi quen ce qui concerne luniformit de la temprature sur lensemble du bloc.
Enfin, la dernire tape consiste en la dtection du produit de PCR lectrophorse sur gel d'agarose.
ELECTROPHORESE EN GEL DAGAROSE
15
L'lectrophorse sur gel d'agarose est une mthode utilise en biochimie et en biologie
molculaire pour sparer l'ADN, l'ARN ou des protines en fonction de leur poids molculaire.
La technique de l'lectrophorse sur gel d'agarose est base sur la sparation des acides nucliques
chargs ngativement sous l'effet d'un champ lectrique. Cette sparation s'effectue travers la
matrice du gel d'agarose : les molcules de plus petites tailles se dplacent plus rapidement et
migreront plus loin que les molcules de tailles suprieures.
Figure 5. Cuve dlectrophorse remplie de tampon et

transformateur (power supply) utiliss pour
l'lectrophorse sur gel d'agarose
APPLICATIONS
Estimation du poids molculaire de fragment d'ADN aprs une digestion par des enzymes de
restriction
Analyse d'ADN aprs une amplification par PCR
Sparation de fragments ADN digrs avant Southern blot ou d'ARN dans le cas de Northern Blot.
Les avantages de l'lectrophorse sur gel d'agarose sont les suivants:
prparation aise, rapide, et peu coteuse des gels d'agarose

pas de dnaturation des chantillons
l'agarose plus ferme et moins toxique que le gel de polyacrylamide
les chantillons peuvent tre rcuprs en vue d'analyses supplmentaires
FACTEURS AFFECTANT LA MIGRATION

Le facteur le plus important est la longueur de la molcule d'ADN : la sparation se fait en fonction
du poids molculaire et donc de la taille de l'ADN. Toutefois la conformation de l'ADN est aussi un
facteur important. Ainsi pour viter les problmes lis cette conformation, n'est spar sur gel
d'agarose uniquement que de l'ADN linaire (fragment d'ADN issu d'une digestion, ADN amplifi
par PCR ou encore de l'ADNc).
L'augmentation de la concentration d'agarose dans un gel rduit la vitesse de migration et permet la
sparation de fragment d'ADN de plus petite taille. Plus le voltage est important, plus la vitesse de
migration augmente. Toutefois le voltage est limit en intensit, effectivement un fort voltage induit
une augmentation de temprature ce qui peut faire fondre le gel.
La conformation d'ADN plasmidique, non digr par une enzyme de restriction, migre diffrentes
vitesses (du plus lent au plus rapide) : ADN circulaire, ADN linaire et ADN superenroul.
16
GEL D'AGAROSE
On utilise gnralement un gel de 1 3 % m/V (1 3 g d'agarose pour 100 ml de volume final) en

lectrophorse. Plus on veut un gel discriminant, plus on augmentera le pourcentage d'agarose.
Agarose
Lagarose est un polymre base d'agar purifi. Lagar agar est constitu principalement dagarose
et dagaropectine. Lagaropectine est charge est donc risque dinterfrer avec la migration lors de
llectrophorse alors que lagarose est relativement neutre et ne perturbe pas la migration.
Cependant, lagarose peut quand mme contenir des groupements chargs comme des sulfates et il
est donc ncessaire denlever ces groupements pour obtenir de lADN pur. Les groupements
chargs ngativement peuvent entrainer un retard dans la migration de lADN dans un processus
appel llectroendosmose (EEO) et par consquent des agaroses faible EEO sont prfrables pour
llectrophorse de lADN en gel dagarose.
Lagarose est un polymre de galactose et de 3,6-anhydro-L-galactopyranose.
Figure 6. Structure de lagarose
Il se prsente sous forme dune poudre blanche. Diffrentes purets d'agarose sont disponibles
auprs des fournisseurs. En gnral, de l'agarose de grande puret la solidification lente est utilis
lorsque l'ADN doit tre extrait du gel aprs migration.
Tampons
Il existe un nombre trs vari de tampons. Les plus souvent utiliss sont le Tris/Actate/EDTA
(TAE), le Tris/Borate/EDTA (TBE) et le sodium borate (SB).
Le TAE possde le plus faible pouvoir tampon mais produit une meilleure sparation pour les
fragments d'ADN de grande taille.
Le SB est relativement nouveau et inefficace pour la sparation de fragments d'ADN d'une taille
suprieure 5000 paires de bases (5 kb). Cependant sa faible conductivit permet l'utilisation d'un
plus fort voltage (jusqu' 35V/cm), ceci rduisant considrablement le temps de migration.
Le TBE offre une meilleure rsolution pour les fragments de petites tailles (<500 pb).
17
Des fragments d'ADN avec seulement quelques paires de bases de diffrences sont spars en
utilisant un gel d'agarose 3 % et avec un tampon SB de trs faible conductivit (1 mM lithium
borate).
Prparation
Exemple pour un mini-gel de 50 ml destin sparer des fragments de 2 6 kb
Prparer le moule et le peigne appropris au nombre et au volume des chantillons sparer.

Prparer suffisamment de tampon (TAE, TBE) pour remplir la cuve (par exemple 200 ml) et
prparer le gel (50 ml).
Dans une fiole Erlenmeyer, peser la quantit d'agarose dtermine d'aprs le tableau suivant
et en fonction de la taille des fragments sparer :

Pouvoir de sparation d'ADN linaire, double brin, selon la concentration d'agarose du gel3
Concentration d'agarose (% en m/V) Gamme de tailles idales (en k b)
0.3 5 60
0.6 1 20
0.7 0.8 10
0.9 0.5 7
1.2 0.4 6
1.5 0.2 3
2.0 0.1 2
Pour l'exemple, pour un gel 1,2% il faudra donc fondre 600 mg d'agarose dans 50 ml de
tempaon:
La concentration finale de 1,2, idale pour sparer des fragments de 0.4 6 kb.
Dissoudre compltement l'agarose dans le tampon, en plaant l'Erlenmeyer soit au four
micro-ondes, soit encore dans un bain marie d'eau bouillante, et en agitant de temps en
temps. L'agarose est totalement dissoute lorsque les grains, initialement visibles sous forme
de petites lentilles, ont compltement disparu.
Mettre sous agitation et laisser refroidir, ou placer dans un bain-marie environ 50C
(temprature supportable au toucher). ventuellement, refroidir plus rapidement en laissant
couler un filet d'eau froide le long de l'Erlenmeyer, en agitant constamment. Il est
particulirement important de refroidir l'agarose en dessous de 60C lors de l'utilisation de
moules en PMMA, qui risquent sinon de fondre.
Si dsir, du bromure d'thidium peut maintenant tre rajout, une concentration finale de
0.5 g/ml. Il est cependant dconseill d'ajouter la place du bromure d'thidium certains
autres rvlateurs (par exemple du SYBR Gold, un fluorophore semblable au (SYBR Green
I) directement dans le gel, car ceux-ci peuvent affecter la mobilit des acides nucliques lors
de l'lectrophorse.
Couler l'agarose dans le moule avec le peigne et laisser refroidir. Un gel froid et fig prt
l'emploi se reconnat par son apparence opalescente lorsqu'il est observ par la tranche, par
rapport un gel encore liquide qui est parfaitement translucide. Emball dans du film
plastique ou dans du tampon (TAE, TBE ou SB), le gel peut alors tre conserv 4C au
18
rfrigrateur pendant plusieurs jours, avant qu'il ne perde trop d'eau par vaporation. La
conservation de gels contenant du bromure d'thidium dans du tampon n'en contenant pas
peut conduire la diffusion du rvlateur hors du gel. Ceci peut faire que la distribution du
bromure d'thidium dans le gel soit inhomogne, ce qui finalement peut affecter l'apparence
des bandes (les acides nucliques, de charge ngative, migreront plus vite l o la
concentration du rvlateur, de charge positive, sera plus faible).
Juste avant d'effectuer l'lectrophorse, placer le gel dans la cuve et s'assurer qu'il est
recouvert de tampon. Retirer ensuite le peigne, charger les chantillons et les standards, et
faire migrer en appliquant une tension ou un courant adapts. La vitesse de migration des
acides nucliques dpendant du champ lectrique, on fixe gnralement la tension entre 1 et
5 V par cm (distance entre les lectrodes) et on laisser varier le courant (parce que la
conductivit du gel varie au cours du temps).

Rvlation de l'ADN
La mthode de rvlation la plus utilise est la rvlation au bromure d'thidium ou BET. Le

bromure d'thidium est un agent d'intercalation couramment utilis comme marqueur d'acide
nuclique dans les laboratoires de biologie molculaire. Comme la plupart des molcules
fluorescentes, le bromure dthidum est une molcule aromatique (figure 7b). Le BET absorbe la
lulire dans lUV 210 et 285 nm et il emet la lumire dans lorange 605 nm (figure 7a).
Figure 7a. Gel dlectrophorse sous UV Figure 7b. Structure chimique du Bromure
dthidium (BET).
Lorsqu'il est expos des rayonnements ultraviolets, il devient fluorescent avec une couleur rouge-
orange, 20 fois plus intense lorsqu'il est li l'ADN. Cet effet serait d l'augmentation de
l'hydrophobie de l'environnement, plutt qu' une rigidification du cycle benznique, celui-ci n'tant
pas situ entre les paires de bases.
19
Limites de rsolution
L'lectrophorse sur gel d'agarose permet thoriquement la sparation de fragments d'ADN d'une
taille allant de 50 paires de bases plusieurs millions. Cependant, elle est gnralement utilise pour
la sparation de fragment d'une taille allant de 100 pb 20 kpb. La dure moyenne de migration est
d'une heure.
Les petits fragments d'acides nucliques sont mieux spars par lectrophorse sur gel de
polyacrylamide. Les fragments de tailles importantes sont plus difficiles sparer. En gnral,
l'utilisation de gel d'agarose forte concentration (3 4 %) est alors ncessaire pour des fragments
infrieurs 150 pb, car elle permet une meilleure sparation et rsolution des diffrentes bandes en
fonction de leur diffrence de taille. Le principal dsavantage est le temps de migration, qui peut aller
jusqu' plusieurs jours. Pour pallier ces problmes, il est avantageux d'effectuer une lectrophorse
en champ puls ou bien une lectrophorse en champ invers.
ANALYSE DU GEL
Aprs la migration d'lectrophorse, le gel est clair sous ultraviolet afin d'observer les bandes
d'ADN fluorescente.
Les bandes peuvent tre alors dcoupes et spares du gel, puis dissoutes afin de rcuprer l'ADN
purifi. L'estimation de la taille des fragments est faite grce la comparaison avec l'chelle de
marqueur de taille molculaire (DNA-ladder) utilise simultanment dans un autre puits lors de la
migration.
Le gel est gnralement pris en photo avec un appareil photo numrique. Bien que la couleur de
l'ADN fluorescent soit rouge-orange, les photographies sont publies en noir et blanc (voir schma
ci-dessous).
Figure 8a Figure 8b Figure 8c
1. chelle de marqueur de poids

Le gel est expos des molculaire (1kbplus), 2. vide,
Un gel d'agarose avant rayonnements ultraviolets, le Puits 3. Un produit de PCR d'une
clairage sous ultraviolets BET colore l'ADN en une taille lgrement suprieure
couleur rouge-orange. 500 paires de bases, 4. Fragment
d'environ 4.5kb d'un Plasmide
digr par une enzyme de
restriction
20
DETERMINATION DU POIDS MOLECULAIRE
Pour une molcule dADN linaire, la mobilit au cours de la migration est inversement
proportionnelle au logarithme de son nombre de paires de bases. Pour dterminer prcisment la
taille dun fragment dADN laide dun gel dagarose, il suffit de tracer une courbe de la taille des
molcules sur une chelle logarithmique en ordonne (laxe des y) en fonction de la distance de
migration en abscisse (laxe des x). Le marqueur de poids molculaire permet de tracer une telle
courbe, qui sera utilise pour dterminer la taille de fragments inconnus. Par exemple, le graphique
permet ici de dterminer que la molcule dADN linaire prsente a une taille de 6000 pb (ou 6
kb). On doit tracer une nouvelle courbe pour chaque gel dagarose, puisque la migration de lADN
varie selon le pourcentage du gel et les conditions de migration. Cependant, une simple valuation
visuelle, en comparant avec les marqueurs de poids molculaire, permet souvent de dterminer avec
suffisamment dexactitude la taille des molcules dADN. En effet, ici, laide des marqueurs
prsents en exemple, on peut aisment prdire que lADN double brin linaire a une taille
denviron 6 kb.
Figure 9. Cacul du poids molculaire des fragments spars par lectrophorse
21
LES ALTERNATIVES AUX BROMURE DETHIDIUM
Alternativement, le gel peut tre incub dans un bain contenant du SYBR Green I (pour les acides
nucliques doubles brins) ou du SYBR Green II (pour dtecter aussi les acides nucliques simples
brins). Le SYBR Green prsente l'avantage d'une moindre toxicit et d'une sensibilit plus leve
permettant de dtecter des quantits plus faibles d'acides nucliques.
La famille des colorants SYBR. La famille SYBR de colorants de l'ADN vendus par Invitrogen
sont commercialiss comme des alternatives srs et trs sensibles au BET. Ils sont cependant
beaucoup plus chers que le BET. Trois colorants diffrents sont disponibles avec des proprits
diffrentes: SYBRGold, SYBRGreen et SYBRSafe. SYBRGold est le colorant le plus
sensible et peut dtecter aussi peu que 25 pg d'ADN. SYBRGold peut tre excit par la lumire UV
ou bleu ce qui empche la degradation de l'ADN. SYBRGold prsente la sensibilit la plus leve
Lorsqu'il est utilis pour une coloration aprs lectrophorse; cependant, on peut l'utiliser dans le gel
aussi. Le SYBRGreen montre des proprits de scurit et d'excitation / mission semblable au
SYBRGold, avec un peu moins de sensibilit (60 pg d'ADN). SYBRGreen ne peut pas tre utilis
dans le gel pendant l'lectrophorse, mais peut tre utilis pour la quantification de l'ADN par PCR
en temps rel. Le SYBRGold et le SYBR green sont considrs comme cancrognes potentiels, et
les procdures d'limination des dchets dangereux doivent tre suivies. SYBRSafe prsente la
mme sensibilit que le BET, mais est un colorant non dangereux, respectueux de l'environnement.
Comme le BET, le SYBRSafe peut tre utilis dans le gel durant l'lectrophorse. Cependant, la
lumire bleue peut tre utilise pour l'excitation.
NB: les filtres traditionnels pour photographier les gels colors au BET ne peuvent pas tre utiliss
pour les colorants de la famille SYBR. Vous avez donc besoin d'acheter des filtres spciaux. Une
transluminateur lumire bleue sera ncessaire si cette longueur d'onde d'excitation est requise.
colorants alternatifs. Plusieurs autres socits vendent des colorants fluorescents avec des proprits
similaires au BET ou aux colorants SYBR.
Biotium, Inc. commercialise Gel Red et Gel Green. Les deux colorants ont t conus pour prvenir
le colorant de passer travers les membranes des cellules vivantes gnrant ainsi un colorant non
dangereux. Gel Red a le mme spectre d'excitation et d'mission que le BET tandis que Gel Green
est excit l'aide de la lumire bleue. Les colorants coutent environ 100 euros pour 0.5 ml d'une
solution 10.000 x.
GelStar, vendu par Lonza Bioscience, est un colorant trs sensible (limite de dtection de 20 pg).
GelStar peut tre visualis en utlisiant un transluminateur UV ou en lumire bleu. Comme le BET,
GelStar est un mutagne potentiel, et est donc considr comme dangereux. Son cot est de 150 euros
pour 250 ul d'un solution 10.000 x.
EZ Vision (Amresco) est un colorant fluorescent non dangereux utilis pendant l'lectrophorse sur
gel. EZ Vision a l'avantage supplmentaire d'tre incorpor dans le tampon de charge, Donc, la
prparation de gels avec des colorants n'est pas ncessaire. Le cot est de 100euros pour 5 ml de
tampon de charge 6x.
22
LES BIOANALYSEURS
Il existe de systmes dlectrophorse de lADN utilisant des casettes prtes lemploi plus
scurise. Cest le cas notamment des bioanalyseur Agilent 2100 et 2200.
Figure 9. Le Bioanalyseur Agilent 2100
Figure 10a. Cassettes utilises dans le

bioanlyseur Agilent 2100 pour les
lectrophorses dADN
Figure 10b. mcanisme de la dtection
23
LA PCR-ELISA
Cette technique permet une dtection du produit de PCR en utilisant un lecteur de microplaques
utiliss pour les tests ELISA. La PCR est classique si ce nest lutilisation dune des amorces qui
est biotinyle. Le produit de PCR est immobilis dans des plaques multipuits recouvertes de
streptavidine (grce laffinit entre la streptavidine et la biotine). La dtection du produit de
PCR se fait en utilisant une sonde spcifique du produit recherch. Cette sonde est marque avec
une molcule cible (digoxignine, fluorescine,). Lhybridation de la sonde est mise en
vidence en utilisant un anticorps coupl une enzyme (peroxydase,
phosphatase alcaline) et dirig contre la molcule cible de la sonde. La fixation de lanticorps est
alors rvle et par une raction enzymatique. Cette technique est assez fastidieuse car elle
implique plusieurs oprations postrieures la PCR mais elle permet de tester de nombreux
chantillons dans un format de microplaques et en utilisant le matriel de dtection de type
ELISA. Il en rsulte que cest une technique facilement utilisable dans la plupart des laboratoires de
routine (Fach et al., 2001).
Figure 11. Schma reprsentant la dtection dun produit de PCR par PCR-ELISA.
Il existe diffrentes variantes de cette techniques (Figures 11 et 12) on peut faire une PCR classique
avec des nuclotides marqus la digoxignine (DIG), il en rsulte un produit de PCR marqu la
DIG. On peut hybrider ce produit de PCR une sonde spcifique du produit de PCR et marque
la biotine. Le produit dhybridation est alors fix une plaque microtitre coate la streptavidine et
le produit de PCR est rvl par un anticorps anti-DIG coupl une enzyme (la peroxydase dans cet
exemple).
24
Figure 12. Alernative la dction dun produit de PCR par PCR-ELISA. Contrairement la figure
11, ici point de sonde de dtection. Une sonde de capture biotinyle est ultilse pour capturer un
brin du produit de PCR et la dtection se fait par un anticorps conjug reconnaissant la digoxignine
(DIG) qui a t incorpore lors da la raction de PCR grce ladjonction de nuclotides modifis.
LES PUCES A ADN
Si on veut dtecter un produit de PCR, on peut utiliser une mthode similaire la PCR-ELISA mais
utilisant cette fois une sonde marque par un fluorochrome (Figure 13), appellons cela la PCR-FSA
pour PCR Flurorescence assay. Cest cette approche qui est la base du dveloppement des puces
ADN.
Figure 13. La PCR-FSA.
Une biopuce, puce ADN, ou micromatrice d'ADN, est un ensemble de molcules d'ADN fixes en
ranges ordonnes sur une petite surface qui peut tre du verre, du silicium ou du plastique. Cette
biotechnologie rcente permet d'analyser le niveau d'expression des gnes (transcrits) dans une
cellule, un tissu, un organe, un organisme ou encore un mlange complexe, un moment donn et
dans un tat donn par rapport un chantillon de rfrence.
25
Les puces ADN sont aussi appeles puces gnes, biopuces, ou par les termes anglais DNA chip,
DNA-microarray, biochip .
Le principe de la puce ADN repose sur la proprit que possde l'ADN dnatur de reformer
spontanment sa double hlice lorsqu'il est port face un brin complmentaire (raction
d'hybridation). Les quatre bases nucliques de l'ADN (A, G, C, T) ont en effet la particularit de s'unir
deux deux par des liaisons hydrogne (A = T et T = A ; G C et C G). Si un patient est porteur
d'une maladie, les brins extraits de l'ARN d'un patient (et rtrotranscrits en ADN), vont s'hybrider
avec les brins d'ADN synthtiques reprsentatifs de la maladie.
PRINCIPE
Concrtement, les ARN totaux sont extraits de cellules, dont on veut comparer l'expression des gnes
avec un talon, et subissent une amplification qui va permettre d'obtenir une quantit de matriel
gntique suffisante pour l'exprience. Ensuite ces ARNm sont transforms en ADN
complmentaires (ADNc) par la technique de rtrotranscription et marqus par un colorant (soit la
Cyanine 3 (fluorochrome vert) soit la Cyanine 5 (fluorochrome rouge)). On met ensuite les ADNc
obtenus dans une puce contenant des fragments d'ADN, en mme temps que l'ADNc talon. Chaque
point (ou spot) de la puce va tre analys individuellement par un scanner trs haute rsolution, et
ce la longueur d'onde d'excitation de la Cyanine 3 puis de la Cyanine 5. L'image scanne va tre
traduite en niveaux de gris. On va ensuite comparer l'intensit du signal entre le vert et le rouge. En
fonction de l'intensit du signal il y aura plus ou moins de pixels pour chaque point de la puce.
chaque point (ou spot) est attribu une valeur d'intensit normalise par rapport l'ADN "talon" : on
parle de spike. Chacune des valeurs peut tre analyse par des techniques de bio-informatique, ce qui
permet d'estimer avec plus ou moins de prcision l'intensit d'expression d'un gne. Selon les
techniques de biologie molculaire, un marquage la biotine des ADNc est possible mais dans ce cas
pour comparer deux populations ou deux tissus, il faudra hybrider pour chaque condition une puce
(et non pas les deux marquages sur la mme puce en comptition.)
Par exemple on peut marquer l'ADN complmentaire du malade en vert et du trait en rouge, ou bien,
du tmoin en rouge et du trait en vert. Ce marquage se fait habituellement grce une enzyme : la
polymrase T7 qui amplifie l'ARNm et incorpore les cyanines pour un marquage optimal. Une fois
marqus ces ADN complmentaires sont dposs sur la lame de verre qui, elle-mme, possde fixs
sa surface, des fragments de gnome humain recouvrant tous les gnes prsents dans une cellule.
Les molcules d'ADN fixes sur la lame sont appeles des sondes mme si la nomenclature peut
varier. Des dizaines de milliers de sondes peuvent tre fixes sur une mme puce. Cela permet de
tester diffrentes cultures cellulaires sur une mme lame voire de faire des rplicats (ce qui est
vivement recommand pour l'analyse biostatistique en aval). Cette technologie provient d'une
adaptation du Northern Blot o de l'ADN fragment est fix un support puis hybrid avec un ADNc.
La mesure de l'expression de gnes par puce ADN s'applique de nombreux domaines de la biologie
et de la mdecine comme l'tude de traitements, de maladies ou bien encore de stades
dveloppementaux.
26
UTILISATION
La comparaison de deux expriences de puce ADN (par exemple deux cellules du mme type l'une
saine et l'autre malade) peut permettre de dcouvrir des gnes exprims diffremment selon les
conditions (par exemple uniquement dans la cellule malade), de fait, en une seule exprience, il est
possible d'identifier les gnes dont l'expression est modifie. Pour tre valide, l'exprience doit tre
ralise sur plusieurs rplicats techniques et biologiques et doit tre soumise une analyse statistique
qui comprend une normalisation des signaux l'aide d'algorithmes informatiques et une mise en
vidence des gnes sur- ou sous-exprims. Une fois ces gnes identifis, d'autres analyses in silico
sont ncessaires, telles que des analyses de clustering pour regrouper les gnes prsentant le mme
profil d'expression. Enfin, les rsultats seront souvent confirms gne par gne par des mthodes
telles que la PCR quantitative ou le Northern Blot. Les puces apportent principalement des donnes
qualitatives (variation d'expression d'un gne) mais il est difficile de quantifier avec prcision
l'expression d'un gne avec la technologie des puces ADN.
Gnralement, aprs une tude de puce ADN, la bio-informatique extrait une liste de gnes
intressants (en fonction de ce que l'on cherche). Pour confirmer ces gnes on fait appel la technique
de qPCR encore appele PCR quantitative ou encore appele RT-PCR pour Real-Time PCR (PCR en
temps rel).
Biologie mdicale
L'utilisation des puces ADN connat un essor croissant notamment dans le domaine de la
cancrologie pour le typage tumoral d'aprs leur profil gntique. L'utilisation des puces ADN
comme outil de diagnostic prsente l'avantage de faire appel de nombreux marqueurs : plusieurs
milliers de gnes peuvent tre cribls simultanment pour fournir une signature du type cellulaire
tudi. Si l'on considre que chaque type de tumeur prsente une signature gntique unique, ce
systme permet virtuellement de distinguer et classer tous les types de tumeurs.
Les puces ADN permettent donc de comparer l'expression des gnes de deux types cellulaires
diffrents, de faire de l'tude des gnes exprims sur un grand nombre de patients pour observer
l'effet d'un mdicament (anti-cancreux par exemple), de regarder l'effet d'un traitement sur
l'expression des gnes, de comparer tissus sains contre tissus malades, traits contre non-traits
etc...
L'approche Puce ADN permet en une seule exprience qui dure environ 2 jours d'avoir une
estimation sur l'expression de plus de 30000 gnes.
27
FABRICATION
La puce est une plaque de petite taille environ 6 cm x 3 cm sur laquelle sont fixs des brins
monocatnaires (un seul brin au lieu des deux habituels) d'ADN, chacun correspondant au brin
complmentaire d'un ARN messager (ARNm). Il peut tre fix sur une puce plusieurs dizaines de
milliers de fragments d'ADN (donc autant de gnes dont on peut tudier l'expression).
Chez la socit Agilent, le dpt des sondes sur la lame se fait de manire similaire celle de
l'impression jet d'encre. De cette manire, des robots spotteurs, avec leurs multiples pointes,
dposent par ranges d'infimes gouttelettes d'une solution d'ADN (d'o le terme anglais microarray)
des positions spcifiques de la puce (adresses). L'ADN est ensuite sch et trait de manire ce
qu'il se fixe sur la puce.
Les ARNm (provenant des gnes exprims) sont extraits de la cellule analyser et des fluorochromes
sont fixs sur les bases. Puis le mlange tmoin marqu et trait est vers sur la puce : chaque brin
d'ADNc va s'hybrider au brin monocatnaire d'ADN qui lui est complmentaire pour former un
double brin. La plaque est ensuite lave par des bains spcifiques pour liminer les brins d'ADNc ne
s'tant pas hybrids car non complmentaires de ceux fixs sur la lame.
Elle est ensuite scanne au laser et une image de la puce est cre : chaque fois qu'il y a eu hybridation,
le fluorochrome fix sur l'ARNm a mis dans la longueur d'onde du laser et cela est visible par un
point de couleur (rouge pour des fluorochromes mettant dans le rouge...) Les puces ADN peuvent
tre fabriques par des techniques diverses qui incluent l'impression sur des plaques de verre l'aide
de pointes, la photolithographie l'aide de caches, de micro-miroirs, d'impression par jet d'encre,
d'lectrochimie sur des puces micro-lectroniques.
Figure 14. Cration d'une Puce ADN par un
robot.
Les puces ADN peuvent tre utilises pour dtecter les ARN qui seront ou pas traduits en protines.
Les scientifiques parlent d'analyse d'expression ou de profil d'expression. Puisque des dizaines de
milliers de sondes sont fixes sur une puce, chaque hybridation sur une puce renseigne autant qu'un
nombre quivalent de tests de gntique quantitative. Les puces ADN constituent ainsi une approche
massive et ont contribu la rvolution de la gnomique. Le premier profil d'expression par puce
ADN a t publi en 1995 dans le magazine amricain Science. Le premier gnome eucaryote fix
sur une puce fut celui de la levure (Saccharomyces cerevisiae) ; ce profil d'expression a t publi en
1997 dans la revue Science.
Image d'une hybridation sur une puce ADN
Rappel : la puce ADN contient les sondes ADN (oligonuclotides ou ADNc) fixes sur le support.
Marquage des ADNc
28
Grce des fluorochromes, marqueurs d'ADN qui fluorescent sous un laser, on peut marquer des
ADNc provenant de la rtrotranscription d'ARNm. En pratique, deux lots d'ADNc correspondant
deux traitements diffrents (par exemple, lot 1 en vert : ADNc de plantes tmoins non traites; lot 2
en rouge : ADNc de plantes inocules avec un agent pathogne) sont colors par deux fluorochromes
diffrents. Ces deux lots sont ensuite mlangs puis hybrids sur la puce ADN. L'hybridation dure
entre 15 et 20 heures selon l'organisme que l'on tudie (bactrie, plante, tissu humain...)
Spcificit de l'hybridation
Suivant la stringence de la solution destine laver la puce, l'hybridation entre les lots d'ADNc et les
sondes sera plus ou moins spcifique.
Comment les analyse-t-on ?
Une image haute rsolution est obtenue grce des scanners trs haute rsolution (2 microns
actuellement). Des logiciels interprtent l'intensit des pixels de chaque point de la puce contenant
une squence d'un gne diffrent et en dduisent une mesure numrique de l'expression de chaque
gne proportionnelle la prsence du gne dans les cellules au moment de l'extraction d'ARN. Une
puce peut contenir jusqu' 1 million de "spots" c'est--dire un million de gnes ou parties d'un gne !
Si le lot d'ADNc no 1 (plantes non traites) est marque en vert et que le lot d'ADNc no 2 (plantes
traites) est marque en rouge alors :
Les gnes dont l'expression est augmente suite au traitement apparaissent alors plus rouge
que vert sous un laser.
Les gnes dont l'expression est diminue suite au traitement apparaissent alors plus vert que
rouge sous un laser.
Les gnes peu affects par le traitement (expression stable) apparaissent alors autant vert
que rouge sous un laser.
Les gnes peu exprims n'apparaissent pas.
Il existe deux grandes familles de puces ADN, l'une ne pouvant recevoir qu'un chantillon de
cellule par plaque (mais pouvant contenir beaucoup plus de gnes fixs sur la plaque) et l'autre
pouvant recevoir deux chantillons diffrents, chacun labellis avec un fluorochrome de couleur
diffrente : sur l'image, un point vert sera donc un gne exprim dans la cellule saine tandis qu'un
point rouge sera un gne exprim dans la cellule malade. Un point jaune est exprim dans les deux
cellules et un point noir dans aucune...
29
LA PCR QUANTITATIVE
Lapplication directe des tests danalyse gntique au diagnostic des maladies infectieuses sans
amplification pralable a souvent le dsavantage dtre peu sensible. Les techniques
damplification de lADN augmentent considrablement la sensibilit tout en gardant une bonne
spcificit. La PCR dcrite en 1985 (Saiki et al., 1985) est la mthode la plus utilise pour
lamplification dADN, elle a conquis un rle central dans les laboratoires danalyses cliniques.
Cependant, les caractristiques de la PCR, telle quelle est tra- ditionnellement utilise ne
permettent pas de quantifier le nombre de molcules dADN cible prsente dans lchantillon de
dpart. Mme de faibles diffrences dans lefficacit de lamplification peuvent grandement affecter
la quantit de produits finaux en raison de la nature exponentielle du processus. A ct des
paramtres contrlables (ADN cible, Taq polymrase, dNTPs, MgCl2, amorces, tailles et
nombres des cycles, temprature dhybridation, etc ), un certain nombre de variables
incontrlables principalement lies la qualit de lADN peuvent aussi exister.
Rcemment, plusieurs approches ont permis de raliser des PCR quantitatives.
De quoi sagit-il ? Ce terme dsigne toute technique de PCR qui permet une mesure fiable de la
quantit dune cible spcifique dADN dans un chantillon biologique. On distingue la PCR
quantitative relative de la PCR quantitative absolue.
LA PCR EN TEMPS REEL
La PCR en temps rel permet de mesurer laccumulation du produit de PCR chaque cycle au
cours de la raction damplification. Le principe est dutiliser un marquage fluorescent du produit
de PCR. Le fluorochrome est ajout la raction de PCR. La raction de PCR et la dtection du
produit de PCR sont donc simultanes. Lappareil de PCR en temps rel nest autre quun
thermocycler classique sur lequel vient sajouter un dtecteur de fluorescence. Lappareil mesure
lintensit de la fluorescence en fonction du nombre de cycles. On ralise une courbe dtalonnage
avec des chantillons de concentrations connues. On ralise une courbe du "cycle threshold "
(Ct) en fonction du logarithme du nombre de copies (Figure 15). Le Ct est dfini comme le cycle
de PCR auquel on observe une augmentation du signal gale 10 fois la dviation standard de la
ligne de base (cycle 3 15).
30
Figure 15. Principe de la PCR en temps rel. La fluorescence associe au produit de PCR est
mesure au cours des cycles, cest-- dire au cours du temps. On calcule le moment, cest--dire
le cycle (Ct) o la fluorescence dpasse un seuil donn. Le Ct est directement proportionnel la
quantit dADN.
Habituellement on observe une excellente linarit sur sept ordres de grandeur ce qui permet de
mesurer le nombre de copies dans une gamme trs large de quantits.
Il existe une relation linaire entre la valeur du Ct et le logarithme du nombre de copies de la squence
cible.
Plus le nombre de copies est important plus le Ct est faible, cest--dire plus rapidement le seuil de
fluorescence est atteint. Donc partir dune solution dont le nombre de copies est connu, je peux
construire une droite dtalonnage qui me permettra de dterminer le nombre de copies dune
solution inconnue. Cest le principe de la quantification par PCR en temps rel.
31
Log N en fonction du Ct
6
5
4
3
Log N
2
1 y = -0,4323x + 17,008
0 R = 0,9944
25 30 Ct 35 40
Figure 16. Variation de la valeur de Ct en fonction du logarithme du nombre de copies de la cible
Pour la dtection de lamplicon, on peut utiliser un marquage non spcifique ou spcifique. Le

marquage non spcifique utilise comme fluorochrome le SybrGreen qui se lie spcifiquement
lADN bicatnaire en tant que minor groove binder . Lavantage de cette mthode est son
faible cot. Le dsavantage de ce processus est son manque de spcificit d au fait que le
fluorochrome se liera indiffremment aux produits de PCR spcifiques et non spcifiques. On
peut circonscrire ce problme en ra- lisant aprs la PCR une courbe de dissociation. On augmente
progressivement la temprature et on observe la diminution de la fluorescence due lapparition
dADN monocatnaire en fonction de la temprature. La drive premire de cette courbe per-
met de dterminer le Tm (temprature de fusion) du produit de PCR, on peut ainsi comparer ce
Tm au Tm thorique du produit attendu.
32
Figure 17. Evalution de la fluorescence (en haut) et la drive premire de la fluorescence (en
bas) en fonction de laugmentation de la temprature.
Une autre mthode est dutiliser une dtection spcifique du produit de PCR recherch. Parmi ces
techniques spcifiques, on trouve lutilisation des sondes TaqMan (Applied Biosystems) base sur
lactivit exonuclasique 5-3 de la Taq polymrase. La sonde spcifique est marque deux fois :
un fluorochrome quencher situ en 3 et un fluorochrome reporter en 5 (Figure 3). Dans cette
configuration, la fluorescence mise par le reporter est absorbe par le quencher situ dans son
voisinage et aucune fluorescence nest dtecte. Au cours de la polymrisation, la Taq polymrase
dgrade la sonde situe sur son che- min et libre le reporter du quencher. La fluorescence associe
au fluorochrome reporter ainsi mesure est proportionnelle la quantit de produit gnr.
33
E1
E2
E1
E1
Figure 18 : Fonctionnement dune sonde Taqman. A : La sonde est marque par un

fluorophore reporter (R) et un fluorophore " quencher " (Q). La sonde est libre en
solution, la fluorescence mise par le reporter (E1) est absorbe par le quencher (A2)
qui met de la lumire (E2) une longueur donde diffrente de celle du dtecteur. Le
bilan de lopration est que trs peu de fluorescence est dtecte par lappareil. B : La
sonde se fixe sur lADN cible entre les positions de fixation des amorces de la PCR. Le
dtecteur nenregistre toujours pas de fluorescence car le reporter et le quencher sont
physiquement proches. C : Lors de ltape dlongation, lADN polymrase par son
activit exonuclasique 5 3, va dgrader la sonde, il en rsulte que le reporter se
trouve loign du quencher qui ne peut plus absorber la fluorescence qui peut tre
dtecte par lappareil. En fin dlongation, la fluorescence E1 est mesure. On
constate que la fluorescence sera directement proportionnelle au nombre de molcules
dADN amplifi.
34
Une autre technologie utilise est appele le FRET (Fluorescence Resonance Energy
Transfer) (Figure 19) (Wittwer et al., 1997). Deux oligonuclotides spcifiques du produit de
PCR shybrident en tandem sur le produit de PCR durant ltape dhybridation. La sonde
amont est marque en 3 avec un fluorochrome (F1) et la sonde aval est marque en 5 avec
un fluorochrome reporter (F2). Les deux fluorochromes sont donc proches lun de lautre.
Aprs hybridation des deux sondes, lexcitation de F1 entrane le transfert de lnergie mise
par d F1 F2 qui va mettre son tour et la fluorescence de cette mission est mesure. Ce
signal est proportionnel aux nombres de molcules cibles prsentes.
Figure 19 : Principe du FRET : A :

Les deux sondes sont en solution,
lune marque par le fluorophore 1
(F1), lautre par le fluorophore 2
(F2). On choisit, le fluorophore 2 de
telle manire quil absorbe la fluo-
rescence mise par le fluorophore 1
(E1=A2). B : Les deux sondes
shybrident lADN cible, plaant le
fluorophore 1 cte du fluorophore
2. La machine excite le fluorophore 1
(A1) qui met de la fluorescence
(E1) absorbe par le second qui met
de la fluorescence de longueur
donde plus leve (E2). Cest cette
dernire fluorescence qui est
mesure. C : Les sondes sont
dgrades par lADN polymrase et
plus aucune fluorescence nest mise
par le fuoro- phore 2, en raison de son
loignement par rapport au
fluorophore 1
Une troisime technologie utilise des sondes particulires appeles les " molecular beacons "
(Tyagi et Kramer., 1996 ; Tyagi et al., 1998). Les " molecular beacons " (Figure 20) possdent
trois domaines fonction- nels (i) un quencher et un reporter aux extrmits 3 et 5 de la
molcule (ii) de courtes squences complmentaires aux extrmits 5 et 3 de la molcule
permettant la formation dune structure en pingle cheveux,
(iii) un rgion centrale complmentaire du produit de PCR dtecter. En dessous de la
temprature dhybridation la molcule se trouve en position ferme, le quencher se trouve
proche du reporter et aucune fluorescence nest dtecte. Si le molecular beacon sassocie
au produit de PCR ou est dtruit, le quencher est loign du reporter et la fluorescence peut
35
tre mesure. Ce type de sonde augmente grandement la spcificit de lhybridation.
Amplicon ADN ou ARN (NASBA) Figure 20 : Principe de

fonctionnement dun " molecular
beacon " : Dans sa position ferme, le
reporter et le quencher sont proches de
telle manire que la fluorescence
mise par le reporter est absorbe par
le quencher et aucune fluorescence
nest dtecte par la machine. Lorsque
la sonde shybride la cible, le
quencher et le reporter se trouvent
loigns et la fluorescence mise par
le reporter est dtecte par lap-
pareil.
REFERENCES
CHINA B., GHAFIR Y., DAUBE G. Estimation quantitative et qualitative par amplification
gntique des bactries prsentes dans les denres alimentaires. Ann. Md. Vt., 2002, 147, 99-109.
http://www.facmv.ulg.ac.be/amv/articles/2002_146_2_04.pdf
FACH P., PERELLE S., DILASSER F., GROUT J. Comparison between a PCR-
ELISA test and vero cell assay for detecting Shiga toxin-producing Escherchia coli in dairy
products and characterization of virulence traits of isolated strains. J. Appl. Microbiol., 2001,
90, 809-818.
TYAGI S., BRATU D., KRAMER F.R. Multicolor beacons for allele discrimination. Nature
Biotechnol., 1998, 16, 49-53.
TYAGI S., KRAMER F.R. Molecular Beacons : probes that fluoresce upon hybridization.
Nature Biotechnol., 1996, 14, 303-308.
WITTWER C.T., HERRMANN M. G., MOSS A.A., RASMUSSEN R.P. Continuous
fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. Biotechniques, 1997, 130, 134-
138.
36
LES TECHNIQUES DAMPLIFICATION ISOTHERMIQUES
A ct de la PCR, se sont dveloppes ces dernires annes des techniques alternatives

damplification de lADN.
STRAND DISPLACEMENT AMPLIFICATION OU SDA
La technique de Strand displacement amplification (SDA) repose sur une ADN

polymrase , typiquement la BST DNA polymrase, le grand fragment de la polymrase de
Kenow (3'5' exo-), pour initier la rplication une coupure cre par endonuclase de
restriction active sur un seul brin ou par une enzyme coupant un site contenu dans un
primer. Le site de coupure est rgnr chaque tape de de dplacement de brin par la
polymrase, entrainant une amplification exponentielle. La SDA est classiquement utilise en
diagnostic clinique (BD Probetec, Becton Dickinson) (Little et al., 1999)1.
La dtection des acides nucliques amplifis est ralise en utilisant une varit de techniques,
y compris l'amplification par dplacement de brin (SDA). Pour que la technologie de dtection
des ADN amplifis devienne plus routinire et pour qu'elle soit adopte dans les laboratoires
cliniques ayant moins de technologues qualifis, il est ncessaire d'utiliser des systmes plus
simples, d'un dbit plus lev et conviviaux. Rcemment, des mthodes utilisant la dtection
en temps rel des acides nucliques amplifis ont t dcrits. Ces mthodes reprsentent
l'avenir dans les laboratoires de diagnostic molculaire et pourrait bientt permettre d'atteindre
ces objectifs. Cependant, aucune de ces mthodes n'avait t adapte en un dispositif de
diagnostic commercial et convivial.
Le systme BDProbeTecET de sconde gnration est bas sur une amplification de lADN par
SDA accompagn dune dtection simultane en temps rel utilisant le transfert dnergie
fluorescente (FRET).
1
Little MC, Andrews J, Moore R, Bustos S, Jones L, Embres C, Durmowicz G, Harris J, Berger D, Yanson K, Rostkowski C, Yursis D,
Price J, Fort T, Walters A,Collis M, Llorin O, Wood J, Failing F, O'Keefe C, Scrivens B, Pope B, Hansen T,Marino K, Williams K, et al.
Strand displacement amplification and homogeneousreal-time detection incorporated in a second-generation DNA probe
system,BDProbeTecET. Clin Chem. 1999, 45:777-84.
37
Figure 21. Principe de la SDA
Pour mieux comprendre la base du systme de dtection en temps rel, il est important de
souligner les mcanismes l'amplification et de dtection. La figure montre les deux phases
distinctes, la cration d'une cible et son amplification, dans le mcanisme de la SDA. Pour la
simplicit, le processus est reprsent pour un seul brin d'une cible double brin, avec la
comprhension que ce processus se produit sur les deux brins et donne une amplification
exponentielle. Pour la phase de la gnration de la cible, une cible d'ADN double brin (1) est
dnatur et on laisse hybrider deux amorces, B1 et S1 (2). B1 est un primer pare-chocs, alors
que le primer S1 contient le site de restriction simple brin pour l'enzyme de restriction simple
brin. En prsence du mlange d'ADN polymerase BST et de dNTP, les produits d'extension de
B1 (3) et de S1 sont gnrs simultanment (4). Ce processus dplace les produits S1, qui
peuvent alors tre hybrided aux amorces du brin oppos, B2 et S2 (5). L'extension simultane
des deux types d'amorces produit la molcule 6. La molcule 6 est capable d'effectuer la phase
exponentielle de l'amplification de la cible. La molcule 6 est un substrat pour l'enzyme BsoBI
dans le mlange, qui reconnat le site BsoBI double brin. Ce site contient un nuclotide dCTP
coupl au thiol incorpor durant la phase d'amplification de la cible, ce qui rend le site
rfractaire un clivage double brin par l'enzyme. Au lieu de cela, le brin ne contenant pas le
dC modifi au niveau du site de restriction est cliv par l'enzyme BsoBI. L'ADN polymrase
BST se lie ce nick et commence la synthse d'un nouveau brin tout en dplaant le brin aval
simultanment (8) (9) (10). Cette tape recre la molcule double brin 7 et le processus itratif
38
rpte clivage et dplacement. Les brins dplacs sont capables de se lier des amorces du brin
oppos, ce qui produit une amplification exponentielle 52,5 Ces produits simple-brin se lie
aussi al sonde dtectrice pour la dtection en temps rel.
Figure 22. Dtection du produit de SDA en temps rel
Une sonde ADN simple brin contenant les fluorochromes fluorescine (reporteur) et rhodamine
(quencher) est prsente dans le mlange de raction. La rgion entre ces fluorochromes
39
comprend une structure en pingle cheveux. La boucle comprend une squence de
reconnaissance pour l'enzyme BsoBI. Cette sonde contient galement une squence spcifique
de la cible en 3 ' de la rhodamine. Avant l'amplification spcifique de la cible par SDA, les
fluorochromes fluorescine et rhodamine sont proches les uns des autres de sorte que toute
l'excitation de la fluorescine conduit transfrer l'nergie mise la rhodamine. L'effet net
est que trs peu d'mission de fluorescine excite est dtecte. Aprs que le SDA, la sonde est
convertie en une molcule double brin, qui est cliv par l'enzyme de restriction BsoBI. Ce
clivage provoque la sparation physique de la fluorescine et la rhodamine de telle sorte
qu'aucun transfert d'nergie de la fluorescine la rhodamine ne peut se produire. L'effet net
est que la fluorescence mise de la fluorescine excite est dtecte, et cette fluorescence est
attribuable une amplification spcifique de la prsence de la squence cible.
Les tapes spcifiques de la conversion de cette sonde fluorescente simple brin sont montres
la figure 22.
Dans ltape 1, un bin dplac (ligne noire), la sonde contenant la fluorescine () et la
rhodamine (), et un primer damplification shybrident. Lextension simultane par une ADN
polymrase la fois du primer damplification et de la sonde conduit au dplacement de la
sonde tendue (2). Dans ltape 3, La sonde tendue se lie au primer du brin oppos et est
prolong (4). Cette extension cre un site double brin BsoBI, qui est flanqu par la fluorescine
et la rhodamine. Cette tape d'extension cre un site BSOBI qui manque l'incorporation de
dCTP thiol incorporation au site de clivage BsoBI. En consquence, la liaison de BsoBI sur
le site provoque un clivage double brin au lieu d'un simple nick (5); Ainsi, les deux
fluorochromes sont physiquement spars, et l'mission de fluorescine est dtecte. Ces tapes
se droulent simultanment au cours du processus de SDA. Ce processus de dtection se
distingue du systme Taqman de plusieurs faons, y compris le fait sur le Taqman utlise la
PCR, exploitant ainsi une activit exonuclase 5'-3 'de la Taq polymrase, alors que la SDA
utilise une polymrase sns activit exonuclase, et que la mthode Taqman ncessite le
thermocyclage pour la formation d'un produit fluorescent.
40
Figure 23. dtection de C. trachomatis et N. gonorrhoeae par SDA en temps rel.
Un aperu de la dtection de la fluorescence FRET qui dr produit au cours de la SDA est

prsent la figure 23A. Comme on le voit dans les graphiques cintiques de la figure. 23B, la
formation de ces produits fluorescents est continue et rapide. Pour les Chlamydia trachomatis
et Neisseria gonorrhoeae, la dtection de petits nombres de cellules se produit en 1 h. La courbe
dose-rponse observe la figure. 23B permet l'application potentielle pour la quantification
de la cible par ce systme.
NUCLEIC ACID SEQUENCE-BASED AMPLIFICATION OU NASBA

La dtection de l'ARN est ralise en utilisant couramment RT-PCR, un processus qui prend
du temps gnrant souvent de faux positifs en raison de contamination croise.
Alternativement, l'amplification base sur une squence d'acide nuclique (NASBA) est un
processus isothermique en une tape pour amplifier l'ARN. Le NASBA s'est avre efficace
dans la dtection de l'ARN viral ou bactrien dans des chantillons cliniques. Une raction
NASBA consiste en la transcriptase inverse du virus de la myloblastose aviaire (AMV-RT),
l'ARN polymrase T7 et de la RNase H ainsi que deux amorces d'oligonuclotides.
L'amplification est suprieure 1012 fois en 90 120 minutes. L'amplification de l'ARN
simple brin est seulement possible si la dnaturation de l'ADN double brin ne se produit pas.
Comme le NASBA est un processus isotherme, c'est alors possible. La raction NASBA ne
donne pas de faux positifs causs par l'ADN gnomique, comme dans le cas de la RT-PCR.
Une reprsentation schmatique de lamplification NASBA amplification est montre ci-
dessous:
41
Figure 24. Le principe du NASBA
Ce mcanisme ncessite 2 amorces et 3 enzymes.

1. Les brins d'ARN sont reprsents comme le brin sens prsent dans les chantillons
originaux.
2. Tout d'abord P1 se lie l'ARN et est allong par la transcriptase inverse (AMV-RT). Le
brin d'ARN est transform en l'ADN. L'ARN hybride est hydrolys par la RNase H.
3. Aprs la liaison de P1, P2 peut galement se lier. P2 est alors along par l'AMV - RT, ce
qui donne une molcule d'ADN double brin.
4. Tout d'abord P1 est conu d'une manire telle que lorsqu'il forme un double brin d'ADN, il
contienne un promoteur de l'ARN polymrase T7. Cela permet de gnrer des copies d'ARN
antisens en utilisant une matrice d'ADN.
5. Les nouvelles copies d'ADN sont gnres en utilisant l'ARN. Le processus est le mme
pour le brin sens. Ici, dans ce cas, P2 se liera d'abord.
Dans une raction NASBA, l'ADN est le produit final form. Il dispose d'une rgion de
promoteur qui est utilis comme cible par l'ARN polymrase T7. Les squences de raction
commenant partir des brins d'ARN sens et antisens sont diffrents, mais ils sont considrs
comme tant cintiquement identiques. Ils ont tous deux sont dsigns comme un ADN
complmentaire (ADNc).
42
MOLECULAR BEACON DANS LE NASBA
Un systme de dtection en temps rel est gnr l'aide de balises molculaires (molecular
beacons) avec l'amplification NASBA (figure 20).
Les balises molculaires sont des sondes oligonuclotifiques simple brin en forme en pingle
cheveux. Leur extrmit 5 'a un marqueur fluorescent et l'agent de neutralisation (quencher)
est prsent l'extrmit 3'. Ces balises molculaires sont trs spcifiques de leurs cibles. Elles
forment un hybride stable avec leur ARN cible amplifie, lorsqu'ils sont prsents dans une
raction d'amplification NASBA
LES AVANTAGES DE LA NASBA

Le NASBA est une technique avec des applications larges dans le domaine de l'amplification
et de la dtection de l'ARN. En voici les principaux avantages:
1. L'amplification de la squence d'acide nuclique de plus de 109 copies peut tre effectu en
moins de 90 minutes par l'action de trois enzymes.
2. Les quipements chers de thermocyclage ne sont pas ncessaires comme la raction est
isothermique 41 C
3. Il contribue une meilleure raction d'amplification que la RT-PCR car il offre une cintique
plus rapide.
4. Les retrovirus sont dtects et quantifis par l'amplification du gnome de l'ARN et non pas
les copies d'ADN proviral.
5. Elle peut mesurer la rplication de l'ADN des virus en dtectant l'expression de l'ARNm
tardif.
6. Elle prend en charge la dtection de squences d'ARNm humain sans risque de
contamination par l'ADN.
43
TRANSCRIPTION MEDIATED AMPLIFICATION (TMA)
La transcription mediated amplification (TMA) est une variante de la NASBA. Son principe
est expliqu ci-aprs.
Pour commencer, prenez un chantillon contamin (sang par exemple) et placer le dans un
tube avec la transcriptase inverse (RT), LARN polymrase, 2 amorces qui se lie lADN ou
lARN cible (HIV dans ce cas). De plus, le mlange de raction ncessite un tampon, des
dNTP et des NTPs pour produire de lADN et de lARN respectivement.
Etape 1. Mlanger tous les ingrdients
Les cellules sont lyses et lamplification commence quand une amorce se lie la cible (le
gnome du VIH). RT synthtise une ADN complmentaire et dgrade le gnome cible.
Etape 2. Le Primer 1 se lie et la RT se lie lextrmit 3 du primer. Notons que le primer

#1 a une petite extension en 5 qui ne se lie pas la cible.
44
Etape 3. La RT synthtise le premier brin du cDNA et dgrade lARN. Ces deux tapes sont
en fait concomitantes.
Une fois quun brin du cDNA est form, un second primer vient sy hybrider et la RT produit
le second brin du cDNA qui inclut aussi la partie 5 du primer 1. Cette squence contient le
promoteur reconnu lARN polymrase contenue dans le mix ractionnel de la TMA
Etape 4. Le primer #2 se lie au cDNA, et la RT commence la synthse du second brin du

cDNA.
Etape 5. La RT synthtise le second brin du cDNA incluant le promoteur de lextension du

primer 1.
Maintenant, lARN polymrase est capable de se lier son promoteur et commence la

transcription. La transcription se droule de nombreuses fois pour amplifier la molcule
originale de 100 1000 fois.
Etape 6. LARN polymrase se lie la squence promotrice de lADN double brin.
45
Etape 7. LARN polymrase produit une nouvelle copie de lARN dorigine (ici HIV).
Ltape 8. La transcription se droule de 100 - 1000 fois pour amplifier la molcule de

dpart.
En fin de compte, les matrices d'ARN nouvellement synthtises servent de matriaux de

dpart pour l'tape 2 ci-dessus, et tout le processus est maintes et maintes fois rpt. Notez
que contrairement la PCR, la raction reste une temprature constante! Dans les 15 30
minutes, plus de 10 milliards de copies de l'ARN de dpart sont produites dans un seul tube.
TMA DETECTION
Une fois que l'ARN est amplifi, il doit tre dtect. Pour ce faire, les amplicons sont
incubs avec une sonde d'ADN qui est modifi de manire covalente par l'ester d' acridinium
(AE). Toute sonde non hybride avec l'ARN va perdre son AE Lorsqu'ils sont exposs des
ions hydroxyde (pH lev).
Structure de lester dacridinium
Etape 9. La raction est arrte et mlange avec une sonde simple brin qui contient de
lester dacridinium (AE).
46
Etape 10. Certaines sondes vont se lier lArn amplifi et protger lAE de la destruction (en
haut). Les AE non protgs sont clives et dgrads (en bas).
Si la sonde est hybride avec l'amplicon d'ARN, le groupement AE est protg et produit de
la lumire ne prsence de superoxyde. Cette lumire peut tre mesure et est proportionnelle
au nombre de molcules de matrice (gnomes VIH) dans la raction initiale.
Etape 11. Quand il est mlang avec le substrat appropri, lAE est modifi et met de la
lumire comme produit de la raction chimique.
47
HELICASE DEPENDENT AMPLIFICATION
L'amplification Hlicase dpendante (HDA) (Vincent et al., 2004)2 utilise une hlcase pour
sparer les brins de l'ADN doubles brins, ceci permet aux primers de s'associer l'ADN
simple brin et l'ADN polymrase d'allonger les amorces. Comme pour la PCR, ce systme
ne ncessite que deux amorces. L'HDA a t employe dans les appareils de diagnostic et de
plusieurs tests sont approuvs par la FDA.
Figure 26. Le principe de lHDA

La dtection du produit de PCR peut se faire par lectrophorse ou par fluorescence si on
ajoute un fluorochorme comme le sybrgreen la raction.
Figure 27. dtection dun produit damplification HDA soit en lectrophorse ( gauche) soit
en temps rel ( droite).
2
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1249482/pdf/5-7400200.pdf
48
LOOP MEDIATED AMPLIFICATION OU LAMP (NOTOMI ET AL., 2000) 3
INTRODUCTION
L'amplification d'acide nuclique est l'un des outils les plus prcieux dans pratiquement tous
les domaines des sciences de la vie, y compris les domaines appliqus : tels que la biologie
clinique, dans lesquels le diagnostic des maladies infectieuses, des maladies gntiques et des
traits gntiques ont particulirement bnfici de cette nouvelle technique. En plus de la
dtection par PCR largement utilise, plusieurs nouvelles mthodes d'amplification ont t
inventes. Elles comprennent l'amplification base sur une squence d'acide nuclique
(NASBA), la TMA et l'amplification par dplacement de brin (SDA). Chacune de ces mthodes
d'amplification a sa propre astuce pour assurer l'amplification de l'ADN. Par exemple, la PCR
utilise la dnaturation thermique des produits d'ADN double brin pour la promotion du cycle
suivant de synthse de l'ADN. La TMA et la NASBA Eliminent la dnaturation thermique en
utilisant un ensemble de la transcription inverse et de ractions de transcription pour amplifier
la squence cible. De mme, la SDA limine l'tape de dnaturation thermique dans la
cyclisation de ma synthse de l'ADN en employant un ensemble de restrictions enzymatiques
et la synthse d'ADN par dplacement de brin avec des nuclotides modifis comme substrat.
Ces mthodes peuvent amplifier les acides nucliques cibles un mme ordre de grandeur, le
tout avec une limite de dtection de moins de 10 copies et en une heure elle doivent faire face
des lacunes. Elles ncessitent soit un instrument de prcision pour l'amplification ou un
procd compliqu pour la dtection des produits amplifis en raison d'une faible spcificit
pour la squence cilbe. Malgr la simplicit et l'ampleur de l'amplification obtenue, l'exigence
d'un thermocycleur de haute prcision dans la PCR empche cette puissante mthode d'tre
largement utilise comme outil de diagnostic de routine dans les laboratoires cliniques privs.
D'autre part, NASBA et la TMA, qui ne ncessitent pas de thermocycleur, ont des problmes
de spcificit, principalement en raison de la ncessit d'utiliser une temprature relativement
basse de 40 C pour l'amplification. La SDA surmonte en grande partie ces lacunes en utilisant
quatre amorces et des conditions isothermes pour l'amplification, mais elle a encore des points
faibles qui sont dune part laugmentation du bruit de fond due la digestion d'ADN non
pertinent contenus dans l'chantillon et dautre part, la ncessit d'utiliser des nuclotides
modifis coteux comme substrat. Bien que l'utilisation de plusieurs amorces comme en PCR
niche et en SDA, offre une spcificit amliore de l'amplification de la squence cible, des
co-amplifications rsiduelles non pertinentes constituent encore un frein gnral dans
l'amplification d'acide nuclique, en particulier pour une utilisation diagnostique.
Une nouvelle mthode qui peut amplifier lADN de quelques copies 109 copies en moins
d'une heure dans des conditions isothermes et avec une grande spcificit a t dveloppe
(Notomi et al., 2000). Le mcanisme, la sensibilit et la spcificit de la mthode
d'amplification, appele Loop-mediated isothermal AMPlification (LAMP) est dcrite ci-aprs
3
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC102748/
49
LA MTHODE LAMP
Cette mthode repose sur une synthse d'ADN par un dplacement de brin auto-entretenu qui
est ralis par une ADN polymrase avec une activit de dplacement de brin leve et un
ensemble de deux primers internes et de deux primers externes. Dans les tapes initiales de la
raction LAMP, quatre amorces sont utilises, mais plus tard, lors de la raction de
cyclisation seules les amorces internes sont utilises pour la synthse d'ADN par dplacement
de brin. Les amorces internes sont appeles amorces intrieure avant (FIP) et l'amorce interne
arrire (BIP), respectivement, et chacune contient deux squences distinctes correspondant
aux squences sens et antisens de l'ADN cible, une pour l'amorage de la premire tape et le
autre pour l'auto-amorage dans les tapes ultrieures. Pour plus de facilit d'explication, les
squences (typiquement 23 24 nt) l'intrieur des deux extrmits de la rgion cible pour
l'amplification d'un ADN sont dsigns F2c et B2, respectivement (Figure 28). Deux
squences internes (typiquement 23 24 nt) 40 paries de bases partir des extrmits F2c et
B2 sont dsignes F1c et B1, et deux squences (17-21 nt) l'extrieur des extrmits de F2c
e B2 sont appeles F3c et B3. Ceci tant dit, les squences de FIP et BIP sont choisies de la
manire suivante: FIP contient F1c, spacer TTTT et la squence (F2) complmentaire
F2c. PIF contient la squence (B1c) complmentaire de B1, un sapcer TTTT et la squence
B2. Les deux amorces extrieures consistent en B3 et la squence (F3) complmentairede
F3c, respectivement. Un chantillon contenant l'ADN cible et les quatre amorces est dnatur
par la chaleur et refroidi rapidement sur de la glace. La raction de LAMP est alors initie par
l'addition de d'ADN polymrase BST et est ralis 65 C pendant 1 h.
50
Figure 28: Initiation de la raction LAMP
Le mcanisme et les rsultats escompts des tapes de raction de LAMP sont illustrs la
figure Figure. Le primer interne FIP s'hybride avec F2c sur l'ADN cible et initie la synthse
du brin complmentaire. L' Outer primer F3, qui est quelques bases la plus court et en plus
faible concentration que la FIP, s'hybride lentement F3c de l'ADN cible et initie la synthse
d'ADN par dplacement de brin librant le brin complmentaire li FIP, qui peut former
une structure en boucle une extrmit (figure 29, structure 4). Cet ADN simple brin sert de
matrice pour la synthse d'ADN initi par BIP et la sytnhse d'ADN par dplacement de brin
initi par B3 conduisant la formation d'une structure en double pingle cheveux (6) qui est
rapidement converti en un structure tige-boucle par synthse d'ADN auto-amore (structure
7). Cet ADN tige-boucle sert ensuite de matrice de dpart pour la cyclisation de la raction
LAMP.
51
Figure 29. Mcanisme damplification par LAMP
Pour initier la cyclisation du LAMP, FIP s'hybride la boucle dans l'ADN tige-boucle (7) et
initie la sytnhse d'ADN par dplacement de brin, gnrant comme intermdiaire un ADN tige-
boucle interrompu avec une copie supplmentaire inverse de la squence cible dans la tige et
une boucle qui se forme l'extrmit oppose via la squence BIP (structure 8). Des synthses
d'ADN subsquentes par dplacement de brin conduisent une structure complmentaire de
l'ADN tige-boucle original (10) et un ADN tige-boucle rpar avec une tige allonge de deux
fois (double copies de la squence cible) et une boucle l'extrmit oppose (9). Ces deux
produits servent de modle pour une raction de dplacement de brin iniit par BIP dans les
cycles suivants, dont une partie est dsigne comme l'tape d'longation et de recyclage,
illustre dans la moiti droite de la figure Figure 29. Ainsi, dans le LAMP la squence cible est
amplifie 3 fois chaque demi cycle.
52
Les produits finaux sont un mlange d'ADN tige-boucle de diffrentes longueurs de tige et des
structures en chou-fleur avec de multiples boucles formes par hybridation entre
alernativement des rptitions inverses de la squence cible alternativement sur le mme brin
(structures 16-18). L'utilisation de quatre amorces (reconnaissant six squences distinctes) dans
les tapes initiales du LAMP et deux amorces (reconnaissant quatre squences distinctes) au
cours des tapes suivantes garantit une haute spcificit pour l'amplification de la cible. En
outre, en LAMP quatre amorces (six squences de reconnaissance distinctes) sont utiliss pour
initier simultanment la synthse d'ADN partir de de l'ADN non amplifi d'origine pour
gnrer l'ADN tige-boucle pour la cyclisation ultrieure du LAMP au cours de laquelle la cible
est reconnu par quatre squences. Par consquent, la slectivit de la cible devrait tre plus
lev que dans la PCR ou la SDA.
OPTIMALISATION DES CONDITIONS DU LAMP

Comme l'hybridation des quatre amorces l'ADN cible dans l'tape initiale est critique pour
l'efficacit de LAMP, les squences et les tailles des amorces qont choisies afin que leurs
tempratures de fusion (Tm) tombent dans certaines gammes. Les squences F2 et B2 dans les
amorces FIP et BIP ont t choisis de sorte que leurs valeurs de Tm soient entre 60 et 65C, la
temprature optimale pour la polymrase BST. Les valeurs de Tm de F1c et B1c sont grement
suprieures que celles de F2 et B2 afin de former une boucle immdiatement aprs la libration
de l'ADN simple brin partir de la cible. En outre, les valeurs de Tm des amorces extrieures
(F3 et B3) sont infrieures que celles de F2 et B2 afin de veiller ce que la synthse se droule
plus tt partir des amorces internes qu' partir des amorces externes. En outre, les amorces
externes sont utilises entre un quart et un dizime de la concentration en amorces internes.
La formation d'un ADN tige-boucle (structure 7) partir d'une structure en haltre (la structure
6) est critique pour la cyclisation du LAMP. L'effet de diffrentes tailles de boucle Entre F2c
(B2C) et F1c (B1c) sur l'efficacit d'amplification a t examin et on a constat qu'une boucle
de 40 bases ou plus ont donn les meilleurs rsultats.
L'efficacit du LAMP dpend de la taille de l'ADN cible parce qu'une tape limitante de vitesse
dans cette mthode est la synthse d'ADN par dplacement de brin. Diffrentes tailles d'ADN
cible ont t testes et les meilleurs rsultats pouvaient tre obtenus ave des ADN de130 200
pb. Des ADN de plus de 500 pb sont amplifis, mais trs mal. En Consquence, la taille de
l'ADN cible doit tre de moins de 300 pb, y compris F2 et B2.
L'ADN polymrase est un autre facteur essentiel pour une amplification efficace. La meilleure
amplification a t obtenue avec la polyumrase BST ou l'ADN polymerase BCABEST
(Takara) pour moins de 10-23 moles d'ADN cible. La Z-Taq DNA Polymerase (Takara) tait
moins efficace, mais pourrait tre utile quand la polymrase doit tre ajout avant Lorsque la
dnaturation thermique de l'ADN cible, car elle est thermostable.
Les produits chimiques dstabilisant les hlices d'ADN se sont rvls fficaces pour
augmenter l'fficacit du LAMP. La prsence de 0,5-1,5 M de btane (N, N, N-
trimethylglycine) ou de L-proline, qui rduit l'empillage des bases, stimule non seulement le
rendement global de la raction, mais aussi sa slectivit avec une rduction importante de
l'amplification de squences non pertinentes.
53
DTECTION DES PRODUITS DE LAMP
1) Turbidimtri.
Le LAMP gnre de nombreuses molcules de pyrophophates qui vont ragir
avec les ions magnsium prsent dans le mileu pour gnrer un prcipit de
pyrophosphate de magnsium.
Il en rsulte une opacit du milieu qui est proportionnelle la quantit dADN
sytnthtis. Ce prcipit peut tre visualis loeil nu ou bien mesurer dans un
turbidimtre.
Figure 30. Formation dun prcipit ( gauche) lors de la raction de LAMP
2) Colorimtrie
On peut ajouter la raction de lhydroxynaphtol blue (HNB). En prsence
dions Mg2+, il est violet et il devient bleu si la quantit dions diminue. Or au
cours de la raction LAMP, les ions mg2+ sont chlats par les
pyrophosphates forms et donc la couleur bleue est proportionelle la quantit
dADN form (Goto et al., 2009)4.
a b c d e f g h
Figure 31. Dtection du produit damplification LAMP en colorimtrie

a. 10 000 000 copies/tube
b. 1 000 000 copies/tube
c. 100 000 copies/tube
d. 10 000 copies/tube
e. 1 000 copies/tube
f. 100 copies/tube
4
Goto et al., 2009.
http://www.biotechniques.com/BiotechniquesJournal/2009/March/Colorimetric-detection-of-
loop-mediated-isothermal-amplification-reaction-by-using-hydroxy-naphthol-
blue/biotechniques-118324.html
54
g. 10 copies/tube
h. 0 copie/tube
3) Fluorescence
On peut ajouter la raction du Sybrgreen (figure 32) qui fluoresce quand il

est li lADN double brin.
.
1) 10 000 000 copies/tube

2) 1 000 000 copies/tube
3) 100 000 copies/tube
6) 100 copies/tube
7) 10 copies/tube
8) 0 copie/tube
Figure 32. Dtection dun produit damplificaition LAMP en fluorscence
On peut aussi utiliser la calcine qui se lie aux ions divalents. Quand la
calcine lie les ions manganse (Mn2+) elle ne fluoresce pas. Au cours de la
raction de LAMP des ions pyrophosphates (P2O7) sont forms et accaparent
les ions Mn2+ qui manquent la calcine qui peut alors mettre de la
fluorescence. Cette fluorescence est encore exacrbe quand elle se lie au ions
Mg2+ (figure 33, Tomita et al., 2008)5.
5
Tomita et al., 2008. http://www.nature.com/nprot/journal/v3/n5/full/nprot.2008.57.html
55
En fluorescence (a) En lumire normale (b)
Figure 33. Dtection du produit de LAMP grce la calcine
AVANTAGES DU LAMP
(I) Le LAMP amplifie l'ADN haut rendement dans des conditions isothermes sans une
influence significative de la prsence d'ADN non-cible. Sa limite de dtection est de quelques
exemplaires et est comparable celle de la PCR.
(II) le LAMP est hautement spcifique de la squence cible. Cette situation est attribuable la
reconnaissance de la squence cible par six squences indpendantes dans la phase initiale et
par quatre squences indpendantes Au cours des tapes ultrieures de la raction de LAMP.
Cela attnue en partie le problme gnral de bruit de fond associ toutes les mthodes
d'amplification des acides nucliques.
(III) Le LAMP est simple et facile raliser, une fois que les amorces appropries sont
slectionnes, Il ncessite seulement quatre amorces, l'ADN polymrase et un bain marie ou
un bloc chauffant
(IV) En combinaison avec la transcription inverse, Le LAMP peut aussi amplifier des
squences d'ARN avec une grande efficacit.
56
STRAND INVASION BASED AMPLIFICATION (SIBA) 6
Les technologies d'amplification des acides nucliques isothermes offrent des avantages
significatifs par rapport la raction en chane par polymrase (PCR) en ce qu'ils ne ncessitent
pas de cyclisation thermique ou d'quipement de laboratoire sophistiqu. Cependant,
l'amplificaton non dpendante de la cible a limit la sensibilit des technologies isothermes et
de sondes complexes sont ncessaires pour distinguer entre l'amplification non-spcifique de
l'amplification de la cible. Ici, nous rapportons une nouvelle technologie isothermique
d'amplification de l'ADN, Strand Invasion Based Amplification (SIBA). La technologie SIBA
est rsistante l'amplification non spcifique, elle est capable de dtecter une seule molcule
d'ADN cible, et ne ncessite pas de sondes spcifiques. La technologie repose sur l'insertion
Les technologies d'amplification des acides nucliques isothermes offrent des avantages
significatifs par rapport la raction en chane par polymrase (PCR) en ce qu'ils ne ncessitent
pas de cyclisation thermique ou d'quipement de laboratoire sophistiqu. Cependant,
l'amplificaton non dpendante de la cible a limit la sensibilit des technologies isothermes et
de sondes complexes sont ncessaires pour distinguer entre l'amplification non-spcifique de
l'amplification de la cible. Ici, nous rapportons une nouvelle technologie isothermique
d'amplification de l'ADN, Strand Invasion Based Amplification (SIBA). La technologie SIBA
est rsistante l'amplification non spcifique, elle est capable de dtecter une seule molcule
d'ADN cible, et ne ncessite pas de sondes spcifiques. La technologie repose sur l'insertion
recombinase-dpendante d'un oligonuclotide d'invasion (IO) dans la cible d'acide nuclique
double brin. Les rgions duplex priphriques au site dinsertion de l'IO se dissocient,
permettant ainsi des amorces spcifiques de la cible de se lier. Une polymerase tend les
amorces ensuite sur lADN cible conduit l'amplification exponentielle de la cible. Les
amorces ne sont pas des substrats pour la recombinase et ne sont donc pas en mesure d'tendre
la cible en l'absence de l'OI. L'inclusion de 2'-O-mthyl ARN l'IO assure qu'il ne soit pas
process et qu'il ne participe pas l'extension de lADN cible. Ces caracteristiques assurent
que la technologie soit rsistante l'amplification non spcifique puisque les dimres de
primers ou un mauvais amorage sont incapables dtre amplifis de manire exponentielle.
Par consquent, SIBA est trs spcifique et fiable pour distinguer des espces proches avec une
sensibilit dune seule molcule en l'absence de sondes complexes ou dquipement de
laboratoire sophistiqu.
La Strand Invasion Based Amplification (SIBA), est par dfinition resistante aux
amplificaitons non spcifiques et en consquence est trs sensible. Cette technologie repose sur
linsertion par une recombinase (UVSX) dun oligonuclotide dinvasion (IO) dans une rgion
complmentaire de lADN cilbe (rgion amplifier). Le duplex dADN proche de linsertion
de IO est dnatur ce qui permet la fixation des primers spcifiques qui eux ne sont pas des
substrats pour la recombinase car ils sont trop courts. Un ADN polymerase peut alors
polymriser lADN partir des primers lis. Hence, the orchestrated recombinase-dependent
insertion of the IO and subsequent polymerase-dependent extension of the primers provide the
basis for exponential isothermal amplification. L inclusion de 2-O-methyl RNA dans lIO
6
Hoser et al., 2014. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4242538/
57
permet que celui-ci ne soit pas considr comme un substrat ou une cible pour la polymrase.
IO nest donc pas responsable damplification non spcifique. De p lus comme les primers ne
sont pas des substrats pour la recombinase, ils sont rsistants la formation dartfacts parce
quils ne peuvent pas dissocier un duplex dADN en labsence dIO. Tout ceci concoure une
grande spcificit.
Gp32 est une protine du phage T4 qui se lie lADN monocatnaire et est ncessaire pour
laction de la recombinase UvrX.
UvrX est une recombinase de 46 kDa isole du phage T4 galement et impliqu dans la
rplication de ce phage et dans son insertion dans lADN bactrien. Cest une protine similaire
recA dE. coli (ATPase DNA-dpendante).
Figure 34. Description du SIBA.bTous les lments monocatnaires sont revtus de gp32,
l'exception des nuclotides d'ARN 2'-O-mthyle. tape 1: uvsX dplace gp32 sur le IO et seulement
faiblement enrobe les amorces, car ils sont trop courts pour la liaison haute affinit. Etape 2: L'IO
envahit la rgion complmentaire du duplex cible qui permet une sparation partielle du duplex cible
avec l'extrmit aval restant double brin. Le brin sortant de la cible duplex partiellement spare est
stabilise par gp32. tape 3: La dpolymrisation par uvsX permet la rgion d'ARN 2'-O-mthyle
de IO de migrer (branch migration) dans le duplex. tape 4: Tant la rgion priphrique en amont et
en aval de l'IO devient assez courte pour se dissocier. Etape 5: La polymrase de dplacement de brin
est capable d'allonger le pulex cible dissoci partir de l'amorce. Le primer avant dplace le IO
durant l'l'extension de la cible. Etape 8: Ces vnements conduisent la production de deux copies de
la cible duplex. Le IO est libr pour tre induit dans une amplification
supplmentaire.doi:10.1371/journal.pone.0112656.g001
58
LE SEQUENAGE DE LADN
Les techniques de squenage de lADN ont t dveloppes pour pouvoir connatre

lagencement des nuclotides dans lADN et ainsi pouvoir lire la squence nuclotidique
dune molcule donne. Les techniques sont ici prsentes par ordre chronologique
dappariton dans les laboratoires de biologie molculaire.
https://fr.wikipedia.org/wiki/S%C3%A9quen%C3%A7age_de_l%27ADN
Le squenage de l'ADN consiste dterminer l'ordre d'enchanement des nuclotides pour

un fragment dADN donn.
La squence dADN contient linformation ncessaire aux tres vivants pour survivre et se
reproduire. Dterminer cette squence est donc utile aussi bien pour les recherches visant
savoir comment vivent les organismes que pour des sujets appliqus. En mdecine, elle peut
tre utilise pour identifier, diagnostiquer et potentiellement trouver des traitements des
maladies gntiques et la virologie. En biologie, l'tude des squences d'ADN est devenue
un outil important pour la classification des espces.
HISTORIQUE
Le squenage de l'ADN a t invent dans la deuxime moiti des annes 1970. Deux
mthodes ont t dveloppes indpendamment, l'une par l'quipe de Walter Gilbert, aux tats-
Unis, et l'autre par celle de Frederick Sanger (en 1977), au Royaume-Uni. Ces deux mthodes
sont fondes sur des principes diamtralement opposs : l'approche de Sanger est une mthode
par synthse enzymatique slective, tandis que celle de Maxam et Gilbert est une mthode par
dgradation chimique slective. Pour cette dcouverte, Gilbert et Sanger ont t rcompenss
par le prix Nobel de chimie en 1980.
Initialement, la mthode de Sanger ncessitait de disposer d'un ADN simple brin qui servait de
matrice pour la synthse enzymatique du brin complmentaire. Pour cette raison, le premier
organisme biologique dont le gnome a t squenc en 1977 est le virus bactriophage
X1741. Ce virus a la proprit d'avoir un gnome constitu d'ADN simple brin qui est
encapsul dans la particule virale.
Au cours des 25 dernires annes, la mthode de Sanger a t largement dveloppe grce

plusieurs avances technologiques importantes :
la mise au point de vecteurs de squenage adapts, comme le phage M13 dvelopp

par Joachim Messing au dbut des annes 1980 2;
le dveloppement de la synthse chimique automatise des oligonuclotides qui sont
utiliss comme amorces dans la synthse ;
59
l'introduction de traceurs fluorescents la place des marqueurs radioactifs utiliss
initialement. Ce progrs a permis de sortir le squenage des pices confines
ncessaires l'usage de radio-isotopes 3;
l'adaptation de la technique PCR pour le squenage ;
l'utilisation de squenceurs automatiques de gnes 3;
l'utilisation de l'lectrophorse capillaire pour la sparation et l'analyse4.
METHODE DE MAXAM ET GILBERT
La mthode de Maxam et Gilbert ncessite des ractifs chimiques toxiques et reste limite
quant la taille des fragments d'ADN qu'elle permet d'analyser (< 250 nuclotides). Moins
facile robotiser, son usage est devenu aujourd'hui confidentiel.
Cette mthode est base sur une dgradation chimique de l'ADN et utilise les ractivits
diffrentes des quatre bases A, T, G et C, pour raliser des coupures slectives7. En
reconstituant l'ordre des coupures, on peut remonter la squence des nuclotides de l'ADN
correspondant. On peut dcomposer ce squenage chimique en six tapes successives :
Marquage : Les extrmits des deux brins d'ADN squencer sont marques par un
traceur radioactif (32P). Cette raction se fait en gnral au moyen d'ATP radioactif et
de polynuclotide kinase.
Isolement du fragment d'ADN squencer. Celui-ci est spar au moyen d'une
lectrophorse sur un gel de polyacrylamide. Le fragment d'ADN est dcoup du gel
et rcupr par diffusion.
Sparation de brins. Les deux brins de chaque fragment d'ADN sont spars par
dnaturation thermique, puis purifis par une nouvelle lectrophorse.
Modifications chimiques spcifiques. Les ADN simple-brin sont soumis des
ractions chimiques spcifiques des diffrents types de base. Walter Gilbert a mis au
point plusieurs types de ractions spcifiques, effectues en parallle sur une fraction
de chaque brin d'ADN marqu : par exemple, une raction pour les G (alkylation par
le sulfate de dimthyle), une raction pour les G et les A (dpurination), une raction
pour les C, ainsi qu'une raction pour les C et les T (hydrolyse alcaline). Ces
diffrentes ractions sont effectues dans des conditions trs mnages, de sorte qu'en
moyenne chaque molcule d'ADN ne porte que zro ou une modification.
Coupure. Aprs ces ractions, l'ADN est cliv au niveau de la modification par
raction avec une base, la pipridine.
Analyse. Pour chaque fragment, les produits des diffrentes ractions sont spars par
lectrophorse en conditions dnaturantes et analyss pour reconstituer la squence de
l'ADN. Cette analyse est analogue celle que l'on effectue pour la mthode de
Sanger.
60
Figure 35. Le principe de la mthode de Maxam et Gilbert
61
LA METHODE DE SANGER
Le principe de cette mthode consiste initier la polymrisation de lADN l'aide d'un petit
oligonuclotide (amorce) complmentaire une partie du fragment dADN squencer.
Llongation de lamorce est ralise par le fragment de Klenow (une ADN polymrase I
dpourvue dactivit exonuclase 53) et maintenue par des ADN polymrases
thermostables, celles qui sont utilises pour la PCR. Les quatre dsoxyribonuclotides
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) sont ajouts, ainsi quune faible concentration de l'un des quatre
didsoxyribonuclotides (ddATP, ddCTP, ddGTP ou ddTTP)5.
Ces didsoxyribonuclotides agissent comme des poisons terminateurs de chane : une

fois incorpors dans le nouveau brin synthtis, ils empchent la poursuite de llongation.
Cette terminaison se fait spcifiquement au niveau des nuclotides correspondant au
didsoxyribonuclotide incorpor dans la raction. Pour le squenage complet d'un mme
fragment d'ADN, on rpte cette raction quatre fois en parallle, avec les quatre
didsoxyribonuclotides diffrents.
Figure 36a. Structure du

dATP (haut) et du ddATP
(bas). Dans le ddATP, le
groupement 3'-OH (en jaune)
est remplac par un
hydrogne. Cette
modification empche la
poursuite de la synthse de
l'ADN qui continue
normalement sur le 3-OH.
Figure 36b. Mcanisme de

polymrisation de l'ADN. La
matrice (en blanc) est
recopie par la polymrase
qui allonge le brin
complmentaire partir de
l'amorce
62
Figure 36c. Principe du squenage par la mthode de Sanger. Les didsoxyribonuclotides
(ici, le ddGTP, en jaune) sont incorpors mais bloquent statistiquement l'allongement de la
chane l o les G sont normalement incorpors. Un traceur fluorescent (en vert clair) est
attach l'extrmit de l'amorce de polymrisation et permet de dtecter les fragments d'ADN
synthtis
Par exemple, dans la raction o on a ajout du ddGTP, la synthse s'arrte au niveau des G.
Le mlange ractionnel contenant, la fois du dGTP et un peu de ddGTP, la terminaison se
fait de manire statistique suivant que l'ADN polymrase utilise l'un ou l'autre de ces
nuclotides. Il en rsulte un mlange de fragments dADN de tailles croissantes, qui se
terminent tous au niveau d'un des G dans la squence. Ces fragments sont ensuite spars par
lectrophorse sur un gel de polyacrylamide6, ce qui permet ainsi de reprer la position des G
dans la squence.
La dtection des fragments ainsi synthtiss se fait en incorporant un traceur dans l'ADN
synthtis. Initialement ce traceur tait radioactif ; aujourd'hui, on utilise des traceurs
fluorescents, attachs soit l'oligonuclotide, soit au didsoxyribonuclotide.
63
Figure 37. Dtection des produits de squenage par la mthode de Sanger. A gauche un marquage
radioactif avec sparation des fragments par lectrophorse en gel dacrylamide dnaturant. Les 4
ractions sont analyses dans des pistes spares et la squence se lit de bas en haut. A droite, une
lectrophorse capilaire de produits de squeage marqus par 4 flurochromes diffrents (vert=A,
rouge=T, bleu=C et jaune=G). Les ractions peuvent se faire dans le mme tube et lensemble des
produits peuvent tre analyss en un seul run. Les fragments les plus petites migrent le plus rapidement
et la couleur dtecte par un rayon LASER dtermine la base dtecte. A partir des signaux de
fluorescence, on construit un lectrophortogramme ( lextrme droite) qui donne lintensite de la
fluorescence et sa couleur en fonction du temps.
64
Figure 38. Plusieurs squenceurs multicapillaires automatiques d'ADN
SEQUENAGE DE GENOME ENTIER
La connaissance de la structure d'un gnome dans son entiret peut passer par son
squenage. Cependant, la taille des gnomes tant de plusieurs millions de bases (ou
mgabases), il est ncessaire de coupler les approches de biologie molculaire avec celle de
l'informatique pour pouvoir traiter un nombre aussi important de donnes.
Deux grands principes de squenage de gnome entier sont utiliss. Dans les deux cas,
l'ADN gnomique est pralablement fragment par des mthodes enzymatiques (enzymes de
restriction) ou physiques (ultrasons) :
la mthode de squenage par ordonnancement hirarchique consiste classer les

fragments gnomiques obtenus avant de les squencer ;
la mthode globale (ou whole-genome shotgun) ne fait pas de classement des
fragments gnomiques obtenus mais les squence dans un ordre alatoire. Une
analyse bio-informatique faisant appel un assembleur permet ensuite de rordonner
les fragments gnomiques par chevauchement des squences communes.
La principale diffrence entre ces deux principes est que l'ordonnancement hirarchique
essaie d'aligner un jeu de clones de grande taille (~ 100 kb) alors que dans la mthode globale
le gnome entier est rduit en fragments de petite taille qui sont squencs puis aligns.
Ordonnancement hirarchique
Aprs extraction, l'ADN gnomique est dcoup par sonication en fragments de 50 200 kb
puis clon dans un vecteur adapt comme les chromosomes artificiels bactriens ou BAC. Le
nombre de clones doit permettre une couverture de 5 10 fois la longueur totale du gnome
tudi. Le chevauchement et l'ordonnancement des clones est ralis soit par hybridation de
65
sondes spcifiques, soit par analyse des profils de restriction, soit plus frquemment par un
ordonnancement aprs squenage et hybridation des extrmits des BAC. Aprs
ordonnancement des clones, ils sont fragments et squencs individuellement, puis
assembls par alignement bio-informatique.
Les avantages de cette mthode sont une plus grande facilit d'assemblage des fragments
grce aux chevauchement des BAC, la possibilit de comparer les fragments aux banques de
donnes disponibles, et la possibilit de partager le travail de squenage entre plusieurs
laboratoires, chacun ayant en charge une rgion chromosomique.
L'inconvnient majeur est la difficult de cloner des fragments contenant des squences
rptes trs frquentes dans certains gnomes, comme ceux des mammifres, ce qui rend
difficile l'analyse bio-informatique finale.
Mthode globale ou Shotgun
Il s'agit d'une mthode de squenage d'ADN gnomique initialement imagine dans le

laboratoire de Frederick Sanger Cambridge la fin des annes 1970 pour squencer les
premiers gnomes de virus8.
Cette mthode a t popularise par Craig Venter pour le squenage des grands gnomes, en
particulier au sein de la socit Celera Genomics. La premire application fut le squenage de
gnomes bactriens, puis du gnome de la drosophile et enfin du gnome humain et murin.
Pour raliser un squenage de gnome complet l'aide de cette technique, deux trois banques
composes de fragments alatoires d'ADN gnomique sont ralises. Entre les banques, les
fragments divergent aussi bien en taille qu'en localisation sur le gnome. partir de ces
banques, de nombreux clones sont squencs puis assembls. La squence totale est obtenue
en traitant l'ensemble des banques l'aide d'outils bio-informatiques, en alignant les fragments
l'aide des squences chevauchantes.
Les avantages par rapport au squenage par ordonnancement hirarchique sont la rapidit de
la technique et un cot plus faible. L'inconvnient est que le traitement informatique ne permet
pas d'aligner des fragments comportant des squences rptes de grande taille qui sont
frquemment prsentes dans les gnomes des mammifres.
Cette mthode est couramment dsigne sous le nom de shotgun (fusil canon sci), ou encore
Whole Genome Shotgun (WGS). Cette mtaphore illustre le caractre alatoire de la
fragmentation initiale de l'ADN gnomique : on arrose tout le gnome, un peu comme se
dispersent les plombs de ce type d'arme feu.
Autres mthodes
Squenage par hybridation
Le squenage par hybridation repose sur lutilisation de puces ADN contenant de plusieurs
centaines (pour les puces de premire gnration) plusieurs milliers doligonuclotides.
LADN analyser est coup en de multiples fragments qui sont ensuite incubs sur la puce o
66
ils vont shybrider avec les oligonuclotides dont ils sont complmentaires. La lecture de la
puce (la dtection des oligonuclotides hybrids), permet dobtenir le spectre de la squence
dADN, cest--dire sa composition en sous-squences de n nuclotides, o n est la taille des
sondes sur la puce utilise. Le traitement informatique du spectre permet ensuite de reconstituer
la squence entire9.
Squenage haut dbit (HTS)
On dsigne par squenage haut dbit (HTS pour high-throughput sequencing) aussi appel
NGS pour next-generation sequencing un ensemble de mthodes apparues partir de 2005
produisant des millions de squences en un run et faibles cot. Le pyrosquenage appartient
ces nouvelles techniques. Elles se caractrisent par l'utilisation d'approches massivement
parallles, permettant de squencer des centaines de milliers de fragments simultanment. Elles
s'affranchissent des tapes de clonage et de constitution de banques gnomiques. Elles
permettent de squencer partir de molcules uniques d'ADN.
67
Comparaison des mthodes de squenage nouvelle-gnration[10],[11]
Mthode Longueur de Prcision Lecture par temps cot par 1 Avantages Inconvnients
la lecture exprience d'exprience million de
bases (en
dollar
amricain
$)
Squenage 10,000 pb 87%15 50,000 par 30 minutes $0.13 lectures dbit modr,
d'une seule 15,000 pb cellule, ou 4 heures18 $0.60 longues. l'quipement peut
molcule en en moyenne 5001000 Rapide. tre trs coteux
temps rel (14,000 pb megabases16,17 Dtecte 4mC,
(Pacific N50); 5mC, 6mA19
Biosciences) longueur de
lecture
maximale
>40,000
bases12,13,14
Ion jusqu' 400 98% jusqu' 80 2 heures $1 l'quipement erreurs
semiconductor pb millions le moins cher, d'homopolymres
(Squenage Ion rapide
Torrent)
Pyrosquenage 700 pb 99.9% 1 million 24 heures $10 lectures l'exprience cote
(454) longues, cher, erreurs
rapide d'homopolymres
Squenage par 50 300 pb 99.9% jusqu' 6 1 11 $0.05 Potentiel de L'quipement peut
synthse milliards jours20 $0.15 rendement tre trs coteux.
(Illumina) lev de Ncessite des
squence, concentrations
selon le leves d'ADN.
modle de
squenceur et
l'application
souhaite
Sequenage par 50+35 ou 99.9% NA 20 minutes $2400 lectures Plus cher et peu
ligation 50+50 bp 3 heures longues. Utile pratique pour les
(squenage pour de grands projets de
SOLiD) nombreuses squenage. Cette
applications. mthode ncessite
aussi du temps pour
l'tape de clonage
de plasmide ou
PCR.
Le premier squenage humain a t annonc en 2003 et a cot plus 2 milliards de dollars21.

L'volution de la technique a permis une trs forte baisse des prix qui se situe actuellement
aux alentours de 1000 USD soit une diminution de 2 millions de fois en 15 ans.
NOTES ET REFERENCES
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marche_4472313_4355770.html
69
LES PRINCIPALES METHODES DE SEQUENAGE DE NOUVELLE
GENERATION
Dans tous les systmes, les premires tapes sont les mmes. Il sagit de cliver lADN total
squencer en petits fragments de quelques centaines de paires de bases et damplifier ces
squences de manire individuelle de manire obtenir des millions de copies de cette
squence unique. Chaque clone molculaire ainsi produit est ensuite squenc. Toutes
les molcules lintrieur dun clone ayant la mme squence. La difficult est donc de
diluer les fragments dADN avant amplification pour avoir une seule copie par raction
damplification.
Cela se fait soit en emprisonnant la molcule dans des goutelettes dhuile (systme Roche) ou
en utlisant un systme dhybridation sur lame (systme Illumina). Lamplification quant
elle se fait grace la ligation aux extrmits des fragments dADN gnrs soit par restriction
enzymatique soit par dchirement mcanique de lADN de linkers de squence connue. Il
suffit alors de raliser lamplification par PCR laide damorces complmentaires de ces
squences connues.
Ensuite, il faut squencer tout ces fragments dADN amplifis. Pour cela diffrentes
mthodes existent.
LE PYROSEQUENCING
Le pyrosquenage est une mthode de squenage d'ADN (dtermination de l'ordre des

nuclotides de l'ADN) qui diffre du squenage de Sanger, en ce qu'elle repose sur la
dtection de la libration de pyrophosphate suite l'incorporation de nuclotide, plutt que de
terminaison de chane avec des didsoxynuclotides. La technique a t dveloppe par
Mostafa Ronaghi et Pl Nyrn l'Institut royal de technologie de Stockholm en 1996. La
squence d'ADN souhaite est dtermin par la lumire mise lors de l'incorporation d'un
nuclotide complmentaire. L'intensit de la lumire dtermine si un ou plusieurs nuclotides
ont t incorpors. Le nuclotide prcdente (un sur quatre dNTP possible) est dgrad avant
l'incorporation du suivant: Permettant la rvlation du nuclotide suivant par l'intermdiaire
de l'intensit de la lumire gnr. Ce processus est rpt avec chacun des quatre
nucltodies jusqu' ce que la squence d'ADN de la matrice simple brin est dtermine.
PROCEDURE
Le pyrosquenage est base sur la dtection de l'activit de l'ADN polymrase (une enzyme
d'ADN de synthse) avec une autre enzyme chimioluminescente. Essentiellement, la mthode
permet le squenage d'un seul brin d'ADN en synthtisant le brin complmentaire, une paire
une base la fois, et la dtection de quelle base a t ajout chaque tape. L'ADN matrice
est immobile, et les solutions des nuclotides A, C, G et T sont ajouts squentiellement et
retir de la raction. La lumire est produite uniquement Lorsque le nuclotide est incorpor
la molcule d'ADN synthtiser. La squence des nucltodies qui produsient des signaux
chimiluminescents permet la dtermination de la squence de la matrice.
70
La matrice d'ADN simple brin est hybrid une amorce de squenage et on l'incube avec les
enzymes ADN polymerase, l'ATP sulfurylase, la lucifrase et l'apyrase, et le substrat adnosine
5' phosphosulfate (APS) et de la lucifrine.
L'addition d'une des quatre dsoxynuclosides triphosphates (dNTP) dclenche la seconde
tape. L'ADN polymrase incorpore les dNTPs, complmentaires correctes sur le modle.
Cette incorporation libre du pyrophosphate (PPi).
L'ATP sulfurylase convertit PPi en ATP en prsence d'adnosine posphosulfate. l'ATP agit
comme substrat pour la conversion de la lucifrine en oxylucifrine et en lumire par la
lucifrase. La lumire produite est proportionnelle la quantit d'ATP. La lumire produite
dans la raction catalyse par la lucifrase est dtecte par une camra et analyse dans un
pyrogramme.
Les nucleotides non incorpors et de l'ATP sont dgrades par l'apyrase, et la raction peut
redmarrer avec un autre nucleotide.
Figure 39. Le principe du pyrosequencing
l'heure actuelle, une limitation de la mthode est que les longueurs des squences lues de la
squence est de 300-500 nucleotides, ce qui est plus court que celles ibtenues par le
squenage par la mthode de Sanger (800-1000 nulcotides). Cela peut rendre le processus
d'assemblage du gnome plus difficile, en particulier pour les squences contenant une
grande quantit d'ADN rptitif. Depuis 2007, le pyrosquenage couramment utilis pour le
squenage et le squenage des gnomes pour lesquels la squence d'un proche parent est
dj disponible. Le pyrosequencing peut se faire soit sur de l'ADN fix sur un substrat solide
(phase solide) ou en solution (phase liquide).
REFERENCES
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pyrophosphate". Science 281 (5375): 363. doi:10.1126/science.281.5375.363.
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2. Ronaghi; Karamohamed, S; Pettersson, B; Uhln, M; Nyrn, P (1996). "Real-time DNA
sequencing using detection of pyrophosphate release". Analytical Biochemistry 242 (1): 849.
doi:10.1006/abio.1996.0432. PMID 8923969.
71
3. Nyrn, P. (2007). "The History of Pyrosequencing". Methods Mol Biology 373: 114.
doi:10.1385/1-59745-377-3:1. PMID 17185753.
A
LElheure actuelleILLUMINA
SYSTEME dans le monde,
OU lesLE
des laboratoires sontPAR
SEQUENCAGE quips du systme illumina et
SYNTHESE
lautre quart par le systme ion torrent.
SEQUENCING BY SYNTHESIS (SBS) TECHNOLOGY

La technologie de squenage Illumina, le squenage par synthse (SBS), est la technologie
de squenage de nouvelle gnration la plus russie et largement adopt (NGS) dans le monde
entier. Des instruments et des ractifs de squenage Illumina supportent le squenage
massivement parallle en utilisant un procd brevet qui dtecte les bases simples car ils sont
incorpors dans des brins d'ADN en croissance.
LA CHIMIE SBS
Une terminaison rversible marque en fluorescence est enregistre queand chaque dNTP est
ajout et ensuite cliv pour permettre l'incorporation de la base suivante. Puisque tous les 4
dNTP terminateurs li rversiblement sont prsents pendant chaque cycle de squenage, la
concurrence naturelle minimise le biais de l'incorporation. Le rsultat final est le squenage
rellement base par base qui permet d'avoir des donnes prcises pour une large gamme
d'applications. La mthode limine pratiquement toutes les erreurs associes l'utilisation de
chanes de nuclotides rpts (des homopolymres). La technologie "squenage par
synthse" maintenant utilise par Illumina a t initialement dvelopp par Shankar
Balasubramanian et David Klenerman l'Universit de Cambridge. Ils ont fond la socit
Solexa en 1998 pour commercialiser leur mthode de squenage. Illumina a continu acheter
Solexa en 2007 et a construit sur, et amliore rapidement la technologie originale.
La mthode de squenage Solexa / Illumina est similaire un squenage Sanger, mais il
utilise des dNTP modifi contenant un terminateur qui bloque la polymerisation ultrieure-
donc une seule base peut tre ajout par la polymrase pour chaque copie de brin d'ADN en
croissance. La raction de squenage est ralise simultanment sur un trs grand nombre
(plusieurs millions en l'occurrence) des diffrentes molcules de matrice tales sur une surface
solide. Le terminateur contient galement un marqueur fluorescent qui peut tre dtect par
une camra. Une seule couleur fluorescente est utilise, de sorte que chacune des quatre bases
doit tre ajoute dans un cycle spar de la synthse d'ADN et la fluorescence associe est
enregistre couleur par couleur. Aprs l'addition des quatre dNTP, les images sont enregistres
et les terminateurs sont limins. Cette chimie est appel "terminateurs rversibles". Enfin,
quatre cycles d'additions de dNTP sont inities. Comme des bases individuelles sont ajoutes
toutes les matrices de manire uniforme, le processus de squenage produit un ensemble de
squence d'ADN lues de longueur uniforme.
72
Figure 40. Le squenage suivant la methode Illumina.
Bien que le systme d'imagerie fluorescente utilise dans les squenceurs dIllumina ne soit
pas assez sensible pour dtecter le signal partir d'une molcule unique, l'innovation majeure
de la mthode Illumina est l'amplification de molcules de matrice sur une surface solide.
L'chantillon d'ADN est prpare dans une bibliothque de squenage" par la fragmentation
en morceaux d'environ 200 bases de long. Des adaptateurs personnaliss sont ajouts chaque
extrmit et la bibliothque est place sur une surface solide (flow cell) et les fragments cibles
se lient cette surface. Suite cela, un processus de PCR par 'amplification en pont" a lieu
73
(avec gnration de clusters=polonies) et cre environ un million d'exemplaires de chaque cible
en grappes serre la surface de la flow cell. Chque cluster ou polonies est squenc et le
signal gnr par ces polonies peut tre dtect par la machine.
SEQUENAGE PAR SEMICONDUCTEUR DIONS

Le squenage semi-conducteur dion est une mthode de squenage d'ADN base sur la
dtection d'ions hydrogne qui sont librs lors de la polymrisation de l'ADN. Ceci est une
mthode de "squenage par synthse", au cours de laquelle un brin complmentaire est
construit sur la base de la squence d'un brin matrice.
Figure 41. Un squenceur Ion Torrent
Un micropuits contenant un brin d'ADN matrice squencer est inond avec une seule espce
de triphosphate dsoxyribonuclotide (dNTP). Si le dNTP introduit est complmentaire du
premier nuclotide de la matrice, il est incorpor dans le brin complmentaire en croissance.
Cela provoque la libration d'un ion hydrogne qui stimule un capteur d'ions ISFET, ce qui
indique qu'une raction a eu lieu. Si des rptitions de nuclotides sont prsents dans la
squence du modle, de multiples molcules de dNTP seront intgrs en un seul cycle. Cela
conduit la libartion d'un nombre correspondant d'atomes d'hydrogne let d'un signal
lectronique proportionnellement plus lev. Cette technologie se distingue des autres
technologies de squenage en ce qu'aucun nuclotide modifi ou aucun matriel optique ne
sont utiliss. Le squenage d'ions semi-conducteur peut galement tre dsign comme le
squenage IonTorrent, le squenage mdi par le pH, ou le squenage par semi-conducteurs
HISTORIQUE
La technologie a t brevete par DNA Electronics Ltd, [1] [2], dveloppe par Ion Torrent
Systems Inc. et a t publi en Fvrier 2010. [3] Ion Torrent a commercialis leur machine
comme un squenceur rapide, compact et conomique qui peut tre utilis dans un grand
nombre de laboratoires comme une machine de paillasse [4] (figure 41). Au dpart, Roche 454
Life Sciences tait partenaire de DNA Electronics sur le dveloppement d'une plate-forme de
sequenage utilisant cette technologie. [5]
74
TECHNOLOGIE
Lincorporation
de dNTP dans
lADN en
croissance cause
la libration
dions hydrognes
et de
pyrophosphates.
La libratoin
dions hydrogne
indique si 0, 1 ou
plusieurs
nuclotides sont
incorpors
La libratoin des
ions dhydrogne
est dtecte par
un dtecteur
dions. De
multiples
incorportations
conduisent la
libration dun
nombre
correspondant
dions hydrogne
et un signal
dintensit
proportionnelle.
Figure 42. Principe du squenage par dtection dions.
75
LA CHIMIE DE SEQUENCAGE
Dans la nature, l'incorporation d'un dsoxyribonucloside triphosphate (dNTP) en un brin
d'ADN en croissance implique la formation d'une liaison covalente et la libration de
pyrophosphate et d'un ion hydrogne charg positivement (Figure 42) [1] [3] [6]. Un dNTP ne
sera incorpore que s'il est complmentaire du premier nuclotide non appari de la matrice.
Le squenage par dtection dions exploite ces donnes en dterminant si un ion d'hydrogne
est libr lors de lajout dun nuclotide spcifique la raction.
Chaque micropuits dune puce semi-conductrice contient pplusieurs copies dune molcule
dADN
On ajoute squentiellement des dNTPS (A, C, G, T) non modifi des micropuits dune puce
semi-conductrice qui contiennent dj: l'ADN monocatnaire squencer, un primer de
squenage, un tampon et une ADN polymrase. [3] [7] [8] Si un dNTP introduit est
complmentaire du nucleotide suivant sur le brin matrice, il est incorpor dans le brin
complmentaire par l'ADN polymrase. [9] Si le dNTP introduit n'est pas complmentaire il
n'y a pas incorporation et aucune raction biochimique ne se produit. L'ion hydrogne qui est
libr dans la raction modifie le pH de la solution, et cest cette modification qui est dtecte
par un ISFET. [1] [3] [7] Les molcules de dNTP non incorpors sont laves avant le cycle
suivant, lors duquel un dNTP diffrent est introduit. [7]
LA DETECTION DU SIGNAL
Sous la couche de micropuits qe trouve une couche sensible aux ions, en dessous de laquelle
se trouve un capteur ISFET. [4] Toutes les couches sont contenues dans une puce semi-
conducteurs CMOS 7 , similaire celles utilises dans l'industrie de l'lectronique. [4] [10]
Chaque puce contient un tableau de micropuits avec des dtecteurs de ISFET correspondant.
[7] Chaque ion d'hydrogne libr dclenche alors le capteur d'ions ISFET. La srie
d'impulsions lectriques transmises par la puce un ordinateur est traduite en une squence
d'ADN, sans conversion de signal intermdiaire ncessaire. [7] [11] Parce que les vnements
d'incorporation de nuclotides sont mesurs directement par l'lectronique, l'utilisation de
nuclotides marqus et les mesures optiques sont vites. [4] [10] Le traitement du signal et
l'assemblage des squences dADN peut tre ralise par le logiciel.
CARACTERISTIQUES DU SEQUENCAGE PAR DETECTIN DIONS

La prcision par base ralis en interne sur le squenceur Ion Torrent Ion partir de Fvrier
2011 a t de 99,6% sur base de 50 bases lues, avec 100 Mb par cycle. [12] La longueur de
lecture partir de Fvrier 2011 a t 100 base paires. [12] La prcision des rptitions
d'homopolymre de 5 rptitions de longueur est de 98%. [12] Les versions ultrieures
montrent une longueur de lecture de 400 paires de bases [13].
7
On appelle CMOS, ou Complementary Metal Oxide Semiconductor, une technologie de fabrication de
composants lectroniques et, par extension, les composants fabriqus selon cette technologie. Ce sont pour
la plupart des circuits logiques comme ceux de la famille Transistor-Transistor logic (TTL)
mais, la diffrence de ces derniers, ils peuvent tre aussi utiliss comme rsistance variable.
76
POINTS FORTS
Les principaux avantages du squenage par semi-conducteurs sont la vitesse rapide de
squenage et les faibles cots (initiaux et d'exploitation). [8] [11] Cela a t possible par
l'vitement des nuclotides modifis et des mesures optiques.
Parce que le systme enregistre les vnements naturels d'incorporation de nuclotides par la
polymrase, la squence peut tre lue en temps rel. En ralit, le taux de squenage est limite
par le cycle dajout successif des diffrents [14] Ion Torrent Systems Inc., le dveloppeur de la
technologie, affirme que chaque mesure de l'incorporation prend 4 secondes et chaque cycle
dure environ une heure, au cours duquel 100-200 nuclotides sont squences. [11] [15] Si les
puces semi-conductrices sont amliores, le nombre de lectures par puce (et donc par cycle)
devraient augmenter. [11]
Le cot d'acquisition d'un squenceur mdie par le pH de Ion Torrent Systems Inc. au moment
du lancement tait de $ 50,000 USD, l'exclusion du matriel de prparation d'chantillons et
un serveur pour l'analyse des donnes. [8] [11] [15] Le cot par cycle est galement
significativement plus faible que celle des autres procds de squenage automatis, environ
1 000 $. [8], [12]
LIMITATIONS
Si les rptitions d'homopolymre du mme nuclotide (par exemple GGGGG) sont prsents
sur le brin matrice (brin squencer) plusieurs nuclotides introduits sont incorpors et plus
d'ions d'hydrogne sont librs en un seul cycle. Cela se traduit par un changement de pH
suprieur et d'un signal lectronique proportionnellement plus grand. [11] Ceci est une
limitation du systme en ce qu 'il est difficile d'numrer les longues rptitions. Cette
limitation est partage par d'autres techniques qui dtectent additions nuclotidiques simples
tels que pyrosquenage [16] Les signaux gnrs partir d'un nombre lev de rptition sont
difficiles diffrencier des rptitions d'un nombre similaire mais diffrent. par exemple, les
homorepeats de longueur 7 sont difficiles diffrencier de ceux de la longueur 8.
Une autre limitation de ce systme est la longueur de lecture courte par rapport d'autres
mthodes de squenage de Sanger tels que le squenage de Sanger ou le pyrosquenage. De
plus longues lectures sont bnfiques pour l'assemblage de novo du gnome. Les sqeunceurs
Ion Torrent squenceurs semi-conducteurs produisent une longueur de lecture moyenne
d'environ 400 nuclotides par lecture. [3] [8] Le dbit est actuellement infrieur celui des
autres technologies haut dbit de squenage, bien que les dveloppeurs esprent changer
cela en augmentant la densit de la puce. [3]
77
REFERENCES
1. Bio-IT World, Davies, K. Powering Preventative Medicine. Bio-IT World 2011

2. GenomeWeb DNA Electronics Licenses IP to Ion Torrent. August 2010
3. Rusk, N. (2011). "Torrents of sequence". Nat Meth 8(1): 44-44.
4. Ion Torrent Official Webpage.
5. GenomeWeb Roche Partners with DNA Electronics to Help Migrate 454 Platform to Electrochemical
Detection. November 2010
6. Purushothaman, S, Toumazou, C, Ou, C-P Protons and single nucleotide polymorphism detection: a
simple use for the ion sensitive field effect transistor
7. Pennisi, E. (2010). "Semiconductors inspire new sequencing technologies". Science 327(5970): 1190.
8. Perkel, J., "Making contact with sequencing's fourth generation". Biotechniques, 2011.
9. Alberts B, Molecular Biology of the Cell. 5th Edition ed. 2008, New York: Garland Science.
10. Karow, J. (2009) Ion Torrent Patent App Suggests Sequencing Tech Using Chemical-Sensitive Field-
Effect Transistors. In Sequence.
11. Bio-IT World, Davies, K. Its Watson Meets Moore as Ion Torrent Introduces Semiconductor
Sequencing. Bio-IT World 2010.
12. Karow, J. (2009) At AGBT, Ion Torrent Customers Provide First Feedback; Life Tech Outlines
Platform's Growth. In Sequence.
13. Eid, J., et al., "Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules". Science, 2009.
323(5910): p. 133-8.
14. Karow, J. (2010) Ion Torrent Systems Presents $50,000 Electronic Sequencer at AGBT. In Sequence.
15. Metzker, M.L., "Emerging technologies in DNA sequencing". Genome Res, 2005. 15(12): p. 1767-76.
16. Pollack, A., Taking DNA Sequencing to the Masses, in New York Times. 2011: New York.
17. Chiosea, SI; Williams, L; Griffith, CC; Thompson, LD; Weinreb, I; Bauman, JE; Luvison, A; Roy, S;
Seethala, RR; Nikiforova, MN (June 2015). "Molecular characterization of apocrine salivary duct
carcinoma.". The American journal of surgical pathology 39 (6): 74452. PMID 25723113.
78

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Post-Graduation

Figure 1. Schma du rsultat de llectrophorse en gel dagarose dADN extrait. A gauche un

Figure 2. Electrophorse dADN plasmidique

La loi de Beer-Lambert peut s'exprimer ainsi :

est la transmittance de la solution (sans unit).

LE PHNOMNE DE RESTRICTION MODIFICATION.

Enzyme Source Sequence reconnue Coupure Extrmits (aprs coupure)

Les digestions enzymatiques se font gnralement dans un microtube mis au bain-marie

En 1983, un processus simple dans le concept damplification du nombre de fragments dADN

ELECTROPHORESE EN GEL DAGAROSE

Figure 5. Cuve dlectrophorse remplie de tampon et

prparation aise, rapide, et peu coteuse des gels d'agarose

FACTEURS AFFECTANT LA MIGRATION

On utilise gnralement un gel de 1 3 % m/V (1 3 g d'agarose pour 100 ml de volume final) en

Lagarose est un polymre de galactose et de 3,6-anhydro-L-galactopyranose.

Figure 6. Structure de lagarose

Exemple pour un mini-gel de 50 ml destin sparer des fragments de 2 6 kb

Prparer le moule et le peigne appropris au nombre et au volume des chantillons sparer.

La mthode de rvlation la plus utilise est la rvlation au bromure d'thidium ou BET. Le

1. chelle de marqueur de poids

Figure 9. Cacul du poids molculaire des fragments spars par lectrophorse

Figure 9. Le Bioanalyseur Agilent 2100

Figure 10a. Cassettes utilises dans le

Figure 10b. mcanisme de la dtection

LES PUCES A ADN

Figure 13. La PCR-FSA.

Image d'une hybridation sur une puce ADN

LA PCR EN TEMPS REEL

Pour la dtection de lamplicon, on peut utiliser un marquage non spcifique ou spcifique. Le

Figure 18 : Fonctionnement dune sonde Taqman. A : La sonde est marque par un

Figure 19 : Principe du FRET : A :

Amplicon ADN ou ARN (NASBA) Figure 20 : Principe de

A ct de la PCR, se sont dveloppes ces dernires annes des techniques alternatives

STRAND DISPLACEMENT AMPLIFICATION OU SDA

La technique de Strand displacement amplification (SDA) repose sur une ADN

Figure 22. Dtection du produit de SDA en temps rel

Un aperu de la dtection de la fluorescence FRET qui dr produit au cours de la SDA est

NUCLEIC ACID SEQUENCE-BASED AMPLIFICATION OU NASBA

Ce mcanisme ncessite 2 amorces et 3 enzymes.

LES AVANTAGES DE LA NASBA

Etape 1. Mlanger tous les ingrdients

Etape 2. Le Primer 1 se lie et la RT se lie lextrmit 3 du primer. Notons que le primer

Etape 4. Le primer #2 se lie au cDNA, et la RT commence la synthse du second brin du

Etape 5. La RT synthtise le second brin du cDNA incluant le promoteur de lextension du

Maintenant, lARN polymrase est capable de se lier son promoteur et commence la

Etape 6. LARN polymrase se lie la squence promotrice de lADN double brin.

Ltape 8. La transcription se droule de 100 - 1000 fois pour amplifier la molcule de

En fin de compte, les matrices d'ARN nouvellement synthtises servent de matriaux de

Structure de lester dacridinium

Figure 26. Le principe de lHDA

OPTIMALISATION DES CONDITIONS DU LAMP

Figure 30. Formation dun prcipit ( gauche) lors de la raction de LAMP

Figure 31. Dtection du produit damplification LAMP en colorimtrie

On peut ajouter la raction du Sybrgreen (figure 32) qui fluoresce quand il

1) 10 000 000 copies/tube

Les techniques de squenage de lADN ont t dveloppes pour pouvoir connatre

Le squenage de l'ADN consiste dterminer l'ordre d'enchanement des nuclotides pour

Au cours des 25 dernires annes, la mthode de Sanger a t largement dveloppe grce

la mise au point de vecteurs de squenage adapts, comme le phage M13 dvelopp

METHODE DE MAXAM ET GILBERT

Ces didsoxyribonuclotides agissent comme des poisons terminateurs de chane : une

Figure 36a. Structure du

Figure 36b. Mcanisme de

SEQUENAGE DE GENOME ENTIER