Abstracto

Fondo

El Plasmodium falciparum multirresistencia 1 transportador, pfmdr1,

contiene cinco polimorfismos de aminocidos que se sugiere que participen
en el transporte de drogas alterada de citosol del parsito en la vacuola
digestiva (DV). Transporte de un sustrato a otro compartimento intracelular
influye en la disponibilidad del frmaco en su sitio de accin, por lo tanto
haciendo que el parsito ms susceptible o resistente a un frmaco. Fluo-4
es un sustrato fluorescente conocido que puede ser utilizado como una
herramienta molecular para investigar la dinmica de transporte de pfmdr1
en muchas cepas de parsitos.

mtodos

Seis cepas de P. falciparum con diferentes mutaciones pfmdr1 se cargaron

con Fluo-4 PM. La acumulacin del fluorforo en el DV se midi utilizando
microscopa confocal. El papel de un aminocido mutacin clave se verific
utilizando parsito clones seleccionados con mutaciones puntuales en
pfmdr1 aminocido posicin de 1042. Igualdad de expresin de pfmdr1 fue
confirmada por Western blot.

resultados

Fluo-4 fue transportado por pfmdr1 en el DV de la mayora de los parsitos

sensibles a frmacos y resistentes. Asparagina en la posicin del
aminocido pfmdr1 1042 fue crucial para el transporte de Fluo-4, mientras
que la sustitucin N1042D aboli el transporte Fluo-4. Se llevaron a cabo
estudios de competicin de Fluo-4 con cloroquina, quinina y mefloquina
sobre los parsitos que albergan asparagina en la posicin 1042. Un Fluo-4
patrn de inhibicin del transporte distinto para cada medicamento contra
la malaria prueba se observ en cepas de parsitos de diferentes
antecedentes genticos.

Conclusin

Este estudio demuestra que Fluo-4 se puede utilizar para investigar pfmdr1
dinmica de transporte en ambos parsitos sensibles a frmacos y
resistentes a. Adems, la evidencia directa de transporte alterado Fluo-4 en
pfmdr1 est vinculado a una nica mutacin de aminocidos en el bolsillo
de unin al sustrato. Este sistema ofrece una gran herramienta para
investigar el papel del transporte sustrato por pfmdr1 y las mutaciones
necesarias para apoyar el transporte, lo que llevara a nuevas perspectivas
para el desarrollo de nuevos frmacos contra la malaria.

material complementario electrnico

La versin en lnea de este artculo (doi: 10.1186 / s12936-015-0791-3)

contiene material complementario, que est disponible para los usuarios
autorizados.

Palabras clave: Plasmodium falciparum, la malaria, Fluo-4, medicamentos

contra la malaria, la cloroquina, mefloquina, quinina, vacuola digestiva,
Transporte
Ir:
Fondo
resistencia a los medicamentos antipaldicos de uso comn que emerge es
un importante revs en la lucha contra la malaria en todo el mundo [1]. La
comprensin de los mecanismos moleculares de resistencia a los
medicamentos es de gran importancia en los esfuerzos en curso para
controlar esta enfermedad.

Al principio, los investigadores encontraron una correlacin entre la

resistencia contra la malaria y el Plasmodium falciparum multirresistencia 1
transportador (pfmdr1) [2, 3]. Pfmdr1 es un homlogo de la glicoprotena P
(Pgh1) y pertenece a la superfamilia de transportadores ATP casete de unin
(ABC). Es una protena 162 kDa con dos dominios de unin de nucletidos
(NBD) y doce dominios transmembrana (TMDS), con un substrato putativo
bolsillo de unin en TMD11 [4]. El transportador se encuentra en la
membrana de la vacuola digestivo (DV) [5], el transporte de sustratos de
citoplasma del parsito en el DV [6].

Hay dos factores que se han propuesto para desempear un papel en la

alteracin de sensibilidad a los medicamentos especficos para
medicamentos contra la malaria: polimorfismos pfmdr1 y duplicaciones de
genes pfmdr1. La resistencia se ha asociado con una o ms variaciones en
cinco posiciones de aminocidos en el transportador, con pfmdr1 de tipo
salvaje pfmdr1 que contiene los aminocidos N86, Y184, S1034, N1042,
D1246. El aumento de pfmdr1 nmero de copias se han vinculado a la
mefloquina (MQ), lumefantrina (LF), halofantrina (HF), la quinina (QN) y la
artemisinina (AS) Resistencia [7-9], mientras que las mutaciones de
aminocidos pfmdr1 S1034C, N1042D, eran D1246Y encontrado para
mejorar la susceptibilidad del parsito a MQ, HF y AS, independiente del
nmero de copias de genes [2, 10].
Pruebas adicionales para el transporte del frmaco alterada en de tipo
salvaje frente a mutante pfmdr1 se muestra a travs de la expresin de
diferentes variantes pfmdr1 en oocitos de Xenopus laevis. De tipo salvaje
pfmdr1 transportado QN y la cloroquina (CQ), pero no HF, mientras que el
mutante pfmdr1 transportado HF pero no QN o CQ [11]. Adems, los
residuos 184 altera la cintica de transporte independientes de la unin de
drogas especificidad [12].

modelos computacionales de pfmdr1 describen un bolsillo de unin al

sustrato, que incluye los residuos de aminocidos 1034 y 1042 [4, 13]. La
unin de varios medicamentos contra la malaria se investig el uso de
simulaciones de acoplamiento dentro del bolsillo de unin al sustrato
pfmdr1. Entre los frmacos probados, MQ era el nico candidato cuya
capacidad de formar un enlace de H con residuos de 1042 fue abolido por
completo a travs de la sustitucin N1042D [13].

Aparte de transporte de frmacos contra la malaria, se demostr que varias

variantes resistentes a los frmacos pfmdr1 podran transportar el sustrato
fluorescente Fluo-4 en el DV del parsito [6]. Por el contrario, el transporte
Fluo-4 fue abolida en HB3 parsitos sensibles a los medicamentos que
albergan la variante pfmdr1 N86, F184, S1034, D1042, D1246. En un
documento de seguimiento, se determin la velocidad de la bomba de
pfmdr1 (F / Y86, Y184, S1034, N1042, D1246) para los parsitos Dd2
utilizando imgenes de clulas vivas de los eritrocitos infectados intactas
[14].

En este estudio, resistentes a las cepas de P. falciparum de diferentes

antecedentes genticos y diversos polimorfismos pfmdr1 sensible a los
frmacos y se utilizaron para investigar las mutaciones esenciales
necesarios para el transporte de Fluo-4. Adems, se analizaron clones de P.
falciparum que albergan una sola mutacin en la posicin 1.042. Se
encontr que el cido asprtico en la posicin 1042 de abolir el transporte
Fluo-4 en el DV. Esto podra ser restaurada mediante la sustitucin de cido
asprtico en la posicin 1042 con asparagina. Adems, la sustitucin
N1042D produjo un aumento de la sensibilidad a MQ. El uso de Fluo-4 como
un sustrato competitivo ofrece una herramienta poderosa para investigar el
papel de pfmdr1 en el transporte de medicamentos contra la malaria que
actualmente se utilizan para los parsitos, tanto sensibles a frmacos y
resistentes.

Ir:
mtodos
Cepas y condiciones de cultivo de parsitos
Tres CQ-sensible (CQS) (3D7, D10, HB3) y tres CQ-resistente (CQR) (Dd2,
FCR3, FCB) cepas de P. falciparum, as como transfectadas de forma estable
clones de P. falciparum, derivadas de las lneas parentales GC03 y 3BA6, se
utilizaron en este estudio. Las dos cepas GC03 y 3BA6 son la progenie del
cruce gentico HB3 Dd2 [15] y el puerto de la variante de pfmdr1 HB3
pero difieren en su fenotipo y el genotipo PfCRT (Tabla 1). pfmdr1 mutantes
derivados de GC03 y 3BA6 fueron producidos por Sidhu y colegas a travs
de la sustitucin de genes pfmdr1 parcial que sustituy el cido asprtico en
la posicin 1042 con asparagina, dejando los residuos de aminocidos en
1034 y 1246 sin cambios. Los clones resultantes fueron: SNDGC03 (S1034,
N1042, D1246 en un fondo gentico GC03), SND3BA6 (S1034, N1042,
D1246 en un fondo gentico 3BA6), as como el control de SDDGC03
recombinante y SDD3BA6 [10]. Todas las cepas se cultivaron de forma
continua, como se describe por Trager y Jensen [16], con modificaciones.
Brevemente, los parsitos se propagan a 5% de hematocrito en medio de
cultivo que contiene RPMI 1640 (Life Technologies, Burlington, ON, Canad)
suplementado con HEPES 25 mM, 2 mM L-glutamina, gentamicina (20 mg /
ml) (Life Technologies, Burlington, ON, Canad), 100 mM de hipoxantina
(Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canad), 0,5% Albumax I (Life Technologies,
Burlington, ON, Canad). Los parsitos se mantuvieron a 37 C con una
atmsfera de 5% de CO2, 3% de O2 y 92% de N2. glbulos rojos A + se
obtuvieron del Banco de Sangre de un estado a otro (Memphis, TN, EE.UU.).
frotis de sangre teidos con Giemsa se prepararon diariamente para
controlar el crecimiento del parsito. Para la sincronizacin, los parsitos se
trataron con 5% d-sorbitol (Bioshop Canad, Burlington, ON, Canad)
durante 10 min a 37 C; sorbitol se retir y los parsitos se lavaron una vez
antes de ponerlos de nuevo en la cultura. Para obtener cultivos de parsitos
altamente sncronos, se repiti el tratamiento de sorbitol despus de 6-8 h.

tabla 1
tabla 1
mutaciones principal PfCRT y pfmdr1 de parsitos Plasmodium falciparum
utilizaron en este estudio
aislamiento del ADN y anlisis de la secuencia

La secuencia de longitud completa de la secuencia pfmdr1 y parcial de pfcrt

fue verificada para todas las cepas. cepas de parsitos se cultivaron a 5%
de parasitemia y el ADN se extrajo usando el kit de ADN QIAamp Blood Mini
(Qiagen, Toronto, ON, Canad) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. ADN se amplific en la superposicin de las fracciones de PCR
usando ADN polimerasa HotStarTaq (Qiagen, Toronto, ON, Canad). Para
tener en cuenta el contenido de nucletidos rica en AT en el genoma de P.
falciparum, dNTPs (Invitrogen Canad, Burlington, ON, Canad) se
mezclaron a 75% a 25% y GC. Para la optimizacin de PCR, MgCl2 2 mM,
300 mM dNTPs y 300 nM primers se utilizaron para la reaccin. Para cada
mezcla de reaccin, se utiliz ADN genmico 20 ng. Las reacciones de PCR
consistieron en una etapa de activacin inicial de 94 C durante 3 min,
seguido de 35 ciclos de 94 C durante 60 s, 49 a 61 C (ajustado para cada
par de cebadores) durante 30 s, y 72 C durante 1 min. Los cebadores
usados para la secuenciacin de genes pfmdr1 se describen en [14]
pfmdr1 sequence analysis
The full length sequence of pfmdr1 was verified in our laboratory HB3 and
Dd2 strains. Parasite strains were grown to 5% parasitaemia and DNA
extracted using the QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen Inc., Toronto, ON,
Canada) according to the manufacturer's instructions. The DNA was
amplified in overlapping PCR fractions using HotStarTaq DNA polymerase
(Qiagen Inc.). To account for the AT-rich nucleotide content in the P.
falciparum genome, dNTPs (Invitrogen Canada Inc., Burlington, ON, Canada)
were mixed at 75% AT and 25% GC. For PCR optimization, 2 mM MgCl2, 300
M dNTPs and 300 nM primers were used for the reaction. For each reaction
mix, a total of 20 ng genomic DNA was used. PCR reactions consisted of an
initial activation step of 94C for 3 min. followed by 35 cycles of 94C for 60
sec., 4961C (adjusted for each primer pair) for 30 sec. and 72C for 1 min.
Primers used for pfmdr1 gene sequencing were: pfmdr1.1_F: 5-AT
ATATGTGTACATAGCTTATTTCA, pfmdr1.1_R: 5-TTGTACTAAACCTATAGA
TACTAATGA, pfmdr1.2_F: 5-GTTTAAATGTTTACCTGCACAACATAGAAAA,
pfmdr1.2_R: 5-CTCCACAATAACTTGCAACAGTTCTTA, pfmdr1.3_F: 5-
ATGCACGTTTGACTTTATGTATTAC, pfmdr1.3_R: 5-
GGATCTTGACTAACAACTCCAA, pfmdr1.4_F: 5-
CTTTATGATCCAACCGAAGGAGATA, pfmdr1.4_R: 5-
GTTATCCGATCCATTATCATTTCCA, pfmdr1.5_F: 5-
ACAAGGTACACATGATAGTCTTATGA, pfmdr1.5_R: 5-
GGATTTCATAAAGTCATCAACTAATATAG, pfmdr1.6_F: 5-
CTGTAATTTGATAGAAAAAGCTATTGATTA, pfmdr1.6_R: 5-
CCATATGGTCCAACATTTGTATC, pfmdr1.7_F: 5-
CAATAGTTAGTCAAGAACCCATGTTA, pfmdr1.7_R: 5-
TCAATATAACGGACAAGAGTTGATAC, pfmdr1.7.1_F: 5-
ACCAATCTGGATCTGCAGAAGA, pfmdr1.7.1_R: 5-
TCTCAGAATTGGAATCAAGTGATGA. If DNA amplification using pfmdr1.7
primers was unsuccessful, the PCR was repeated with the alternative
primers pfmdr1.7.1. Samples were sent for sequencing to Genome Quebec,
Canada and analysed using the BioEdit software. Los cebadores utilizados
para la secuenciacin de la regin del gen pfcrt que contiene los principales
sitios de mutacin fueron: pfcrt_F: 5'-GGAGGTTCTTGTCTTGGTAAATG, pfcrt_R:
5'-TGGTAGGTGGAATAGATTCTCTTATAAA. Las muestras fueron enviadas para
la secuenciacin del genoma de Quebec, Canad y analizados utilizando el
software Bioedit [17].

expresin de protenas

Para determinar los niveles de protena pfmdr1, 20 g de protena de clulas

enteras lisados se cargaron en cada carril de un gel de acrilamida 8% que
contiene SDS. Las protenas se transfirieron a una membrana de PVDF, que
despus se bloque O / N a 4 C con 5% de leche (w / v) y 0,05% de Tween-
20 (ACP Chemicals, St-Leonard, QC, Canad) en fosfato tamponada de
solucin salina (PBS). La membrana se incub con la dilucin adecuada de
primaria anti-pfmdr1 (amablemente proporcionado por el profesor Cowman,
Walter y Eliza Hall Institute, VIC, Australia) o anti-PfHSP70 (Genway Biotech,
San Diego, CA, EE.UU.) anticuerpo (1: 2.000) en PBS-T + 5% de leche
durante 1 h (RT), despus se lav y se incub con HRP-conjugado anti-IgG
de conejo secundaria de anticuerpos (Abcam, Toronto, ON, Canad) (1:
20.000) durante 1 h (RT ). Las bandas inmunorreactivas se detectaron con
ImmunStar WesternC quimioluminiscente Kit (Bio-Rad Laboratories,
Mississauga, ON, Canad) usando un myECL Imager (Thermo Scientific,
Burlington, ON, Canad). Para confirmar la igualdad de protenas de carga,
la intensidad de la quimioluminiscencia de los pfmdr1 se calcularon para
cada clon parsito con relacin a la respectiva quimioluminiscencia PfHSP70
usando ImageJ 1.47q (Institutos Nacionales de Salud, EE.UU.).

ensayo de inhibicin de crecimiento

ensayos de inhibicin de crecimiento se realizaron como se describe

anteriormente [18], con modificaciones. Brevemente, parsitos en fase de
anillo sincronizados se diluyeron hasta una parasitemia final de 0,5% y un
hematocrito de 2%. Se prepar un total de 100 l de medio de cultivo por
pocillo en una placa de ensayo de 96 pocillos, con una serie de diluciones de
frmaco de 1: 3, que van desde 1 mM a 0,15 nM. Las placas se incubaron a
37 C, 5% de CO2, 3% de O2 y 92% de N2 durante 72 h, a continuacin,
congelados y almacenados a -80 C. Las placas se descongelaron a
temperatura ambiente y 100 l 2 x tampn de lisis (20 mM Tris pH 7,5, EDTA
5 mM, 0,008% de saponina, 0,08% de Triton X-100, 0,2 l de SYBR Green I /
ml) se aadi a cada pocillo. Las placas se incubaron en la oscuridad
durante al menos 1 h. La intensidad de fluorescencia se determin usando
un lector de placas de Synergy H4 (Fisher Scientific, Nepean, ON, Canad)
con 485 nm de excitacin y 520 nm de emisin longitudes de onda. Los
valores de IC50 se determinaron mediante curvas de respuesta a la
concentracin de instalacin con un procedimiento de medida para IGOR Pro
6.2 basada en un guin R amablemente proporcionados por Le Nagard [19,
20].

imgenes de clulas vivas

parsitos en fase de trofozoto sincronizados se cargaron con 5 mM de Fluo-

4 de AM (Life Technologies, Burlington, ON, Canad) en solucin de Ringer
(mM NaCl 122,5, KCl mM 5,4, CaCl2 1,2 mM, MgCl2 0,8 mM, 11 mM de D-
glucosa, 10 HEPES mM, NaH2PO4 1, pH 7,4) durante 50 min a 37 C. Las
clulas fueron lavadas dos veces con solucin de Ringer y se transfirieron a
una cmara de microscopio. Los parsitos se mantuvieron a 37 C durante
la microscopa utilizando una incubadora de etapa superior (Hit Tokai,
Shizuoka-ken, Japn). Una serie de cuatro imgenes por parsito fue tomada
utilizando un microscopio confocal Zeiss LSM710 (Carl Zeiss, Oberkochen,
Alemania) equipado con un objetivo corregido-agua (C-Apocromtico 63 /
1,20 W Korr M27) y un lser de 488 nm (12,5 mW , 2% de intensidad). La
gama de fluorescencia emitida se midi 493-622 nm. Las imgenes fueron
analizadas usando ImageJ 1.47q (Institutos Nacionales de Salud, EE.UU.).

Ir:
Resultados y discusin
Pfmdr1 transporta Fluo-4 en la vacuola digestiva

Un ligamiento gentico entre Fluo-4 acumulacin en el DV y el transportador

pfmdr1 fue descrito previamente [6]. Aunque se observaron variaciones en
Fluo-4 acumulacin entre cepas de parsitos que albergan mutaciones
diferentes pfmdr1, la mutacin (s) de aminocidos responsable del
transporte de Fluo-4 queda por determinar. Para identificar la mutacin
pfmdr1 (s) crucial para el transporte de Fluo-4, varias cepas sensibles a
frmacos y resistentes a P. falciparum de diferentes orgenes genticos
fueron probados para la acumulacin de Fluo-4 en el DV. Se seleccionaron
tres CQS y CQR tres cepas que albergan mutaciones diferentes pfmdr1 para
estos experimentos (Tabla 1). Mientras pfmdr1 se ha sugerido que
desempear un papel en la resistencia CQ, el indicador gentico clave para
CQS frente a parsitos CQR se atribuye a la K76T mutacin de aminocidos
en el transportador de P. falciparum resistente a la cloroquina (PfCRT) [21].
Esta mutacin fue tomada en consideracin en este estudio y la relevancia
de los polimorfismos pfmdr1 se discute para las cepas que albergan ya sea
lisina (K76) o treonina (K76T) en PfCRT.

De los cinco sitios de mutacin en pfmdr1 sabe que juega un papel en la

resistencia a los medicamentos, las cepas de parsitos utilizados para estos
experimentos contenan mutaciones en las posiciones de aminocido 86,
184 y 1042, que se encuentran principalmente en los aislados asiticos [7
africano y, 22-24 ]. Para determinar si las mutaciones en estos residuos
influyen en el transporte de Fluo-4 a travs de pfmdr1, la acumulacin de
Fluo-4 en el DV se midi en parsitos vivos utilizando microscopa confocal.
Todas las cepas de parsitos, excepto HB3, mostraron alta acumulacin de
Fluo-4 en el DV (Figura 1a, b). Fluo-4 acumulacin en el DV fue impedida por
pre-incubacin de los parsitos con tariquidar (TQ) (Figura 1b), un inhibidor
especfico de los transportadores de Pgp [25]. Es importante destacar que,
Fluo-4 acumulacin en el DV se demostr que era independiente de la
mutacin PfCRT K76T, lo que sugiere que la mutacin PfCRT solo no tiene
ningn efecto Fluo-4 de acumulacin.

Figura 1
Figura 1
Fluo-4 de fluorescencia en los parsitos P. falciparum. Los parsitos se
incubaron con 5 M Fluo-4. unas imgenes representativas de los eritrocitos
infectados por P. falciparum. La barra de escala 5 micras. b Proporcin de
media de fluorescencia Fluo-4 (DV / citosol) SEM. ...
transporte fluo-4 se asocia con pfmdr1 N1042

El HB3 cepa del parsito, que no se acumula Fluo-4 en el DV, alberga dos
polimorfismos de Y184F y pfmdr1 N1042D-no se encuentra en las otras
cepas de P. falciparum ensayadas (Tabla 1), lo que sugiere que uno de estos
dos residuos es responsable de la alteracin del transporte de Fluo-4 visto
en los parsitos HB3. Previamente se ha demostrado para el homlogo
humano de pfmdr1 que la mutacin Y184F no influye en la especificidad de
drogas [12]. Adems, este residuo aument slo ligeramente la resistencia a
frmacos en comparacin con otros sitios de mutacin pfmdr1 [4]. Por el
contrario, la posicin de aminocido 1042 se cree que es parte de las
interacciones de bolsillo y forma electrosttica con amodiaquina, CQ, MQ
(slo en presencia de asparagina), HF, vinblastina y vincristina [4, 10, 13] de
unin a transportador. Por lo tanto, el papel de las mutaciones pfmdr1 en la
posicin 1042 se investig con ms detalle.

Para comprobar la influencia de PfCRT en el transporte de Fluo-4, fueron

seleccionados y compara parsito clones que contenan lisina o treonina en
el residuo 76 en PfCRT existente. Para esto, transfectadas de forma estable
clones de P. falciparum derivados de las lneas parentales se utilizaron GC03
y GC03 3BA6, donde alberga el genotipo K76 PfCRT y es CQ sensible, y 3BA6
contiene la mutacin PfCRT K76T que confiere resistencia CQ (Tabla 1).
Tanto GC03 y 3BA6 contienen la secuencia pfmdr1 N86, F184, S1034,
D1042, D1246, idntica a la cepa HB3. Los experimentos verifican que ni
GC03 ni 3BA6 fueron capaces de acumular Fluo-4 en el DV, como se
esperaba (figura 2a, b).

Figura 2
Figura 2
Fluo-4 de fluorescencia en los clones de P. falciparum con diferentes
mutaciones pfmdr1 y PfCRT. Los parsitos se incubaron con 5 M Fluo-4 a.m.
en solucin de Ringer durante 50 minutos a 37 C, despus se lavaron con
Ringer ...
Como control, los clones parsito SDDGC03 y SDD3BA6, que alberga la
misma mutacin que GC03 y 3BA6, revel que la mutacin pfmdr1 N1042D
no transport Fluo-4 en el DV (figura 2a, b). transporte Fluo-4 solamente se
estableci con la introduccin de asparagina en el residuo 1042 para ambos
clones (SNDGC03 y SND3BA6). El transporte era independiente de la
mutacin PfCRT K76T, ya que el transporte de Fluo-4 se vea afectada por
igual en GC03 y 3BA6 lneas parentales, as como los controles y SDDGC03
SDD3BA6, y slo se ve en los clones SNDGC03 y SND3BA6 (Figura 2a, b).
especificidad de transporte para pfmdr1 en los clones SNDGC03 y SND3BA6
se confirm a travs de pre-incubacin de las muestras con el TQ inhibidor
de Pgp (Figura 2b; archivo adicional 1: Figura S1). Estos resultados indican
un papel fundamental para la asparagina en la pfmdr1 residuo 1042 en el
transporte de Fluo-4, independiente de PfCRT.

Adems de los polimorfismos pfmdr1, aumento del nmero de copias del

gen pfmdr1 [8, 9, 26] y los niveles de expresin de protenas tambin se ha
sugerido que desempear un papel en la resistencia a frmacos o la
susceptibilidad. Para verificar que Fluo-4 acumulacin en el DV de clones
SNDGC03 y SND3BA6 no estaba vinculado a una mayor expresin pfmdr1,
se analizaron los niveles de protena pfmdr1 de estos clones parsito (Figura
2C). No se detect ningn aumento significativo en la expresin pfmdr1
para el GC03 y 3BA6 lneas parentales o sus clones que albergan la
sustitucin D1042N (p> 0,05). Por lo tanto, Fluo-4 acumulacin en el DV de
estos clones se halla asociada con la mutacin en el residuo pfmdr1 1042.

Efecto del polimorfismo N1042D de sensibilidad a los medicamentos

Dado que el transporte de Fluo-4 era dependiente de polimorfismos

especficos pfmdr1, se deduce que la sustitucin N1042D en el bolsillo
pfmdr1 sustrato de unin no slo puede alterar el transporte de unin y de
Fluo-4, sino tambin influir en otros sustratos, tales como frmacos contra la
malaria . Para determinar si la sustitucin de aminocido en el residuo 1042
result en sensibilidad a los frmacos alterada o resistencia de los clones de
parsitos, se llevaron a cabo ensayos de inhibicin de crecimiento. Un
cambio en la IC50 de un frmaco dado indicara un papel para la posicin
pfmdr1 amino cido 1042 en su transporte. valores CQ IC50 para clones
CQS se encontr que eran 47 2,6 nM para GC03, 46 2,2 nM para
SDDGC03 y 49 2,8 nM para SNDGC03, mientras que los valores CQ IC50
para clones CQR eran 262 5,7 nM para 3BA6, 204 9,4 nM para
SDD3BA6 y 274 5,6 nM para SND3BA6 (Tabla 2). Esto sugiere que una
mutacin de aminocido en pfmdr1 residuo 1042 no afecta a la
susceptibilidad o resistencia a CQ. resistencia CQ podra invertirse en el CQR
cepas a travs de la adicin de 1 verapamil mu M, mientras que no se
observ ninguna diferencia significativa en las cepas CQS (p> 0,05), como
se esperaba. Del mismo modo, los clones CQS eran ms susceptibles a la
quinacrina (QC) con valores de CI50 de 11 0,3 nM para GC03, 13 0,3 nM
para SDDGC03 y 14 0,4 nM para SNDGC03 en comparacin con los
valores ms altos de control de calidad de CI50 de 43 3,4 nM para 3BA6 ,
41 1,0 nM para SDD3BA6 y 42 2,3 nM para SND3BA6. Aqu de nuevo,
como para CQ, una mutacin de aminocido en pfmdr1 residuo 1042 no
afect a la susceptibilidad o resistencia a QC. Lo mismo se encontr para la
dihidroartemisinina (DHA). clones CQS eran cuatro veces ms resistente que
clones CQR (4 0,1 vs 1 0,1 nM) y la resistencia DHA no fue reversible
por la adicin de 1 M verapamil. Por lo tanto, la mutacin pfmdr1 N1042D s
sola no parece ser un factor determinante para el CQ, control de calidad o
resistencia DHA en estos parsitos (Tabla 2).

Tabla 2
Tabla 2
valores de IC50 de los parsitos Plasmodium falciparum usados en este
estudio
Curiosamente, la mutacin N1042D proporcion los cambios en la
sensibilidad a los medicamentos para el QN medicamentos contra la malaria
y MQ. Se observ una disminucin significativa en los valores QN de IC50 en
el GC03 y 3BA6 derivados de clones SNDGC03 y SND3BA6 en comparacin
con las lneas parentales GC03 y 3BA6 o sus controles SDDGC03 y SDD3BA6
recombinante (p <0,005) (Tabla 2), que est de acuerdo con los resultados
anteriores [10]. Se observ el efecto opuesto para MQ. Para el SNDGC03
clones y SND3BA6clones, la sustitucin D1042N condujo a un aumento de
tres veces en la resistencia a aproximada MQ. los valores de IC50 MQ
aumentaron de 6 0,9 nM en GC03 a 19 0,6 nM en SNDGC03, y de 5
0,3 nM en 3BA6 a 14 0,5 nM en SND3BA6. Este fue un aumento
significativo en los valores de IC50 para la MQ clones SNDGC03 y SND3BA6
en comparacin con las lneas parentales (p = 0,0003 para GC03 vs
SNDGC03; p = 0,0001 para 3BA6 vs SND3BA6). Incrementos similares en la
resistencia MQ (aproximadamente tres veces) se han encontrado en los
aislamientos de campo de frica y Asia [27, 28]. Un aumento de tres veces
en la resistencia MQ tambin fue confirmada in vitro a travs de intercambio
de alelos pfmdr1 [2]. Por lo tanto, es probable que desempee un papel en
el aumento de la resistencia MQ en el campo de la mutacin pfmdr1 crucial
para la resistencia MQ in vitro. Sin embargo, los experimentos de inhibicin
del crecimiento no dilucidar plenamente el transporte alterado de MQ
pfmdr1. Por esta razn, la co-incubacin de medicamentos contra la malaria
con Fluo-4 puede arrojar nueva luz sobre el papel del transporte en pfmdr1
resistencia a los medicamentos.

competicin por el sustrato de medicamentos contra la malaria con Fluo-4

para determinar el transporte de frmacos por pfmdr1

Pfmdr1 est implicado en el transporte de sustratos, incluyendo varios

medicamentos contra la malaria, desde el citosol a la DV [10, 11], pero el
papel de los polimorfismos pfmdr1 en resistencia a los medicamentos no se
entiende completamente. Las mutaciones en el residuo 86 ha sido sugerido
para influir alostrica del sitio de unin de drogas TMD11 [4], mientras que
los residuos pfmdr1 1034 y 1042 se encuentran en un bolsillo de unin
propuesto. interacciones electrostticas con tanto asparagina y cido
asprtico en la posicin 1042 se ha demostrado in silico para CQ, QN y MQ
[4, 13]. Mientras que CQ fue incapaz de formar un hidrgeno (H) -bond con
asparagina o cido asprtico en el residuo 1042, asparagina en el residuo
1042 fue capaz de formar un enlace de H con MQ [4, 13]. No existe
informacin disponible sobre la formacin del enlace de H QN con residuos
de 1042.

Una mayor comprensin de la importancia de pfmdr1 en el transporte del

frmaco se puede lograr a travs de estudios de competicin utilizando dos
sustratos potencialmente competitivos, cantidades por ejemplo, fijos de
Fluo-4 y concentraciones crecientes de la droga. Para este propsito, dos
cepas de parsitos fueron elegidos para evaluar las diferencias potenciales
en el transporte de frmacos contra la malaria en los parsitos sensibles
(3D7) y resistentes (Dd2). 3D7 es sensible a CQ, QN y MQ (Tabla 2),
mientras que Dd2 es resistente a estos frmacos. HB3 no fue utilizado, ya
que no es capaz de transportar Fluo-4 en el DV. Los cambios medidos de
Fluo-4 acumulacin en el DV en presencia de los frmacos contra la malaria
se compararon para 3D7 y Dd2 parsitos.

Para 3D7 parsitos, aumentando la concentracin CQ condujo a la fuerte

disminucin de Fluo-4 acumulacin en el DV (Figura 3a). Mientras TQ es un
inhibidor no competitivo de MDR1 travs de la inhibicin de la actividad de
ATPasa [25], se cree que CQ para unirse al bolsillo de unin al sustrato del
transportador y es probable un inhibidor competitivo de Fluo-4. Pre-
incubacin de parsitos 3D7 con 250 nM CQ dio lugar a disminucin de la
acumulacin Fluo-4 en el DV, donde slo se midi 5 1,0% Fluo-4 de
fluorescencia en comparacin con los parsitos no tratados con el frmaco.
En parsitos Dd2, pre-incubacin con 250 nM CQ reduce Fluo-4
fluorescencia en el DV por medio (48 3,0%). MQ reduce transporte Fluo-4
en el DV a 45 2,0% en parsitos 3D7 y slo 82 6,0% en Dd2 parsitos
(Figura 3a). Para MQ, una disminucin en el transporte de Fluo-4 en
comparacin con 3D7 parsitos Dd2 no se puede atribuir a una mutacin de
aminocido en la posicin 1042 pfmdr1 solo desde ambas cepas puerto de
tipo salvaje N1042. Sin embargo, los parsitos Dd2 albergan una mutacin
de aminocido en pfmdr1 residuo 86, que se describi para influir en la
sensibilidad MQ en los aislados de campo de frica [24, 30, 31]. Esta
mutacin N86Y puede alterar el transporte de MQ por pfmdr1, como se
muestra en los experimentos presentados aqu. QN fue menos eficaz en la
reduccin de Fluo-4 acumulacin de CQ o MQ y slo disminuy Fluo-4
fluorescencia en el DV a 59 2,9% en los parsitos 3D7 y no de forma
significativa en los parsitos Dd2 (92 3,4%) (Figura 3a). Las diferencias
entre 3D7 y Dd2 parsitos en el nivel de reduccin de Fluo-4 pueden estar
vinculados a pfmdr1 residuo 86, que se sugiere para influir en la
susceptibilidad CQ [29]. Es concebible que N86Y puede influir alostrica del
sitio de unin de drogas en TMD11, como se sugiere en [4]. Residuo 86 no
fue examinado en este estudio.

figura 3
figura 3
La competencia del transporte de Fluo-4 con medicamentos contra la
malaria. una parsitos se pre-incubaron con diferentes concentraciones de
cloroquina (CQ), mefloquina (MQ) o quinina (QN), o se deja sin tratar antes
de la adicin de Fluo-4 a.m.. b Los parsitos se preincubaron ...
Fluo-4 competicin con medicamentos contra la malaria tambin se prob
en el SNDGC03 parsito clones y SND3BA6. El uso de una sola
concentracin de frmaco de 250 nM, Fluo-4 acumulacin se redujo en el DV
de SNDGC03 y SND3BA6 parsitos a 33 1,9% y 39 3,0% para el CQ, 61
3,1% y un 65 4,8% para MQ y 58 3,9% y un 91 4,4% para QN,
respectivamente. Casi todos los frmacos contra la malaria analizados
disminuyeron la acumulacin de Fluo-4 en el DV en ambos clones SNDGC03
y SND3BA6, a excepcin de QN (Figura 3b). De nuevo, esto sugiere que la
influencia de medicamentos contra la malaria en el transporte de sustrato
por pfmdr1 no slo depende de polimorfismos pfmdr1 sino tambin de los
antecedentes genticos variable de la cepa del parsito.

La influencia de la sustitucin N1042D en el transporte de Fluo-4 se explica

en un modelo propuesto (Figura 4). Fluo-4 est cargado negativamente y la
sustitucin de una asparagina neutral en el residuo 1042 con un cido
asprtico cargado negativamente altera el medio ambiente local, lo que es
menos favorable al transporte Fluo-4. TQ no influye Fluo-4 afinidad por el
sustrato vinculante de bolsillo, pero impide la hidrlisis de adenosina
trifosfato (ATP) de pfmdr1. Dado que ambos NBDs actan en concierto [32],
la inhibicin completa de la actividad ATPasa por TQ se puede lograr cuando
un sitio de unin a nucletidos es bloqueado.

Figura 4
Figura 4
Modelo de transporte de Fluo-4. El acoplamiento de sustratos en el bolsillo
de unin pfmdr1 est influenciado por el tamao, la carga y la polaridad de
aminocidos locales. Asparagina (N) y cido asprtico (D) son a la vez polar,
hidrfila y de pequeo volumen. Mientras que N es un ...
cintica de transporte detallados de cepas de parsitos de diferente origen
proporcionarn informacin adicional sobre el transporte de sustrato a
travs de pfmdr1. El uso de Fluo-4 como un sustrato competitivo elude la
cuestin del etiquetado directo de medicamentos contra la malaria con una
etiqueta fluorescente que puede alterar sus propiedades de transporte. Por
lo tanto, Fluo-4 es una poderosa herramienta para estudiar la cintica de
transporte de forma selectiva pfmdr1 en los eritrocitos infectados por P.
falciparum intactas.

Ir:
Conclusin
Este estudio proporciona evidencia directa para el transporte de sustrato
impulsado por pfmdr1 reducido a travs de la mutacin de un solo
aminocido N1042D, que se encuentra en el bolsillo de unin al sustrato. La
relevancia de esta mutacin de aminocidos puede haber sido subestimado
y necesita ms investigacin. Adems, ahora es posible probar mutaciones
adicionales dentro del bolsillo de unin de pfmdr1 para verificar su papel
potencial en el transporte de frmacos. En consecuencia, el uso de Fluo-4
en ensayos de competicin de drogas proporciona una poderosa
herramienta para examinar mejor la cintica de transporte de frmacos a
travs de pfmdr1. Esta informacin recin adquirida puede ayudar a
dilucidar el papel de pfmdr1 en el transporte de drogas, que se ha
mantenido controvertido durante dcadas. Por ejemplo, mientras que las
investigaciones anteriores han sugerido una relacin entre la resistencia MQ
y asparagina en la posicin pfmdr1 aminocido 86 en aislados procedentes
de Tailandia y frica Occidental [30, 33], otros han asociado de tipo salvaje
pfmdr1 y el aumento de nmero de copias de genes con resistencia MQ [ 3,
34]. publicaciones ms recientes han encontrado una fuerte evidencia de un
papel para el N1042 en la resistencia MQ en los aislados de Tailandia [35,
36], lo que sugiere que la importancia de esta mutacin se ha subestimado
en estudios de campo anteriores. La importancia de N1042 para la
resistencia MQ se demostr de manera similar in vitro a travs de
sustituciones de aminocidos combinados que generaron una cepa del
parsito que alberga las mutaciones S1024C, N1042D, D1246Y [2]. Esta
cepa recin generado era aproximadamente tres veces ms susceptibles a
la exposicin MQ comparacin con la cepa parental [2]. Los resultados
presentados aqu apoyan el papel potencial de la pfmdr1 N1042 en la
resistencia del parsito a MQ. Ms investigaciones ayudarn a esclarecer el
significado de este polimorfismo en el transporte de sustrato.

Ir:
Contribuciones de los autores
SJR y PR dise el estudio; SJR realiz experimentos y se cuantifica los
datos; SJR y PR escribi el manuscrito. Ambos autores leyeron y aprobaron
el manuscrito final.

Expresiones de gratitud

Este estudio fue apoyado en parte por becas del Servicio Alemn de
Intercambio Acadmico (DAAD) (SJR), la Beca Robert P. Harpur (SJR), el
Centro de Interaccin parsito-anfitrin (FRQNT) (SJR), y subvenciones del
Natural Ciencias e Ingeniera de Investigacin (NSERC) Descubrimiento
Grant (PR) y la Fundacin Canadiense para la Innovacin (CFI) Lderes
Opportunity Fund (PR).

El cumplimiento de las normas ticas

Conflicto de intereses Los autores declaran que no tienen intereses en
competencia.

la disposicin

archivo adicional 1: (122K, png)

Figura S1. La inhibicin del transporte de Fluo-4 a travs tariquidar. clones

de Plasmodium falciparum se pre-incubaron con 100 nM tariquidar durante
10 min a 37 C, a continuacin, se aadi 5 M Fluo-4 a.m. para 50 min.
Fluo-4 acumulacin en la vacuola digestivo fue disminuida. Los
experimentos se realizaron por triplicado en das diferentes. Estas imgenes
son suplementarios a los datos obtenidos para la Figura 2. La barra de
escala, 5 micras.
Google Traductor para empresas:Translator ToolkitTraductor de sitios
webGlobal Market Finder
Acerca de Google TraductorComunidadCelularesAcerca de GooglePrivacidad
y condicionesAyudaEnviar comentarios