Proposal Isolasi Metabolit Sekunder Dari

Fraksi N-heksan Pada Spons Aaptos Sp

Asal Pulau Randayan
Uploaded by Ardhi indie on Mar 20, 2009

BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Sejak tahun 1969 sampai 1999 lebih kurang 300 paten telah dihasilkan
dalam bidang marine natural products. Setiap tahun sekitar 100 senyawa yang
berhasil diinvestigasi. Sebagian besar senyawa aktif dari lingkungan laut diteliti
khasiatnya sebagai bahan antikanker (Proksch et al., 2002).
Spons dikenal sebagai organisme yang kaya dengan kandungan senyawa
bioaktif. Menurut Munro et al. (1999), spons merupakan biota laut yang paling
banyak diteliti kandungan senyawa bioaktifnya. Senyawa bioaktif dari spons
sangat beragam dan secara kimia memiliki struktur yang unik dan menarik untuk
dijadikan sebagai senyawa pemandu (lead compound) dalam sintesis obat-obat
baru. Hewan ini hidup dengan baik pada ekosistem terumbu karang dan tersebar
di beberapa pulau dalam wilayah perairan Kalimantan Barat seperti Pulau
Randayan.
Aaptos merupakan salah satu genus spons yang banyak diteliti kandungan
dan aktivitas senyawa bioaktifnya. Spons ini banyak mengandung senyawa
alkaloid yang memiliki aktivitas antitumor, antimikrobial, antivirus dan lain-lain.
Menurut Souza et al (2007), senyawa 4-metilaaptamin yang diisolasi dari spons
Aaptos aaptos dapat menghambat infeksi Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1).
Nakamura et al. (1987) menemukan 2 senyawa baru golongan alkaloid dari spons
Aaptos aaptos yang berasal dari perairan Okinawa yaitu dimetilaaptamin dan
dimetil(oksi) aaptamin yang memiliki aktivitas sitotoksik dan antimikrobial.
Laporan lain menyebutkan bahwa isoaaptamin dari Aaptos memiliki aktivitas
untuk mencegah infeksi Staphylococcus aureus dengan menghambat enzim

Copyright 2009. 1
Licensed by Ardhi. www.kimia-untan.com. admin@kimia-untan.com
sortase A (SrtA) (Jang et al., 2007). Namun, minimnya informasi, pengetahuan
dan hasil penelitian tentang metabolit sekunder dari fraksi n-heksana pada spons
Aaptos dari Kalimantan Barat menunjukkan bahwa hewan porifera ini kurang
dimanfaatkan sebagai objek penelitian. Hingga saat ini baru sebagian kecil spesies
spons di perairan Kalimantan Barat yang telah diidentifikasi.
1.2 Perumusan Masalah
Observasi awal yang dilakukan terhadap ekosistem terumbu karang di perairan
Kalimantan Barat menunjukkan bahwa di perairan ini banyak terdapat spesies
spons. Salah satu spesies spons yang ditemukan merupakan anggota genus
Aaptos. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada beberapa spesies spons dari
genus Aaptos mengandung metabolit sekunder dari golongan alkaloid yaitu
aaptamine dan aaptosin pada fraksi metanol (Proksch, 2005). Namun informasi,
pengetahuan dan hasil penelitian tentang kandungan metabolit sekunder dari
fraksi n-heksana pada spons genus Aaptos di perairan ini masih sangat terbatas.
Karena itu perlu dilakukan penelitian dengan mengisolasi metabolit sekunder dari
fraksi n-heksana pada spons genus Aaptos asal Perairan Kalimantan Barat.

1.3 Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan mengidentifikasi metabolit sekunder
dari fraksi n-heksana ( fraksi non polar ) pada spons Aaptos sp. pada asal perairan
Pulau Randayan Kalimantan Barat.

1.4 Manfaat
Hasil penelitian ini diharapkan dapat menjadi tambahan informasi mengenai
kandungan kimia spons Aaptos yang berasal dari perairan Pulau Randayan
Kalimantan Barat serta dapat memberikan sumbangan yang berarti pada
penelitian-penelitian selanjutnya.

Copyright 2009. 2
Licensed by Ardhi. www.kimia-untan.com. admin@kimia-untan.com
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tinjauan Umum Spons

Spons adalah biota multiseluler primitif yang bersifat filter feeder,
menghisap air dan bahan-bahan lain di sekelilingnya melalui pori-pori (ostia)
kemudian dialirkan ke seluruh bagian tubuhnya melalui saluran (channel) dan
dikeluarkan melalui pori-pori yang terbuka (ostula). Spons termasuk hewan laut
dalam filum porifera yang berarti memiliki pori-pori dan saluran. Melalui pori-
pori dan saluran-saluran inilah air diserap oleh sel khusus yang dinamakan sel
leher, yang dalam banyak hal menyerupai cambuk. Jenis sel ini dinamakan
koanosit (choanocyte; Yunani=choane: cerobong, kytos=berongga). Diduga hewan
ini berasal dari jaman paleozoik sekitar 1,6 milyar tahun yang lalu (Munifa,2008).

Copyright 2009. 3
Licensed by Ardhi. www.kimia-untan.com. admin@kimia-untan.com
 Gambar 2.1. Anatomi spons

Spons hidup secara heterotrof. Makanannya adalah bakteri dan plankton.

Makanan yang masuk ke tubuhnya dalam bentuk cairan sehingga porifera disebut
juga sebagai pemakan cairan. Ukuran dan bentuk spons bervariasi. Ukurannya
mulai dari mikroskopis hingga mencapai 2 meter. Sedangkan bentuknya
merambat, bercabang, tegak seperti cerobong atau pipa (Bergquist, 1978). Warna
spons bervariasi, dari warna gelap hingga cerah. Warna pada Spons disebabkan
oleh pigmen karotenoid. Spesies spons tertentu memiliki pigmen yang berwarna
gelap setelah kontak dengan udara. Sedangkan spons lainnya mampu
menghasilkan pigmen yang dapat menyebabkan iritasi pada kulit manusia.
(Hooper, 2002).

Sepintas nampaknya spons memperlihatkan gejala seperti benda mati yang

diam tanpa aktivitas. Tetapi jika diamati secara seksama, di dalam tubuhnya
terjadi aktivitas yang luar biasa di mana air mengalir melalui pori di dalam
tubuhnya. Spons mampu memompa air secara aktif sampai 10 kali volume
tubuhnya setiap jam, sehingga membuatnya seperti vakum pembersih laut yang
sangat efisien. Spons menyaring air laut untuk memperoleh makanan. Air laut
tersebut dapat mengandung nutrisi berupa mikroorganisme (diatomae, bakteri,
protozoa), bahan-bahan organik yang merupakan lapukan atau sisa-sisa tubuh
organisme yang telah mati, serta senyawa kimia toksik yang dihasilkan oleh
tumbuhan atau hewan lain. Senyawa kimia toksik ini kemudian dimodifikasi oleh
spons di dalam tubuhnya (Hooper, 2002).

Secara garis besar, spons dikelompokkan menjadi 4 kelas yaitu Demospongiae,

Calcarea, Hexactinellida dan Sclerospongiae (Hooper, 2002).

1. Demospongiae
Umumnya hidup di laut, tetapi ada pula yang hidup di air tawar. Kelas ini
mendominasi lebih dari 90 % spesies Spons. Kerangka tubuhnya ada yang
terbuat dari silika, Sponsin, dan campuran keduanya. Tingginya ada yang

Copyright 2009. 4
Licensed by Ardhi. www.kimia-untan.com. admin@kimia-untan.com
 mencapai 1 meter dan memiliki warna yang cemerlang. Contohnya Cliona,
Spongilla, dan Haliclona.
2. Calcarea atau Calcispongiae
Hidup di daerah pantai yang dangkal. Bentuk tubuhnya sederhana dengan
kerangka yang terbuat dari CaCO3. Tingginya kurang dari 10 cm dan
umumnya hidup di air laut. Contohnya Leucosolenia, Clathrina, Grantia,
Scypha, dan Sycon.
3. Hexactinellida atau Hyalospongiae
Umumnya dikenal sebagai Spons kaca yang hidup di laut dalam. Kerangka
tubuhnya terbuat dari silika dan spikulanya berduri enam (hexaxon).
Tingginya rata-rata 10-30 cm. Contohnya Euplectella dan Hyalonema.
4. Sclerospongiae
Jumlah spesiesnya sangat terbatas. Umumnya ditemukan dalam gua dan
terowongan karang laut. Bentuknya mirip dengan Demospongiae.

2.2. Spons Aaptos sp

2.2.1 Data Taksonomi
Klasifikasi spons Aaptos sp sebagai berikut (Proksch ,2005) :
Domain : Eukariota
Kingdom : Animalia
Filum : Porifera
Kelas : Demospongiae
Ordo : Hadromerida
Famili : Tethyidae
Genus : Aaptos
Spesies : Aaptos sp

Jenis spons ini mempunyai rangka yang menyebar dengan 3 ukuran kategori
seperti berbentuk kecil, berdinding tebal, atau tidak mikrosklera. Spons ini seperti

Copyright 2009. 5
Licensed by Ardhi. www.kimia-untan.com. admin@kimia-untan.com
kerang yang besar dengan permukaan alasnya seperti akar yang memiliki tonjolan,
reproduksinya aseksual dan teksturnya halus dan licin (Proksch ,2005).

Gambar 2.2 Spons Aaptos sp.

2.2.2 Metabolit Sekunder Spons
Spons dapat memproduksi racun dan senyawa lain yang digunakan untuk
mengusir predator, kompetisi dengan hewan sesil lain dan untuk berkomunikasi
dan melidungi diri dari infeksi. Menurut Harper et al., 2001 dalam (Anton,2008)
mengatakan bahwa Metabolit sekunder merupakan salah satu cara organisme
untuk mempertahankan eksistensinya dan sebagai tindakan responsif terhadap
lingkungan. Metabolit sekunder ini digunakan untuk mencegah dan
mempertahankan diri dari serangan predator, sebagai alat kompetisi, mencegah
infeksi bakteri, membantu proses reproduksi dan mencegah sengatan sinar ultra
violet. Lebih dari 10 % spons memiliki aktifitas sitotoksik yang dapat yang
berpotensial untuk bahan obat-obatan.
Secara umum pada spons ditemukan kelompok senyawa pada fraksi non
polar seperti senyawa terpenoid, senyawa steroid dan asam lemak.

Copyright 2009. 6
Licensed by Ardhi. www.kimia-untan.com. admin@kimia-untan.com
a. Steroid
Steroid didefinisikan sebagai kelompok senyawa organik bahan alam yang
merupakan salah satu metabolit sekunder. Robinson (1991) menunjukkan
kerangka dasar karbon steroid sebagai berikut:

Gambar 2.3 Kerangka dasar karbon steroid di mana R1, R2 dan R3 adalah
substituen

Di alam, steroid terdapat dalam jaringan hewan dan tumbuhan. Senyawa

ini berasal dari senyawa triterpen. Steroid yang terdapat dalam jaringan hewan
berasal dari triterpen lanosterol, sedangkan yang terdapat dalam jaringan
tumbuhan berasal dari triterpen sikloartenol. Tahap-tahap awal dari biosintesis
steroid adalah sama bagi semua steroid alam, yakni pengubahan asam asetat
melalui asam mevalonat dan skualen (suatu triterpen) menjadi lanosterol atau
sikoartenol. Kemudian lanosterol atau sikloartenol mengalami beberapa tahap
perubahan menjadi steroid (Arifin, 1985).

b. Terpenoid
Terpenoid merupakan suatu golongan hidrokarbon yang banyak dihasilkan
oleh tumbuhan dan terutama terkandung pada getah dan vakuola selnya. Pada
tumbuhan, senyawa-senyawa golongan terpenoid, merupakan metabolit sekunder.
Terpenoid dihasilkan pula oleh sejumlah hewan, terutama serangga dan beberapa
hewan laut. Di samping sebagai metabolit sekunder, terpenoid merupakan
kerangka penyusun sejumlah senyawa penting bagi makhluk hidup. Sebagai
contoh, senyawa-senyawa steroid adalah turunan skualena, suatu triterpen; juga

Copyright 2009. 7
Licensed by Ardhi. www.kimia-untan.com. admin@kimia-untan.com
karoten dan retinol. Secara kimia, terpenoid umumnya larut dalam lemak dan
terdapat di dalam sitoplasma sel tumbuhan (Harbone, 1987).
Sebagian besar terpenoid mempunyai kerangka karbon yang dibangun
oleh dua atau lebih unit C-5 yang disebut unit isopren. Unit C-5 ini dinamakan
demikian karena kerangka karbonnya sama seperti senyawa isopren:

Kepala Ekor

Isopren Unit Isopren

Gambar 2.4 Isopren dan unit isopren

Klasifikasi terpenoid ditentukan dari unit isopren atau unit C-5 penyusun senyawa
tersebut. Secara umum biosintesa dari terpenoid dengan terjadinya tiga reaksi
dasar yaitu (Lenny, 2006):
1. Pembentukan isopren aktif berasal dari asam asetat melalui asam
mevalonat
2. Penggabungan kepala dan ekor dua unit isopren akan membentuk mono-
seskui-, di-, sester- dan poli-terpenoid.
3. Penggabungan ekor dan ekor dari unit C-15 atau C-20 menghasilkan
triterpenoid dan steroid.

Semua terpenoid berasal dari molekul isoprena CH2 = C (CH3) CH = CH2 dan
kerangka karbonnya dibangun oleh penyambungan dua atau lebih satuan isoprena.
Kemudian senyawa itu dipilah-pilah menjadi beberapa golongan berdasarkan
jumlah satuan yang terdapat dalam senyawa tersebut; dua (C10), tiga (C15), empat
(C20), enam (C30), atau delapan (C40) satuan. Terpenoid terdiri atas beberapa
macam senyawa, mulai dari komponen minyak atsiri, yaitu monoterpena dan
seskuiterpena yang mudah menguap (C10 dan C15), diterpena yang lebih sukar
menguap (C20), sampai ke senyawa yang tidak menguap, yaitu triterpena dan

Copyright 2009. 8
Licensed by Ardhi. www.kimia-untan.com. admin@kimia-untan.com
sterol (C30), serta pigmen karotenoid (C40). Setiap golongan terpenoid itu seperti
yang terdapat pada Tabel 2.1, sangat penting baik pada pertumbuhan dan
metabolisme maupun pada ekologi hewan dan tumbuhan (Harbone, 1987).

Tabel 2.1. Golongan Utama Terpenoid

Jumlah Jumlah Golongan
satuan isoprena karbon
1 C5 isoprena
2 C10 monoterpenoid
3 C15 seskuiterpenoid
4 C20 diterpenoid
6 C30 triterpenoid
8 C40 tetraterpenoid
n Cn poliisoprena

1. Monoterpenoid
Monoterpenoid merupakan senyawa "essence" dan memiliki bau yang
spesifik yang dibangun oleh 2 unit isopren atau dengan jumlah atom karbon 10.
Lebih dari 1000 jenis senyawa monoterpenoid telah diisolasi dari tumbuhan
tingkat tinggi, binatang laut, serangga dan binatang jenis vertebrata dan struktur
senyawanya telah diketahui.
Menurut J.B Harbone (1987), monoterpenoid dapat dipilah menjadi tiga
golongan, bergantung pada apakah struktur kimianya (gambar 2.5) asiklik
(misalnya geraniol), monosiklik (misalnya limonena), atau bisiklik (misalnya -
pinena). Dalam setiap golongan, monoterpenoid dapat berupa hidrokarbon tak
jenuh (misalnya limonena) atau dapat mempunyai gugus fungsi dan berupa
alkohol (misalnya mentol), aldehida, atau keton (misalnya; menton, karvon).

Copyright 2009. 9
Licensed by Ardhi. www.kimia-untan.com. admin@kimia-untan.com
 Asiklik Monosiklik

Geraniol Limonena

Bisiklik Alkohol

pinena Mentol

Menton Karvon
Gambar 2.5 Beberapa contoh monoterpenoid

Struktur dari senyawa mono terpenoid yang telah dikenal merupakan

perbedaan dari 38 jenis kerangka yang berbeda, sedangkan prinsip dasar
penyusunannya tetap sebagai penggabungan kepala dan ekor dari 2 unit isopren.
struktur monoterpenoid dapat berupa rantai terbuka dan tertutup atau siklik
senyawa monoterpenoid banyak dimanfaatkan sebagai antiseptik, ekspektoran,
spasmolotik dan sedatif. Disamping itu monoterpenoid yang sudah dikenal banyak
dimanfaatkan sebagai bahan pemberi aroma makan dan parfum dan ini merupakan
senyawa komersial yang banyak diperdagangkan.

Copyright 2009. 10
Licensed by Ardhi. www.kimia-untan.com. admin@kimia-untan.com
2. Seskuiterpenoid
Seskuiterpenoid merupakan senyawa terpenoid (C15) yang dibangun oleh 3
unit isopren yang terdiri dari kerangka asiklik dan bisiklik dengan kerangka dasar
naftalen. Anggota seskuiterpenoid asiklik yang terpenting ialah farnesol, alkohol
yang tersebar luas (Robinson, 1991) :

Gambar 2.6 Struktur farnesol

Senyawa seskuiterpenoid ini mempunyai bioaktivitas yang cukup besar,

diantaranya adalah sebagai antifeedant, hormon, antimikroba, antibiotik dan
toksin serta regulator pertumbuhan tanaman dan pemanis. Senyawa-senyawa
seskuiterpen diturunkan dari cis farnesil pirofosfat dan trans farnesil pirofosfat
melalui reaksi siklisasi dan reaksi sekunder lainnya dan kedua senyawa antara ini
merupakan kunci dalam biosintesis terpenoid.

Trans- farnesil pirofosfat Cis- farnesil pirofosfat

Gambar 2.7 Isomer farnesil pirofosfat

Kedua isomer farnesil pirofosfat ini dihasilkan in vivo melalui mekanisme
isomerisasi.

Copyright 2009. 11
Licensed by Ardhi. www.kimia-untan.com. admin@kimia-untan.com
3. Diterpenoid
Menurut J.B Harbone (1987) Senyawa diterpenoid merupakan senyawa yang
beraneka ragam yang mempunyai kerangka karbon C20 yang berasal dari 4 unit
isopren. Barangkali, satu-satunya diterpenoid yang tersebar di semesta ialah
senyawa induk asiklik dari deret senyawa tersebut, yaitu fitol.

Gambar 2.8 Struktur Fitol

Senyawa ini mempunyai bioaktivitas yang cukup luas yaitu sebagai

hormon pertumbuhan tanaman, podolakton inhibitor pertumbuhan tanaman,
antifeedant serangga, inhibitor tumor, senyawa pemanis, anti fouling dan anti
karsinogen. Senyawa diterpenoid dapat berbentuk asiklik, bisiklik, trisiklik dan
tetrasiklik dan tatanama yang digunakan lebih banyak adalah nama trivial
(Lenny,2006).

4. Triterpenoid
Triterpenoid adalah senyawa yang kerangka karbonnya berasal dari enam
satuan (unit) isoprena dan secara biosintesis diturunkan dari hidrokarbon C30
asiklik, yaitu skualena.

Gambar 2.9 Struktur Skualena

Copyright 2009. 12
Licensed by Ardhi. www.kimia-untan.com. admin@kimia-untan.com
 Lebih dari 4000 jenis triterpenoid telah diisolasi dengan lebih dari 40 jenis
kerangka dasar yang sudah dikenal dan pada prinsipnya merupakan proses
siklisasi dari skualen. Senyawa ini berupa senyawa tak berwarna, berbentuk
kristal, sering kali bertitik leleh tinggi dan aktif optik (Harbone, 1987).

2.3. Metode Pemisahan

Pemisahan dan pemurnian kandungan senyawa baik hewan maupun
tumbuhan terutama dilakukan dengan menggunakan salah satu dari empat teknik
kromatografi atau gabungan teknik tersebut. Keempat teknik kromatografi itu
adalah kromatografi kertas (KKt), kromatografi lapis tipis (KLT), kromatografi
gas cair (KGC), dan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Pemilihan teknik
kromatografi sebagian besar tergantung pada sifat kelarutan dan keatsirian
senyawa yang akan dipisahkan. KKt dapat digunakan terutama bagi kandungan
atau senyawa yang mudah larut dalam air, yaitu karbohidrat, asam amino, basa
asam nukleat, asam organik, dan senyawa fenolat.
KLT merupakan metode pilihan untuk pemisahan semua kandungan yang
larut dalam lipid, yaitu lipid, steroid, terpenoid, karotenoid, kuinon sederhana dan
klorofil. Sebaliknya teknik ketiga yaitu KGC, penggunaan utamanya ialah pada
pemisahan senyawa atsiri, yaitu asam lemak, mono- dan seskuiterpena,
hidrokarbon, dan senyawa belerang. Cara lain yaitu KCKT, dapat memisahkan
kandungan yang keatsiriannya kecil. KCKT adalah suatu metode yang
menggabungkan keefisienan kolom dan kecepatan analisis (Harbone, 1987).
Pada KLT adsorben dilapiskan pada lempeng kaca yang bertindak sebagai
penunjang fase diam. Fase bergerak akan merayap sepanjang fase diam dan
terbentuklah kromatogram. Metode ini sederhana, cepat dalam pemisahan dan
sensitif. Kecepatan pemisahan tinggi dan mudah untuk memperolah kembali
senyawa-senyawa yang terpisahkan. Biasanya yang sering digunakan sebagai
materi pelapisnya adalah silika-gel, tetapi kadangkala bubuk selulosa dan tanah
diatome, kieselguhr juga dapat digunakan. Pelarut yang digunakan adalah
CH3COOH atau asetonitril. Zat-zat berwarna dapat terlihat langsung, tetapi dapat

Copyright 2009. 13
Licensed by Ardhi. www.kimia-untan.com. admin@kimia-untan.com
juga digunakan reagen penyemprot untuk melihat berkas suatu zat (Khopkar,
2003).
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) atau high performance liquid
chromatography (HPLC) berbeda dari kromatografi cair klasik. HPLC
menggunakan kolom dengan diameter umumnya kecil, 2-8 mm dengan ukuran
partikel penunjang 50m; sedangkan laju aliran dipertinggi dengan tekanan yang
tinggi. Bila dibandingkan terhadap kromatografi gas cair, maka HPLC lebih
bermanfaat untuk isolasi zat tidak mudah menguap (Khopkar, 2003). Menurut J.B
Harbone (1987) KCKT digunakan terutama untuk golongan senyawa takatsiri,
misalnya terpenoid, segala jenis senyawa fenol, alkaloid, lipid dan gula.

2.4. Metode Identifikasi

Pada identifikasi suatu kandungan tumbuhan maupun hewan, setelah
kandungan itu diisolasi dan dimurnikan, pertama-tama harus kita tentukan dahulu
golongannya, kemudian barulah ditentukan jenis senyawa dalam golongan
tersebut. Sebelum itu, keserbasamaan senyawa tersebut harus diperiksa dengan
cermat, artinya senyawa harus membentuk bercak tunggal dalam beberapa sistem
KLT.

a. Spektroskopi Massa (SM/MS)

Pada dasarnya spektroskopi massa merupakan suatu metode identifikasi
yang memiliki kemampuan untuk menentukan bobot molekul dengan tepat,
kemampuannya menghasilkan pola fragmentasi rumit yang khas bagi senyawa
yang bersangkutan sehingga dapat diidentifikasi.

b. Spektroskopi Resonansi Magnet Inti (RMI / NMR)

Sesuai dengan namanya, resonansi magnet inti (RMI) berhubungan
dengan sifat magnet dari inti atom. Mempelajari molekul senyawa organik secara
spektrometri resonansi magnet inti akan memperoleh gambaran perbedaan sifat
magnet dari berbagai inti yang ada dan untuk menduga letak inti tersebut dalam
molekul (Sudjadi,1985).

Copyright 2009. 14
Licensed by Ardhi. www.kimia-untan.com. admin@kimia-untan.com
 Spektroskopi RMI proton pada hakikatnya merupakan sarana untuk
menentukan struktur senyawa organik dengan mengukur momen magnet atom
hidrogennya. Pada kebanyakan senyawa, atom hidrogen terikat pada gugus yang
berlainan (seperti CH2-, -CH3, -CHO,-NH2,-CHOH-) dan spektrum RMI proton
merupakan rekaman sejumlah atom hidrogen yang berada dalam keadaan
limgkungan yang berlainan tersebut (Harbone, 1987).
.

Copyright 2009. 15
Licensed by Ardhi. www.kimia-untan.com. admin@kimia-untan.com
 BAB III
METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Waktu dan tempat penelitian

Penelitian ini dilaksanakan selama 5 bulan sejak Bulan Februari tahun 2009 di
laboratorium kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas
Tanjungpura Pontianak. Identifikasi taksonomi spesies Spons dilakukan dengan
bantuan LON (Lembaga Oseanografi Nasional) Jakarta. Pemurnian isolat
menggunakan instrumen HPLC prepararif di Laboratorium Cibitung. Sedangkan
analisis isolat dengan instrumen MS dan H-NMR dilakukan di laboratorium P2K
LIPI Serpong.

3.2. Alat dan bahan

Alat yang digunakan adalah alat gelas, corong pisah, evaporator, funnel filter,
instrumen HPLC, kolom kromatografi, lampu UV, melting block, neraca analitik,
dan pelat tetes.

Bahan yang digunakan adalah akuades, vanili, asam sulfat pekat, boraks,
formaldehida 37 %, kertas saring Whatman, kloroform p.a, magnesium sulfat
anhidrat, metanol teknis, n-heksan p.a, etil asetat p.a, diklorometan, kloroform,
aseton, pelat KLT, dan silika gel.

3.3 Prosedur kerja

Prosedur kerja dalam penelitian ini dibagi dalam beberapa tahap seperti berikut:
(1) Pengambilan sampel, (2) Ekstraksi, (3) Uji spesifik golongan senyawa, (4)
Penelusuran komposisi eluen, (5) Fraksinasi dengan Flash Coulumn, (6)
Pemurnian isolat dengan HPLC preparatif, (7) Analisis isolat dengan instrumen
MS dan H-NMR. Tahapan penelitian dijelaskan berikut ini.

Copyright 2009. 16
Licensed by Ardhi. www.kimia-untan.com. admin@kimia-untan.com
1. Pengambilan sampel
Sampel Spons genus Aaptos sp diambil dari Perairan Pulau Randayan
Kalimantan Barat dengan SCUBA DIVING. Data mengenai sampel seperti
tekstur, warna dan bentuk dicatat dan didokumentasikan. Sampel yang telah
diambil dibersihkan, dimasukkan dalam kantong plastik, diberi label dan
disimpan dalam cool box.

2. Ekstraksi: maserasi dan partisi

Tahap awal dalam mengisolasi dan menentukan struktur kelompok senyawa-
senyawa organik adalah ekstraksi dengan cara maserasi dan partisi.

a. Maserasi
Sampel diekstraksi dengan cara maserasi (perendaman) selama 24 jam
menggunakan metanol ( 500 mL). Kemudian disaring dan residu dimaserasi
kembali dengan metanol (2 x 300 mL). Hasil ekstraksi disaring. Ekstrak
metanol hasil maserasi digabung, diuapkan dalam evaporator dan ditimbang.
b. Partisi
Ekstrak metanol dipartisi dengan n-heksan (3x200 mL). Fraksi n-
heksan digabung dan diuapkan dalam evaporator hingga hampir kering,
kemudian ditimbang untuk dilakukan analisis selanjutnya.

3. Uji spesifik golongan senyawa

Uji spesifik golongan senyawa dilakukan terhadap fraksi n-heksan
menggunakan teknik Liebermen-Burchard test.

4. Penelusuran komposisi eluen

Penelusuran komposisi eluen dilakukan dengan teknik kromatografi lapis
tipis (KLT) menggunakan pelarut tunggal yaitu n-heksan, diklorometan,
kloroform, aseton, etil asetat dan kombinasi dari dua atau lebih pelarut
tersebut.

Copyright 2009. 17
Licensed by Ardhi. www.kimia-untan.com. admin@kimia-untan.com
5. Fraksinasi dengan Flash Column
Fraksinasi dilakukan dengan teknik kromatografi Flash Column
menggunakan pelarut yang paling sesuai (pelarut yang menunjukkan pola
pemisahan yang paling baik pada penentuan komposisi eluen). Pola noda
diidentifikasi dengan teknik kromatografi lapis tipis. Fraksi yang
menunjukkan pola noda yang sama digabung kemudian ditentukan nilai Rf
spotnya. Setelah diuapkan, isolat ditimbang dan ditentukan titik lelehnya.
Purifikasi dilakukan jika isolat belum murni.

6. Pemurnian isolat dengan instrumen HPLC preparatif

Tahapan ini dilakukan jika tidak diperoleh isolat murni.

7. Analisis isolat dengan instrumen MS dan H-NMR

Analisis dilakukan terhadap isolat murni menggunakan instrumen MS dan
H-NMR kemudian diidentifikasi untuk memprediksi struktur senyawanya.

Copyright 2009. 18
Licensed by Ardhi. www.kimia-untan.com. admin@kimia-untan.com
3.4. Rencana Jadwal Penelitian
Penelitian ini akan dilaksanakan selama 5 bulan mulai dari persiapan alat dan
bahan sampai penyusunan laporan hasil penelitian yang dijelaskan melalui tabel
berikut.

Tabel 3.1. Rencana jadwal penelitian

Bulan ke-
NO Aktivitas 1 2 3 4 5
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Persiapan
1. alat dan
bahan
Pengambilan
2.
sampel
Ekstraksi :
3. maserasi dan
partisi
Uji spesifik
4. golongan
senyawa
Penelusuran
5. komposisi
eluen
Fraksinasi
7. dengan
KKG
Analisis
8.
isolat
Penyusunan
9.
laporan

Copyright 2009. 19
Licensed by Ardhi. www.kimia-untan.com. admin@kimia-untan.com
 DAFTAR PUSTAKA

Arifin, A., 1985, Kimia Organik Bahan Alam, Departemen Pendidikan dan
Kebudayaan Universitas Terbuka, Jakarta.

Anton Timur, 2008, Makalah: Peran Ilmu Kelautan dalam Pembangunan

Indonesia, Potensi Obat dari Laut Nusantara, Fakultas Perikanan dan Ilmu
Kelautan Universitas Diponegoro, Semarang.

Bergquist, P.R., 1978, Sponges, Hutchinson and Company, London.

Harbone, J.B., 1987, Metode Fitokimia: Penuntun cara modern menganalisis

tumbuhan, terbitan kedua, a.b: Kosasih Padmawinata dan Iwang Sudiro,
ITB Bandung.

Hooper, J.N.A., 2002, Sponguide: guide to spons collection and identification,

Queensland Museum, South Brisbane.

Jang, Kyoung, H., Chung, Soon-chun, Shin, Jongheon, Lee, So-Hyoung, Kim,
Tae-Im, Lee, Hyi-Seung and Oh, ki-bong, 2007, Aaptamines as sortase A
inhibitors from the tropical sponge Aaptos aaptos, Bioorganic & medicinal
chemistry letters, Elsevier, Oxford.

Khopkar, S.M., 2003, Konsep Dasar Kimia Analitik, terbitan pertama, a.b: A.
Saptorahardjo, Universitas Indonesia, Jakarta.

Lenny, S., 2006, Senyawa Terpenoida dan Steroida, Universitas Sumatera Utara,
Medan.

Munifa, I.;Wikanta, T. dan Nursid, M., 2008, Spons:biota laut penghasil senyawa
bioaktif yang potensial, Laboratorium Bioteknologi Kelautan, Pusat Riset
Pengolahan Produk dan Sosial-Ekonomi Kelautan dan Perikanan.

Munro, M., H., G., Blunt, J., W., Dumdei, E., J., Hickford s. J.H., Lill,R. E.,
Shangxiao, li, Battershill, C., N., and Duckworth, A. R., 1999, The
discovery and development of marine compounds with pharmaceutical
potential, Journal of biotechnology, Elsevier, Amsterdam.

Nakamura, H.; Kobayashi, J. And Ohizumi., 1987, Aaptamine, Novel benzo[de]

[1,6]naphthyridine from the Okinawan marine sponge Aaptos aaptos,
J.Chem.Soc.Trans.,1173 176.

Proksch, P., Edrada, R., A. And Ebel, R., 2002, Drugs from the seas current
status and microbiological implications, Appl Microbiol Biotechol 59:125-
134, Springer-Verlag.

Copyright 2009. 20
Licensed by Ardhi. www.kimia-untan.com. admin@kimia-untan.com
Proksch, P., 2005, Isolation and Structure Elucidation of Secondary Metabolites
from Marine Spons and a Marine-derived Fungus, Dsseldorf.

Robinson, T., 1991, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, Padmawinata, K., ed.
Ke-6, ITB, Bandung.

Souza, Thiago, M., L., Abrantes, Juliana, L., Epifanio, Rosangela de, A.,
Frederico Leite Fontes Carlos, Frugulhetti Izabel, C., P., P., 2007, The
alkaloid 4-methylaaptamine isolated from the sponge Aaptos aaptos impairs
Herpes simplex virus type 1 penetration and immediate-early protein
synthesis, Thieme, Stuttgart.

Sudjadi, 1985, Penentuan Struktur Senyawa Organik, Ghalia Indonesia, Jakarta.

Copyright 2009. 21
Licensed by Ardhi. www.kimia-untan.com. admin@kimia-untan.com
 LAMPIRAN

Lampiran . Bagan prosedur kerja

Sampel spons

- dimaserasi dengan metanol

- disaring

Ekstrak metanol Residu spons

- dievaporasi
Ekstrak kental metanol

- dipartisi dalam n-Heksan

Fraksi Fraksi
n-Heksan metanol

- diidentifikasi komponen
senyawanya
- ditelusuri komposisi eluennya
- difraksinasi menggunakan
kromatografi flash column
Isolat - isolat

- diuji dengan KLT

- diuji titik leleh
- dipurifikasi
Isolat

Dianalisis
MS dan H-NMR

Copyright 2009. 22
Licensed by Ardhi. www.kimia-untan.com. admin@kimia-untan.com
Copyright 2009. 23
Licensed by Ardhi. www.kimia-untan.com. admin@kimia-untan.com