EXTRACCIN ENZIMTICA

Para la extraccin de enzima de microorganismos o de tejidos

animales y vegetales las clulas se desintegran, ya sea por
frotamiento, agitacin, ultrasonido, etc. Antes del aislamiento, se
deben entender las propiedades de la enzima, como la especificidad
de sustrato, condiciones de pH, temperatura y el mtodo de ensayo
(Yufera, 1995). Existen diferentes fuentes para la extraccin de
enzimas como lo son a partir de material animal, plantas o
microorganismos. En la tabla I se ajuntan diferentes tipos de enzima,
con las respectivas fuentes de las cuales se recomienda su obtencin:

Tabla I. Fuente para aislamiento de acuerdo al tipo de enzima

Tipo de enzima Fuente

Metablicas Hgado
Insulina Pncreas
ATPasa Mitocondria
Sntesis de protenas Ribosomas
Sntesis de carbohidratos Material vegetal
Industriales y comerciales, en general Microorganismos
(Acharya, Achyara, & Modi, 2008)

Las condiciones para extraer enzimas y pasarlas a solucin son a

menudo crticas y requieren el estudio de muchas variables. En
general, el primer paso consiste en la obtencin de un homogenizado,
que implica la destruccin de la clula y el pasaje de las enzimas a
solucin o suspensin. Para ello se toma en cuenta dos grandes
grupos de enzimas: intracelulares y extracelulares. En las primeras se
debe realizar el rompimiento celular, para lo cual existen diversos
mtodos qumicos, fsicos y enzimticos, para las enzimas
extracelulares tan solo se requiere la separacin de la biomasa con el
sobrenadante de la fermentacin (Bradfors, 2006).
MTODOS FSICOS

HOMOGENIZACIN MECNICA

Puede utilizarse un homogeneizador de vidrio, mortero o

licuadora, a veces con la ayuda de abrasivos como almina,
arena o bolitas de vidrio. Las clulas deben suspenderse en un
solvente isotnico adecuado (puede ser sacarosa 0,25 M, NaCl
0,9%, KCl 0,15 M) o ligeramente hipertnico, en un buffer
adecuado para controlar el pH. La homogenizacin a altas
presiones es muy frecuente para romper clulas y estudiar la
actividad de enzimas (Ayala, 2005).

HOMOGENEIZACIN SNICA

Esto se lo realiza con el choque de ondas snicas o

ultrasnicas provocando cambios de presin de miles de
atmsferas, que rompen la pared celular. Se usa generalmente
con bacterias, levaduras y a veces para determinados tejidos
animales como el bazo, rin o eritrocitos (Ayala, 2005). Si se
realiza el rompimiento celular por mtodo de sonicacin, se
debe considerar los efectos que se tendr en la estabilidad
enzimtica, que depender de factores asociados como el pH,
temperatura, tipo de Buffer, tiempo, entre otros. Se ha
reportado una disminucin del 70% de la estabilidad enzimtica
de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PDH) y un 15% de la
Alcohol deshidrogenasa (ADH) por la extraccin con sonicacin
(Glaehter, 2012).

DESINTEGRACIN TRMICA

El congelamiento y descongelamiento rpidos y repetidos

suelen usarse para desintegrar bacterias y eritrocitos. Por
congelacin se forman cristales de hielo intracelulares, que

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 destruyen la estructura. Al descongelarse, las clulas se
destruyen osmticamente debido a la presencia de agua pura y
se libera su contenido (Ayala, 2005).

PRECIPITACIN SALINA

Las enzimas son fraccionadas al reducirse su solubilidad hasta

el punto en que precipitan. Esto se logra por adicin de sales a
cierto pH y a elevada concentracin inica o por solventes
orgnicos (alcohol, acetona, isopropanol) a baja temperatura. La
sal ms usada es el sulfato de amonio por su alta solubilidad,
bajo costo, nula toxicidad para la enzima y por no afectar
mayormente la viscosidad de la solucin (Yufera, 1995).

La mayora de las protenas son menos solubles a

concentraciones elevadas de sal. Las concentraciones de sal en
las que precipita una protena varan de una protena a otra. Por
ejemplo, el sulfato amnico 0,8 M precipita el fibringeno,
mientras que se necesita una concentracin 2,4 M para
precipitar la albmina del suero. Para eliminar la sal, cuando sea
necesario se puede utilizar la dilisis (Stryer, et al., 2008).

CENTRIFUGACIN DIFERENCIAL

La centrifugacin es un mtodo que utiliza la propiedad de

sedimentacin de partculas con base en la masa de las
molculas para la separacin de partculas de una solucin. Es
el paso inicial ms comn en la purificacin de protenas
solubles a partir de material insoluble. Al sedimentar en
condiciones suaves (poco tiempo, poco fuerza de aceleracin)
sedimentara partculas con mayor densidad. Se puede realizar
una centrifugacin del sobrenadante donde igualmente se
sedimentarn las partculas ms densas y as sucesivamente.
Se pueden aplicar condiciones crecientes de severidad en la

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centrifugacin y obtener una coleccin de sedimentos que
corresponden sucesivamente a fracciones de partculas de
diferente tamao y/o densidad. (Lodish, et al., 2006).

CENTRIFUGACIN POR ZONAS DE VELOCIDAD

Se puede separar protenas por centrifugacin a travs de una

solucin con densidad creciente llamado gradiente de densidad.
Por lo general el gradiente usado es sacarosa. Al colocar una
mezcla de protenas sobre la parte superior de un gradiente de
sacarosa en un tubo sometindolo a centrifugacin, las
protenas quedan en la parte inferior del tubo a una velocidad
controlada por factores que controlan la constante de
sedimentacin, separndose por bandas o zonas de protenas
con distintas masas. (Koolman, et al, 2004)

La muestra se aplica en una capa delgada sobre el medio de

centrifugacin, que es un gradiente de densidad. Bajo la fuerza
centrfuga, las partculas sedimentan a travs del gradiente
concentrndose en zonas o bandas discretas. Su velocidad de
avance (y, por tanto, el mecanismo de la separacin) depende
de su tamao, forma y densidad; todos estos parmetros se
combinan en el coeficiente de sedimentacin,

velocidad de sedimentacin
Coeficiente de sedimentacin=s=
aceleracin centrfuga

que se mide en unidades svedberg (1 S = 1013 segundos).

La centrifugacin debe terminar antes de que alguna de las

partculas separadas llegue al fondo del tubo. Los componentes
separados se recogen individualmente aspirando con mucho
cuidado las diferentes bandas o, mejor, perforando el fondo del
tubo y recogiendo en fracciones el lquido que cae.

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 Figura1. Centrifugacin zonal. Fuente: (Koolman, et al, 2004)

MTODOS QUMICOS

USO DE SOLVENTES ORGNICOS

Disuelven la pared celular fundamentalmente por la disolucin

de lpidos asociados a membrana. Existen varios solventes
ampliamente utilizados como: etanol, acetona, butanol, etc.;
pero dichos solventes modifican la constante dielctrica del
enzima produciendo algo de desnaturalizacin, por ello no suele
ser muy recomendable la implementacin de este mtodo
cuando se quiere un enzima totalmente funcional y son
necesarias bajas temperaturas para producir una separacin
(Yufera, 1995).

RUPTURA CELULAR QUMICA

Los detergentes favorecen la lisis celular rompiendo la barrera

lipdica, solubilizando las protenas e interrumpiendo la
interaccin lpido-lpido, lpido-protena y protena-protena,
permitiendo la salida del material intracelular. Sin embargo, la
presencia de detergentes puede afectar en la etapa de
purificacin por precipitacin proteica o por tratamiento con
sales, ya que estos interaccionan con las mismas (Stryer, et al.,
2008).

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DEGRADACIN CELULAR

Es necesario el implemento de una enzima, la lisozima la cual

ataca la capa de pptidoglucano de la pared celular. Es extrada
de lgrimas, saliva y comercialmente de la clara de huevo
donde se encuentra en grandes cantidades. Esta enzima da
buenos resultados a la hora de una extraccin en bacterias
gram (+), pero depender de la presin osmtica del medio lo
cual conlleva a la ruptura de la membrana celular. En el caso de
bacterias gram (-) para originar la lisis celular se necesitar el
uso de un agente quelante de iones como el EDTA. Estos
procedimientos no se realizan a gran escala debido al costo de
la lisozima (Held, 2003).

SHOCK OSMTICO

Las clulas se hacen estallar al someterlas a un medio

hipotnico, lo cual hace que la membrana no resista la presin
osmtica. Puede ocasionar el dao a las membranas de algunas
organelas. Es utilizado para el aislamiento: Mitocondria y
Cromosomas Mitticos. Este mtodo es usado para la extraccin
de enzimas hidrolticas y protenas ligadas del espacio
periplsmico de bacterias gram (-) como en el caso de la E. coli
(Muoz, 2009).

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SEGUNDO CAPITULO

PURIFICACIN ENZIMTICA

La purificacin enzimtica es un procedimiento vital en la

caracterizacin de las enzimas, facilitando el estudio de la funcin de
la enzima, y su actividad cataltica. La purificacin es una tcnica que
requiere mucho cuidado, necesita habilidad y pruebas de ensayo-
error. Cuando se quiera purificar una enzima particular, debe
seleccionarse la fuente de la cual se la obtendr, es decir si ser de
una planta, animal o microorganismo. Despus de seleccionar la
fuente, un procedimiento de ensayo adecuado tambin debe
seleccionarse. Si este no es correcto, entonces se tendr una
extraccin y purificacin errnea, y los resultados no podrn ser
confiables (Glaehter, 2012).

En la purificacin de una enzima, cuya metodologa es nica para

cada protena, cada paso sistemtico y el proceso total de la
purificacin depende de tres aspectos: (i) la naturaleza bioqumica
(estabilidad y actividad enzimtica), (ii) la utilizacin del enzima
(analtica, industrial) y (iii) la complejidad del proceso de purificacin
(costos tecnolgicos). La complejidad del proceso de purificacin
incide en el resultado final en cuanto al valor econmico total, entre
ms purificada sea una enzima mayor es el costo de produccin, por
ejemplo 500 ml de cuajo industrial (quimosina) para 5000 litros de
leche posee un costo promedio de 10 US, mientras que una taq ADN
polimerasa convencional para amplificacin en PCR, 2ml posee un
valor de 145 US.

Existen variadas tcnicas y metodologas para la purificacin de

protenas, pero cada una de ellas consiste en separar la enzima de

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inters de otras protenas y macromolculas, manteniendo la mayor
actividad enzimtica posible entre estos mtodos tenemos:

ELECTROFORESIS
Durante la electroforesis la fuerza que provoca la migracin de
las protenas es un campo elctrico y el gel acta como filtro
molecular, ralentizando la migracin de las protenas en funcin
de su relacin carga/masa. A diferencia de lo que ocurra en la
cromatografa de filtracin, en las electroforesis las protenas
mayores son retardadas y se mueven ms lentamente a travs
del gel (Wiseman, 1991).

DESALINIZACIN
Este proceso varia el pH de la solucin o adiciona agentes
qumicos que llevan a cabo la precipitacin. En el pH
isoelctrico las protenas disminuyen la solubilidad y se
precipitan como cristales puros. Este proceso es posible
tambin por la adicin de qumicos como sulfato de amonio,
acetona, etc.

El agente qumico utilizado y la protena se solubilizan en una

primera etapa, pero al alcanzar un lmite crtico, la interaccin
protena- protena supera la interaccin agua- protena, as
como el agente desplaza las molculas de agua, esto da lugar al
desplazamiento salino y protenas o enzimas (Anand, 2011).

CROMATOGRAFA

Un mtodo cromatogrfico siempre consta de dos fases, una

fase estacionaria y una fase mvil (La muestra a purificar). La
fase estacionaria est constituida por partculas de polmeros

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 con poros de distinto tamao. La separacin se da dependiendo
del tamao de las molculas (Glaehter, 2012).

Cromatografa de Exclusin molecular o Tcnica de

Filtracin en gel
Aquellas protenas ms grandes no pueden penetrar los poros
de la matriz de filtracin y por lo tanto caen mucho ms
rpidamente que aquellas partculas de menor tamao que
penetran los poros siguiendo un camino mucho ms
obstaculizado. El tamao de los poros internos depende de la
naturaleza misma de los polmeros utilizados, por lo que
permiten la entrada a protenas por debajo de un determinado
peso molecular (Glaehter, 2012).

Figura 2: Cromatografa y
filtracin por gel

Una vez que fluye la muestra con el solvente y empieza a salir

por la boquilla se recogen muestras consecutivas del mismo
volumen en tubos separados, para ser analizadas en el
espectrofotmetro, midiendo as la concentracin de protena
en cada tubo. Esto permite realizar un Cromatograma, que
consiste en una grfica de las concentraciones de fracciones
proteicas en cada tubo (Devaux, 1984).

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Cromatografa de Intercambio Inico:

Esta tcnica es similar a la anterior, sin embargo en esta la fase
estacionaria est formada por intercambiadores inicos
cargados positivamente (intercambiadores aninicos), o
negativamente (Intercambiadores catinicos). Estos
intercambiadores interactuarn con las molculas cargadas
contrariamente al intercambiador, y dejarn el libre flujo de las
protenas cargadas igualmente que el intercambiador (Parra,
2002).

Cromatografa Hidrofbica:
Es similar al intercambio inico con diferencia en la naturaleza
de la fase estacionaria. En esta tcnica, el intercambiador est
formado por molculas apolares, que atraparan a otras
molculas apolares, mientras que aquellas molculas de
naturaleza polar seguirn su paso a travs de la columna
(Glaehter, 2012).