introduccin

3 Separaciones quirales y enantiomerismo

3.1 Introduccin

Las publicaciones del siglo XIX de Vant Hoff y Le Bed intentando explicar la asimetra molecular,
deducida por Pasteur aos antes, marcaron el principio de la estereoqumica. Este campo de estudio se
define como la parte de la qumica que estudia las estructuras moleculares en tres dimensiones. Uno de los
aspectos de la estereoqumica es el estereoisomerismo; los ismeros (compuestos de igual frmula
molecular) que difieren entre s slo en la forma en que los tomos estn orientados en el espacio son
llamados estereoismeros. La quiralidad es un atributo geomtrico, consecuencia de esa orientacin de los
tomos en una molcula. Una molcula presenta quiralidad cuando no puede superponerse a su imagen
especular. Los estereoismeros de un compuesto quiral se denominan enantimeros y poseen la misma
energa interna. Los estereoismeros que no son enantimeros son denominados diasteroismeros. Los
diasteroismeros se pueden superponer con su imagen especular y no poseen la misma energa interna.

Tabla 3.1 Clasificacin de las diferentes clases de isomera

ISOMEROS

Ismeros Estereoismeros
constitucionales
Enantimeros Diastereoismeros

Diferente conectividad Igual conectividad

La diferenciacin entre un enantimero y un diasteroismero tiene implicaciones desde el punto de vista

bioqumico, farmacutico y analtico cruciales. Los enantimeros poseen las misma propiedades fsico-
qumicas y slo se comportan de forma diferente frente a un entorno quiral como por ejemplo: la luz
polarizada, las enzimas del metabolismo, otro compuesto quiral etc. En este captulo comentaremos el
fenmero del enantiomerismo y explicaremos las tcnicas de anlisis de moleculas quirales. Estos mtodos
de anlisis se basan en el uso de tcnicas quirpticas (aquellas que hacen uso de luz polarizada) o mediante
la reaccin reversible o irreversible de los analitos quirales con otro compuesto quiral.

27
separaciones quirales y enantiomerismo

3.2 Enantiomerismo y quiralidad

Como ya se ha comentado, se define como molcula quiral aquella que no puede superponerse a su
reflexin especular, o lo que es lo mismo, una molcula es quiral cuando carece de simetra de reflexin.
Esta propiedad es debida, en general, al diferente arreglo espacial de los grupos alrededor de un centro
asimtrico o tambin llamado centro estereognico. Este tipo de quiralidad es la ms habitual y se
denomina quiralidad central.

Figura 3.1. Enantimeros de un compuesto con quiralidad central. Comparacin con la quiralidad de las
palmas de la mano.

Las dos posibles orientaciones espaciales alrededor del centro estereognico da lugar a los dos
enantimeros que presentan un comportamiento diferente respecto a la luz polarizada plana; cuando un
rayo de luz polarizada plana pasa a travs de un compuesto quiral, el plano de polarizacin gira, siendo el
grado de rotacin el mismo para ambos enantimeros, pero en direcciones opuestas.

Figura 3.2. Cambio del plano de polarizacin de la luz cuando atraviesa una disolucin de un compuesto
quiral.

Hablamos entonces que los enantimeros poseen actividad ptica que se mide a travs del poder ptico
rotatorio (). Una disolucin racmica (mezcla de enantimeros a la misma concentracin) no presenta
actividad ptica porque los poderes pticos rotatorios se compensan.

28
separaciones quirales y enantiomerismo

existen ms de dos estereoismeros. Para n carbonos estereognicos el nmero mximo de

estereoismeros es 2n. Puesto que los enantimeros existen en pares, algunos de los estereoismeros no
tienen una relacin de imagen especular con otros, y entonces son diastereoismeros. Por ejemplo, una
molcula con dos carbonos asimtricos tendr como mximo cuatro estereoismeros, de los cuales habr
dos parejas de enantimeros. Cada enantimero de un grupo tendr una relacin diastereoisomrica con
los del otro par de enantimeros. Sin embargo, existen tambin otras posibilidades como se representa en
la figura 3.4 y se ejemplifica con el cido tartrico.

COOH COOH COOH COOH

HO H H OH HO H H OH Plano de
HO H simetra
H OH HO H H OH
COOH COOH COOH COOH

Signo de rotacin

(+) (-) ninguno ninguno

Figura 3.4. Signo de la rotacin y estereoismeros del cido tartrico.

En este caso slo son posible tres estereoismeros. Existe una pareja de enantimeros con signo de
rotacin opuesto pero la otra pareja no presenta una relacin de enantiomerismo porque se pueden
superponer al disponer de un plano de simetra. Estas formas se conocen como meso y se definen como
aquellas formas que aun conteniendo centros estereognicos se pueden superponer con su imagen
especular y por tanto no presentan actividad ptica.

3.3 Nomenclatura

La propiedad fsica que distingue especficamente a dos enantimeros de un compuesto es la rotacin de

la luz polarizada plana; por este motivo, los enantimeros han sido histricamente llamados ismeros
pticos. Para molculas simtricas el efecto neto de la rotacin de la luz polarizada plana es cero, puesto
que la rotacin efectuada por una molcula es compensada por una rotacin opuesta debida al encuentro
de la luz con una molcula que es la imagen especular de la primera. Para un enantimero, no existe ese
efecto de cancelacin (no hay ninguna molcula que sea imagen especular de otra), por lo que s se da una
rotacin del plano de la luz. Por tanto, es comprensible que el primer intento de sistematizar la
nomenclatura de los enantimeros se basara en el signo de rotacin de la luz polarizada. El enantimero
que rota el plano de la luz polarizada plana en sentido horario fue llamado dextrorrotatorio y designado
con los smbolos (+) o (d). El otro enantimero produce el efecto contrario (levorrotatorio) y se designa
con los smbolos (-) o (l).

30
 introduccin

No obstante, el signo de la rotacin ptica no informa de la ordenacin espacial de los substituyentes

alrededor del centro asimtrico y por tanto no se puede deducir la estructura espacial del enantimero.
Fisher propuso una nomenclatura para solucionar este problema. A partir de unas proyecciones en dos
dimensiones y siguiendo unas reglas de ordenacin denominaba los dos enantimeros como D y L (no
confundir con d y l) atendiendo a como quedaban ordenados los sustituyentes respecto a una sustancia
que tomaba como referencia. Esta nomenclatura, es totalmente arbitraria (no tiene que ver nada con el
signo de rotacin) por lo que era comn su uso conjunto con la anterior dando lugar a nomenclaturas del
tipo D(-), L(-) etc. La dificultad en su aplicacin limita el uso de esta nomenclatura aunque se ha
conservado hasta nuestros das para indicar la estereoisomera de glcidos y aminocidos.

El sistema actual de ordenacin aceptado por la IUPAC, es aquel conocido como de Cahn-Ingold-Prelog
o tambin llamado sistema R-S (figura 3.5). ste se basa en establecer un orden de prioridad de los
sustituyentes mediante una serie de reglas, las ms importantes de las cuales son:

1. Se asigna a cada grupo unido al carbono asimtrico un orden de prioridad decreciente. Esta
prioridad se establece en funcin del nmero atmico de los tomos directamente unidos al
carbono asimtrico, siendo el tomo prioritario el de mayor nmero atmico.
2. Para dos tomos de igual nmero atmico la prioridad se establece por los siguientes tomos de
los grupos hasta que se observa una diferencia. Por ejemplo, CH2Cl > CH2OH > CH2CH3. Los
enlaces dobles cuentan como dos enlaces simples.
3. Para asignar la configuracin, el centro asimtrico debe observarse con el grupo de menor
prioridad en la posicin ms alejada del observador. Si la secuencia de prioridad decreciente se da
en sentido horario, la configuracin es R; en caso que la secuencia sea en sentido antihorario, la
configuracin es S.

Figura 3.5. Sistema R,S para la nomenclatura de enantiomeros.

31
separaciones quirales y enantiomerismo

3.4 Enantiomerismo y actividad biolgica

Los enantimeros de un compuesto presentan las misma propiedades fsico-qumicas en un entorno

aquiral sin embargo los organismos vivos son inherentemente quirales. La naturaleza ha seleccionado los
levoaminoacidos para formar las protenas mientras que todos los glcidos del DNA y RNA son
dextrorotatorios. En consecuencia, las enzimas, receptores celurares y todas las especies bioqumicas que
intervienen en el metabolismo presentan una estereoqumica definida y por tanto los enantimeros de una
sustancia presentaran en el organismo humano un comportamiento distinto. Esto se debe a que las
interacciones biolgicas son estereoespecficas y necesitan de una interaccin triple (3D point interaction)
para producirse. La figura 3.6 representa este tipo de interacciones y como puede observarse slo uno de
los enantimeros posee la configuracin espacial adecuada para enlazarse adecuadamente.

D D

A C C A

B B

A C A C
B B
Interaccin fuerte Interaccin dbil

Figura 3.6. Esquema de la interaccin trpode de dos enantimeros con un receptor stereoespecfico.

Por tanto, los enantimeros de un compuesto presentarn una reactividad distinta (velocidad de reaccin,
interacciones con receptores diferentes, efectos secundarios, etc). El fenmeno del enantiomerismo es
muy importante en la industria farmacutica. La pureza enantiomrica de los frmacos ha sido estudiada y
legislada1 desde el desastre de la talidomida a principios de los aos setenta. Slo uno de los enantimeros
de la talidomida posee efecto teraputico mientras que el otro presenta un efecto teratgeno indeseado.
Esto no es una situacin aislada y son muchos los ejemplos que podemos encontrar donde existe un
enantimero con la actividad biolgica buscada (eutmero) mientras que el otro enantimero no la posee
(distmero). Sin embargo, podemos distinguir varias situaciones:

El distmero es txico, por ejemplo el caso de la talidomida.

El distmero es inactivo o menos activo. Se define entonces una relacin eutomrica que expresa
cuanto ms activo es el eutmero. Esto ocurre por ejemplo en la epinefrina cuya relacin
eutomrica es igual a 100 a favor del enantimero levorotatorio.

32
 introduccin

Los dos enantimeros poseen una actividad biolgica distinta. El dextropropoxifeno es una
analgsico mientras que el levopropoxifeno no tiene propiedades analgsicas pero si antitusivas.
La combinacin de ambos enantimeros es beneficiosa. Bien, porque poseen efectos teraputicos
complementarios o bien porque el distmero reduce los efectos secundarios del eutmero. Por
ejemplo, los cuatro esteroismeros del labetalol poseen diferentes capacidad y bloqueadoras
La combinacin de los cuatro proporciona un excelente ,-bloqueador. El diurtico indacrinona
es un ejemplo del segundo caso. El enantimero R es el eutmero pero posee un efecto
secundario indeseado de retencin del cido rico que puede evitarse si se administra el
enantimero S que favorece su eliminacin.

En el primer caso la comercializacin del frmaco en forma racmica est totalmente prohibido y es
imprescindible demostrar que bajo ninguna condicin de almacenamiento y uso se puede producir una
inversin de configuracin. Esto ocurre, en la talidomida que aun administrada en forma
enantiomricamente pura racemiza in vivo generando el enantimero indeseado. El segundo caso, el
distmero es inactivo, parece un caso ms favorable y por tanto era habitual la comercializacin de estos
frmacos hasta la ltima dcada en forma racmica. Sin embargo, estos productos han evolucionado en la
ltima dcada haca su comercializacin en su forma enantiomricamente pura, en una evolucin conocida
como racemic switch2 .

Este cambio no es obligado pero son varios los motivos relacionados entre s que lo han promovido:

La obtencin de nuevos procesos de sntesis quiral, o de purificacin de enantimeros a partir del

racmico, ms econmicos y sencillos.
La obligacin por parte de los organismo reguladores a realizar todos los estudios previos
(farmacocintica, estabilidad, ensayos clnicos...) a la comercializacin del frmaco para los dos
enantimeros aunque el frmaco vaya ser administrado en forma racmica.
La necesidad de una dosis menor en el frmaco. Como consecuencia de la reduccin de la dosis,
se reducen los efectos secundarios del frmaco.

Los dos primeros motivos son puramente econmicos, lanzar al mercado un producto
enantiomricamente puro permite reducir a la mitad los costes porque implica un menor nmero de
estudios farmacolgicos y es tcnologicamente factible. El frmaco racmico necesita doblar la dosis para
conseguir el mismo efecto que el frmaco enantiomricamente puro. Pero lo qu pasa con el ismero
inactivo, es una problema que preocupa a la industria farmacutica. No es descartable su acumulacin
innecesaria en el organismo humano provocando efectos secundarios a largo plazo. Las palabras de
Simonyi3 son adecuadas en este contexto: Si una sustancia se acumula en el organismo y no es un

33
separaciones quirales y enantiomerismo

frmaco, entonces es un veneno. Un ejemplo de lo explicado hasta ahora es la familia de los profenos
que ha sido objeto de estudio en esta tesis doctoral. Estos compuestos son antinflamatorios no
esteroidales (NSAIDs) aunque tambin presentan accin antipirtica y analgsica. Esta familia de
compuestos tiene como estructura comn el grupo cido 2-arilpropinico y la diferencia en los
sustituyentes de este grupo da lugar a una variedad de profenos, siendo el naproxeno, el ibuprofeno y el
ketoprofeno los ms significativos comercialmente. Todos los profenos contienen un centro asimtrico,
que es el tomo de carbono unido al grupo carboxlico. En todos lo casos el ismero S(+) es ms activo
farmacolgicamente que el R(-), aunque este ltimo no es txico. Estos frmacos han pasado a
comercializarse en los ltimos aos en forma enantiomricamente pura porque se ha comprobado que el
isomero S(-) sufre un proceso de acumulacin indeseado en el tejido adiposo por reaccin con los
triacilgliceroles endgenos4 .

El caso de enantimeros con efecto teraputico diferente o con efectos teraputicos complementarios son
casos ms favorable. Los enantimeros que poseen diferentes propiedades farmacolgicas se administran
en forma enantiomricamente pura y hemos de pensar en ellos como dos principios activos distintos. Por
el contrario, cuando sus efectos son complementarios se administran en forma conjunta y slo es deseable
que la proporcin de ambos sea tal que maximice el efecto teraputico y minimice los efectos secundarios.

Tabla 3.2. Distribucin de los frmacos segn su estereisomera.

Nmero de drogas totales

(1850 en 1990)

Sintnticas 72% Naturales o

Semisintticas 28 %

Aquirales 43% Quirales 29% Aquirales 0.3% Quirales 28%

Ent 3% Rac 26 % Ent 28% Rac 0.4 %

Racmicos (rac) 25% ; enantimero (ent) 31% ; aquirales= 44%

La incidencia del enantiomrismo en la industria farmacutica, tal y como se muestra en la tabla 3.2, es
importante2. Como puede observarse, un 31% de los frmacos totales se comercializan en su forma
enantiomericamente pura, y este porcentaje ha ido en aumento debido al proceso de racemic switch. Este ha
sido el caso del ibuprofeno o del atenolol dos de los principios activos de mayores ventas2 (tabla 3.3).

34
 introduccin

Tabla 3.3. Lista de los frmacos ms vendidos en 1990

Droga Actividad teraputica
Ranitidina (aq) Antiulceroso
Amoxicilina (aq) Antibitico
Captopril (en) Antihipertensivo
Enalapril (en) Antihipertensivo
Ibuprofeno (rac) NSAID
Nifedipina (aq) Antagonista del calcio
Cimetidina (aq) Antiulceroso
Atenolol (rac) Beta-bloqueador
Diclofenaco (aq) NSAID
Dilitiazem (en) Antagonista del calcio
Naproxeno (en) NSAID
Cefalexin (en) Antibitico

(aq)=aquirales, (en)=enantiomricamente puros, (rac)=racmico

No obstante, el enantiomerismo no es slo importante en la industria farmacutica sino que tiene

implicaciones en otros campos como la cosmtica, los plaguicidas y pesticidas o la industria alimentaria
(figura 3.7).

H2 NCO CH2 CO2H HO2C CH2CO NH2

Asparagina
H2N H
H NH2
(S) sabor amargo (R) sabor dulce

H
H3C O O CF3
BuOOC
N

Fluazifop

(R) herbicida, (S) inactivo

O O

Carvona

(S) aroma de alcaravea (R) aroma de menta

Figura 3.7. Ejemplos no farmacuticos de diferencias de comportamiento entre enantimeros.

Adems el fenmeno del enantiomerismo est despertando un inters especial en los ltimos tiempos y se
investiga su papel en el origen de la vida5 o su utilidad como trazadores biolgicos6 . El movimiento en la

35
separaciones quirales y enantiomerismo

biosfera de pesticidas quirales y sus residuos puede ser trazado a travs de determinaciones de excesos
enantimericos (ee) Los fenmenos de transporte habituales (volatilizacin, lixiviacin, deposicin
atmosfrica) y las reacciones abiticas (fotolsis, hidrlisis) no alteran el ee. Sin embargo, el metabolismo
de los pesticidas por parte de microorganismos y enzimas en animales superiores si lo altera. Por lo tanto,
la determinacin del ee indica la degradacin biolgica de estos productos y puede informar sobre el
origen de los pesticidas en algunos puntos de la atmsfera.

En definitiva, este creciente inters provoca una demanda de mtodos de anlisis para determinar la
pureza enantiomrica de productos basados en tcnicas fiables, rpidas y selectivas. Esta necesidad, es
especialmente importante en la industria farmacutica ya que es necesario disponer de herramientas de
anlisis para controlar la pureza ptica de frmacos durante su produccin, uso y almacenamiento.

3.5 Control y determinacin de enantimeros

3.5.1 Introduccin
Los mtodos de anlisis de sustancias quirales los podemos dividir segn se basen en tcnicas
espectroscpicas o en tcnicas de separacin. Dentro de las tcnicas espectroscpicas destacan las tcnicas
quirpticas, es decir aquellas basadas en la interaccin de los analitos con un haz de luz polarizada. El
grupo de tcnicas de separacin est constituido por las tcnicas habituales y destaca entre ellas la
electroforesis capilar. La aplicacin de esta tcnica a las separaciones quirales y a la determinacin de
purezas enantiomricas ha sido objeto de estudio de esta memoria. En consecuencia, ser tratada con
detenimiento y de forma individual.

No obstante, tambin podemos establecer un segundo criterio basado en el fundamento de la

determinacin. Distinguimos, as los mtodos que necesitan de un auxiliar quiral para proporcionar
informacin analtica de los enantimeros y los que no. Estos ltimos, son mtodos basados en tcnicas
inherentemente quirales como las quirpticas. El resto de tcnicas analticas necesitan de la interaccin
con un auxiliar quiral.

Esta interaccin se puede establecer mediante el mtodo directo y el indirecto. El mtodo indirecto,
consiste en la transformacin de los enantimeros en diasteroismeros por reaccin previa con el auxiliar
quiral. Los diasteroismeros formados poseen diferentes propiedades fsico-qumicas y pueden ser
separados, por ejemplo, en una columna convencional de HPLC. El mtodo directo consiste en la
interaccin diferencial del auxiliar quiral con los enantimeros del analito formando complejos
diasteroismericos transitorios fruto de un equilibrio dinmico. El auxiliar quiral puede ponerse en

36
 introduccin

contacto bien porque es aadido al medio o porque forma parte de la fase estacionaria en las tcnicas
separativas.

En el mtodo indirecto, los enantimeros de un compuesto A se hacen reaccionar con un enantimero

puro del auxiliar quiral B. Entonces, segn la siguiente ecuacin se forman dos especies qumicas que
guardan una relacin de diasteroisomerismo.

R,S-A + R -B [R -A,R -B] + [S-A,R -B] (3.1)

I II

Las especies I y II pueden ser diferenciadas mediante una tcnica convencional de anlisis y en el caso de
las tcnicas de separacin generan dos picos resueltos en mayor o menor medida en funcin de las
condiciones cromatogrficas. Si se dispone del otro enantimero del auxiliar quiral ( en nuestro caso S-B)
entonces el orden de elucin de los enantimeros puede ser invertido. Este mtodo presenta los
inconvenientes tpicos de cualquier derivatizacin (aumento del coste y tiempo de anlisis, derivatizacin
incompleta..) y adems es necesario, en el caso de determinaciones de pureza enantiomrica, de un auxiliar
quiral de pureza ptica muy elevada. Para estudiar esto ltimo, vamos a ver que ocurre si el racmico del
analito A reacciona con el rcemico del auxiliar B (figura 3.8).

R -B R -A,R-B I
R,S -A
S-A,R -B II
Pares de enantimeros
S-B R -A,S-BIII
S-A,S-B IV

Figura 3.8. Especies que se forman en la reaccin de A con el racmico del auxiliar quiral B.

En este caso se formaran cuatro especies, pero solo observaremos dos picos en el cromatograma aquellos
correspondientes a los picos de I y II (diasteroismeros) pero cada uno de ellos contendr solapados sus
respectivos enantimeros IV y III. Una situacin similar ocurre en las determinaciones de pureza
enantiomrica.

Si suponemos que el enantimero mayoritario de A es el R y que usamos tambin el enantimero R del

auxiliar quiral, intentaremos hallar la relacin de reas ( y as de concentraciones) entre el pico minoritario
S,A-R ,B (II) y el pco mayoritario R ,A-R ,B (I). No obstante estas reas se vern desvirtuadas por la

37
separaciones quirales y enantiomerismo

contribucin de los picos III y IV provinentes de la reaccin entre los enantimeros de A con el
enantimero minoritario del auxiliar quiral B. En definitiva, cometeremos un error en la determinacin si
el auxiliar quiral no es de una pureza enantiomrica muy elevada. Esto an limita ms el nmero de
auxiliares quirales disponibles y favorece que el mtodo directo sea ms utilizado.

El mtodo directo consiste en aadir a la disolucin (donde se har la medida en una tcnica
espectroscpica o a la fase mvil en una tcnica separativa), un auxiliar quiral que establecer un equilibrio
dinmico para formar con los enantimeros del analito (en diferente extensin) unos complejos
diasteroismericos. Estos complejos transitorios provocaran un diferente comportamiento
espectroscpico o cromatogrfico en base al cual se podr hacer una determinacin del contenido de
ambos enantimeros en la muestra original. Alternativamente, en las tcnicas cromatogrficas el auxiliar
quiral puede ser la misma fase estacionaria (columnas quirales) y la diferente distribucin de los
enantimeros en esta fase estacionaria ser la responsable de la separacin.

El contenido enantiomrico de una mezcla de esteroismeros se puede expresar de distintas maneras7 . En

polarimetra es habitual expresarlos como pureza ptica P (%), segn la siguiente frmula:

P (%) = 100 (3.2)

max

Donde max es el poder ptico rotatorio especfico del compuesto puro y el poder ptico rotatorio
especfico de la mezcla. El exceso enantiomrico (ee, ecuacin 3.3) y la pureza enantiomrica (pe, ecuacin
3.4) son otras formas habituales.

R -S (3.3)
ee = 100
R +S
R
pe = 100 (3.4)
R +S

Siendo S el enantimero minoritario en ambos casos.

3.5.2 Tcnicas de anlisis espectroscpicas

Las tcnicas quirpticas que incluyen la polarimetra, la dispersin ptica rotatoria (ORD) y el dicrosmo
circular (DC) son las tcnicas espectroscpicas de anlisis ms habituales aunque tambin otras tcnicas
como la resonancia magntica nuclear (RMN) ha sido aplicada. La polarimetra es el mtodo de anlisis
ms comn para la determinacin de purezas pticas. La nica propiedad fsica que distingue entre
substancias quirales y aquirales es la capacidad de las primeras de rotar el plano de la luz polarizada plana
(LPP). Un rayo de luz consta de dos planos oscilantes perpendiculares, correspondientes a los campos

38
 introduccin

elctrico y magntico; estos planos, a su vez, son perpendiculares a la direccin de propagacin del rayo de
luz. En un rayo de luz ordinaria se observa como las oscilaciones de los campos elctrico y magntico
ocurren en todos los planos posibles, mientras que la LPP slo oscila en un plano. La LPP es la suma de
dos componentes polarizados circularmente, uno a la izquierda (LPCI) y otro a la derecha (LPCD), de la
misma amplitud (figura 3.9). El fenmeno de la actividad ptica viene determinado por los ndices de
refraccin para la luz polarizada circularmente a la derecha (LPCD) y la polarizada circularmente a la
izquierda (LPCI) del medio considerado. y

T
T T
T
E

EL ER

Figura 3.9. Representacin del vector elctrico E como resultante de dos vectores rotatorios EL y ER

En un medio pticamente inactivo los ndices de refraccin para ambos componentes de la luz polarizada
son iguales. Sin embargo, en un medio pticamente activo, los ndices de refraccin son diferentes, por lo
que los dos componentes de la LPP se desfasan uno con respecto al otro (viajan en el medio a diferente
velocidad), dando lugar a un vector resultante igual al de incidencia pero con el plano de polarizacin
rotado grados (ecuacin 3.5).

1800 b ( L - R )
= 100 (3.5)

Donde b es el camino ptico de la celda de medida, L y R los ndices de refraccin para la componente
polarizada circularmente a la izquierda y a la derecha, respectivamente, y la longitud de onda de la
radiacin utilizada. La rotacin especfica, a una determinada longitud de onda y temperatura, viene dada
por:

100
[]T =
]

bC
(3.6)
donde C representa la concentracin y b el camino ptico. Este valor es el que se compara con la rotacin
especfica del enantimero puro (segn ecuacin 3.2) y se estima as la pureza ptica de la mezcla
problema.

39
separaciones quirales y enantiomerismo

Figura 3.10 Esquema de un polarmetro

La polarimetra proporciona datos de pureza ptica rpidos y de forma sencilla, sin embargo su aplicacin
a la determinacin exacta de excesos enantiomricos elevados es muy limitada por una serie de razones8 :

El conocimiento de la rotacin ptica especfica del enantimero puro es imprescindible

Este valor (como cualquier otra rotacin ptica) depende de mltiples factores: pH,
concentracin del analito, temperatura, naturaleza o pureza del solvente.
El analito debe poseer un poder ptico rotatorio medio o alto para poder determinar
correctamente pequeas diferencias de excesos enantiomricos
Una cantidad relativamente elevada de muestra es necesaria
La muestra no debe contener ningn otro analito quiral que contribuye al poder ptico rotatorio
total.

La dispersin ptica rotatoria (ORD) es una extensin de la polarimetra a n longitudes de onda por lo
que tambin es denominada espectropolarimetra. Comparte entonces sus ventajas y limitaciones. Las
curvas de ORD muestran un aumento hiperblico de intensidad al disminuir la sin observarse cambio
en la direccin de rotacin, siempre y cuando el medio quiral no absorba luz. En este caso se trata de una
ORD normal. No obstante, cuando se mide a una longitud de onda en una banda de absorcin del
compuesto se puede observar una dispersin anmala, una curva sigmoidal que se superpone a la curva
normal de ORD. Esta anomala en la dispersin, que supone un cambio en la direccin de la rotacin, es
llamado efecto Cotton. En el caso ms sencillo, cuando slo existe un efecto Cotton, la distancia entre el
mximo y el mnimo de la curva puede utilizarse para medidas cuantitativas.

40
 introduccin

La espectroscopia de dicroismo circular (DC)9 es la ms sofisticada de las tcnicas quirpticas porque

consiste en una medida simultnea de una rotacin y una absorcin de la radiacin polarizada. Cuando
un medio quiral absorbe luz no slo tiene lugar la rotacin del plano de la LPP, sino que adems los dos
componentes circulares del haz pueden ser absorbidos en diferente grado ( L- R) de forma que el rayo
incidente de luz polarizada plana emerge como un rayo polarizado elpticamente, cuyo eje mayor est
rotado grados (figura 3.11). El hecho que los dos componentes de la luz polarizada plana se absorban en
diferente extensin provoca que su suma ya no genere una luz polarizada en un plano sino una elipse cuya
relacin entre ejes es denominada elipticidad (). Por convencin, la diferencia = L- R es denominada
dicrosmo y se mide mediante o bien mediante la diferencia de absorbancia medida para ambos
componentes.

y
"

$
b
E

EL

ER

Figura 3.11. Representacin de las componentes circularmente polarizadas a la derecha y a la izquierda de

la LLP al atravesar una sustancia pticamente activa cuando hay absorcin de radiacin.

La elipticidad (en radianes )puede calcularse a travs de la siguiente expresin:

= 2.303( L - R ) bC (3.7)

Siendo b el camino ptico y C la concentracin del soluto quiral absorbente. Como puede observarse, la
relacin entre la elipticidad y la concentracin es anloga a la ley de Lambert-Beer. Los dos enantimeros
de un compuesto presentan un espectro de DC idntico pero de signo contrario de tal manera que una
mezcla de ambos presenta una seal que es la diferencia de ambos espectros. Si se conoce la elipticidad de
un enantimero puro por comparacin puede calcularse la pureza ptica de una mezcla. No obstante, este
tipo de anlisis tiene los mismos inconvenientes expuestos para la polarimetra.

41
separaciones quirales y enantiomerismo

La resonancia magntica nuclear (RMN) ha sido otras de las tcnicas espectroscpicas usadas en el anlisis
de sustancias quirales. Esta tcnica no diferencia entre enantimeros al menos que stos hayan sido
convertidos en diastereoismeros por reaccin con un reactivo quiral. De esta forma, los picos idnticos
que aparecen en el espectro de ambos enantimeros, aparecen con un desplazamiento qumico diferente al
formarse los diastereoismeros. La relacin molar de stos (y, por tanto, de los enantimeros) puede ser
determinada por las intensidades relativas de los picos.

La derivatizacin de enantimeros con un auxiliar quiral formar disteroismeros (mtodo directo) es la

opcin ms usada para la determinacin de purezas pticas mediante RMN en contra de los reactivos
quirales lantnidos o los agentes quirales solvatantes que forman complejos diasteroisomricos transitorios
(mtodo indirecto). La tabla 3.4 resume los agentes derivatizantes quirales ms usuales en RMN de
hidrgeno y fluor-19.

Tabla 3.4. Algunos agentes derivatizantes quirales usados en RMN

cido R-O-acetilmandlico
R,R-2,3-butandiol
cido camfnico
R-2-fluoro-2-feniletilamina
cido S-O-metilmandlico

Los reactivos lantnidos quirales son compuestos de coordinacin seis que forman complejos de adicin
dbiles con una gran cantidad de sustancias orgnicas. La tabla 3.5 indica alguno de estos agentes quirales:

Tabla 3.5 Ejemplos de reactivos lantanidos quirales

L en LnL3 Lantnido (L) Abreviatura
Dicamfoil-d-metanato-
heptafluorodihidroximetileno- Eu Eu(dcm)3
d-camforato
Pivaloil-d-camforato- Eu Eu(hfc)3
trifluorohidroximetileno-d- Yb Yb(hfc)3
camforato Pr Pr(hfc)3

Estos agentes quirales provocan desplazamientos diferenciados para los enantimeros de un analito en el
espectro de RMN de 1H y 13C.

42
 introduccin

Los agentes quirales solvatantes son la otra alternativa para diferenciar la seal de RMN de dos
enantimeros. Estos solventes forman complejos diastereoisomricos de solvatacin de diferente
extensin con los dos enantimeros del analito va un rpido equilibrio reversible. Este mtodo es
simple y ha sido usado para la determinacin de la pureza enantiomrica de lactonas o teres. El agente
solvatante ms habitual es el 1-(9-antril)-2,2,2-trifluoroetanol (TFAE) que provoca desplazamientos
qumicos de los espectros de RMN de 1H y 19C.

3.5.3 Tcnicas de anlisis cromatogrficas

Las tcnicas cromatogrficas son tcnicas habituales usadas para la separacin y posterior determinacin
de los enantimeros de un compuesto. Entre ellas destacan por el nmero de aplicaciones la
cromatografa de lquidos de alta resolucin (HPLC) y la cromatografa de gases (GC). Sin embargo,
tambin existen aportaciones interesantes de la cromatografa de fluidos supercrticos (SFC) o la
cromatografa de capa fina (CCF)10 . A pesar del gran xito de las tcnicas cromatogrficas en el anlisis
quiral existen tambin algunas fuentes potenciales de error en la determinacin de excesos enantiomricos:
(ee). Por ejemplo;

enantiomerizacin de compuestos lbiles en la fase estaciona quiral: algunos analitos pueden

invertir su configuracin cuando interactan con la fase estacionaria quiral. En este caso el ee se
desplazar hacia el primer enantimero en eluir (el de menor retencin).
contaminacin del pico del analito con impurezas: la matriz que acompaa al analito, puede
contener alguna especie interferente. La adecuada seleccin de los parmetros cromatogrficos
que afectan a la separacin evita este problema.
respuesta no-lineal del detector: para poder determinar el ee, es necesario conocer la
concentracin del enantimero mayoritario y minoritario. Puede ocurrir que algunas de las dos
determinaciones se produzca fuera del intervalo de linealidad del mtodo.

HPLC es una tcnica exitosa en la separacin de enantimeros tanto por el mtodo directo como por el
indirecto. Las sustancias quirales habitualmente separadas en forma de diasteroismeros son aminas,
alcoholes y cidos carboxlicos porque poseen grupos funcionales que facilitan su derivatizacin. Esta
derivatizacin tiene como objetivo permitir la resolucin quiral pero tambin puede aprovecharse para
mejorar las propiedades de deteccin del analito (derivatizacin con un cromforo o fluoroforo quiral).
Algunos agentes derivatizantes quirales se muestran en la tabla 3.5.

43
separaciones quirales y enantiomerismo

Sin embargo, siempre que es posible, el mtodo directo es la opcin elegida. Podemos distinguir dos
posibilidades: la adicin de un reactivo quiral a la fase mvil o el uso de una fase estacionaria quiral. Estos
aditivos quirales aadidos a la fase mvil se conocen como selectores quirales y hablamos entonces de
interacciones selector-selectante (analito). Entre los selectores quirales ms habituales en HPLC podemos
incluir a los complejos metlicos, las ciclodextrinas y los contraiones quirales.

La separacin quiral mediante complejos metlicos se fundamenta en el fenmeno del intercambio de

ligandos entre un quelato consistente en un cation central (Cu(II), Zn(II o Ni(II) ) ms dos ligandos
quirales bifuncionales (normalmente aminocidos) y los enantimeros del analito. El analito sustituye uno
de los ligandos quirales para formar un complejo ternario mixto. La enantioseparacin es posible debido a
la diferente estabilidad de los complejos con los enantimeros R y S. Este intercambio de ligandos se
produce en la fase mvil y la separacin se lleva a cabo en fases estacionarias tradicionales (C8 ,C18).

Tabla 3.6. Complejos metlicos usados en la resolucin de compuestos quirales mediante cromatografa
de intercambio de ligandos
Ligando Catin Metlico Fase Estacionaria Analito
L-prolina Cu2+ Octilo-silica Aminocidos
Acido mandlico y
L-fenilalanina Cu2+ Octadecilo-silica
derivados
L-histidina Cu2+ Octilo-silica Aminocidos
R,R-cido tartrico Cu2+,Ni2+ Octadecilo-silica Aminocidos

Las ciclodextrinas (, o ) son oligosacridos cclicos consistente en seis, siete u ocho anillos de
glucopiranosa respectivamente. Tienen una forma de cono truncado con una cavidad relativamente
hidrofbica que puede albergar a una gran variedad de compuestos (complejos host-guest). Las
ciclodextrinas son quirales y en consecuencia cuando actan como husped incluyen en su interior en
diferente extensin a los enantimeros de un compuesto. Por tanto, aadidas como un aditivo a la fase
mvil permiten la separacin de enantimeros en columnas aquirales.

Otra posibilidad, es la separacin de enantimeros haciendo uso de la formacin de pares inicos.

Analitos que contienen un grupo amino pueden formar un par inico con un contrain como el cido
(+)-10-camforsulfnico. Si el analito es quiral, sus enantimeros formaran complejos de diferente
estabilidad y su separacin ser posible.

44
 introduccin

No obstante, la opcin ms habitual para conseguir la separacin es el uso de fases estacionarias quirales
(CSP). Estas separaciones consisten en la diferente particin que presentan los analitos con estas fases
estacionarias capaces de reconocer diferencias estereoqumicas. El nmero de CSPs disponibles
comercialmente y las posibilidades de separacin son mltiples por lo que existe en la bibliografa tratados
especficos sobre el tema11 . En esta memoria, slo se comenta brevemente la divisin y el fundamento de
las CSP ms comunes.

Tabla 3.7 Fases estacionarias quirales disponibles comercialmente (DNB=dinitrobenzoilo)

Tipo Nombre Unidad Quiral Fase mvil habitual Distribuidor
Pirkle BakerbondChiral S-DNB-leucina Hexano/isopropanol Baker
Spherisorb Chiral 2 R-Naftiletilurea Hexano/isopropanol PhaseSep
Covalent L-leucina S-DNB-leucina Hexano/isopropanol Regis/Alltech
Ligando Chiralpak WM Aminoacido-Cu(II) Tampn acuoso Daicel
Triacetato de
Celulosa Chiralcel CA-1 Tampn acuoso Daicel
celulosa
Carbamato de
Chiralcel OD Tampn acuoso Daicel
trifenilcelulosa
Inclusin ChiraDex -ciclodextrina Tampn acuoso Merck
CrownPack CR ter quiral HClO4 (aq) Daicel
Tampn fosfato-
Protena Chiral-AGP -glicoprotena Baker
solvente orgnico

Las columnas quirales tipo Pirkle o brush-type CSP son las ms extendidas porque son ms baratas y
resistentes que aquellas basadas en polmeros naturales (protenas, celulosa,ciclodextrinas..). Adems estn
disponibles en su forma R y S, lo que permite invertir el orden de elucin de los enantimeros si es
necesario y permiten adems usarlas en modo preparativo. No obstante presentan algunas desventajas que
limitan su uso como la necesidad de analitos con algn grupo aromtico y de polaridad baja o media. Esto
se debe al mecanismo de enantiodiscriminacin que se esquematiza en la figura 3.12.

Zona de interaccin
R
Si H Anillo
aromtico
H H H
N N N

O O

Figura 3.12. Representacin esquemtica de una columna tipo Pirkle.

45
separaciones quirales y enantiomerismo

La enantiodiscrminacin se basa en una interaccin triple de carcter secundario como fuezas de Van der
Waals, puentes de hidrgeno o interacciones cido-base. No obstante, la interaccin ms importante en
este tipo de columnas son las interacciones electoestticas - entre el anillo aromtico del analito y el
grupo amida, carbomato o urea de la zona de interaccin de la columna. Este enlace secundario no es
estereoespecifco pero ancla el analito a la columna. La parte quiral del analito entonces interacciona de
forma estereoespecifca con la cadena terminal de la columna.

Las fases estacionarias basadas en el fenmeno del intercambio de ligandos se fundamentan en el mismo
fenmeno explicado para el selector libre adicionado a la fase mvil (pg 20). El inconveniente de estas
columnas es su poco universalidad ya que slo se pueden enantioseparar analitos capaces de
intercambiarse con los ligandos del complejo de Cu (II) como los aminocidos o aminoalcoholes. Otro
tipo de columnas de elevado uso son las de celulosa o derivados como unidad quiral. La celulosa es un
polmero compuesto por unidades de D-(+)-glucosa y por tanto puede discriminar entre los
enantimeros de un compuesto. Las propiedades de adsorcin o de discrminacin quiral pueden ser
modificadas derivatizando los grupos OH de la celulosa con grupos como el acetato, el benzoato o el
carbamato generndose as una gran variedad de fases estacionarias quirales.

El fenmeno de la inclusin tambien ha sido aprovechado para proponer fases estacionarias con
ciclodextrinas o teres coronas quirales. Las columnas de ciclodextrinas son relativamente estables y
pueden ser diseadas en unas dimensiones que permitan su uso en modo preparativo. Sin embargo,
presentan una capacidad de enantiodiscriminacn menor que aadidas como selector quiral a la fase mvil
probablemente porque su unin a la fase estacionaria implica que queden ligadas en una conformacin fija
que dificulta ms la inclusin que cuando estn libres en disolucin. Las columnas de teres corona
quirales se emplean para enantiodiscriminar analitos que contengan algn grupo amino primario y
presentan el inconveniente de su elevado coste econmico. Fases estacionarias con protenas como
elemento de reconocimiento quiral tambin han sido descritas siendo la de -glicoprotena y la de
albmina srica humana las ms habituales.

Un gran nmero de monografas y revisones bibliogrficas sobre la aplicacin de la CG a las separaciones

quirales han sido publicadas12 ,13 . El desarrollo de la CG como tcnica de anlisis quiral viene ligada a
separciones enantiomrias de aromas y feromonas. En la actualidad, algunos pesticidas, insecticidas y
auxiliares quirales en sntesis de naturaleza voltil han sido analizados por Chiral GC. Esta
enantioseparaciones son dependientes de la temperatura e incluso puede haber un cambio del orden de
elucin de los enantimeros a una temperatura dada ( Tiso o temperatura isoenantioselectiva). Durante un
largo periodo de tiempo, la conversin a diasteroismeros fue el nico mtodo de anlisis disponible para

46
 introduccin

separar enantimeros. Estas aplicaciones hacen uso de auxiliares quirales como el (-)-mentol o el R,R-2,3-
butandiol (tabla 3.8).

Tabla 3.8. Algunos auxiliares quirales usados en GC y HPLC para separaciones quirales indirectas.
Auxiliar quiral Comentario
Acido 2-acetil- D-lctico Para formar estres con alcoholes quirales
R-(-)-2-Butanol Para formar steres con cidos o glicsidos con monosacridos
1R,3R,4S-(-)-Mentol Idem con amionocidos o hidroxicidos
2R,3R-(-)-Butandiol Para forma acetales cclicos con cicloalcanonas o hidrocarburos con
un grupo carbonilo.

Sin embargo, est opcin est actualmente en desuso y se prefiere la separacin directa de los
enantimeros en columnas quirales. El mtodo indirecto slo se aplica cuando se consigue una mejora en
la sensibilidad o en la volatilidad del analito como por ejemplo haciendo uso de auxiliares quirales con
tomos de halgeno en su estructura que permiten mejorar los lmites de deteccin en el detector de
captura electrnica (ECD). Las columnas quirales en GC se fundamentan en los mismos principios de
separacin expuestos para las columnas de HPLC siendo las columnas de ciclodextrinas y las tipo Pirkle
las ms habituales.

La cromatografa de fluidos supercrticos (SFC) y tcnicas relacionadas14 se ha mostrado desde su

introduccin como tcnica de anlisis de molculas quirales como una alternativa vlida a la tcnicas
cromatogrficas ms establecidas (HPLC y GC). Los fluidos supercrticos tienen un poder de solvatacin
cercano al de los lquidos pero mantienen la baja viscosidad de los gases. Estas propiedades permiten el
anlisis de compuestos no volatiles o trmicamente inestables que no son adecuados para GC y mantener
una buena eficiencia de la separacin (superior a la que se obtiene en HPLC). En el campo de las
separaciones quirales, SFC se lleva a cabo usualmente con dixido de carbono supercrtico como eluyente
(ms algn modificador orgnico) y las misma columnas quirales descritas para HPLC (tabla 3.7). En
general, SFC permite obtener mejores resoluciones quirales (picos ms estrechos) y menores tiempos de
anlisis. Esta reduccin del tiempo de anlisis est relacionada con la menor viscosidad del fluido
supercrtico (comparado con el lquido) lo que permite el uso de caudales ms elevados y de columnas ms
largas (o incluso varias columnas en serie) porque la cada de presin a lo largo del sistema es menor. Otra
ventaja de la tcnica es la posibilidad de usarla en modo preparativo y obtener as pequeas cantidades de
los enantimeros puros. Sin embargo, tambin presenta inconvenientes bsicamente relacionados con su
alto coste porque a parte del uso de CSPs de precio elevado y estabilidad reducida hay que aadir los
costes instrumentales derivados de utilizar un fluido supercrtico (dispensador de dixido de carbono,
reguladores de presin que eviten su expansin a gas, celdas especiales de medida etc).

47
separaciones quirales y enantiomerismo

3.5.4 Aplicacin de la electroforesis capilar a las separaciones quirales

En el captulo 2 se han expuesto las ventajas generales de la CE como tcnica de separacin y sus campos
de aplicacin. En el campo de las separaciones quirales, CE es una tcnica muy exitosa, prueba de ello son
las mltiples revisiones bibliogrficas aparecidas15 ,16 ,17 o la publicacin de tratados especficos del tema18 .
Entre estas revisiones destacan la de Verleysen19 et al. que incluye ms de 350 referencias y la de Gbitz20
et al. que reporta condiciones de separacin de ms de 250 analitos quirales. Estas separaciones se llevan a
cabo bsicamente en el modo CZE o MEKC aadiendo al BGE un selector quiral que discrimina entre
los dos enantimeros (mtodo directo). Las ventajas que ofrece la CE en las separaciones quirales son
varias:

Su alta eficacia en la separacin permite que una pequea diferencia de estabilidad entre los
enantimeros del selectante y del selector provoque enantioseparacin. Esta pequea
discriminacin quiral probablemente no sera detectada mediante otra tcnica cromatogrfica
La concentracin y naturaleza del BGE puede ser rpidamente modificada lo que aumenta la
capacidad de resolucin de la tcnica. Esta versatilidad no es posible con tcnicas que usan
selectores quirales inmovilizados
El hecho que el selector quiral este libre en disolucin favorece la interaccin con el selectante
porque no est en una conformacin fija como cuando est inmovilizado
Una combinacin de selectores quirales puede ser usada para mejorar la resolucin quiral
El mnimo consumo de muestra y reactivos permite el uso de selectores quirales caros

No obstante, todas estas ventajas pueden ser resumidas en una sola, la probabilidad de xito. Comparada
con otras tcnicas anlogas, la probabilidad de conseguir la separacin quiral de un analito mediante CE es
superior. Esto es an ms evidente cuando se pretende separar y enantioseparar simultneamente una
mezcla de compuestos quirales (por ejemplo metabolitos de un frmaco). Este problema analtico es difcil
de abordar con tcnicas de menor poder de resolucin o la solucin puede necesitar de condiciones de
separacin diferentes para algunos analitos de la mezcla.

Sin embargo, las separaciones quirales mediante CE tambin presentan inconvenientes:

La separacin quiral depende de mltiples factores; pH del BGE, concentracin y naturaleza del
BGE , fuerza inica del BGE o temperatura del capilar. La optimizacin de estos parmetros es
bsicamente emprica lo que dificulta el desarrollo del mtodo.

48
 introduccin

La presencia del selector quiral en el BGE complica el acoplamiento de la tcnica con detectores
como el polarimtrico, el dicrosmo circular o el espectrmetro de masas (MS). Esto ltimo es
una limitacin importante para la aplicacin de la Chiral CE a muestras con matrices complejas
donde el uso de un detector tan selectivo como el MS es necesario.
No es posible su uso en modo preparativo para obtener fracciones de los enantimeros puros.

Los principios de la separacin quiral mediante CE son varios de los cuales los ms importantes son:

1.Complejacin por intercambio de ligandos . Como ya se ha comentado, los enantimeros de un compuesto

pueden formar complejos de diferente estabilidad con un complejo constituido por un in metlico (Cu2+,
Ni2+) y un aminocido pticamente puro. La adicin del analito provoca la sustitucin de uno de estos
amianocidos por el analito para formar un complejo ternario.

2.Complejacin host-guest o de inclusin: los complejos en los que el analito (molcula guest) es espacialmente
incluido en el interior de un ligando (molcula host) son llamados complejos host-guest o de inclusin. De
esta forma, ciertos compuestos quirales que tienen la capacidad de actuar como host son utilizados para
formar complejos con un elevado nmero de compuestos de inters, con el fin de conseguir su resolucin
enantiomrica. Estos compuestos son los siguientes:

- teres corona21 . Los teres corona son politeres macrocclicos consistentes en un cierto nmero de
tomos de oxgeno , que forman un plano, unidos por cadenas de dos carbonos, algunos de los cuales
contienen grupos -COOH. El anillo crea una cavidad capaz de formar complejos con cationes alcalinos y
alcalinotrreos, as como aminas primarias protonadas. La amina primaria puede penetrar en la cavidad
formando enlaces de hidrgeno con los tomos de O; no obstante, la enantioseparacin proviene, en
general, de la interaccin entre los substituyentes del centro asimtrico y los grupos -COOH del anillo
mediante interacciones de enlace de hidrgeno y/o electrostticas.

O
HOOC COOH
O O

O O COOH
HOOC
O

Figura 3.13. Estructura del (+)-(18-Crown-6)-2,3,11,12-tetra-carboxylic acid

49
separaciones quirales y enantiomerismo

- Antibiticos macrocclicos22 :como el Rifamycin B, Vancomycin o Teicoplanin. Estos compuestos pueden

exhibir una enatioselelectividad superior a las de las ciclodextrinas. Las interacciones principales entre
estos selectores quirales y los analitos son interacciones electrostticas, mientras que las secundarias son
interacciones de puente de hidrgeno, hidrofbicas, dipolo-dipolo o 6-6. A pesar de su alta
enantioselectividad y poder de resolucin, tambin presentan ciertos problemas como una alta absorcin
en el UV, adsorcin en la pared del capilar e inestabilidad a ciertos pHs y temperaturas.

- Ciclodextrinas (CDs)12. Las ciclodextrinas naturales , y -CD o sus anlogas modificadas qumicamente
han sido ampliamente utilizadas. Su forma es la de un cono truncado de extremos abiertos, con un
dimetro de la cavidad determinado por el nmero de unidades de glucosa (tabla 3.8). Las ciclodextrinas
son muy estables, resistentes a la luz y no absorben apreciablemente en el UV-visible.

Tabla 3.8. Propiedades fsico-qumcas de las ciclodextrinas naturales

Parmetro -CD -CD -CD
Unidades de glucosa 6 7 8
Masa molecular 972 1135 1297
Dimetro interno de la
5,7 7,8 9,5
cavidad ()
Dimetro externo de la
13,7 15,3 16,9
cavidad ()
Solubilidad en agua
14,5 1,8 23,2
(25C) (% w/v)

La cavidad de las CDs es relativamente hidrofbica, mientras que la superficie es hidroflica. Los
substituyentes hidroxilo en las posiciones 2 y 3 (hidroxilos secundarios), y 6 (hidroxilos primarios) de cada
unidad de glucosa son los responsables de las interacciones quirales, puesto que estn unidos a carbonos
asimtricos. La separacin enantiomrica se basa en la inclusin de una funcin aromtica o alqulica en la
cavidad, ms enlaces de hidrgeno adicionales entre los grupos hidroxilo secundarios de la ciclodextrina y
substituyentes de la molcula guest. Los cinco tomos de carbono asimtricos de cada unidad de glucosa
confieren a las ciclodextrinas sus propiedades quirales. Las ciclodextrinas naturales, especialmente la -
CD, pueden ser derivatizadas para dar nuevos selectores quirales, tanto neutros como cargados, con una
capacidad enantioselectiva diferente a la de la ciclodextrina natural.

50
 introduccin

OR1
OR2

OR3

Figura 3.14. Estructura general de una ciclodextrina y esquema de su cavidad

- Calixarenos quirales23 . Los calixarenos forman tambin complejos de inclusin, pero hasta ahora su
utilizacin ha sido mnima.

3. Interacciones de afinidad con polisacridos lineales24 . Estos selectores son de origen biolgico y consisten
en varias unidades de monosacridos quirales. A este grupo pertenecen las maltodextrinas, los
maltooligosacridos como el dextrn y el dextrn. La estructura helicoidal de las dextrinas podra ser la
responsable del reconocimiento quiral, siendo las interacciones principales los enlaces de hidrgeno y las
interacciones dipolo-dipolo.

4. Interacciones de afinidad con protenas25 . Estos selectores quirales son compuestos naturales formados
por aminocidos en su estructura polimrica, que pueden estar cargados positiva o negativamente, o
neutros, dependiendo del pH del BGE. En funcin del pH los puntos de interaccin entre analito y
protena cambian, modificndose as la estereoselectividad. Entre las protenas utilizadas para la separacin
enantiomrica destacan la albumna srica humana o el avidin.

5. Utilizacin de micelas26 . En el caso de la MEKC la separacin de enantimeros puede realizarse por

medio del uso de micelas quirales (sales biliares como colato o taurocolato sdico, o derivados de
aminocidos, como el N-dodecanoil-L-valinato o N-dodecanoil-L-alalinato sdico), o mediante la
combinacin de micelas y ciclodextrinas (CD-MEKC). En esta ltima modalidad, el analito se distribuye
entre la fase micelar y la ciclodextrina, y prcticamente no existe en la fase acuosa.

6. Interaccin con un selector quiral enlazado a la pared del capilar o con un capilar relleno de una fase estacionaria
quiral en CEC27 .

51
separaciones quirales y enantiomerismo

Desde su aparicin como tcnica de anlisis quiral, la eleccin de un principio de separacin o utro de los
anteriormente expuestos ha sido bsicamente emprica. Sin embargo, despus de ms de una dcada de
investigacin en este campo se observan en la literatura algunas tendencias que ayudan a elegir el tipo de
selector quiral ms adecuado para un analito dado. Este es el objetivo del anexo VI de esta memoria,
donde se proponen pautas para la correcta eleccin del selector quiral en funcin de la estructura del
selectante y se discuten las posibilidades de los selectores quirales expuestos anteriormente.

Para las CDs, que constituyen los selectores quirales de mayor uso, se ha desarrollado un modelo
tericos para explicar la enantioseparacin28 . No obstante, es un modelo genrico que puede ser aplicado
a cualquier otro selector neutro que forma complejos 1:1 con el analito.

Para dos enantimeros A y B, que interaccionan con un selector quiral C, para dar los complejos AC y BC
pueden escribirse las siguientes ecuaciones qumicas:

A + C D AC K1= [AC]/[A][C] (3.8)

B + C D BC K2= [BC]/[B][C] (3.9)

La movilidad electrofortica de cada enantimero ser funcin lineal de su movilidad en forma libre y de
la movilidad del complejo segn:

A= A1 + AC2 (3.10)

B= B1 + BC3 (3.11)

Donde A , AC, B , BC son las fracciones molares de las especies A, AC, B y BC respectivamente: 1, la
movilidad del soluto libre, y 2 la movilidad del complejo AC. Obsrvese en la ecuacin 3.11, que el
trmino 3, la movilidad del complejo BC es igual al trmino 2 ya que ambos complejos tienen la misma
relacin carga-radio por lo que denominaremos a partir de ahora 2 a la movilidad de cualquiera de los dos
complejos. Los trminos de las fracciones molares pueden expresarse como:

[A ]
A = (3.12)
[A] + [AC]

[B] (3.13)
B =
[B] + [BC ]
52
 introduccin

Expresiones anlogas pueden encontrarse para los trminos AC y BC. Si sustituimos estos trminos en la
ecuacin 3.10 obtenemos :

1 + 2 K1 [C]
A = (3.14)
1 + K1 [C]

donde K1 es la constante de equilibrio del complejo AC (tambin llamada constante de inclusin) y [C] la
concentracin de selector quiral. Se pude hallar una expresin similar para el enantimero B si sustitumos
K1 por K2. La resolucin ser proporcional a la diferencia de movilidades entre los dos enantimeros
(=A -B ). Si remplazamos en esta expresin las movilidades descritas por la ecuacin 3.14 llegamos a:

[C]( 2 1 )(K 1 - K 2 )
= (3.15)
1 + (K 1 + K 2 )[C] + K1 K 2 [C]2

Se deduce que en medio aquiral donde no existe selector quiral ([C]=0) la separacin quiral no es posible
porque ambos enantimeros presentarn igual movilidad electrofortica. Esta separacin ser mayor
cuanto mayor sea la diferencia en las constantes de inclusin de ambos analitos (K1-K2) y cuanto mayor
sea la diferencia de movilidad entre las forma complejadas y los enantimeros libres.

Como la diferencia de movilidad entre los enantimeros es funcin de la concentracin de selector quiral
si derivamos la expresin 3.15 respecto a esta concentracin e igualamos a cero podemos hallar para que
concentracin de selector quiral la diferencia de movilidad electrofortica es mxima. Esta operacin
conduce a la siguiente expresin:

1
C ptima = (3.16)
K1K 2

El modelo predice entonces que los enantimeros con una alta afinidad por el selector quiral necesitarn
una concentracin de ste ms baja para ptimizar la resolucin quiral.

La aplicacin de la CE en las separaciones quirales fue calificada por Vespalec15 en 1999 como una
tcnica madura con un nmero de publicaciones que crece exponencialmente cada ao y con un
fundamento terico y una descripcin matemtica disponible. En definitiva, consideraban que el perodo
de investigacin inicial de la CE en este campo haba llegado a su fin. Recientemente, Chankvetadze17 se
expresa en trminos parecidos y reflexiona sobre la necesidad de aplicar la Chiral CE a problemticas
como la determinacin de purezas enantiomricas en muestras reales que ayuden a la aceptacin de la
Chiral CE no slo a nivel acadmico sino tambin industrial.

53
separaciones quirales y enantiomerismo

La aplicacin de la CE a la determinacin de purezas enantiomricas ha sido reducida5 y algunos ejemplos

se muestran en la tabla 3.9. La gran resolucin necesaria y otros problemas relacionadas con la sensibilidad
han sido en parte las causa de este desinters. Aquellas aplicaciones que reportan resoluciones a lnea base
no podran aplicarse a la determinacin de excesos enantiomricos. En el caso de muestras reales(no
mezclas sintticas como la mayora de los ejemplos de la tabla 3.9) pueden aparecer otros problemas
relacionados con la matriz puede contener analitos interferentes.

Tabla 3.9. Algunas determinaciones de purezas enantiomricas mediante CE

Enantimero Impureza Selector quiral usado Deteccin
detectado Enantiomrica (%)
D-Loxiglumida 29
0.2 1mM Vancomycin UV 255 nm
(-)-Isoproterenol 30
0.1 25 mM Ryfamicin Indirecta UV 350 nm
(+)-Fluparoxan31 1.0 150mM -CD UV 214 nm
D-Triptofano32 0.05 75mM -CD UV 214 nm
(R)-Ropivacaina33 0.25 100mg/ml Met -CD a CE-MS
(R)-Ketoprofeno34 0.20 50mM TM--CD a UV 254 nm
a Derivados metilados de la -CD; mometilada (Met--CD) y trimetilada (TM--CD)

54
 introduccin

Referencias

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