EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD

DE REACCIN TRIPSINA

INTRODUCCIN

Cuando se utilizan concentraciones crecientes de sustrato en una serie de

determinaciones, se encuentra generalmente una curva hiperblica. La velocidad se
expresa corrientemente en unidades (mol de producto formado o de sustrato
transformado por minuto) o en actividad especfica (unidades por miligramo de protena).
La velocidad aumenta con la concentracin de sustrato hasta que se aproxima de forma
asinttica a una v mxima (Vmx), despus de la cual concentraciones mayores de
sustrato no aumentan de forma significativa la velocidad de reaccin. En la primera parte
inferior de la curva hiperblica, la reaccin se aproxima a una cintica de primer orden, lo
que significa que v es una funcin directa de la concentracin de sustrato porque los sitios
activos de las molculas de enzima no estn saturados. En la porcin superior de la
grfica, la reaccin se aproxima a cintica de orden cero porque los sitios activos de todas
las molculas de enzima estn saturados y la velocidad de reaccin, es por consiguiente,
independiente de posteriores incrementos en la concentracin de sustrato. El Km es la
concentracin de sustrato necesario para obtener la mitad de la velocidad mixma. Y se
expresa en M(molaridad) (Armstrong y Bennett, 1982). Puede considerarse como medida
aproximada de la afinidad de una enzima. En esta ocasin para hallar el Km se trabajar
con el grfico de Lineweaver y burck que es una modificacin de la ecuacin de michaelis
y menten. En esta prctica se trabaj con la tripsina que libera a la p-nitroanilina del
BAPNA; esto es medido con un elecrofotmetro a 410nm. Los objetivos son calcular el Km
y la Vm. Hallar las diferencias cuando se usan diferentes concentraciones de enzima

Metodologa.

1. Se agregan a tubos 2.5ml de BAPNA ms Tris, en cantidades de BAPNA sealadas

por el profesor (0.75, 1, 1.25, 1.5, 1.75, 2, 2.25) y cada uno tiene un tubo a reaccionar y
un tubo blanco
2. Se pre-incubas los tubos 5 minutos a 37C
3. Se agregan a los tubos (que NO SON LOS BLANCOS) 0.25ml de la solucin de
trabajo. Esta vara de acuerdo al grupo. Se trabaja con 2ml de tripsina en 25ml (enrasado
con una solucin que contiene HCl y CaCl2), 3ml en 25ml, 1ml en 25ml, 1.33ml en 25ml.
Considerar que el stock de tripsina tiene una concentracin de 12.3mg%
4. Se incuban todos los tubos 10 minutos a 17C
5. Se agregan 0.25ml de cido actico a los tubos
6. Se agregan 0.25ml de la solucin de trabajo a los tubos blanco

Resultados

En la siguiente tabla (TABLA 1) se observan los siguientes ttulos. Absorbancia obtenida

de la resta entre la absorbancia obtenida en un tubo con su respectivo blanco.
Concentracin del producto (M) hallada dividiendo la Absorbancia entre el
coeficiente de extincin molar de nitroanilina 7760 (1/cm.M). Cantidad de moles de
producto obtenido en los 3ml totales de la reaccin, esta fue obtenida por regla de tres
simple, trabajando con la concentracin de producto obtenida anteriormente. UE
(mol/minuto), obtenida dividiendo la cantidad anterior entre 10 minutos.
La concentracin del sustrato se encuentra sabiendo que hay 0.04g de BAPNA
(PM=434.88g), es decir 9,198.10 -5 moles de BAPNA. Entonces la concentracin del BAPNA
en los 100ml en los que se encontraba es 9,198.10-4M. Con la frmula de dilucin
(C1V1=C2V2) se encuentra la concentracin en las diferentes diluciones de BAPNA con las
que se trabaja en cada tubo. Cada grupo trabaj con diferente concentracin de enzima
tambin sealada

Cantid Absorban Concentrac Cantidad UE Concentra 1/V 1/S (1/M)

ad de cia in de de (mol/min) cin de (min/mol
BAPNA producto producto sustrato )
(ml) (M) (mol) (S)M.
2ml de tripsina en 25 ml (0.984mg% de tripsina)
0.75 0.122 1.57216E- 4.71649E- 4.71649E- 0.0002759 2120218 3624.015
05 08 09 4 58
1 0.172 2.21649E- 6.64948E- 6.64948E- 0.0003679 1503875 2718.011
05 08 09 2 97
1.25 0.18 2.31959E- 6.95876E- 6.95876E- 0.0004599 1437037 2174.409
05 08 09 04
1.5 0.207 2.66753E- 8.00258E- 8.00258E- 0.0005518 1249597 1812.007
05 08 09 7 42
1.75 0.206 2.65464E- 7.96392E- 7.96392E- 0.0006438 1255663 1553.149
05 08 09 5 43
1.25 0.177 2.28093E- 6.84278E- 6.84278E- 0.0004599 1461393 2174.409
05 08 09 60
1.5 0.187 2.40979E- 7.22938E- 7.22938E- 0.0005518 1383244 1812.007
05 08 09 7 21
1.75 0.196 2.52577E- 7.57732E- 7.57732E- 0.0006438 1319727 1553.149
05 08 09 5 89
2 0.212 2.73196E- 8.19588E- 8.19588E- 0.0007358 1220125 1359.005
05 08 09 3 79
2.25 0.221 2.84794E- 8.54381E- 8.54381E- 0.0008278 1170437 1208.005
05 08 09 1 41
3ml de enzima en 25 ml (1.476mg% de tripsina)
0.75 0.19 2.44845E- 7.34536E- 7.34536E- 0.0002759 1361403 3624.015
05 08 09 4 51
1.25 0.235 3.02835E- 9.08505E- 9.08505E- 0.0004599 1100709 2174.409
05 08 09 22
1.5 0.29 3.73711E- 1.12113E- 1.12113E- 0.0005518 8919540 1812.007
05 07 08 7 2.3
2 0.351 4.5232E-05 1.35696E- 1.35696E- 0.0007358 7369420 1359.005
07 08 3 7
2.25 0.327 4.21392E- 1.26418E- 1.26418E- 0.0008278 7910295 1208.005
05 07 08 1 6.2
1ml de la enzima en 25 ml (0492mg% de tripsina)
0.75 0.111 1.43041E- 4.29124E- 4.29124E- 0.0002759 2330330 3624.015
05 08 09 4 33
1.25 0.165 2.12629E- 6.37887E- 6.37887E- 0.0004599 1567676 2174.409
05 08 09 77
1.5 0.171 2.20361E- 6.61082E- 6.61082E- 0.0005518 1512670 1812.007
05 08 09 7 57
2 0.238 3.06701E- 9.20103E- 9.20103E- 0.0007358 1086834 1359.005
 05 08 09 3 73
2.25 0.261 3.3634E-051.00902E- 1.00902E- 0.0008278 9910600 1208.005
07 08 1 2.6
Dilucin 1.33ml en 25ml (0.65436mg% de tripsina)
0.75 0.06 7.73196E- 2.31959E- 2.31959E- 0.0002759 4311111 3624.015
06 08 09 4 11
1.25 0.072 9.27835E- 2.78351E- 2.78351E- 0.0004599 3592592 2174.409
06 08 09 59
1.5 0.113 1.45619E- 4.36856E- 4.36856E- 0.0005518 2289085 1812.007
05 08 09 7 55
2 0.116 1.49485E- 4.48454E- 4.48454E- 0.0007358 2229885 1359.005
05 08 09 3 06
2.25 0.121 1.55928E- 4.67784E- 4.67784E- 0.0008278 2137741 1208.005
05 08 09 1 05
TABLA1

Si trabajo con UE/L como velocidad (considerando los mililitros de enzima que se
utilizaron para las diluciones), se obtiene la siguiente tabla:

(S) M V (UE/L) M/min (S) M V (UE/L) M/min

0.00027594 2.35825E-06 0.00027594 4.29124E-06
0.00036792 3.32474E-06 0.0004599 6.37887E-06
0.0004599 3.47938E-06 0.00055187 6.61082E-06
0.00055187 4.00129E-06 0.00073583 9.20103E-06
0.00064385 3.98196E-06 0.00082781 1.00902E-05
0.0004599 3.42139E-06 0.00027594 1.74405E-06
0.00055187 3.61469E-06 0.0004599 2.09286E-06
0.00064385 3.78866E-06 0.00055187 3.28463E-06
0.00073583 4.09794E-06 0.00073583 3.37183E-06
0.00082781 4.27191E-06 0.00082781 3.51717E-06
0.00027594 2.44845E-06 0.00073583 4.5232E-06
0.0004599 3.02835E-06 0.00082781 4.21392E-06
0.00055187 3.73711E-06
TABLA 2

Es decir en resumen de la TABLA 2 se

obtiene la siguiente TABLA 3 y el GRFICO1 de acuerdo a la frmula de Michaelis y
Menden

S (M) V (M/min)
0.000275 2.7105E-06
94
 0.000367 3.32474E-06
92
0.000459 3.68017E-06
9
0.000551 4.24971E-06
87
0.000643 3.78866E-06
85
0.000735 5.2985E-06
83
0.000827 5.5233E-06
81
TABLA 3

DILUCIN DE LA ENZIMA 3ml en 2

tripsina)

f(x) = 35799.65x + 69656250.21

R = 0.91 f(x) = 25785.94x + 45153766.79
R = 0.95

DILUCIN DE
LA ENZIMA 2ml en 25ml (0.984mg% de tripsina)

Vmax= 2.10-08mol/min
Km= 0.00051572
Vmax= 1.42857.10-08mol/min
Km=0.000511429 M
 DILUCIN DE LA ENZIMA 1ml en 25 ml (0492mg%
DILUCIN
de DE LA ENZIMA 1.33ml en 25m
tripsina) tripsina)

f(x) = 54249.02x + 39348181.86

R = 0.98 f(x) = 95271.53x + 97284182.83
R = 0.88

Vmax=2.510-08mol/min
Km= 0.001356225

Vmax= 1. 10-08mol/min
Km=0.00095272

Trabajando con el grfico de lineweaver y burlk para cada diferente concentracin de enzima se
obtienen los siguientes grficos (GRAFICA2). En todas, 1/S (1/M) est en las ordenadas y 1/V
(min/mol), en abscisas. (VER DATOS DE TABLA1)

Variacin de la Velocidad de reaccin (mol/min) de acuerdo a concentracin

de enzima

1/V (min/mol)
1/S (1/M) 1/25 (0492mg%) 1.33/25(0.65436mg
2/25 (0.984mg%)
3/25(1.476mg%)
%)
3624.01 233033033 431111111 212021858 136140351
563
2174.40 156767676.8 359259259 144921532 110070922
938
1812.00 151267056.5 228908555 131642082 89195402.3
781
1359.00 108683473.4 222988506 122012579 73694207
586
 1208.00 99106002.55 213774105 117043741 79102956.2
521

TABLA 4

GRFICA3

1/S (1/M) vs 1/V (min/mol)

GRFICA3

DISUSIN DE RESULTADOS

1. Se observa en la TABLA 4 y GRFICA 3 que conforme aumenta la

concentracin de enzima la velocidad incrementa (Excepto a concentracin de
0.65436mg% de tripsina)

Se espera que la velocidad inicial de la reaccin sea proporcional a la concentracin de la

enzima. (Eisenthal y Danson, 2002). Si bien, en los resultados se ha observado un incremento
de la velocidad inicial conforme aumenta la concentracin de la enzima, este no ha sido
proporcional. (ver TABLA4)
 Observando el conjunto de grficas de la GRAFICA2, se observa que las
velocidades mximas no coinciden con lo antes propuesto porque se observa que la
velocidad mxima cuando la dilucin de enzima es 1/25 (2.510-08mol/min) es mayor
que cuando la dilucin es 3/25 (2.10-08mol/min).

2. En el grfico de Michaelis y menten obtenido en la GRFICA 1 se

observa que a mayor concentracin de sustrato mayor velocidad

En la GRAFICA1 cuando se unen todos los valores obtenidos en la prctica se puede

observar que la grfica coincide con el grfico hiperblico que normalmente se
obtiene y que demuestra que a mayor concentracin de sustrato mayor velocidad
(Armstrong y Bennett, 1982)

3. Se observa que el valor del Km varia muy poco conforme varia la

concentracin de enzima.

El Km por definicin es la concentracin de sustrato cuando la velocidad es la mitad de la

velocidad mxima. Este parmetro es independiente de la concentracin de enzima, y es
caracterstico de cada enzima segn el sustrato utilizado (si tiene varios). En la prctica se
obtuvieron Km bastante similares entre s, excepto cuando la dilucin de tripsina es de 1ml en
25 ml. (Observar GRAFICA2).

4. El Km obtenido con todos los datos es 6,599.10 -4M y la velocidad mxima

es 9,1328x10-6(min/M)

1/S (1/M) 1/V (min/M) En la siguiente tabla y grfico, basados en la TABLA 3,se puede obtener
3623.976 el valor de Km de la tripsina
23 3.69E+05
2717.982
17 3.01E+05 f(x) = 72.26x + 109494.61
2174.385 R = 0.9
74 2.72E+05
1812.020
95 2.35E+05
1553.156
79 2.64E+05
1359.009
55 1.89E+05
1208.006
67 1.81E+05

-4 -4
Segn trabajos anteriores, el Km para la tripsina con respecto al BAPNA es 1.4x10 o 8.7 x10
en tripsina de sardina y bovina respectivamente.

No se sabe en la prctica con que tripsina se trabaj pero el valor obtenido es muy cercano a
los mencionados. Adems el promedio de los Km obtenidos con las diferentes diluciones de
enzima es 8.3x10-4

La mayor parte de los errores que se tienen se deben a errores humanos, al haber quizs
incubado ms del tiempo requerido o no haber calculado bien las diluciones. Sin embargo se
observan alta correlacin en la mayora de los grficos lineales obtenidos lo que indica que la
cantidad de valores atpicos es mnima.

Conclusiones

1. En la prctica se obtiene que el Km obtenido con todos los datos es 6,599.10-4M y la

velocidad mxima es 9,1328x10-6 M/min
2. El Km y la velocidad mxima varan conforme vara la concentracin de enzima. Se
puede observar que las velocidades iniciales aumentan conforme aumenta la
concentracin de la enzima sin embargo tambin se obtienen valores (como las
velocidades mximas en las que no se observa dicha tendencia

BIBLIOGRAFA

Eisenthal R. y Danson M. (2002). Enzyme Assays. 2da edicin. Oxford. Pag. 2