PRUEBAS PARA LA DETERMINACIN DE PROTENAS

Reaccin Xantoproteica Es debida a la formacin de un compuesto aromtico nitrado de color amarillo, cuando las
protenas son tratadas con cido ntrico concentrado. La prueba da resultado positivo en
aquellas protenas con aminocidos portadores de grupos bencnicos, especialmente en
presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un lcali vira a un
color anaranjado oscuro.
Reaccin de Biuret La producen los pptidos y las protenas, pero no los aminocidos, ya que se debe a la
presencia del enlace peptdico (- CO- NH -) que se destruye al liberarse los
aminocidos. Cuando una protena se pone en contacto con un lcali concentrado, se forma
una sustancia compleja denominada Biuret; que en contacto con una solucin de sulfato
cprico diluida, da una coloracin violeta caracterstica.
Reaccin de los Se pone de manifiesto por la formacin de un precipitado negruzco de sulfuro de plomo. Se
aminocidos azufrados basa esta reaccin en la separacin mediante un lcali, del azufre de los aminocidos, el
cual al reaccionar con una solucin de acetato de plomo, forma el sulfuro de plomo.
Si se forma un precipitado de color negruzco indica que se ha formado sulfuro de plomo,
utilizndose el azufre de los aminocidos, lo que nos sirve para identificar protenas que
tienen en su composicin aminocidos con azufre.

Mtodo Kjeldahl En esta tcnica se digieren las protenas y otros componentes orgnicos de los alimentos en
una mezcla con cido sulfrico en presencia de catalizadores. El nitrgeno orgnico total se
convierte mediante esta digestin en sulfato de amonio. La mezcla digerida se neutraliza
con una base y se destila posteriormente. El destilado se recoge en una solucin de cido
brico. Los aniones del borato as formado se titulan con HCl (o H2SO4) estandarizado
para determinar el nitrgeno contenido en la muestra. El resultado del anlisis es una
buena aproximacin del contenido de protena cruda del alimento ya que el nitrgeno
tambin proviene de componentes no proteicos.
Mtodo Kjeldahl/Berthelot Este mtodo combina la digestin hmeda del mtodo de Kjeldahl con la reaccin
colorimtrica de Berthelot. Al producto de la digestin se le reduce la acidez, lleva a
volumen final y luego una alcuota se somete a la reaccin colorimtrica. El NH 4 +
presente en la digestin sulfrica reacciona con el fenol e hipoclorito de sodio en medio
alcalino, formndose un complejo de color azul. La intensidad del color producido es
directamente proporcional a la cantidad de N amoniacal presente en la muestra.
Mtodo de absorbancia a El mtodo se basa en la medicin de absorbancia a 280 nm. La mayora de las protenas
280 nm muestran una absorcin a 280 nm., la cual se atribuye al grupo fenlico de la tirosina y al
grupo indlico del triptfano. Generalmente se toma una protena como la Albmina Srica
Bovina (BSA), que es soluble en agua, para construir curvas patrn que sirvan de referencia
para cuantificar otras protenas, que sern ms precisas mientras la protena en cuestin se
parezca ms a la BSA.
Mtodo de Lowry El mtodo de Lowry combina la reaccin de Biuret con la reduccin del reactivo de Folin -
Ciocalteu (cidos (cidos fosfomolbdico y fosfotngstico) por la oxidacin de tirosina,
triptfano, cistena, cistina de las cadenas poli peptdicas. El proceso de xido-reduccin se
acompaa de la formacin de un color azul caracterstico. Los quelatos de cobre en la
estructura del pptido facilitan la transferencia de electrones de los grupos funcionales
amino al cromforo cido. El desarrollo de color es dependiente del pH, que se debe
mantener entre 10 y 10.5.
Mtodos de adhesin de Controlando el pH y la fuerza inica del medio los grupos funcionales cidos y bsicos de las
colorante aninicos protenas pueden interactuar con grupos orgnicos de carga opuesta. Comnmente se
usan colorantes sulfonados los cuales reaccionan a pH cido con el grupo -amino de la
lisina y el grupo guanidina de la arginina, el imidazol de la histidina y un nmero limitado de
- amino terminales. Pueden adherirse colorantes ANINICOS o CATINICOS (BRADFORD).
El COLORANTE ANINICO se une a los grupos catinicos de los residuos bsicos de las
 protenas (histidina, arginina, lisina) y forman un complejo insoluble.
Mtodo de Bradford Se basa en la unin del colorante Coomassie Blue G-250 a las protenas, Las protenas
(aminocidos bsicos y aromticos) se unen a la forma azul para formar un complejo
protena-colorante con un coeficiente de extincin mayor que el colorante libre. Los
aminocidos que son reconocidos por el colorante son arginina, fenilalanina, triptfano y
prolina.
Espectroscopia infrarroja Se aprovecha la absorcin del grupo amida del enlace peptdico.
Espectroscopia infrarroja La muestra se ilumina con seis longitudes de onda cercanas a la radiacin infrarroja y se
reflectante detecta la luz reflejada.
Mtodo electroforesis Pueden realizarse electroforesis en condiciones nativas en las que las protenas migran
conservando su diversidad y propiedades fsicas, especialmente su punto isoelctrico y
peso molecular, Una vez realizadas las separaciones, generalmente se contina con una
digestin proteoltica y la separacin de los fragmentos por electro elucin o para su
anlisis por espectroscopia de masas (MS).
Reaccin con Ninhidrina Se utiliza a menudo para cuantificar aminocidos libres, pptidos y protenas. El aminocido
reacciona con un exceso de ninhidrina, que le causa una desaminacin oxidativa y la
produccin de amoniaco, el aldehdo correspondiente, que tiene un tomo menos de
carbono que el aminocido original, CO2 e hidrindantina que proviene de la reduccin
simultnea de la ninhidrina. El amoniaco liberado subsecuentemente reacciona con una
molcula de hidrindantina, formando un producto color prpura conocido como morado de
Ruhemanns [Ec. 6], que tiene una absorbancia mxima a 570 nm. La prolina y la
hidroxiprolina dan un producto amarillo que tiene una absorbancia mxima a 440 nm. Estas
reacciones coloridas son la base para las detecciones en cromatografa en papel y de capa
fina (TLC), as como para la determinacin colorimtrica de aminocidos que se utiliza en
los analizadores de aminocidos para lo cual la protena se hidroliza primero hasta amino-
cidos libres.
Reaccin con Los aminocidos, pptidos y protenas que contienen aminas primarias producen, con
fluorescamina fluorescamina, un derivado altamente fluorescente con una mxima emisin a 475 nm
cuando la excitacin se hace a 390 nm [Ec. 7]. Este mtodo se puede utilizar para
cuantificar aminocidos, protenas y pptidos. Es mucho m sensible y no tiene las
desventajas de la ninhidrina. El grupo amino que ha reaccionado puede ser recuperado con
alto rendimiento por hidrlisis cida y puede ser identificado por anlisis subsecuentes.
Reaccin con Orto- La reaccin de aminocidos con O-ftalaldehdo (1,2-benzeno dicarbonal) en la presencia de
ftalaldehdo 2-mercaptoetanol produce un derivado fluorescente que tiene una excitacin mxima a 380
nm y una emisin de fluorescencia mxima a 450 nm . Es tan sensible que es posible
cuantificar aminocidos a niveles de picomoles (10-12 mol).
Tincin con nitrato de El ms sensible de los reactivos para teir protenas fijadas en un gel o en un blot es la
plata tincin de plata, el cual puede detectar menos que un nanogramo (1029 g) de protena. Se
utiliza nitrato de plata en condiciones cidas y la reaccin est basada en los procesos
fotogrficos, donde al parecer se involucra a las cadenas laterales bsicas de la protena.
Determinacin de amino y Existen diversos mtodos que requieren que ninguno de estos grupos se encuentre
carboxilo terminales bloqueado. La determinacin de grupo amino terminal involucra el marcaje qumico de
todos los grupos amino de la protena, incluyendo los de Lys, para posteriormente someter
a hidrlisis cida a la protena, a una separacin por electroforesis o cromatografa en
papel, para identificar a los aminocidos que tienen marcado el grupo a-amino.
Peso molecular El peso molecular de las protenas es muy variable, pero se puede considerar que va de un
mnimo de aproximadamente 3,550 daltones (DA), para el caso del glucagon, hasta varios
cientos de miles o incluso millones de Da en algunas fracciones de soya o gluteninas del
trigo. Para su determinacin se pueden e
mplear diversos mtodos para los que hay que seleccionar cuidadosamente, no slo el
disolvente sino las condiciones de extraccin y manejo, ya que las condiciones pueden
disociar o desagregar los dmeros, trmeros, etc., en monmeros sencillos, o bien, producir
 reagrupamientos como sucede con las zenas y otras protenas vegetales a bajas
temperaturas. Actualmente son la electroforesis y la filtracin en gel. Los mtodos ms
aplicados para el estudio del peso molecular.

PRUEBAS DE DETERMINACIN DE LPIDOS

Determinacin de ndice de Mtodo de Wijs y Mtodo de Hanus.
Yodo El ndice de yodo de un cuerpo graso es funcin de su grado de instauracin. Se
determina aadiendo a la muestra un exceso de reactivo halogenado, valorando el
reactivo que no reacciona. Se expresa convencionalmente por el peso de yodo
absorbido por cien partes en peso de materia y grasa. La diferencia entre ambos
mtodos es el agente halogenado, en el Mtodo de Hanus el agente es IBr, preparado
de la mezcla de I2 con Br2 en cido actico y en el Mtodo de Wijs el agente es ICl
preparado de la mezcla de ICl3 con I2 en medio de cido acetico. (AMV ediciones,
1988).
ndice de saponificacin Montar un equipo de reflujo en la campana, colocar en el matraz bola con boca
esmerilada 2 g de lpidos y adicionar 25 mL de solucin alcohlica de KOH (0.5 M en
etanol al 95%). Llevar a ebullicin suave y mantener durante 1 hr. Adicionar 1 mL de
solucin de fenolftalena (0.1%). Titular en caliente el exceso de lcali con cido
clorhdrico 0.5 N Calcular el ndice de saponificacin (mg KOH necesarios para
saponificar los cidos grasos totales de un gramo de muestra).
Material insaponificable Transferir el lquido titulado del ndice de saponificacin a un embudo de separacin,
usando 50 mL de agua para lavar el matraz. Extraer la solucin con 50 mL de ter
etlico, tres veces. Lavar dos veces con 20 mL de agua en un embudo de separacin
los extractos etreos. Deshidratar el extracto etreo pasndolo por un filtro con sulfato
de sodio anhidro. Recuperar el extracto etreo en un matraz tarado y evaporar el
disolvente a presin reducida, hasta sequedad, utilizando un rotavapor. Colocar el
 matraz en una estufa de secado a 70C, hasta llegar a peso constante. Cuantificar el
material in saponificable por gramo de muestra.
Colesterol Pesar 100 mg. de material lipdico y disolver en un volumen conocido de
diclorometano. Colocar 0.2 mL en un tubo de ensaye. Adicionar con precaucin 4 mL
de anhdrido actico (6.33 M en c. actico). Mezclar y dejar 10 min en reposo.
Adicionar 1 mL de H2SO4 conc. Y agitar con precaucin. Dejar 30 min a temperatura
ambiente. Leer contra un blanco de reactivos a 620 nm Preparar una curva patrn con
colesterol en un intervalo de concentracin de 0.2 -2 mg/mL. Llevar a cabo la reaccin,
como se mencion anteriormente y leer a 620 nm. Fundamentos y Tcnicas de Anlisis
de Alimentos 38 LABORATORIO DE ALIMENTOS I FACULTAD DE QUIMICA, UNAM Calcular
el contenido de colesterol por gramo de lpidos y por gramo de muestra.
Acidez titulable En un matraz Erlenmeyer de 125 o 250 mL, colocar 0.5 g de lpidos y adicionar 25 mL
de alcohol previamente neutralizado (utilizando fenolftalena 0.1% como indicador).
Calentar en un bao de agua en ebullicin suave y titular en caliente con KOH 0.0025
N, agitando fuertemente despus de cada adicin de lcali. Calcular el ndice de
acidez, como equivalentes de KOH por 100 g de aceite.
Determinacin del ndice Pesar 2.5 0.1 g de aceite o grasa en un matraz Erlenmeyer de 250 mL y adicionar 25
de Perxidos. (Mtodo mL de una solucin de cido actico/diclorometano (3:2), disolviendo perfectamente.
volumtrico) Adicionar 0.5 mL de una solucin saturada de yoduro de potasio y dejar reposar en la
oscuridad durante 60 seg., medidos con cronmetro. Aadir 75 mL de agua
desionizada hervida y fra, titular lentamente con tiosulfato de sodio 0.1 N. Si se
gastan menos de 3 mL, diluir el titulante a 0.01 N. Agitar vigorosamente durante la
titulacin hasta obtener un color amarillo plido. Adicionar 0.5 mL de solucin de
almidn indicador (almidn soluble al 1% en agua) y continuar la titulacin hasta la
desaparicin del color azul por 30 seg. El ndice de perxidos se obtiene calculando los
miliequivalentes de tiosulfato utilizados en la titulacin por kilogramo de muestra.
 Mtodo volumtrico Pesar 0.5 0.05 g de aceite o grasa en un matraz Erlenmeyer de 125 o 250 mL y
Micromtodo adicionar 2.5 mL de una solucin de cido actico/diclorometano (3:2), disolviendo
perfectamente. Adicionar 0.05 mL de una solucin saturada de yoduro de potasio y
dejar reposar en la oscuridad durante 60 seg., medidos con cronmetro. Aadir 7.5 mL
de agua desionizada hervida y fra, adicionar 0.1 mL de solucin de almidn indicador
(almidn soluble al 1% en agua). Si se presenta una coloracin azul oscuro (en toda la
solucin o en forma de puntos aislados) titular lentamente con tiosulfato de sodio
0.001 N hasta la desaparicin total del color azul. El ndice de perxidos se obtiene
calcula
ndice de Kreis Disolver de 50 a 500 mg de grasa en 5 mL de diclorometano. Aadir 10 mL de una
solucin de cido tricloroactico al 30% en cido actico glacial y 1 mL de floroglucinol
al 1% en cido actico. Agitar e incubar por 15 min, en un bao mara a 45C, dejar
enfriar y agregar 4 mL de etanol. Medir la absorbancia de la muestra a 540 nm frente a
un blanco de reactivos. El ndice de Kreis se calcula como Abs a 540 nm/g de grasa.
Determinacin de ndice de Es un mtodo colorimtrico indirecto. Se basa en que a una muestra que contenga
Perxidos (Mtodo perxidos se adiciona un reactivo de fierro (II); en la muestra se llevar a cabo la
colorimtrico) oxidacin electroqumica de fierro (II) a fierro (III) y ste ltimo ser cuantificado por su
reaccin de complejacin con tiocianato mostrando un color rojo caracterstico. El
ndice de perxidos se obtiene relacionando la cantidad de fierro con el peso de la
muestra. (Kirk, 1991).
ndice de refraccin Se emplea un refractmetro, se realiza la prueba de 20-25C para aceites y a 40C
para grasas. Se puede mantener la temperatura empleando un bao de agua a
temperatura constante para que circule a travs de los prismas. Colocar la muestra en
los prismas del refractmetro de campo, adecuadamente calibrado. Cierre la tapa,
suavemente, la muestra debe cubrir completamente la superficie del prisma. Mirar la
escala a travs de la mirilla. Leer en la escala, en la interseccin de los campos. En
 caso de que la separacin de los campos no sea clara, ajustar moviendo la base del
objetivo. Eliminar la muestra del prisma, utilizando un papel suave.

PRUEBAS DE DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS

Carbohidratos Totales Los carbohidratos sern destruidos por calor y por cido, son particularmente sensible
a cidos fuertes y altas temperaturas. Bajo estas condiciones una serie de reacciones
complejas toman lugar empezando con una deshidratacin simples, si se contina el
calentamiento y la catlisis cida se producen varios derivados del furano que
condensan consigo mismos y con otros subproductos para producir compuestos
obscuros o compuestos coloridos producto de la condensacin de compuestos
fenlicos y con heterociclos con el nitrgeno como heterotomo. La condensacin ms
comn es con fenol. Este mtodo es fcil, eficaz y rpido. Todos los azcares como
oligosacridos y polisacridos pueden ser determinados, recordando que estos bajo
hidrlisis cida producen monosacridos.
AZUCARES (EN SOLUCIN) El RI vara con la naturaleza del compuesto, la temperatura, la longitud de onda de la
luz y la concentracin del compuesto. Si las tres primeras variables se hacen
constantes la concentracin del compuesto se puede determinar midiendo el RI, de tal
forma que el RI se utiliza para determinar slidos totales en disolucin. El uso del RI
para determinar concentraciones es preciso solamente para sacarosa pura u otras
disoluciones puras, tambin se utiliza para obtener concentraciones aproximadas de
azucares para productos lquidos en cuyo caso la solucin debe ser clara. Los
refractmetros pueden leer directamente en unidades de sacarosa. (Nielsen, 1998)
DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS REDUCTORES
Mtodo cido Tomar 1mL de la solucin acuosa de la muestra, adicionar 1mL del reactivo de DNS y
dinitrosaliclico (DNS) calentar por 5 min en un bao de agua hirviente, enfriar y diluir con 10 mL de agua
destilada. Leer absorbancia del color producido a 540 nm frente a un blanco de
 reactivos y agua tratado igual que la muestra. Cuantificar los azcares reductores
interpolando los valores de absorbancia obtenidos en una curva estndar preparada
con el carbohidrato reductor de inters en concentraciones de 0.2 a 2 mg/mL.
Mtodo de Fehling En el mtodo Lane-Eynon se titula con el reactivo de Fehling caliente en dos etapas,
primero se aade una cantidad de reactivo de Fehling tal que se lleve a cabo la total
reduccin y despus se determina el punto final con azul de metileno por goteo, es
necesario un control de la temperatura y se sugieren dos titulaciones. (Pomeranz,
1984).
DETERMINACIN DE CARBOHIDRATOS TOTALES
Medicin por ndice de Colocar una o dos gotas de la solucin en el prisma del refractmetro de campo,
refraccin adecuadamente calibrado. Cierre la tapa, suavemente, la muestra debe cubrir
completamente la superficie del prisma. Mirar la escala a travs de la mirilla. Leer en
la escala, en la interseccin de los campos. En caso de que la separacin de los
campos no sea clara, ajustar moviendo la base del objetivo. Eliminar la muestra del
prisma, utilizando un papel suave hmedo. Los refractmetros ATC-1 y N10 solamente
se calibran a 0%, colocando unas gotas de agua destilada en el prisma. Si la
separacin de los campos no marca 0%, en la escala, ajustar girando el tornillo que se
encuentra en la parte superior de la base del prisma.