Biotecnologa Farmacutica]

UPIBI-IPN
[Gua de Prcticas

[2014]

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE
BIOTECNOLOGA

Departamento de Bioprocesos

Academia de Biotecnologa

Realizado por:

M.en C. Flor Selene Villalobos escobedo

M.en E. Hernn corts arroyo
M. en E. Hctor molina Jimnez
Dra. Estela Flores Gmez
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NDICE

REGLAMENTO DEL LABORATORIO 4

PRCTICA 1. OBTENCIN DE ADN GENMICO DE HONGOS 5

I. OBJETIVOS 5

II. INTRODUCCIN 5

III. MATERIAL Y REACTIVOS 5

IV. METODOLOGA 6

V. RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS 8

VI. CUESTIONARIO PREVIO 8

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 9

PRACTICA 2. TIPIFICACIN SANGUNEA ABO Y FACTOR RH 10

I. OBJETIVOS 10

II. INTRODUCCIN 10

III. MATERIAL Y REACTIVOS 10

IV. METODOLOGA 11

V. RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS 12

VI. CUESTIONARIO PREVIO 12

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 13

PRACTICA 3. LECTINAS 14

I. OBJETIVOS 14

II. INTRODUCCIN 14

III. EQUIPO Y MATERIALES 14

IV. METODOLOGA 15

V. RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS 18

VI. CUESTIONARIO PREVIO 18

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 19

PRCTICA 4. PRODUCCIN DE PENICILINA EN DIFERENTES

SISTEMAS DE FERMENTACIN 20

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I. OBJETIVOS 20

II. INTRODUCCIN 20

III. MATERIALES Y MTODOS 20

IV. METODOLOGA 21

V. RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS 22

VI. CUESTIONARIO PREVIO 22

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 22

PRACTICA 6. ELISA (ENZYME- LINKED INMUSORBENT ASSAY) 23

I. OBJETIVOS 23

II. INTRODUCCIN 23

III. MATERIAL Y REACTIVOS 24

IV. METODOLOGA 24

V. RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS 24

VI. CUESTIONARIO PREVIO 24

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS 25

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REGLAMENTO DEL LABORATORIO

El laboratorio representar el 30% de la calificacin final de la asignatura de Biotecnologa

Farmacutica

La calificacin de laboratorio se distribuir de la siguiente manera:

1. TRABAJO PRCTICO 40%

- Asistencia al laboratorio.
- Puntualidad. Se dar un mximo de tolerancia de 10 minutos.
- Limpieza de su mesa de trabajo y tarja al inicio y fin de clase.
- Cada alumno deber presentarse a la sesin de laboratorio con bata y con el manual de
prcticas engargolado en el cual debern anotar todos los resultados obtenidos en las
prcticas.
- El material se entregar una vez llenado de manera correcta el vale correspondiente.
- El comportamiento del alumno dentro del laboratorio estar regido por el reglamento interno
del Laboratorio de Biotecnologa.
- Cooperacin con el grupo (esterilizacin de material, lavado y preparacin de reactivos as
como asistencia extraclase)

2. INFORME POR EQUIPO 30%

Este porcentaje se divide en:
- Introduccin 10%
- Objetivo
- Resultados 15%
- Discusin de resultados 20%
- Cuestionario 20%
- Conclusiones 30%
- Referencias 5% (diferentes a las mencionadas en la prctica)

3. EXAMEN DE LABORATORIO 20%

Consistir en una evaluacin del conocimiento adquirido durante las prcticas

4. DISCUSIN 10%
Consistir en la participacin activa de cada alumno durante la sesin de discusin.

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PRCTICA 1. OBTENCIN DE ADN GENMICO DE HONGOS

I. OBJETIVOS

Objetivo General
Extraer ADN genmico de Hongos con importancia Farmacutica.
Objetivos especficos
Comprender los fundamentos del proceso de extraccin de ADN genmico
Analizar la calidad del ADN genmico a travs de la electroforesis en gel de agarosa
Analizar la pureza y concentracin del ADN genmico
Obtener el Peso Molecular del ADN genmico
Discutir la importancia de la Ingeniera Gentica dentro de la Farmacutica

II. INTRODUCCIN

La produccin de antibiticos ha resultado ser una de las ms lucrativas actividades de la

industria farmacutica en los ltimos cincuenta aos, razn por la cual en este tiempo se han
conseguido los mayores avances en el conocimiento de la biosntesis de la mayora de dichos
compuestos (la penicilina es un buen modelo y un ejemplo, a este respecto). El conocimiento
de los mecanismos bsicos de biosntesis de antibiticos (fundamentalmente los denominados
beta-lactmicos) ha permitido la puesta a punto de importantes procesos de produccin a gran
escala. A medida que se optimizaron la composicin del medio de cultivo, las condiciones de
temperatura, aireacin, etc. o se mejoraron las cepas productoras, por medio de tcnicas de
mutagnesis al azar, se consigui aumentar en varios rdenes de magnitud la produccin de
antibitico.
La Biologa Molecular supone una herramienta avanzada en cuanto a la posibilidad de mejora
gentica de las cepas de produccin industrial. Estas tcnicas posibilitan la modificacin
controlada del genoma del microorganismo, permitiendo en todo momento asignar una relacin
causa-efecto entre la alteracin introducida y el resultado observado (algo mucho ms
complicado de analizar en el caso de las mutaciones inducidas por mtodos clsicos).Gracias
a esta disciplina, se puede observar el efecto de cambios introducidos en todos los niveles de
la ruta de biosntesis (incorporacin de los compuestos precursores, ensamblaje de los
productos intermediarios de la va y secrecin al medio). Pueden observarse, asimismo, los
efectos de la introduccin de factores que afecten de forma global al proceso e incluso
obtenerse compuestos que anteriormente no eran producidos por el microorganismo.
La utilizacin de las tcnicas de Ingeniera Gentica ha permitido dar un nuevo impulso al
desarrollo de cepas con mayor produccin de antibiticos, pero tambin ha servido para
conocer en detalle la naturaleza de los cambios ocurridos durante los procesos de mutagnesis
al azar (tanto en los casos en los que se consigue aumentar la produccin como en los que
sta resulta disminuida) y la localizacin especfica de tales cambios en el genoma del
microorganismo.Se puede hablar a este nivel de dos tipos de mecanismos relacionados con la
produccin de antibiticos: por un lado los mecanismos directamente relacionados con este
proceso, es decir los que intervienen de modo fundamental en la produccin del antibitico y
por otro los que podramos denominar como indirectamente relacionados (que afectaran de
modo pleiotrpico al proceso o modificaran ste por completo).

III. MATERIAL Y REACTIVOS

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- Mortero estril y altamente fro.

- Pistilo para mortero estril previamente enfriado.
- Micropipeta 1 ml, 20 mL
- Puntas para micropipeta 1 ml y 20 mL estriles
- Tubos eppendorf estriles
- un cuadrito de parafilm
- Cepa de hongo de importancia farmacutica.
- Guantes

EQUIPO
- Microcentrfuga
- Espectrofotmetro
- Celdas de cuarzo.
- Cmara de Electroforesis
- Campana de extraccin

REACTIVOS
- Arena de cuarzo blanca
- Buffer de extraccin (100 mM TrisHCl pH 8.0, 20 mM Na2EDTA, 0.5M NaCl, 1% SDS)
- Fenol (25 partes): Cloroformo (24 partes): Isoamilico (1 parte)
- Isopropanol fro
- Acetato de sdio 3.0 M pH 5.2
- EtOH 70 %
- Buffer TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM Na2EDTA, pH 8.0)
- Buffer de corrimiento TAE 50X (Trisbase, Ac. actico glacial, Na 2EDTA pH 8.0)
- Buffer de carga (Tris, azul de bromofenol y glicerol)
-Gel red (Rojo Texas)
- Marcador de peso de 1Kb como control.

IV. METODOLOGA

Obtencin de ADN genmico de hongos

Mtodo modificado de Chow and Kafer (Fungal Genet. Newsl. 40:25-27) utilizando Arena de
cuarzo blanca usada como agente pulverizante.

1. COLOCARSE GUANTES Y CUBREBOCAS

2. Se coloca 1 gr del micelio y esporas en un mortero se aade N 2 lquido y se muele la
muestra, en caso de no tener N2 lquido se coloca el mortero en un recipiente con hielo.
3. Antes de que se descongele se aade 2 gr de arena por gramo de tejido.

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4. Posteriormente se aade 4 ml de buffer de extraccin y se muele durante 5 minutos.

5. Se corta una punta azul estril para micropipeta de 1 ml con unas tijeras (alrededor de 0.5
cm de la punta).
6. Se pasa 1.0 ml de sta suspensin de hongo y arena a tubos para micro centrifuga
(eppendorf) estriles. Mnimo 4 tubos por equipo

7. Se aade a cada tubo eppendorf 0.5 ml de la mezcla fenol:cloroformo:isoamilico.

8. Se mezcla vigorosamente durante 30 segundos con un pistilo estril se agita el tubo en el
vrtex. NOTA: El fenol es corrosivo y quema la piel. Usa guantes.
9. Los tubos se centrifugan a 13 krpm por 5 min a T amb.
10. El debris celular y la arena se van al fondo del tubo formando un pellet. Por encima
de ste se encuentra la mezcla de fenol:cloroformo:isoamlico y encima se forma una
capa de protenas que no debes romper cuando tomes la fase de acuosa que sta hasta
arriba.
11.sta fase acuosa se transfiere a un tubo eppendorf nuevo (ADN).

NOTA: Se puede hacer otra extraccin con fenol:cloroformo:isoamilico si se desea antes

de la precipitacin con isopropanol
12.Se aade 0.1 V de acetato de sodio, se agita suavemente y se aade 0.6 V de
isopropanol fro.
13.Se incuban las muestras a 4C (hielo) en un ultracongelador (-20C -80C) por
15 min.
14.Centrifugar a 12krpm por 10 min para recuperar el precipitado.
15.Se lava el pellet con 500 l de EtOH 70%, agitando en el vrtex.
16.Centrifugamos 13krpm, 1 min para recuperar la pastilla.

17.Decantamos sobrenadante y se deja secar el pellet por 20 min. (si se desea se vuelve a
realizar el lavado)

18.Una vez seco el pellet (ADN) se resuspende en 200 ul de buffer TE agua estril.

Electroforesis en gel de agarosa.

La calidad de ADN se determina mediante una corrida de electroforesis en gel de agarosa al

1%.

1. Pesar 1 gr de agarosa y aadir Buffer TAE 1X para completar 100 ml.

2. Se funde en un horno de microondas, se enfra un poco y se aade 1 ul de Rojo Texas
10000X.
Nota: La adicin del Rojo Texas puede hacerse de diferentes formas.
3. Se deposita en el carro con el peine para crear los pozos en el gel.
4. Se deja solidificar en una campana de extraccin.
5. Se desmonta y se coloca en la cmara de corrimiento con Buffer TAE 1X cuidando
que cubra el gel de agarosa.
6. Para cargar la muestra, se coloca 5 ul de ADN y una gota de buffer de carga (6X) sobre
un cuadrito de parafilm, se mezclan y se cargan en el gel. Nota: se puede colocar
marcador de peso en el primer carril (1Kb).
7. Se carga el gel de agarosa.
8. Se conecta la fuente de poder y se corre el gel a un voltaje de 70-90 V segn el tamao
de la cmara.
9. Una vez que se separaron los dos colorantes y estos llegaron partes del gel, se saca
el gel de la cmara de corrimiento y se observa en el transiluminador con la luz UV.
10. Reportar tu imagen con pie de figura indicando el PM (pb) de cada banda del Marcador
de Peso Molecular 1kb; indicar la muestra de cada carril.

Estimacin de la concentracin de ADN

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a. Diluir 20 l de muestra de ADN en 980 l de agua desionizada y estril (dilucin

1/50)
b. Medir absorbancia por espectrofotometra a 260 nm usando celdas de 1 ml de
cuarzo.
c. La concentracin de ADN a A260 = 1.0 en una celda de 1 cm equivale a 50 g de
ADN por ml de agua. Para calcular la concentracin de la muestra:
[ADN] = 50 g / ml x A260 x factor de dilucin (50)
[ADN total] = [ADN] x volumen eludo en ml

Estimacin de la pureza del ADN

El grado de pureza o ausencia de protenas y otros contaminantes de una disolucin de ADN

puede estimarse calculando el cociente A260/A280.

Cuando este se encuentra entre 1.8-2.0 la muestra contiene casi exclusivamente ADN.

Clculo del Peso Molecular (pares de bases, pb)

a) Grficar en el eje de las Y, el log 10 del PM (pb) y en el eje de las X, la distancia en cm a

cada banda. Es importante medir de arriba hacia abajo tomando como base el borde
superior del gel. Sacar la ecuacin de la regresin lineal y=mx+b, sustituir la distancia a
la banda del DNAg y sacar el antilogaritmo del valor Y para tener el PM en pb.

V. RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS

a) Lleve a cabo un diagrama de flujo del procedimiento efectuado y coloca del lado derecho la
funcin de cada solucin utilizada en el proceso de obtencin de ADN.

b) Discute los resultados obtenidos en tu prctica:

Obtencin de ADN
Electroforesis en gel (FOTO GEL con ubicacin de tu carril de corrimiento)
Espectrofotometra (Concentracin y pureza del ADN)

c) Elabore un dibujo de la cmara de electroforesis donde muestras el corrimiento de tu gel y

las caractersticas de la corrida.

VI. CUESTIONARIO PREVIO

1. Cul es la importancia de los hongos en la Industria Farmacutica (IF)?

2. Cmo utilizaras la Ingeniera Gentica en el ADN obtenido en sta prctica?
3. Para qu se usa el buffer de corrimiento TAE?
4. Cules son las caractersticas del buffer de carga?

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5. Cmo funciona el Rojo Texas?

6. Existen otros colorantes adems del Rojo Texas para hacer visible el ADN en el gel de
agarosa?
7. Por qu se utilizan celdas de cuarzo y no de plstico para leer ADN en el
espectrofotmetro?
8. Por qu se lee el ADN a una absorbancia de 260 y 280 para valorar su pureza?
9. Cmo se llama el equipo que te permite visualizar el ADN genmico?
10. Cul es el porcentaje adecuado de agarosa para realizar tu gel de acuerdo al PM
(pb)?

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

http://www.fgsc.net/fgn44/weiland.html
http://www.uprm.edu/biology/profs/velez/extraccionADN.htm
Fernndez-Perrino F.J.. Sobreproduccin de antibiticos en hongos filamentosos utilizando
tcnicas de Ing. Gentica Depto de Biotecnologa. UAM-Iztapalapa. Mxico D.F. (PDF)

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PRACTICA 2. TIPIFICACIN SANGUNEA ABO Y FACTOR RH

I. OBJETIVOS

Objetivo General
Analizar la reaccin antgeno- anticuerpo a travs de la tipificacin ABO y Factor Rh de
acuerdo a su importancia nivel farmacutico
Objetivos especficos
Tipificar el grupo sanguneo de una poblacin determinada (grupo de clase)
Comprender el fundamento de la reaccin Ag-Ac en la tipificacin ABO
Discutir las aplicaciones de la tipificacin ABO y factor Rh

II. INTRODUCCIN

El descubrimiento del grupo sanguneo ABO en el ao 1900 por el cientfico austriaco Karl
Landsteiner, caus gran entusiasmo en la comunidad cientfica de la poca. Hasta entonces,
toda la sangre se consideraba igual en todas las personas y no se entendan las consecuencias
a menudo trgicas de las transfusiones de sangre.(1).
Los antgenos ABO son glcidos unidos a protenas y lpidos de la superficie celular que
sintetizan enzimas glucosiltransferasas polimrficas, cuya actividad vara en funcin del alelo
heredado. Los sujetos que expresan un antgeno ABO particular toleran ese antgeno, pero los
sujetos que no expresan ese antgeno producen anticuerpos naturales que reconocen el
antgeno. (2)
Los reactivos para tipificar los antgenos del sistema ABO, se basan en anticuerpos
monoclonales producidos por lneas celulares de hibridomas murinos y ofrecen todas las
ventajas de los reactivos monoclonales actuales, es decir, un comportamiento parejo y un
abastecimiento seguro. Dado que estos reactivos no provienen de fuentes humanas, el riesgo
de transmisin de enfermedades tales como Hepatitis o Sida es nulo (3).
En la reaccin Ag- Ac, los anticuerpos del sistema ABO son principalmente de clase IgM por lo
que son altamente aglutinantes. Propiedad que se emplea para su identificacin (4).
En 1939 Levine y Stetson, luego de que una mujer diera a luz un feto muerto, hallan en el suero
de la misma un anticuerpo que aglutinaba a los glbulos rojos del marido y a los del 80% de la
poblacin ABO compatible.
En 1940 Landsteiner y Wiener inyectan hemates de Macaco Rhesus a un conejo y observan
que ste desarrolla un anticuerpo que aglutina no solo a los eritrocitos del mono sino que
tambin, a los eritrocitos, del 85% de la poblacin caucsica de Nueva York. Quienes suponen
que se trata del mismo anticuerpo descubierto el ao anterior, por lo tanto, proponen como
nombre "Sistema Rh" por analoga con el antisuero producido por el conejo luego de la
sensibilizacin con el Rhesus. En 1942 utilizan el suero del animal como suero anti-Rh. Se
necesitaron casi 20 aos para demostrar que los anticuerpos humanos y los animales no
reaccionaban con el mismo antgeno (Rho), reasignndole a este nuevo sistema el nombre de
LW en honor a sus descubridores; los antgenos de ste sistema son ms frecuentes en
individuos Rh-positivos que en Rh-negativos, de all la concordancia que origin la confusin.
El anticuerpo humano descubierto por Levine y Stetson est dirigido entonces hacia el antgeno
"D" (Rho) del sistema.(5)

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III. MATERIAL Y REACTIVOS

Reactivos monoclonales para tipificacin de grupos sanguneos anti - A, Anti - B, anti -

AB, anti D
Los reactivos se han formulado de acuerdo a las normas de la FDA de Estados Unidos
y se entregan coloreados de Azul y Amarillo, Anti-A y Anti-B respectivamente, reactivo
Anti-A,B. Todos los reactivos se suministran estandarizados y listos para ser usados en
tcnicas de hemoaglutinacin en tubo o en lmina)
Reactivo Monoclonal Anti-D (Anti-Rho)
El reactivo Anti-D es una mezcla monoclonal IgM + IgG para tcnica en microplaca, en
lmina y en tubo.(3)
Palillos de madera
Frasco gerber con un poco de cloro para desechos de torundas con sangre, palillos.
Un frasco gerber con torundas de algodn con alcohol
Un frasco Gerber con torundas de algodn secas
Portaobjetos desengrasados (con alcohol)
Lancetas
Guantes
Nota: Desechar las lancetas en el contenedor de punzocortantes

IV. METODOLOGA

Toma de muestra

1. Lavarse las manos con agua y jabn (analista y paciente)

2. Preparar la lanceta o pinchador.
3. Masajear colocando el dedo hacia abajo
4. Desinfectar con una torunda con alcohol el dedo que se va a picar con la lanceta.
5. e)Dejar secar el alcohol y pinchar el dedo de forma rpida en la parte lateral
manteniendo la mano hacia abajo (figura 1).
6. f)Repartir en un portaobjetos desengrasado previamente de 3 a 4 gotas de sangre de
forma equidistante

Figura 1. Tcnica para toma de muestra sangunea.

Fuente: http://www.chospab.es/cursos_on_line/insulino/pagina_25.htm

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Aplicacin de reactivos para tipificacin ABO y Factor Rh

1. Aadir una gota del anticuerpo Anti A, B, AB o Rh al lado de la gota de sangre segn
sea el caso. CUIDADO de no tocar con el gotero la gota de sangre ya que
contaminas el reactivo.
2. Mezclar suavemente con un palillo y observar la aglutinacin.
3. Reportar positivo en donde se encuentre aglutinacin, por ejemplo, si aglutina con el
anticuerpo A ser grupo sanguneo A.
4. Colocar los portaobjetos de cada equipo sobre una hoja blanca y tomar foto para el
reporte.

V. RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS

a) Fotografa rotulada con el nombre del estudiante, anticuerpo

utilizado en cada gota y finalmente el tipo sanguneo con los
resultados del equipo Figura 2.

Figura 2. Tipificacin ABO y Factor Rh.

Fuente:
http://mesa8labd.blogspot.mx/2009/10/pru
ebas-pretransfunsionales.html

b) Tabla con los resultados del grupo

Alumno Edad Sexo Grupo sanguneo Rh

VI. CUESTIONARIO PREVIO

1. Qu son los antgenos del grupo sanguneo ABO? Describe cada uno.
2. En qu clulas se encuentran estos antgenos?
3. Realiza un cuadro con el tipo de Ag presente en la clula, que anticuerpo se produce
en el plasma y el tipo sanguneo

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Antgeno A Antgeno B Antgeno AB (*) Sin Antgeno

(*) ()

Clula

Anticuerpo en el Anti- Anti- Ninguno ambos Ninguno

suero Ambos
Tipo Sanguneo

4. Qu tipos de Ig se producen contra estos antgenos? Qu importancia tienen estos

anticuerpos en el pasaje a travs de la placenta de la madre al feto?
5. Qu tipos de reacciones pueden provocar una incompatibilidad de grupo sanguneo
ABO?
6. Qu significa Rh y como se descubri?
7. Qu otras tipificaciones hay y qu importancia clnica tienen?
8. Realiza tu rbol genealgico con 3 generaciones de acuerdo al tipo sanguneo.
Complementa buscando informacin del alelo dominante que es heredado. Leyes de
Mendel.
9. Investiga el grupo sanguneo predominante en Mxico y por que es as?
10. Investiga el uso de la Inyeccin de inmunoglobulina Rho (D) (RhoGAM)
11. Qu es un donante y receptor universal?
12. Describe la reaccin Ag-Ac que ocurre en la tipificacin ABO y factor Rh

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

http://www.medigraphic.com/pdfs/medlab/myl-2009/myl097-8c.pdf
http://med.unne.edu.ar/catedras/bioquimica/pdf/guia-11.pdf
http://ingemeci.com/productos.html
http://microeinmuno.files.wordpress.com/2011/10/grupos-sanguineos-e-
isohemaglutininas.pdf
http://www.aathi.com.ar/pdfs/sis_rh_lo_que_hay_que_saber.pdf
http://www.galactose.org
http://www.joel-sistem-xd.blogspot.mx/2007/10/herencia-gentica-cromosomas.html
http://mesa8labd.blogspot.mx/2009/10/pruebas-pretransfunsionales.html
http://www.cnts.salud.gob.mx/

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PRACTICA 3. LECTINAS

I. OBJETIVOS

Objetivo general
Adquirir los conocimientos terico-prcticos para la obtencin de compuestos proteicos
con actividad hemoaglutinante a partir de extractos vegetales
Objetivos especficos
Determinar la actividad hemoaglutinante de los extractos obtenidos
Investigar el mtodo de conservacin no destructivo para las lectinas obtenidas
Confirmar los pesos moleculares de las lectinas obtenidas mediante el uso de geles de
poliacrilamida (SDS-PAGE)

II. INTRODUCCIN

Las lectinas son protenas naturales de origen no inmune, ampliamente distribuidas en el reino
Plantae y que muestran una serie de actividades biolgicas que las hacen poderosas
herramientas biotecnolgicas. Las semillas leguminosas son una rica fuente de lectinas y varios
gneros de la subtribu Diocleinae y Phaseoleae, han sido la principal fuente de extraccin de
ellas.
Las lectinas estn presentes en casi todos los seres vivos, pues se han encontrado en el reino
vegetal, animal y en microorganismos. En las plantas se han detectado, principalmente en los
cotiledones y endospermos de las semillas y constituyen del 2 al 10 % del total de las protenas
de stas. En el reino animal se han encontrado en invertebrados, tales como cangrejos,
camarones, caracoles, lombrices y moluscos. En el humano estn presentes
fundamentalmente en la hemolinfa y rganos sexuales.
Las lectinas comparten en comn la propiedad de enlazarse de forma especfica y reversible a
carbohidratos, ya sean libres o que formen parte de estructuras ms complejas. Contienen al
menos dos sitios de unin, de ah que puedan enlazarse en primer lugar a un azcar especfico
y en forma secundaria a una molcula glicosilada. Su importancia se debe fundamentalmente a
sus propiedades biolgicas, tales como aglutinacin de eritrocitos y otras clulas como
linfocitos, espermatozoides, plaquetas, bacterias, induccin de mitosis en linfocitos, efectos
citotxicos sobre linfocitos, aglutinacin de virus y otras.
Actualmente se han estudiado en detalle 9 lecitinas con efecto mitognico sobre los linfocitos,
entre las que se destacan las provenientes de Phaseolus vulgaris (PHA), Canavalia ensiformis
(Con A), Pisum sativum (PSA) y Fitolaca americana (PWM).
Estos mitgenos pueden activar de forma diferente los linfocitos T y B, por ejemplo la PHA y
Con A inducen mitogenicidad en clulas T, mientras que el mitgeno de carmn (PWM) estimula
ambos tipos de clulas. No se conoce lectina alguna que estimule slo a los linfocitos B
humanos. Las lectinas se emplean igualmente en la caracterizacin de grupos sanguneos
humanos, as como en la identificacin de nuevos grupos sanguneos. Aunque tambin hay
evidencia de que la mayora de las lectinas juegan un importante papel en la defensa de las
plantas contra diferentes tipos de organismos herbvoros.

III. EQUIPO Y MATERIALES

Centrifuga

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Bomba de vacio para solventes

Campana de extraccin de humos
Cmara de Electroforesis vertical
Fuente de poder para cmara de electroforesis
Mortero con pistilo
Papel filtro Whatman No. 1
Tubos Falcon de 50 mL
Tubos Eppendorf de 1.5 mL
Vasos de p.p. de plstico de 50 mL
Probeta de 100 mL
Matraces Kitasato
Embudo Buchner
Juego de micropipetas
Recipiente de plastico

REACTIVOS

Solucin isotnica (NaCl 0.85%)

Solucin amortiguadora (PBS 0.015 M, pH 7.2, 0.15 M NaCl)
Acetona fra
Solucin de Acrilamida 30% - Bis-acrilamida 0.8%
Amortiguador del gel separador pH 8.8
Amortiguador del gel separador pH 6.8
Amortiguador de corrida 5X / SDS
Amortiguador de muestra pH 6.8
Persulfato de amonio al 10% p/v
TEMED
Solucin de azul de bromofenol 10 mg/mL
Solucin teidora
Solucin desteidora
Marcadores de peso molecular para protenas

IV. METODOLOGA

1. Seleccionar, por equipo, una de las especies de leguminosas que se listan a

continuacin; las cuales son productoras de lectinas.

1) Canavalia ensiformis 6) Lens culinaris

2) Phaseolus vulgaris 7) Triticum vulgaris
3) Phytolacca americana 8) Glycine max
4) Pisum sativum 9) Eritrina coralloides
5) Vicia faba 10) Ricinus communis

(En caso de no encontrar la especie seleccionada proponer una especie productora de lectinas)

2. De cada especie listada adquirir 50 g, lo mas fresco posible, lavarlas y poner a remojar
durante una hora en una solucin isotnica; en caso de que sean semillas secas poner

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a remojar con la menos cantidad posible de solucin isotnica durante unas 4 horas; en
ambos casos, la solucin debe estar contenida en una matriz que proporcione
suficiente humedad pero que no permita que las semillas estn sumergidas
(embebidas) en la solucin, por ejemplo con torundas de algodn.
3. Transcurrido este tiempo y de ser posible, separar con mucho cuidado el epitelio de la
semilla, y ponerlos a remojar -junto con los cotiledones- durante toda la noche previa a
la sesin de laboratorio en un volumen 1:1 v/m en una solucin buffer (PBS 0.015 M,
pH 7.2, 0.15 M NaCl) o cuando menos en una solucin isotnica (ATENCIN:
conservar la solucin de remojo de toda la noche que ser la solucin de extraccin A),
en el caso de la Triticum vulgaris dejar en remojo el mayor tiempo posible hasta que
germine de ser posible.
4. En la sesin de laboratorio retirar de la solucin de remojo a los epitelios y los
cotiledones y molerlos en un mortero por separado. En caso de que el cotiledn sea
muy pequeo el material crudo se moler finamente junto con su epitelio. Despus del
molido se colocan en 50-100 mL de solucin de remojo por una hora (extraccin B),
transcurrido ese lapso se filtra e igual que la solucin de remojo (solucin extraccin A)
de toda la noche se les hace una extraccin con acetona fra para remover lpidos (2:1,
lquido:lquido). Si se requiere se puede hacer una remocin de slidos con papel filtro
del No. 1.
5. Se remueven las partculas que aparezcan usando una combinacin de centrifugacin
a 200 g 20 minutos y filtrado al vaco con papel Whatman No.1. Se puede optar por
remover los restos de la acetona dejando la muestra dentro de una camapana de
extraccin de humos.
6. El sobrenadante claro (y probablemente amarillezco), se toma una alcuota de 1 mL
para la prueba de hemaglutinacin y otros 5 mL para determinacin de protenas por el
mtodo de Lowry (Hartree, 1972) el de Bradford
7. Determinar el peso molecular aproximado de los compuestos proteicos mediante
electroforesis (SDS-PAGE).

Electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE)

Tratamiento de la muestra.

1. A una muestra de concentracin conocida de protena se le adiciona amortiguador de

muestra hasta un volumen final de 85 L
2. Aadir 10 L de solucin de azul de bromofenol y 5 L de -mercaptoetanol.
3. Incubar en bao mara a ebullicin durante 5 minutos.

Preparacin del Gel

1. Se limpia con etanol al 70% las placas de vidrio para remover contaminantes.
2. Colocar las placas de vidrio y los separadores en la base para preparar el gel.
3. Preparar el gel separador de acuerdo a lo indicado en la tabla 1 del anexo, adicionando
el persulfato de amonio y el temed al final.
4. Vaciar el gel separador en los vidrios evitando la formacin de burbujas, y alcanzando
un nivel 3 cm por debajo del borde superior. Dejar polimerizar de 20 a 30 minutos.
5. Preparar el gel concentrador de acuerdo a la tabla 2 del anexo.
6. Vaciar en la parte superior y colocar el peine, evitando la formacin de burbujas. Dejar
polimerizar de 15 a 20 minutos.

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Montaje de la cmara de electroforesis y corrimiento del gel.

1. Montar las placas de vidrio conteniendo el gel, en su base, y esta en la cmara.

2. Preparar amortiguador de corrida 1x.
3. Llenar con amortiguador de corrida la cmara interna hasta el lmite y la externa hasta
cubrir los electrodos. Revisar que no existan fugas de la cmara interna antes de llenar
la cmara externa
4. Retirar con cuidado el peine. Cargar aproximadamente 20 L de muestra y 5 L
marcador de peso molecular en los pozos.
5. Colocar la tapa de la cmara y conectar a la fuente de poder.
6. Correr a 50 V mientras las muestras se encuentren en el gel concentrador.
7. Correr a 100 V una vez alcanzado el gel separador y hasta que el frente de corrida
alcance el final del gel.
8. Detener la fuente de poder, recuperar el amortiguador de corrida y desmontar la
cmara.
9. Cuidadosamente recuperar el gel de los vidrios y colocarlo en la solucin teidora
durante 3 horas
10. Transcurrido el tiempo, desteir el gel con la solucin desteidora hasta la aparicin de
las bandas.
11. Medir el frente de corrimiento y obtener el Rf de las muestras para obtener el peso
molecular de las bandas.

ANEXO I

Tabla 1. Volumenes para preparar el gel separador (para un volumen de 15 mL)

Sol. stock (mL) / Conc. gel (%) 5 6 7 8 9 10 12 13 15

Sol. Acrilamida bisacrilamida 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 6.0 6.5 7.5

Amortiguador pH 8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75

Agua desionizada 8.75 8.25 7.75 7.25 6.75 6.25 5.25 4.75 3.75

Persulfato de amonio 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05

TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01

Tabla 2. Gel concentrador (para un volumen de 2 mL)

Sol. Acrilamida bisacrilamida 0.26 mL

Amortiguador pH 6.8 0.5 mL
Agua desionizada 1.22 mL
Persulfato de amonio 0.01 mL
TEMED 0.2

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PREPARACIN DE SOLUCIONES

Acrilamida 30% - Bis-acrilamida 0.8%

Pesar 29.2 g de acrilamida (99.9% pureza) ms 0.8 g de bis-acrilamida. Disolver en agua
bidestilada y aforar a 100 mL. Filtrar con papel Whatman 1. Guardar en frasco mbar a 4 C.
Usar guantes al pesar ya que la acrilamida es un compuesto neurotxico.
Amortiguador del gel separador pH 8.8
Pesar 9.081 g de Tris-base, y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustar el pH
con HCl (aprox. 1 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente.
Amortiguador del gel separador pH 6.8
Pesar 3.027 g de Tris-base y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustar el pH
con HCl (aprox. 1.5 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente.
Amortiguador de corrida 5X / SDS
Pesar 7.55 g de Tris-base, 36 g de glicina y 2.5 g de SDS, disolver con agua desionizada y
aforar a 500 mL. Al usar ajustar a 1X.
Amortiguador de muestra pH 6.8
Pesar 1.52 g de Tris-base y 2.0 g de SDS. Disolver en 40 mL de agua desionizada y ajustar el
pH a 6.8 con HCl (aprox. 2.0 mL). Adicionar 20 mL de glicerol y ajustar el volumen a 100 mL.
Persulfato de amonio al 10% p/v
Se prepara al momento de usarlo. Preparar el volumen mnimo necesario.
Solucin de azul de bromofenol 10 mg/mL
Pesar 100 mg de azul de bromofenol y disolverlo en 10 mL de agua desionizada. Guardar en
refrigeracin.
Solucin teidora
Para preparar 100 mL se usan 50 mL de Metanol, 10 mL de cido actico y 40 mL de agua
desionizada y 0.05 g de azul de Coomassie R-250. Disolver el azul de Coomassie en el
metanol y adicionar el cido actico. Aforar con el agua desionizada.
Solucin desteidora
Para preparar 500 mL se usan 25 mL de cido actico, 82.5 mL de metanol y 392.5 mL de agua
desionizada.

V. RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS

a) Elabore un dibujo de la cmara de electroforesis donde muestras el corrimiento de tu

gel y las caractersticas de la corrida.
b) Realiza un cuadro comparativo de cada una de las muestras utilizadas en la prctica
c) Discute sobre las aplicaciones de las lectinas en la industria farmacutica

VI. CUESTIONARIO PREVIO

1. Qu es la liofilizacin y que utilidad tiene como mtodo de conservacin?

2. Investigue si las lectinas son productos que se pueden liofilizar
3. Investigue los fundamentos de la metodologa experimental

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4. Investigue el fundamento de la tcnica de Lowry y la de Bradford

5. Qu es hemoaglutinacin?
6. Cules son las aplicaciones que tienen las lectinas en la industria farmacutica?

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Agrawal BBL, Goldstein IJ. 1972. Concanavalin A, the jack bean (Canacalia ensiformis)
phytohemagglutinin, In V Purification of carbohidrate-beinding protein. Ginsberg (ed.), Methods
in enzymology, XXVIII . Academic Press Inc., New York. 313-318.
Dahanukar SA, Kulkarni RA, Rege NN. 2000. Pharmacology of medicinal plants and natural
products. Indian Journal of Pharmacology. 32: S81-S118
Goldstein IJ. Hollerman CE. Merrick JM. 1965. Protein-carbohydrate interaction. I. The
interaction of polysaccharides with concanavalin A. Biochim. Biophys. Acta 97:68-76.
Hartree EF. 1972. Determination of protein: a modification of the Lowry method that gives a
linear photometric response. Analyt. Biochem. 48: 422-427
Hernndez-Daz P, Martn-Gonzlez O, Rodrguez-de-Pablos-Vlez Y, Ganem-Bez FA. 1999.
Aplicaciones de las lectinas. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter. 15(2):91-5
Mccabe MM, Smith EE. 1975. Relationship between cell-bound dextransucrase and the
agglutination of streptococcus mutans. Infection and Immunity. 12 (3): 512-520.
Monteiro ACO, Walbert E. Muniz-Filho WE, Horta ACG, Beltramini LM, Moreira RA. 1998.
Isolation and partial characterization of a lectin from Canavalia dictyota seeds. Revista
Brasileira de Fisiologia Vegetal, 10(3):167-172.
Wu C, Lovrien R, Matulis D. 1998. Lectin Coprecipitative Isolation from Crudes by Little Rock
Orange Ligand. Analyt. Biochem. 257: 33-39.
Peumans WJ, Van Damme EJM. 1995. Lectins as PIant Defense Proteins. Plant Physiol. 109:
347-352

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PRCTICA 4. PRODUCCIN DE PENICILINA EN DIFERENTES

SISTEMAS DE FERMENTACIN

I. OBJETIVOS

Objetivo General
Obtener penicilina por varios sistemas de fermentacin.
Objetivos especficos
Comparar el rendimiento de la fermentacin slida y la fermentacin lquida.
Determinar ventajas y desventajas de la produccin y de la extraccin del antibitico.

II. INTRODUCCIN

Existen diferentes clases de antibiticos los cuales tienen un valor econmico importante
debido a su aplicacin clnica, sobre todo en los pases como Mxico en el cual actualmente las
enfermedades de etiologa infecciosa representan el tercer lugar de causa de mortalidad (1),
siendo los de mayor demanda la cefalosporina, penicilinas y tetraciclinas, estas ltimas
representan el 17.5% en ventas del mercado mundial de antibiticos (2) y estn considerados
dentro del Cuadro Bsico de Medicamentos del Sector Salud.
La produccin de tetraciclina se realiza por fermentacin lquida con altos costos de operacin
lo que se refleja en el valor agregado de los productos, por lo que resulta interesante generar
procesos de produccin de antibiticos con aplicacin de biotecnologas alternativas que
resulten ms rentables como en el caso de la fermentacin en estado slido o con el uso de
soportes semislidos, las cuales son ampliamente utilizadas en los pases orientales y presenta
ventajas sobre la fermentacin sumergida (4).
La fermentacin slida se realiza sobre soportes que generalmente son seleccionados de
acuerdo a sus caractersticas, utilizacin y abundancia regional, siendo Mxico un pas con
generacin de una gran cantidad de residuos agroindustriales con poco o ningn
aprovechamiento de los mismos, la utilizacin de estos residuos como soportes en
fermentaciones slidas para la produccin de metabolitos microbianos representa una
alternativa para su aprovechamiento y una mejora ambiental, as como econmica, de las
regiones en las que se producen.
El salvado de trigo por su consistencia y bajo costo, ha sido utilizado como soporte para la
produccin de metabolitos en estado slido de enzimas, cidos orgnicos, entre otros.

III. MATERIALES Y MTODOS

Microorganismo: Penicillium chrysogenum, como productor de penicilina

Inculo: A un cultivo previamente esporulado de P. chrysogenum se adiciona solucin salina al
0.85% hasta obtener una solucin de 108 esporas por mililitro, lo anterior puede conseguirse
ajustando a una absorbancia de 0.5 a una longitud de onda de 540 nm.
Soporte slido: Salvado de trigo (u otro que puedan conseguir los alumnos)
Medio de Produccin de penicilina
Lactosa al 3%, Agua de cocimiento de maz 5%, Farmamedia 1%, Minerales: Fosfato de
potasio monobsico de 0.3%, fosfato de potasio dibsico 0.2%, CaCl 2 0.01% (preparar por
separado). Ajustar a pH 5.0.

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Sistema slido: En matraces Erlenmeyer de 125 mL colocar 5 gramos de salvado, 10 mL del

medio de cultivo. Inocular con el 3% de la solucin de esporas y adicionar 5 ml de agua estril
para conseguir una humedad relativa del 58%.
Sistema Clulas libres o sumergida: En matraces Erlenmeyer de 500 mL colocar 200 mL del
medio 1 e inocular con 3% de la solucin de esporas e incubar a 28C con agitacin orbital de
150 rpm.
Toma de muestra: Se toma muestra cada 24 horas, en el caso de la fermentacin slida se
muestrea un matraz cada 24 horas, en caso de la fermentacin sumergida se toman 10 ml, en
condiciones estriles.
Tratamiento de la muestra: En ambos casos se eliminan los slidos ya sea biomasa y restos
del medio. Para el medio slido se adiciona agua estril en una proporcin 1:5 agitar durante
10 minutos y filtrar, al filtrado medir el pH y guardarlo en refrigeracin para cuantificacin de
azcares y antibitico. En al caso de la sumergida se toman los 10 mL y se elimina la biomasa
por medio de filtracin o centrifugacin; el sobrenadante guardar en refrigeracin hasta su
anlisis o uso.

ENSAYO PARA ANTIBITICOS

Antibiticos
Penicilina
Microorganismos
Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis
Medios de cultivo
Medio para antibiticos No. 1 agar y medio lquido
Medio para antibiticos No. 2
Diluyente:
Solucin Buffer No. 1 (Disolver 2.0 g de fosfato dibsico de potasio y 8.0 g de fosfato
monobsico de potasio en 1000 mL de agua. Ajustar el pH con cido fosfrico 18 N o Hidrxido
de potasio 10 N a pH 6.0 +/- 0.05)

IV. METODOLOGA

Preparacin del estndar

Estndar de penicilina
Pesar la cantidad necesaria para obtener una solucin de 100 U/ml y realizar las diluciones
necesarias para obtener por lo menos 5 puntos de la curva de manera que el punto medio sea
1.0 U/ml
Preparacin del inculo
En un tubo de agar nutritivo sembrar el microorganismo de prueba e incubarlo 24 h. Aadir
solucin salina estril suficiente para obtener una solucin ajustada al 25% de transmitancia a
580 nm.
Mtodo del cilindro-placa
1. Aadir 20 ml del medio No. 2 en cada caja de petri, una por cada dilucin y dejar
solidificar.
2. Aadir al medio No. 1, 0.1 ml del microorganismo de la suspensin del inculo
(ajustada al 25%) por cada 100 ml. (Hacer lo mismo por separado con los dos
microorganismos a probar)

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3. Aadir 10 ml del medio inoculado sobre la placa gelificada de agar No. 2 y dejar
solidificar nuevamente.
4. Colocar 2 cilindros sobre las placas gelificadas y aadir 50 l de cada una de las
diluciones, incubar a 37oC por 24 h, medir el halo de inhibicin.

V. RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS

1. Calcule el rendimiento del metabolito con respecto al sustrato.

2. Para el anlisis de la fermentacin y el comportamiento, comparar las variables pH, el

incremento de biomasa, consumo de azcares y su relacin con la produccin del
analito.

3. Anlisis de todos las variables en funcin del las caractersticas del soporte utilizado.

VI. CUESTIONARIO PREVIO

1. Investigar los tipos de fermentacin utilizada para la obtencin de antibiticos en la

industria.
2. Investigar los mtodos de purificacin para el antibitico obtenido.
3. Investigar el mecanismo de accin para las penicilinas.
4. Investigar cules son los microorganismos de prueba para este antibitico, segn la
farmacopea de Estados Unidos, y cmo se reportan stos bioensayos.

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Bowman, W.C. and M.J. Rand, Farmacologa, Ed. Interamericana.

Manual de Productos Naturales.
Farmacopea Nacional de los Estados Unidos.

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PRACTICA 6. ELISA (Enzyme- Linked Inmusorbent Assay)

I. OBJETIVOS

Objetivo General
Determinar cualitativa y cuantitativamente la presencia de una protena dada en la
muestra problema
Objetivos especficos
Detectar agentes patgenos y su transmisin en muestras.
Detectar antgenos de manera especfica.
Evaluar la presencia de anticuerpos dependientes de procesos fisiolgicos.

II. INTRODUCCIN

El uso de la tcnica inmunoenzimtica Enzyme- Linked Immunosorbent Assay (ELISA) est

ampliamente difundido para el diagnstico serolgico de las enfermedades. El ensayo
inmunoenzimtico ELISA se basa en el uso de antgenos o de anticuerpos marcados con una
enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como
enzimtica pudiendo ser revelada mediante la adicin de un substrato especfico que, en
contacto con la enzima, producir un color observable a simple vista y cuantificable por un
lector de densidad ptica.
La tcnica de ELISA se caracteriza por presentar alta sensibilidad, especificidad, rapidez y
economa. Brinda la posibilidad de analizar un gran nmero de muestras de manera sencilla,
rpida y econmica, sin mayor infraestructura (Ruiz M. L, 2006).
Existen diferentes tipos de ELISAs descritos: ELISAs para detectar antgeno, ELISAs sndwich
y ELISAs para detectar anticuerpos: ELISAs indirectos.
Dando la ventaja de que los reactivos son relativamente estables, el color producido en la
reaccin puede leerse a simple vista cuando no se dispone de equipo adecuado y puede
analizarse grandes cantidades de muestra al mismo tiempo.
El sistema inmunolgico, caracterstico de animales superiores, es un complejo mecanismo de
defensa por medio del cual, stos se defienden de infecciones causadas por diferentes
microorganismos. Las reacciones de defensa ocurren de diversas formas, empleando
numerosos mecanismos, y a los efectos del desarrollo de varias tcnicas serolgicas, los
aspectos claves son el reconocimiento del agente invasor como un cuerpo extrao, y la
produccin de anticuerpos especficos para su eliminacin o neutralizacin.
Cualquier sustancia, molcula o microorganismo que entra en el torrente sanguneo de
un animal, y que es capaz de inducir en el organismo invadido una reaccin de defensa o
respuesta inmune, es considerado como un antgeno o inmungeno. Esta respuesta puede ser
variada, y uno de esos mecanismos consiste en que, cuando el antgeno entra en el torrente
sanguneo, es procesado y reconocido por grupos de clulas guardianas conocidas como
glbulos blancos o linfocitos del tipo B y T, de cuya interaccin son producidos
los anticuerpos que reconocen el antgeno de manera especfica. El sitio del antgeno que es
reconocido por un anticuerpo es denominado determinante antignico o eptope, pudiendo
tener el antgeno ms de un eptope.

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III. MATERIAL Y REACTIVOS

Materiales

Tubos eppendorf de 2.0ml

Micropipetas (50 l o 20-200 l)
Pipetas plsticas
Frascos con tapas
Microplacas

Reactivos

Antgeno (globulina gamma de pollo)

Anticuerpo primario (anticuerpo policlonal anti- pollo conejo)
Anticuerpo secundario (anticuerpo conjugado anti-conejo cabra a peroxidasa de rbano
HRP por sus siglas en ingls)
Sustrato enzimtico HRP (3,3, 5,5- tetrametil bencidina)
Solucin tampn salina de fosfatos 10 X
Tween 20 al 10 %

IV. METODOLOGA PARA DETECTAR LA PRESENCIA DE UN ANTIGENO

1. Agregar el control positivo, el control negativo y la muestra en un pozo
cada uno (50 uL). Hacer por triplicado.
2. Incubar durante 5 minutos para permitir la unin del antgeno al pozo.
3. Lavar pozos con buffer PBST (200 uL) y decantar (lavar 2 veces).
4. Agregar el anticuerpo primario (50 uL) a los pozos e incubar durante 5
minutos para permitir el reconocimiento del antgeno por el anticuerpo.
5. Lavar pozos con buffer PBST (200 uL) y decantar (lavar 2 veces).
6. Agregar el anticuerpo secundario acoplado a la enzima de peroxidasa de
rbano (50 uL) e incubar por 5 minutos para permitir el reconocimiento
del anticuerpo primario por el anticuerpo secundario.
7. Lavar pozos con buffer PBST (200 uL) y decantar (lavar 2 veces).
8. Agregar el sustrato de la enzima (50 uL) y observar el cambio a color azul
dentro de los primeros 5 minutos en los pozos donde el antgeno est
presente en la muestra.
9. (Opcional) Agregar cido sulfrico 0.18M para detener la reaccin
enzimtica despus de 5 minutos. La solucin azul se tornar amarilla.

METODOLOGA PARA DETECTAR LA PRESENCIA DE UN ANTICUERPO.

1. Agregar una muestra de antgeno a cada pozo (50 uL).

2. Incubar durante 5 minutos para permitir la unin del antgeno al pozo.
3. Lavar pozos con buffer PBST (200 uL) y decantar (2 veces).
4. Agregar la muestra de suero, el control positivo y el control negativo en
cada pozo con antgeno por triplicado. Incubar durante 5 minutos para
permitir el reconocimiento del antgeno por el anticuerpo presente en el
suero de la muestra.
5. Lavar pozos con buffer PBST (200 uL) y decantar (lavar 2 veces).
6. Agregar el anticuerpo secundario acoplado a la enzima de peroxidasa de
rbano (50 uL) e incubar por 5 minutos para permitir el reconocimiento
del anticuerpo primario por el anticuerpo secundario.
7. Lavar pozos con buffer PBST (200 uL) y decantar (lavar 2 veces).

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8. Agregar el sustrato de la enzima (50 uL) y observar el cambio a color azul

dentro de los primeros 5 minutos en los pozos donde el anticuerpo
especfico para el antgeno est presente en la muestra de suero.
9. (Opcional) Agregar cido sulfrico 0.18M para detener la reaccin
enzimtica despus de 5 minutos. La solucin azul se tornar amarilla.

V. RESULTADOS Y ANLISIS DE RESULTADOS

Resultados cualitativos provenientes de observar el cambio o no en el

color de la solucin debida a la reaccin de la enzima de peroxidasa de
rbano.

Resultados cuantitativos provenientes de la lectura de la absorcin a 655

nm en un lector de microplacas (En caso de haber usado cido sulfrico
leer a 450 nm). Los estudiantes comparan la lectura de sus muestras con
las de una curva estndar para estimar la concentracin en sus muestras

VI. CUESTIONARIO PREVIO

1. Cmo acta nuestro sistema inmune para protegernos de una enfermedad?

2. Cules son las vas por las cuales una enfermedad se extiende o propaga?
3. Escribe 5 ejemplos de enfermedades que atacan el sistema inmune.
4. Qu problemas previene el sistema inmunolgico al funcionar
adecuadamente?
5. Cules son los frmacos inmunosupresores necesarios cuando alguien tiene
un trasplante de rgano?
6. Qu significa ELISA? Por sus siglas en ingls y en espaol.
7. Por qu se usan enzimas en este inmunoensayo?
8. Por qu se requieren controles positivos y negativos durante el ensayo
experimental?
9. Qu pruebas basadas en la deteccin de anticuerpos puedes comprar en
una farmacia?

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Ruiz M. L., Martnez M. L., Trichinellosis: Tcnica Inmunoenzimtica de diagnstico (ELISA).

Instituto de Patologa, 2006 pg. 84-87
Ezequiel R. et, al. Implementacin de la tcnica de ELISA para la deteccin de virus y otros
patgenos en plantas en Venezuela, Nuemero.10 2006.

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