La reaccin en cadena de la polimerasa es sin lugar a dudas, la tcnica mas importante y revolucionaria en

biologia molecular, debido a que permite obtener in vitro millones de copias de un fragmento de acido
desoxirribonucleico (ADN).
En la reaccin, si usamos como sustrato ADN genmico, entonces tpicamente hablamos de una PCR, pero si
usamos ADN complementario (ADNc) proveniente del ARNm (cido ribonucleico mensajero) se le conoce
como RT-PCR (Reverse Transcription-PCR.
APLICACIONES
Secuenciacin Estudios evolutivos
Establecimiento de polimorfismos Deteccin de microorganismos infecciosos
Rastreo de mutaciones Deteccin de OGMs
Diagnstico de enfermedades genticas Deteccin de clulas tumorales
Resolucin de problemas forenses o arqueolgicos Clonacin molecular
PRINCIPIO
La reaccin en cadena de la polimerasa es una tcnica o metodologa basada en el proceso natural de
replicacin del DNA. Por tanto, incluye los tres grandes pasos que se describen en la replicacin como son:
Desnaturalizacin: Separacin de las dos hebras que conforman el DNA
Hibridacin: La unin de primers u oligonucletidos a cada una de las hebras sencillas previamente
separadas. Existe un oligo para cada hebra y son denominados oligo 5 y oligo 3.
Polimerizacin: Extensin de la hebra complementaria a cada una de las dos hebras inicialmente separadas
para dar lugar a dos molculas de DNA idnticas
A pesar de la aparente complejidad es un mtodo sencillo, sensible y relativamente rpido para la
amplificacin de secuencias de DNA. En la prctica se requiere controlar ciertas variables y el uso de un
equipo adecuado conocido como termociclador para el establecimiento de las condiciones de cada etapa
del proceso (tiempo y temperatura) y repetirlas de forma cclica el nmero de veces deseado.
REACTIVOS NECESARIOS
DNTPs nucletidos. Los cuatro dNTPs son los ladrillos para construir las nuevas cadenas de ADN.
Variaciones en su concentracin afectan especificidad y fidelidad. Concentraciones altas hacen disminuir la
actividad de la enzima e incluso pueden llegar a inhibirla. El uso de concentraciones desbalanceadas tambin
afecta la fidelidad, siendo las concentraciones utilizadas en la mayora de los casos entre 0,2 a 1Mm (13). Los
dNTPs pueden captar iones de magnesio (Mg2+) por lo tanto las concentraciones de ambos deben guardar
siempre la misma relacin
PRIMERS Delimitan la zona de ADN a amplificar. Al ser reconocidos por la enzima permiten iniciar la reaccin.
Son secuencias cortas, normalmente de 18 a 22 nucletidos (aunque pueden llegar hasta 40 segn el caso) y
contenido en GC entre 40-75%. Ambos iniciadores deben tener una temperatura de fusin (Tm) similar. Deben
estar situados enfrentados y no a mucha distancia. Son el componente ms sensible que determina el xito de
un ensayo. Normalmente se disean para ser exactamente complementarios al molde de ADN y la
concentracin a la que suelen emplearse est en el intervalo de 0,1-0,5M
H2O: Usada como solvente. Se requiere al menos que sea desionizada (18m-chms) o milli-Q grado molecular.
Si se busca un mejor rendimiento se aconseja adems, que sea libre de DNasas y RNasas, purificada por luz
ultravioleta, ozono o 0,1% de dietilpirocarbonato (este ltimo inactiva las RNasa) (13). Una buena opcin
prctica resulta el uso de agua dispensada para la preparacin de soluciones inyectables
BUFFER: Mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. Por lo general incluye Tris-
HCl (pH=8,4 a temperatura ambiente), KCl, 26, gelatina y MgCl2. Algunos autores recomiendan el uso de
adyuvantes los cuales en la prctica aumentaran especificidad y fidelidad (en ningn caso son
imprescindibles). Entre los adyuvantes ms empleados se sealan dimetilsulfxido (DMSO), aadido para
disminuir las estructuras secundarias del ADN, detergentes como el Tween 20 o el Tritn X-100 que ayudan a
estabilizar la enzima y finalmente polietilenglicol (PEG), glicerol, formamida y seroalbmina bovina (13). Se
AMORTIGUADOR: Los iones divalentes actan como cofactores de la enzima por tanto tienen una funcin
crtica en la reaccin. Se suele usar Mg2+, agregado comnmente como cloruro de magnesio (MgCl2),
requirindose que sea usado a una concentracin que oscila regularmente entre 0,5 y 2,5mM. En muchos
casos la concentracin debe optimizarse para cada ensayo. En general, concentraciones insuficientes dan
lugar a bajo rendimiento mientras que el exceso tiende a producir amplificaciones inespecficas (2). Entre los
iones monovalentes el ms empleado es el potasio (K), generalmente unido a otros iones como el cloro (KCl)
en una solucin tampn (13).
MUESTRA : Contiene la regin de ADN que se va a amplificar. La cantidad de este molde puede ser de tan
slo 1ng en caso de material gentico clonado o de un mnimo de 20ng cuando se utiliza ADN genmico
proveniente de clulas eucariotas
DNA POLIMERASA TERMOESTABLE Las ADN polimerasa utilizadas en PCR incluyen un grupo de enzimas
termoestables aisladas de organismos termfilos, de calidad suficiente que evitan prdidas en especificidad,
eficiencia, fidelidad y rendimiento (16). Su temperatura ptima de catlisis oscila alrededor de 70-72C,
temperatura a la cual incorporan aproximadamente 100 nucletidos por segundo. En la actualidad la mayora
son versiones recombinantes e incluso mejoradas por ingeniera gentica
. Hoy en da las casas comerciales venden junto con la DNA polimerasa el buffer que incluye en caso de
necesitar los cofactores. Completando as los elementos necesarios en la mezcla de reaccin de PCR. De
igual forma a esta mezcla se adiciona agua grado biologa molecular.
ETAPAS DEL PROCESO
Se requiere una sucesin de ciclos que incluirn los pasos de desnaturalizacin, hibridacin y replicacin para
conseguir la amplificacin de un gran nmero de molculas que contiene la secuencia de inters o diana.
1. Desnaturalizacin
2. Hibridacin
3. Elongacin o polimerizacin de la cadena
Adems de estas tres etapas de cada ciclo se aade una etapa previa y una final.
La etapa previa consiste en mantener elevada temperatura la cual asegura la desnaturalizacin completa del
DNA y la etapa final permite la elongacin completa de todos los fragmentos.
Imagen
2.1 Desnaturalizacion inicial. Habitualmente la PCR utiliza un ciclo de desnaturalizacin (separacion de la
doble helice porque los puentes de hidrogeno se rompen), la temperatura y el tiempo se determinan de
acuerdo a las caracteristicas del ADN y de la ADN polimerasa utilizada, por lo general es entre 94 y 96 C
durante 5-10 minutos.
2.2 Ciclos de la PCR. Se realizan ciclos sucesivos de desnaturalizacion, alineamiento y extension,
generalmente estas etapas se repiten entre 25 y 35 veces.
2.2.1 Desnaturalizacion. En esta etapa es muy importante que el ADNNmolde se desnaturalice
completamente. Para lograrlo de manera adecuada se recomiendan temperaturas de 94 oC durante 30
segundos a 1 minuto. Si el ADN tiene un alto contenido de guaninas y citosinas, se recomienda aumentar el
tiempo o la temperatura. La actividad de la enzima decrece muy rapido a partir de los 95 oC, por lo que a
estas temperaturas o superiores es aconsejable disminuir el tiempo de incubacion.
2.2.2 Alineamiento- hibridacion. Al disminuir la temperatura de incubacion los iniciadores se unen al ADN
molde en las zonas 3complementarias. Ambos iniciadores se unen de manera especifica al ADN flanqueando
el fragmento que se quiere amplificar. En este caso, la temperatura y el tiempo van a depender de 3 factores
relacionados con los iniciadores: la concentracion, el numero de bases y el porcentaje de guaninas-citosinas.
En la practica, la temperatura de alineamiento oscila entre 45 y 65 oC durante un tiempo entre 30 segundos y
1 minuto. Un aumento de temperatura o del tiempo favorece la especificidad porque disminuye las uniones
incorrectas de los iniciadores con la hebra molde
2.2.3 Extension-polimerizacion .. Esta etapa, tambien conocida como elongacion, amplificacin o
polimerizacion, consiste en la sintesis de la nueva cadena de ADN, a partir del extremo 3 del iniciador por
accion de la ADN polimerasa, empleando como sustrato los cuatro dNTPs. En la mayoria de las reacciones, la
etapa de extension se realiza a 72 oC porque es la temperatura a la cual la Taq polimerasa (enzima mas
utilizada) alcanza su mayor actividad. El tiempo de extension depende de la longitud del fragmento a
amplificar, la Taq polimerasa aade de 500 a 1000 nucleotidos por minuto.
2.3 Extension final. Generalmente, al terminar los ciclos, se realiza una ultima extension de aproximadamente
5 minutos a 72 oC para permitir que la polimerasa termine de sintetizar todos los fragmentos que pueden
haber quedado incompletos.
3. Realizar electroforesis del producto obtenido
CARACTERISTICAS DEL PROCESO
Rendimiento: Puesto que los productos de cada ciclo sirven de molde para el siguiente la acumulacin de
copias es exponencial.
Duracin: La duracin de cada etapa del ciclo debe optimizarse dependiendo de la secuencia completa a
amplificar.
Especificidad: Es elevada y determinada por la secuencia de los oligonucletidos utilizados. La aparicin de
una nica banda o un nico producto de PCR demuestra una alta especificidad.
Capacidad de deteccin o sensibilidad: Es muy alta. La CR puede permitir detectar un DNA diana en casi
cualquier tipo de muestra clnica, forense o arqueolgica, sin embargo esto supone tambin un elevado riesgo
de contaminacin.
Fidelidad: Es la capacidad de copiar secuencias con precisin, sin introducir mutaciones (cambios en la
secuencia de nucletidos). Esta caracterstica depender de si la enzima empleada tiene o no actividad
correctora de pruebas (actividad exonucleasa 3). Esta caracterstica puede ser de gran importancia
parasituaciones en donde el objetivo es:
- La identificacin de mutaciones poco frecuentes
- La expresin de protena
PCR EN TIEMPO REAL
El principio de la tcnica se basa en la PCR punto final pero la deteccin de los productos amplificados
sucede en cada ciclo de la reaccin pudiendo as cuantificar la cantidad de ADN en la muestra. El producto es
monitoreado conforme transcurre la reaccin. Si se usa DNA genmico se escribe qPCR si es cDNA RT-
qPCR. La PCR en tiempo real detecta y cuantifica secuencias especficas de cidos nucleicos mediante el uso
de reporteros fluorescentes en la reaccin
METODOS PARA DETECTAR PRODUCTOS AMPLIFICADOS
Los mtodos no especfi cos se basan en el uso de molculas intercalantes que tienen afi nidad por el ADN de
doble cadena y que al ser oxidados generan una seal fl uorescente. La fl uorescencia emitida es capturada
en la etapa de extensin de cada ciclo y es proporcional al nmero de copias de ADN de doble cadena
obtenidas en cada ciclo de la PCR. El reportero ms usado para estos fi nes se llama SYBR Green, la cual es
una molcula cargada positivamente que, mientras est en solucin sin unirse al ADN de doble cadena,
prcticamente no emite fl uorescencia; sin embargo, cuando se une al surco menor del ADN incrementa hasta
1,000 veces su fl uorescencia Aunque el SBYR Green es uno de los reporterosmfl uorescentes ms utilizados
por los investigadores debido a su bajo costo, la principal desventaja es que puede unirse a cualquier
molcula de ADN de doble cadena, incluyendo dmeros de primers. Muchos laboratorios, para evitar esta
situacin, optimizan sus reacciones realizando una curva melting o curva de disociacin al fi nal de la
reaccin, cuya funcin es la de evaluar si se form un producto nico o si hay presencia de dmeros de
primers. Hoy en da la mayora de los software de los termocicladores ofrecen esta funcin que es fcil de
aplicar y analizar
METODO ESPECIFICO
parten de principios distintos a diferencia de los no especfi cos y tienen en comn la seal de fl uorescencia
emitida para detectar los productos amplifi cados. Estos mtodos siguen el principio conocido como
transferencia de energa de resonancia fl uorescente (FRET, por sus siglas en ingls) para generar la seal;
este mtodo consiste en transferir energa desde un donador o reportero fl uorescente a un aceptor o
quencher. Para ello, existen dos mtodos especfi cos, stos son:
pruebas basadas en hidrlisis. Los primeros se basan en sondas fl uorescentes de oligonucletidos
etiquetados con un reportero fl uorescente y un quencher, ambos se encuentran en estrecha unin mientras
la sonda no hibride a su secuencia blanco. Cuando hibrida, ocurren cambios conformacionales en el reportero
y el quencher, lo cual permite que la actividad exonucleasa 5-3 de la Taq polimerasa rompa esta unin,
logrando que la fl uorescencia emitida por el reportero sea liberada y capturada por el equipo. Estos mtodos
son muy seguros, ya que mientras no haya unin de la sonda a su blanco, no habr amplifi cacin y tampoco
seal de fl uorescencia; es por eso que la especifi cidad es muy alta. Un ejemplo de estos sistemas son las
sondas comerciales conocidas como TaqMan12 aunque existen otras enel mercado.
HIBRIDACION consisten en una sonda unida a un reportero fl uorescente que est en estrecha proximidad
con un aceptor fl uorescente unido a otra sonda. Tanto el reportero como el aceptor presentan un espectro de
excitacin y de emisin similar, de tal forma que cuando las dos sondas hibriden a su templado blanco, el
reportero es excitado y la seal emitida es transferida al aceptor, generando un incremento en la cantidad de fl
uorescencia. Un ejemplo de este mtodo son las sondas molecular Beacons13 que tambin son comerciales.
Los mtodos especfi cos son ms costosos que los no especfi cos, pero son ms efi cientes al garantizar la
especifi cidad de la reaccin, evitando la formacin de productos inespecfi cos
COMO SE CAPTURA FLUORESCENCIA
Cualquiera de los mtodos que se utilicen para detectar los productos amplifi cados en cada ciclo de la
reaccin necesita de la tecnologa incluida en los termocicladores de PCR en tiempo real para: a) excitar al
reportero, b) capturar la seal de emisin del mismo y c) realizar el anlisis cuantitativo. En el mercado existen
diferentes tipos de termocicladores para esta fi nalidad, cuyas diferencias principales son la fuente de energa
que utilizan para la excitacin. En general son tres las fuentes: las lmparas de luz, diodos de emisin de luz
(LED, por sus siglas en ingls) y lseres. Cualquiera que sea la fuente, primero el reportero es excitado y su
seal de emisin colectada a travs de un fi ltro que permite el paso de la longitud de onda correspondiente
que llega hasta un fotodetector que captura la informacin proveniente de la muestra para su anlisis enel
software del equip
COMO SE ANALISAN LOS RESULTADOS
tiempo real y capturar la fluorescencia de cada muestra, el anlisis de la reaccin es el paso fi nal para
determinar la cuantifi cacin gnica. Para ello, los termocicladores estn provedos de una PC con un software
que generalmente son fciles de usar. Este software genera una serie de grfi cas en donde se muestran
todos los datos necesarios para conocer si la reaccin fue exitosa. Una de estas grfi cas es la de amplifi
cacin (Figura 6) que muestra el curso y el progreso de la reaccin, otra grfi ca es la curva de disociacin o
curva melting (Figura 7) que muestra informacin sobre la especifi cidad de la reaccin. Otro paso importante
del anlisis es elegir el tipo de cuantifi cacin que se usar para determinar la amplifi cacin precisa del blanco
gnico; este procedimiento depende de los intereses del investigador. Para ello existen dos tipos de cuantifi
cacin: la absoluta y larelativa. La primera generalmente se utiliza para conocer el nmero exacto de copias
amplifi cadas del blanco o la concentracin precisa de cidos nucleicos en una muestra. En la prctica, este
tipo de cuantifi cacin se usa para medir la carga viral o bacteriana en diferentes tejidos. La segunda se aplica
cuando se desean evaluar los cambios en la expresin de genes en distintos estados fi siolgicos Estos
cambios se basan en los niveles del ARNm del gen blanco comparados con un gen de referencia (gen
housekeeping) que no cambia su expresin a pesar de que los estados fi siolgicos se modifi quen por
diversas causas. Los datos son expresados como relativos al gen de referencia y generalmente son referidos
como el nmero de veces en el que aumentaron o decrementaron los niveles de ARNm o en su caso, si no
hubo cambios. Cualquiera que sea el tipo de cuantifi cacin que se elija, casi todos los software de los
equipos estn posibilitados para llevar a cabo los anlisis matemticos y estadsticos que se requieren en
cada tipo de cuantifi cacin.
PCR MULTIPLEX
Multiplex PCR es una tcnica de biologa molecular generalizada para la amplificacin de
mltiples objetivos en un nico experimento de PCR. En un ensayo de multiplexacin, ms de
una secuencia diana puede ser amplificado mediante el uso de mltiples pares de cebadores en
una mezcla de reaccin. Como una extensin para el uso prctico de PCR, esta tcnica tiene el
potencial de producir un ahorro considerable en tiempo y esfuerzo en el laboratorio sin
comprometer la utilidad del experimento.
TIPOS

1. Single Template PCR Reaccin

Esta tcnica utiliza una nica plantilla que puede ser un ADN genmico, junto con varios pares
de cebadores directo e inverso para amplificar regiones especficas dentro de una plantilla.

2. Reaccin Mltiple Template PCR

Se utiliza mltiples plantillas y varios conjuntos de cebadores en el mismo tubo de reaccin. La
presencia de mltiples cebadores puede dar lugar a hibridacin cruzada entre s y con la
posibilidad de errores de cebado con otras plantillas

Parmetros de diseo de cebadores para PCR multiplex

Diseo de conjuntos de cebadores especficos es esencial para una reaccin multiplex
xito. Las importantes consideraciones de diseo de cebadores descritos a continuacin son
una clave para la amplificacin especfica con alto rendimiento.
1. Primer Longitud
ensayos Multiplex PCR implican el diseo de un gran nmero de cebadores, por lo tanto, se
requiere que el cebador diseado debe ser de longitud apropiada. Por lo general, se utilizan
cebadores de corta longitud, en el intervalo de 18-22 bases.
2. Temperatura de fusin
cebadores con Tm similares, preferiblemente entre 55 C-60 C se utilizan. Para las
secuencias con alto contenido de GC, se recomiendan cebadores con una Tm ms alta
(preferiblemente 75 C-80 C). Una variacin Tm de entre 3 -5 C es aceptable para los
cebadores usados en una piscina.
3. Especificidad
Es importante tener en cuenta la especificidad de los cebadores diseados para las secuencias
diana, mientras se prepara un ensayo mltiple, sobre todo porque existe competencia cuando
mltiples secuencias diana estn en un solo recipiente de reaccin.
4. Evitar la formacin de dmero Primer
Los cebadores diseados deben ser revisadas para la formacin de dmeros de cebadores, con
todos los cebadores presentes en la mezcla de reaccin. La dimerizacin conduce a la
amplificacin inespecfica.
Todos los dems parmetros son similares a las directrices de diseo de cebadores de PCR
estndar .
PROBLEMAS EN COMUN
Un problema comn en mPCR es la amplificacin preferencial de un blanco sobre otro. Mediante modelos
tericos y estudios experimentales han sido detectados los causales de dichas amplificaciones en los
planetamientos conocidos como deriva y seleccin (ver figura 1). La deriva (o direccionalidad) asume la
existencia de variaciones o fluctuaciones en la interaccin de los reactivos durante el ciclaje particularmente
en ciclos iniciales, situacin que encontrara su justificacin en las bajas concentraciones en la que se
encuentra el templado de ADN originando concentraciones iniciales muy bajas del blanco a amplificar que en
conjunto a las variaciones en los perfiles trmicos del equipo, dan lugar a rampas de temperaturas desiguales
(error experimental simple). El planetamiento por seleccin define a un mecanismo que por s mismo favorece
la amplificacin de ciertos blancos debido a propiedades inherentes del blanco y de las secuencias que lo
flanquean. En este sentido se menciona el contenido de GC como principal responsable de una mayor
eficacia vinculante entre los primers. En principio la deriva es inevitable en cualquier reaccin, mientras que la
seleccin puede ser modulada a fin de fomentar la igualdad de amplificacin de dianas

Ventajas de Multiplex PCR

Controles internos 1.
Los problemas potenciales en un simple PCR incluyen falsos negativos debido a la falta de
reaccin o falsos positivos debido a la contaminacin. Los falsos negativos a menudo se
revelan en ensayos multiplex, porque cada uno de amplificacin proporciona un control interno
para los otros fragmentos amplificados.
2. Eficiencia
El gasto de los reactivos y el tiempo de preparacin es menor en PCR multiplex que en los
sistemas donde se utilizan varios tubos de PCR UNIPLEX. Una reaccin mltiple es ideal para
la conservacin de la polimerasa costoso y plantillas escasean.
3. Indicacin de Plantilla Calidad
La calidad de la plantilla se puede determinar de manera ms eficaz en multiplex que en un
simple reaccin de PCR.
4. Indicacin de Plantilla Cantidad
La amplificacin exponencial y los estndares internos de PCR multiplex se puede utilizar para
evaluar la cantidad de una plantilla determinada en una muestra. Para cuantificar las plantillas
con precisin por PCR multiplex, la cantidad de plantilla de referencia, el nmero de ciclos de
reaccin, y la inhibicin mnima de la duplicacin terica de producto para cada ciclo deben
tenerse en cuenta.

Aplicaciones de la PCR multiplex

1. La identificacin de patgenos 5. La cuantificacin de plantilla

2. Genotipado de alto rendimiento SNP 6. El anlisis de ligamiento

3. Anlisis de la mutacin 7. Deteccin de RNA

4. Anlisis de delecin del gen 8. Los estudios forenses

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