Artculos Cientficos
Dinmica de levaduras mediante tcnicas
microbiolgicas y moleculares
Resumen
En un proceso fermentativo intervienen una gran cantidad
de diversos microorganismos, tales como levaduras y bac-
terias lcticas, que aunque son responsables de las caracte-
rsticas del producto final, la presencia y cantidad de cada
uno de stos vara en el transcurso de la fermentacin. A
la fecha se han realizado esfuerzos encaminados a conocer
el comportamiento de dicha microflora; que involucran
desde las tcnicas microbiolgicas convencionales, hasta
las moleculares, que tienen como soporte a la reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR), esta revisin bibliogrfica
menciona la importancia de la identificacin morfolgica y
fisiolgica de las levaduras y describe las tcnicas depen-
dientes de cultivo para la identificacin y caracterizacin
de estos microorganismos; as como las tcnicas que no
requieren de un cultivo previo de las muestras, por ltimo
se resalta la importancia de realizar a un mismo proceso
fermentativo, ms de una tcnica con el fin de obtener
resultados que demuestren realmente la dinmica de las
levaduras involucradas con el producto en estudio.
Palabras clave: Levaduras, PCR, Tcnicas dependientes
e independientes de cultivo
Abstract
In a fermentative process takes part a great amount of di-
verse microorganisms, such as yeasts and lactic bacterias,
those although they are responsible for the characteristics
of the end item, the presence and amount of each one of
*Universidad de Ciencias y Artes de Chiapas-
Escuela de Biologa. verdugov1@yahoo.com.mx
Alma Gabriela Verdugo Valdez*
these vary in the course of the fermentation. To the date
directed efforts have been made to know the behavior mi-
croflora happiness; that they involve from the conventional
microbiological techniques, to molecular ones, that they
have like support to the polymerase chain reaction (PCR),
this bibliographical review is mentioned the importance of
the morphologic and physiological identification of yeasts
and describes to the dependent techniques of culture for the
identification and characterization of these microorganis-
ms; as well as the techniques that they do not require of a
previous culture of the samples, and finally the importance
is emphasized of making to a same fermentative process,
more than a technique with the purpose of obtaining re-
sults than they really demonstrate the dynamics of yeasts
involved with the product in study.
Key words: Yeasts, PCR, Dependent and independent
techniques of culture
Introduccin
S
e ha demostrado que el proceso de fermentacin
es llevado a cabo y completado por un nmero
limitado de cepas dominantes de levaduras aso-
ciadas con un nmero variable de cepas secundarias;
y adems, que ocurre una sustitucin secuencial de
cepas durante la fermentacin en la medida en que
sta progresa y los niveles de alcohol van aumentando
(Capello et al., 2004). Las levaduras ms comnmente
encontradas en los procesos de biosntesis de etanol
pertenecen a la especie Saccharomyces cerevisiae (Gue-
29
rra et al., 2001) y generalmente se ha observado un
extenso polimorfismo entre las cepas; algunas de ellas
han sido elegidas y adaptadas para procesos de fer-
mentacin industrial; las levaduras no-Saccharomyces
crecen bien en las etapas iniciales de la fermentacin
pero son subsecuentemente reemplazadas durante las
etapas siguientes por cepas del gnero Saccharomyces,
las cuales son ms tolerantes al etanol (Querol et al,
2003). El estudio de la evolucin de la microflora
de levaduras durante la fermentacin alcohlica
natural puede ayudar a preservar las cepas indge-
nas representativas y controlar la calidad del vino
(Capello et al., 2004). Para una evaluacin adecuada
de dicha evolucin, es necesario el conocimiento de
las caractersticas genticas, as como de los perfiles
especficos de expresin de las levaduras de bebidas
alcohlicas, lo que ayudar a comprender mejor el
proceso biolgico de fermentacin a nivel molecular
y al conocimiento de la regulacin de la expresin de
genes en relacin con los cambios en las propiedades
fsicas y qumicas del medio de cultivo (Querol et al.,
2003).
1. Identificacin morfolgica y fisiolgica
Las levaduras pueden ser definidas como aquellos
hongos, ya sea Ascomicetos o Basidiomicetos, que se
caracterizan por realizar gemacin o fisin como pri-
mer mecanismo de reproduccin vegetativa y tienen
estados sexuales que no estn encerrados en cuerpos
fructferos (Kurtzman y Robnett, 2003).
La asignacin de levaduras a gneros y familias
ha estado basada principalmente en la morfologa de
los estados vegetativo y sexual de las clulas; y sobre
la respuesta fisiolgica, para esto ltimo, se realizan
alrededor de 60 a 80 fermentaciones o pruebas de cre-
cimiento con base en diferentes sustratos (Kurtzman
y Robnett, 2003, Las Heras Vzquez et al., 2003).
Las caractersticas morfolgicas de los diferentes
tipos de colonias encontradas en los medios de cultivo
30
ensayados deben registrarse para su posterior purifi-
cacin y caracterizacin fisiolgica (Ardhana y Fleet,
2003); como puede vislumbrarse, la identificacin de
las levaduras con estos criterios, es un proceso muy la-
borioso que implica tiempo, que es importante evitar
para tomar decisiones que no afecten a los procesos
industriales, cuando stos se estn llevando a cabo.
Sin embargo, ms de 90 % de los microorganismos
de los ambientes naturales, no pueden cultivarse por
tcnicas tradicionales o no es posible obtener cultivos
puros porque dependen de las actividades de otros
microorganismos o porque no se conocen las con-
diciones para su cultivo, por estos inconvenientes la
identificacin de la microbiota se debe fundamentar
en tcnicas moleculares que salven estos problemas;
adicionalmente a la identificacin de las especies, el
conocimiento de los microorganismos contribuye a
producir alimentos y bebidas fermentadas en condi-
ciones controladas y de calidad.
2. La reaccin en cadena de la polimerasa
(pcr): una herramienta indispensable para
la caracterizacin e identificacin de
levaduras
Desde hace algunos aos, los enfoques moleculares,
en particular, la reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR), ha sido desarrollada para la deteccin de va-
rios hongos patgenos, incluyendo Candida albicans,
Aspergillus fumigatus y Cryptococcus neoformans. Se
ha demostrado que la PCR basada en secuencias
universales conservadas entre los ADN ribosomales
(ADNr) de hongos es altamente especfica y sensible
para la deteccin de un amplio rango de stos micro-
organismos.
La PCR es un procedimiento extremadamente
poderoso, que permite la amplificacin seleccionada
de una secuencia de ADN in vitro. Tal amplificacin
se alcanza por un proceso cclico de tres pasos; que
se describen a continuacin:
 1. Desnaturalizacin: consiste en la elevacin de
la temperatura dentro del tubo de reaccin, hasta
los 95 C.
2. Alineamiento: El ADN desnaturalizado se
alinea a cebadores por incubacin a 35-60 C. La
temperatura de alineamiento depende de la compo-
sicin de los cebadores.
3. Elongacin: La enzima Taq polimerasa se usa
para replicar el segmento de ADN entre los sitios
complementarios a los oligonucletidos de los ceba-
dores; entre los extremos hidroxilo 3 necesarios para
la extensin covalente, y el ADN desnaturalizado
que realiza la funcin del templado requerido para
la polimerizacin.
2.1. Tcnicas dependientes de cultivo
Para numerosas pruebas moleculares es necesario
hacer una amplificacin de genes o de porciones
de genes, con el fin de tener una mayor cantidad de
material gentico sobre el cual aplicar los mtodos
y obtener resultados confiables, a continuacin se
describe una tcnicas que se est utilizando actual-
mente para el estudio de las levaduras en bebidas
fermentadas.
2.1.1. Amplificacin de secuencias
repetidas aleatoriamente (rapd)
sta tcnica se basa en la amplificacin de secuen-
cias repetidas aleatoriamente a lo largo del genoma.
Los cebadores se escogen al azar, por lo que no es
necesario contar con informacin sobre secciones
especficas del microorganismo a tipificar. Se utili-
zan temperaturas de alineamiento bajas, de manera
que se obtengan productos de PCR que permitan el
alineamiento de los cebadores a pesar de que una o
dos bases no coincidan. Despus de su separacin me-
diante electroforesis en geles de agarosa se obtienen
patrones simples de fragmentos de ADN de distintos
tamaos. Al ser esta tcnica muy sensible a las con-
diciones de reaccin, es difcil su reproducibilidad
entre laboratorios (Daz y Wacher, 2003). Guerra et
al., (2001) que construyeron un dendograma usando
los cebadores EI 1 y M 13 para realizar el anlisis
filogentico por comparacin del nmero de bandas
de ADN amplificado a partir de varias cepas de Sa-
ccharomyces cerevisiae.
2.1.2. Amplificacin de microsatlites
Es una tcnica efectiva, debido a su capacidad de
revelar un alto nivel de polimorfismo, que provee
de una fcil interpretacin de perfiles genticos y a
la rapidez del mtodo; por esto es una herramienta
importante en estudios enolgicos ya que puede ser
aplicada para investigar la ecologa y la diversidad
gentica de las especies que predominan durante pro-
cesos de fermentacin espontnea, y tambin puede
ser usada como marcador gentico para identificar,
monitorear y controlar cepas seleccionadas de S.
cerevisiae con fines comerciales (Prez et al., 2001);
estas secuencias fueron empleadas por Cadez et al.,
(2002), y Cadez et al., (2003); usando los cebadores
(ATG)5, (GTG)5 y (GACA) 4 en ambos casos; en el
primer estudio, se observ la relacin filogentica
entre distintas especies de levaduras y en el segundo
estudio, se evaluaron nuevas especies de Hansenias-
pora-Kloeckera distribuidas en Sudfrica.
2.1.3. Secuenciacin
Fernndez-Espinar et al. (2001), utilizaron los ceba-
dores d1: 5-CAA AAT TCA CCT ATA TTC TCA-3
Y d2: 5-GTG GAT TTT TAT TCC A ACA-3 que
flanquean la regin del retrotransposn TY1 para
estudiar la autenticidad de cepas comerciales de le-
vaduras del vino. El extremo 5 de LSU contiene las
regiones variables D1 y D2 de alrededor de 600 pb,
de stas, la ms variable es la regin 2 que muestra
una divergencia de 0-1% en cepas co-especficas que
pueden ser distinguidas sobre las bases. Este mismo
31
criterio usaron Cadez et al., (2003) para determinar la
relacin filogentica de distintas cepas de las especies
Hanseniaspora y Kloeckera.
Kurtzman y Robnett (2003), tambin estudiaron la
filogenia entre levaduras del complejo Saccharomyces,
por medio del anlisis de secuencias de los multigenes
del ADNr (18S, 26S e ITS), los genes nucleares de
copia nica (factor de elongacin 1a, actina-1, RNA-
polimerasa II), y los genes mitocondriales (subunidad
pequea del rDNA, citocromo oxidasa II).
Capello et al., (2004), en su estudio de caracteri-
zacin de cepas de S. cerevisiae aisladas a partir de
uvas, utilizaron tambin los cebadores d1: 5-CAA
AAT TCA CCT ATA TTC TCA-3 Y d2: 5-GTG
GAT TTT TAT TCC A ACA-3, para determinar la
autenticidad de cepas comerciales de levaduras del
vino. Jespersen et al., (2005), secuenciaron los genes
D1/D2 para valorar la presencia y diversidad de leva-
duras en la fermentacin de granos de cocoa en frica
y encontraron que es aplicable para la identificacin
de muchas especies.
2.1.4. Polimorfismo de la longitud de los
fragmentos de restriccin (rflp)
Con el fin de caracterizar e identificar cepas de
levaduras, es posible realizar una amplificacin de
una regin especfica del ADN genmico, como por
ejemplo el complejo de las regiones del espaciador
interno (ITS; no codificante y variable) y el gen ri-
bosomal 5.8S (codificante y conservado) . En 1999,
Esteve-Zarzoso et al., encontraron que las formas
anamrficas y teleomrficas de las mismas especies
de levaduras, generan el mismo patrn; finalmente,
gracias a los resultados presentados en este trabajo,
fue posible constituir una base de datos inicial, que
puede complementarse con ms especies, que debern
probarse bajo las mismas condiciones.
Fernndez-Espinar et al., (2001), citan a varios
autores que han empleado este mtodo desarrollado
para discriminar entre cepas muy relacionadas; el
32
polimorfismo mitocondrial ha sido usado extensa-
mente para caracterizar cepas de levaduras cerveceras
y del vino usando las enzimas de restriccin Hinf I o
DdeI, separando los fragmentos obtenidos en geles de
agarosa al 0.8% (w/v).
En 2001, Esteve-Zarzoso et al., utilizaron esta
tcnica para realizar la caracterizacin gentica de
27 cepas del gnero Hanseniaspora, Lopes et al., (2002),
estudiaron con RFLP-ADNmt la poblacin de S. ce-
revisiae en vinos de la Patagonia a nivel industrial y a
escala, encontrndose las mismas cepas dominantes
en ambos casos. Asimismo Cadez et al., (2002), de-
terminaron el polimorfismo intraespecfico de Han-
seniaspora y Kloeckera, con 11 enzimas de restriccin
una vez amplificada la regin ITS1-5.8S-ITS2.
Con este mtodo, Cadez et al., (2003) llegaron a
nuevas especies del gnero Hanseniaspora. Asimismo
Las Heras-Vazquez et al., (2003) identificaron Candida
tropicalis, Clavidospora lusitaniae, Hanseniaspora uvarum,
Pichia anomala, Pichia fermentans, Rhodotorula mucilagi-
nosa y S. cerevisiae a partir de jugo o fruto de naranja
secuenciando los fragmentos de restriccin obtenidos.
Esta misma secuencia fue usada por Dias et al., (2003),
para identificar levaduras aisladas de ambientes
relacionados con los vinos y capaces de producir
4-etilfenol; Martnez et al., (2004), caracterizaron
cepas de S. cerevisiae productoras de vino aisladas
de diferentes reas de Sudamrica, por anlisis de
restriccin del ADN mitocondrial (RFLP-mtDNA)
para la obtencin de su huella gentica. Asimismo
Morrissey et al., (2004), combinando esta tcnica
con el aislamiento de levaduras en medio presuntivo
(WL) identificaron a las especies que participan en
la produccin de la cidra irlandesa. Jespersen et al.,
(2005), estudiaron la presencia y la diversidad de
levaduras involucradas en la fermentacin de granos
de cocoa de frica Oriental; y gracias a sus resul-
tados fue posible identificar los grupos de especies
de una muestra amplia de levaduras; encontrando
que Candida krusei es la especie dominante, seguida
por P. Membranifaciens, P. Kluyveri, H. guilliermondii y
Trichosporum asahii.
Antunovics et al., (2005), encontraron que el an-
lisis RFLP del gen MET2 provee de un medio para la
diferenciacin de S. bayanus, S. cerevisiae y S. paradoxus
ya que la enzima de restriccin Pst I corta este gen de
S. bayanus, EcoRI corta el de S. cerevisiae y ninguna de
las dos enzimas cortan el gen de S. paradoxus, usando
tambin los genes ITS1-5.8S-ITS2 para confirmar la
clasificacin de las levaduras aisladas asignadas a S.
cerevisiae o S. pastorianus.
La tcnica RFLP puede tambin servir como base
para hacer una ribotipificacin; transfirindose los
fragmentos obtenidos del RFLP a una membrana,
se hibridizan con una sonda de ARNr marcada y se
visualizan nicamente los fragmentos hibridados, que
se pueden comparar con cepas de referencia (Daz y
Wacher, 2003) y recientemente Divol et al., (2006)
usaron esta tcnica para complementar su estudio de
caracterizacin gentica de S. cerevisiae responsable
de la refermentacin de vinos dulces.
2.1.5. Anlisis del polimorfismo de la longitud
de los fragmentos de amplificacin (aflp)
Es aplicable universalmente, y los patrones pueden ser
fcilmente almacenados en una base de datos; por lo
que esta tcnica puede ser adecuada para la identifica-
cin de levaduras, debido a su poder discriminatorio.
Se realiza en tres etapas, a) Restriccin del ADN y
ligamiento de adaptadores. La restriccin se realiza
con dos enzimas que producen extremos cohesivos; a
stos se ligan adaptadores, que son oligonucletidos
cortos que funcionarn como los sitios de alineamien-
to de algunos cebadores. b) Amplificacin selectiva de
algunos de los fragmentos de restriccin. Se usan dos
cebadores diferentes conteniendo la misma secuencia
que los adaptadores ms varias bases contiguas al sitio
de restriccin; deben emplearse condiciones estrictas,
de manera que se amplifican nicamente los fragmen-
tos en los que los extremos del cebador coinciden
exactamente con los nucletidos adyacentes al sitio
de restriccin y c) Separacin de los fragmentos en
geles (Daz y Wacher 2003, Borst et al., 2003).
La ventaja del anlisis de AFLP es que slo se
requiere de una cantidad limitada de ADN debido
a que los fragmentos son amplificados por PCR.
Adems, debido a que se utilizan temperaturas de
alineamiento estrictas durante la amplificacin, la
tcnica es ms reproducible y robusta que otras como
el anlisis de RAPD-PCR.
Recientemente, se ha aplicado en estudios de
levaduras, aisladas de bebidas mexicanas destiladas
de agave y de mostos de uva de regiones de Italia y de
Sudfrica, como el realizado por Flores Berrios et al.,
(2005), quienes estudiando el polimorfismo del ADN,
el genotipo y la diversidad gentica encontraron que
existen diferencias entre las especies de levaduras de
las tres regiones respecto al perfil gentico, al origen
y al proceso de fermentacin que realizan.
Conclusiones
Las tcnicas moleculares pueden ser usadas para
la identificacin, caracterizacin y taxonoma de
diferentes organismos, entre los que se encuentran
las levaduras. Sin embargo, hay estudios que demues-
tran que ninguno de los mtodos es suficientemente
efectivo para la identificacin de las levaduras si se
aplica solo (Fernndez-Espinar et al., 2001, Antuno-
vics et al., 2005).
La combinacin de varios mtodos es ideal para
determinar las especies de un gnero. Actualmente
existen organismos que se encuentran ubicados por
identificacin fenotpica en taxas que no les corres-
ponden, debido a que el fenotipo puede variar por
las caractersticas ecolgicas; de ah que el estudio
del genotipo sea mas certero, porque los genes se en-
cuentran en el organismo independientemente de si
se expresan o no, por estas razones es deseable contar
33
con varias tcnicas moleculares que sean aplicables,
tanto para este tipo de estudios, como para los de
dinmica de fermentaciones en los que las levaduras
en particular presentan cambios morfofisiolgicos.
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