PRACTICA

No. 13
Escuela de
Microbiologa
LABORATORIO ACTIVACIN DE MICROORGANISMOS

MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Y AMBIENTAL Laboratorio de
PROYECTO CURRICULAR: MICROBIOLOGA INDUSTRIAL Microbiologa
5-228
Realizada por Profesora Laura Margarita Castaeda Sandoval
MSc Biotecnologa; PhD Biologa Molecular




OBJETIVO

Determinar la viabilidad y porcentaje de supervivencia de un microorganismo al ser
conservado durante un perodo de 3 meses.


FUNDAMENTOS TERICOS

Los principales objetivos por los que se conserva una cepa microbiana son lograr que el cultivo
permanezca puro durante todo el proceso de conservacin y almacenamiento; alcanzar altos
porcentajes de viabilidad de las clulas y lograr que las clulas permanezcan estables
genticamente, durante el perodo de conservacin. El primero puede alcanzarse con la
implementacin de rigurosas medidas de asepsia y una buena manipulacin del proceso de
conservacin. El segundo depende de una gran variedad de factores como son:

Edad de las clulas
Velocidad de congelacin/descongelacin
Temperatura de almacenamiento
Agentes crioprotectantes, Protegen del dao por congelacin

Por lo anterior, es de extrema importancia el proceso de activacin, lo cual demanda una serie de
controles para asegurar la inocuidad del proceso y por tanto la exitosa activacin del
microorganismo para su posterior utilizacin. Las pruebas de esterilidad de los instrumentos y
sobre todo de los medios de cultivo slidos y lquidos, son fundamentales, dado que stos nos
aseguran la inocuidad del sustrato donde crece el microorganismo y nos permitir evaluar, la
inocuidad del proceso inicial de conservacin as como durante el perodo de conservacin.



MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

Cabina de flujo laminar
Incubadoras

1

 Mecheros
Vortex
Solucin salina al 0.9%
Pipetas automticas de 100, 200 y 1000 ul
Puntas plsticas
Microtubos de 1.5 y 2.0 ml
Gradillas para tubos
Medios lquidos y slidos con prueba de esterilidad de 8 das.


PROCEDIMIENTO

Descongelar el vial criconservado

1. Identifique los viales crioconservado iniciamente e identifique el vial del cual se
realiz el recuento inicial.
2. Descongele de forma rpida la suspensin de clulas microbianas congeladas al
frotarlo con sus manos.
3. Una vez que toda la suspensin est lquida, aplquele agitacin vigorosa por
medio de vortex.
4. Proceda a tomar una pequea aliquota para realizar las diluciones seriadas


Recuento de Clulas y verificacin de la Pureza

Realice el recuento de clulas viables en placas de agar, de acuerdo a cada microorganismo.
Proceda de la siguiente manera:

1. Tome 100 ul del vial y realice diluciones seriadas, a un volumen final de 1 ml (100
ul ms 900 ul de solucin salina estril). Las diluciones se realizarn hasta un orden
de magnitud menos, con respecto al recuento inicialmente obtenido. Si por
ejemplo al realizar el recuento inicial se obtuvo crecimiento hasta 10-8, entonces
realice diluciones seriadas hasta 10-7.
2. Homogenice cada dilucin aplicando agitacin por medio del vortex.
3. Siembre las ltimas 5 diluciones por triplicado en placas de agar de acuerdo a cada
microorganismo.
4. Incube los microorganismos a su temperatura ptima de crecimiento durante 48 a
72 horas dependiendo del microorganismo.
5. Realice el recuento de unidades formadoras de colonia en cada una de las placas.
6. Reporte el nmero de UFC por ml. Tenga en cuenta el factor de dilucin para el
reporte final
7. Determine el porcentaje de supervivencia teniendo en cuenta el recuento inicial.

2

TABLA PARA EL REGISTRO FINAL DE DATOS EXPERIMENTALES

Variables UFC/ml
Recuento inicial de
Recuento final
Porcentaje de viabilidad



PREGUNTAS

1. De acuerdo al procedimiento realizado para conservar el microorganismo, cual es el
porcentaje de viabilidad o supervivencia?
2. De que factores depende la viabilidad de una cepa conservada, tanto por liofilizacin como
por criocongelacin?



BIBLIOGRAFA


Crueger, Wulf and Crueger Anneliese. Biotecnologa. Manual de Microbiologa industrial. Editorial
Acribia, S.A. Zaragosa, Espaa. 1993.

Leveau, J-Y and Bouix, M. Microbiologa industrial, Los microorganismos de inters industrial.
Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. 2000.

Shuler, Michael L and Kargi Fikret. Bioprocess engineering, basic concepts. Prentice Hall
international series in the physical and chemical engineering sciences. 1992.