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BIOQUIMICA ING.

AGROINDUSTRIAL
PRCTICA N 01

SOLUCION DE PROBLEMAS

PROBLEMA 01:
En un experimento donde se determinaron tasas de respiracin, un cultivo de bacterias
consumi 24,9 mL de O 2. La T de la medicin fu de 32,5C y la presin de 1 atm. Calcular el
nmero de moles de O 2 consumido por el cultivo?

PV (1 atm) (0,0249L)
n=----- = --------------------------------------------- = 9,93 x 10-4 moles
RT (0,082 atm.L/mol.K) (305,65K)

PROBLEMA 02:
Una mezcla de gases compuesta de 0,1 moles de O 2; 0,3 moles de N2; 0,05 moles de CO 2 y
0,05 moles de CO se encuentra a 27C y en un recipiente de 8L. Determinar los volmenes de
cada gas.
Solucin:
Para determinar la presin del gas se debe tomar el nmero total de moles o sea 0,5 Moles:
P= nRT/V= (0,5)(0,082)(298,15)/8 = 1,53 atm
La presin total ser igual a la suma de las presiones de cada uno de los gases (presiones
parciales):
La presin parcial del Oxgeno es:
O2 = (0,1) (0,082) (298,5) /8 = 0,31 atm
Para los otros gases seran:
N2= 0,92 atm; CO2 = 0,15 atm; CO = 0,15 atm
A partir de ellos se pueden obtener los volmenes parciales:
Para el Oxgeno: VO2 = nRT / P = (0,1)(0,082)(298,15) / 1,53 = 1,60 L
Para N2, CO2 y CO seran: 4,79; 0,80 y 0,80 respectivamente.

PROBLEMA 03:
Se colocan 10 mL de un cultivo de Saccharomyces cerevisiae en el aparato de Warburg. El
cultivo contiene 106 clulas/ml, se mantiene a 30 C y el volumen del sistema es de 50 mL. El
cambio de presin en el matraz conteniendo la solucin alcalina fu de 70 mm de agua y el
cambio de presin en el matraz conteniendo agua fu de 33 mm de agua. Calcular la cantidad
de O2 consumido y de CO2 producido?
Solucin:

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En el matraz con solucin alcalina se tiene cantidad de O 2 consumido; sabiendo que 1 atm= 10
330 mm de agua:
70/10330 atm (0,05L)
n = ------------------------------- = 1,36 x 10-5 moles de O 2 consumido.
(0,082)(303,15K)

En el matraz que contiene agua se tiene la produccin de CO 2, menos del consumo de O 2:

33/10330 atm x (0,05L)


n = ----------------------------------- = 0,64 x10-5 moles de O 2 - CO2
(0,082) (303,15K)

n= 0,64 x10-5 moles de O 2

El nmero de moles de CO 2 producido ser:


n= 1,36 x 10-5 0,642 x 10-5
n= 0,72 x 10-5 moles de CO 2

PROBLEMA 04:
Cul ser la presin ejercida por 30 moles de CO2 contenido en un tanque de 60L a T de
100C. Calcular presin usando: (a) Ley general de gases ideales y (b) usando ecuacin de
Van Der Waals. Si b=0,0427 y a=3,592
Solucin:
P= n R T / V = (30)(0,082)(373,15)/60 = 15,3 atm.

P= n RT / V-nb n2a/V2 = (30)(0,082)(373,15) / (60)-(30)(0,0427)-(30)2(3,592)/(60)2


P= 14,7 atm.

PROBLEMA 05:
La hidrlisis del ATP que libera su grupo terminal es una reaccin de considerable importancia
bioqumica, al medir los valores de H, S y G para esta reaccin a valores fisiolgicos
(309K, pH 7) y en presencia de iones Mg2+ se calcul que cuando H = -20,08 kJ/mol,
S=+35,21 J/K. mol. Calcular el valor de G para la reaccin?
Solucin:
Utilizando la ecuacin G = H T x S
G = -20 080 J/mol - (309K * 35,21J/K.mol)
G = -30,96 kJ/mol

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PRCTICA N 02

FOTOCOLORIMETRIA
I.- INTRODUCCIN

La colorimetra es una de las tcnicas ms usadas en Bioqumica cuando se requiere


determinar la concentracin de un compuesto o grupo de compuestos que forman parte de
una solucin coloreada, ya sea naturalmente o hecha as mediante reacciones qumicas
especficas.

Si un rayo de luz monocromtica, de intensidad inicial Io pasa a travs de una solucin,


parte de la luz es absorbida, de manera que la intensidad de luz transmitida It es menor que
Io.

La relacin entre It e Io depende de la longitud del medio absorbente, I; y de la concentracin


de la solucin, c.

Solucin absorbente
Concentracin o

Rayo Rayo
Incidente Emergente
Luz
Monocromtica
Intensidad Io Intensidad It

Espesor de la
Solucin

Fig. 1: Absorcin de la luz por una solucin

Estos factores se hallan relacionados en la ley de LAMBER y BEER que se expresa en la


siguiente frmula:
Log (Io/It ) = E.c.l.

DONDE:
Io = Intensidad de luz incidente
It = Intensidad de luz transmitida
E = Coeficiente de extincin (contante que depende de la longitud de onda y del
soluto)
l = Distancia que recorre la luz a travs de la solucin
C = Concentracin de la solucin.

En esta frmula log (Io/It ) se conoce como DENSIDAD PTICA (D.O.) o ABSORBANCIA, la
cual es directamente proporcional a la concentracin de la solucin e inversamente
proporcional a la intensidad de la luz transmitida.

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La cantidad de la luz absorbida por una solucin puede ser medida por los
FOTOCOLORIMETROS, aparatos que funcionan a base de filtros, y los
ESPECTROFOTMETROS que utilizan prismas o redes de difraccin que dispersan la luz,
formando un espectro del cual se elige la longitud de onda o la banda.

Un espectrofotmetro tiene dos aplicaciones importantes, una de ellas es para medir la


absorbancia o transmitancia en una determinacin cuantitativa basada en la ley de BEER.
Otras es para medir los espectros de absorcin se sustancias coloridas. Como cada
sustancia colorida tiene su propio espectro, los espectros son importantes para la
identificacin cualitativa de sustancias y para elegir una longitud de onda adecuada en una
determinacin espectrofotomtrica cuantitativa.

Para calcular la concentracin de una solucin se puede recurrir a dos procedimientos:

Factor de calibracin
Curva de calibracin o curva estndar

1.- FACTOR DE CALIBRACION (FC).- Es la cantidad en peso de una sustancia que


corresponde a una unidad de lectura en el fotocolormetro o espectrofotmetro. Se
halla dividiendo la concentracin de muestras estndar (solucin de composicin
qumica igual a la muestra problema, y de concentracin conocida) entre su D.O. Para
mayor exactitud se obtienen varios FC y se trabaja con el promedio. Esta divisin debe
ser un valor aproximadamente igual para cada estndar, puesto que expresa la
proporcionalidad entre D.O. y concentracin.

D.O: muestra problema X promedio =Concentracin muestra problema

2.- CURVA ESTNDAR.- Este mtodo consiste en preparar soluciones estndar de


diferente concentracin y construir un grfico en un sistema de coordenadas en el que
se colocan las lecturas del estndar en la ordenada y la concentracin (en g%, mg% o
moles/l, etc) en la abscisa. La concentracin de la muestra problema se obtendr
ploteando su lectura en el grfico y en el punto de interseccin se trazar una
perpendicular al eje de las abscisas donde se leer su concentracin.

Una de las mediciones ms frecuentes en bioqumica es la concentracin de una sustancia


y para su determinacin se puede recurrir a dos mtodos. Factor de calibracin o Curva de
calibracin. Esta ltima no siempre es correcta; es decir, sus puntos de interseccin (X,Y) =
(concentracin, Absorbancia) no se encuentran colineales, lo cual lleva a elaborar una curva
irreal, no representativa de lo esperado.

La curva de calibracin relaciona los datos de concentracin contra sus respectivas


absorbancias, por lo que se puede tomar como variable independiente las concentraciones
(eje de las X) y como variable dependiente las absorbancias (eje de las Y), siendo posible
determinar la ecuacin de la curva que se adapta mejor a los datos.

Y = a + X + E

a = Verdadero valor de la interseccin de la curva


= Verdadero valor de la pendiente.
X, Y = X es una variable pre establecido o no aleatoria, se utiliza para hacer una
prediccin de Y.
E = Representa una variabilidad en toda medicin causada por material de vidrio
sucio, variacin de temperatura, fluctuaciones elctricas, variabilidad biolgica, no
linealidad, interferencias qumicas, etc. Este valor no se toma en cuenta en la ecuacin
final por ser un valor constante.

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Una de las consideraciones que se toma en cuenta un anlisis de regresin lineal, es que
para cualquier valor de X exactamente conocido, existen sendas distribuciones normales de
valores de Y, quedando la ecuacin reducida a:

= a + Bx

a y b = Son coeficientes de regresin y reemplazan a a y respectivamente.


= Denota el valor predecible de la media de Y para un valor dado de X.

Finalmente lo que interesa es determinar los coeficientes de regresin, aplicando el


mtodo de los mnimos cuadrados, luego hallar el valor de las nuevas lecturas aplicando:

Y = a + Bx

II.- OBJETIVOS
2.1. Obtener el espectro de absorcin de una sustancia
2.2. Preparar una curva de calibracin para una sustancia coloreada
2.3. Determinar la concentracin de una muestra problema mediante factor de calibracin
y curva de calibracin.
2.4. Aprender a ajustar matemticamente curvas de calibracin con dispersin, como
consecuencia de errores.
2.5. Determinar el factor de calibracin para clculo de concentraciones.

III. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS


3.1. EQUIPOS
3.1.1. Espectrofotmetro
3.1.2. Balanza
3.1.3. Agitador magntico

3.2. MATERIALES Y REACTIVOS


3.2.1. Azul de metileno 0,1%
3.2.2. Sulfato de cobre 10%
3.2.3. Dicromato de potasio 0,1%
3.2.4. Agua destilada
3.2.5. Pipetas de 5 10 ml
3.2.6. Matraces
3.2.7. Probetas
3.2.8. Tubos de ensayo

IV.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL


4.1. Armar el siguiente esquema
TUBOS (ml) I II III IV V VI VII
Sol. sulfato de cobre 10% 0.25 0.50 0.70 1.0 2.0 4.0 ----
Agua destilada 0.75 9.50 9.30 9.0 8.0 6.0 10.0
Mezclar. Leer a nm
Concentracin
Absorbancia

4.2. Armar el siguiente esquema


TUBOS (ml) I II III IV V VI VII
Sol. dicromato de potasio 0,1% 0.25 0.50 0.70 1.0 2.0 4.0 ----
Agua destilada 0.75 9.50 9.30 9.0 8.0 6.0 10.0
Mezclar. Leer a nm

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Concentracin
Absorbancia

4.3. Armar el siguiente esquema


TUBOS (ml) I II III IV V VI VII
Sol. permanganato de potasio 0.25 0.50 0.70 1.0 2.0 4.0 ----
0,01%
Agua destilada 0.75 9.50 9.30 9.0 8.0 6.0 10.0
Mezclar. Leer a nm
Concentracin
Absorbancia

4.4. OBTENCION DEL ESPECTRO DE ABSORCIN


Encender el espectrofotmetro (siga las instrucciones del prof.)
Preparar 20 ml de las soluciones de: CuSO 4, Azul de metileno, K2CrO2
Colocar agua destilada (solvente) en una cubeta del espectrofotmetro para que
sirva de blanco
Medir el blanco a la longitud de onda seleccionada como inicial: 400 nm
Reemplazar el blanco con una cubeta que contenga las muestras a medir
Realizar lecturas a intervalos de 25 nm
Construir los espectros de absorcin para cada solucin representando el valor de
absorbancia en el eje vertical y la longitud de onda en el eje horizontal.

4.5. CALCULO DE LA CONCENTRACIN DE UNA SOLUCIN


Preparar soluciones de acuerdo al siguiente esquema:

TUBOS (ml) I II III IV V VI


CuSO4 --- 1 2 3 4 5
Agua destilada 5 4 3 2 1 ---

Leer las D.O. de las soluciones preparadas a la longitud de onda adecuada


(resultado de 4.1)
Construir en papel milimetrado una curva de calibracin con las D.O. y sus
concentraciones respectivas.
Hallar el F.C. para cada solucin y sacar un promedio
Determinar la concentracin de la muestra problema (proporcionado por el docente)
por los dos mtodos estudiados.

V.- RESULTADOS
5.1. Construir en papel milimetrado la curva estndar, colocando en el eje de las X, la
concentracin y en el eje de las Y las absorbancias.
5.2. Trazar la curva de calibracin que mejor crea conveniente.
5.3. Si la curva es excelente: !!!!!FELICITACIONES!!!!!, ha trabajado muy bien y es
representativa
5.4. Si su curva es mala: NO SE PREOCUPE MUCHO!, aplique los mnimos cuadrados a
sus datos, siguiendo el esquema.
DATOS X1 Y1 X1Y1 X2
I
II
III
IV
V

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VI
VII

5.5. Trace su nueva curva de calibracin con su regresin lineal, utilizando los valores
nuevos
5.6. Determine el factor de calibracin promedio. Use la frmula siguiente:
Estndar
FC = ------------------
Absorbancia

VI.- DATOS EXPERIMENTALES


5.1. Tabla de datos obtenidos (D.O. a las diferentes longitudes de onda)

VII.- CALCULOS RESULTADOS Y DISCUSION


7.1. Utilizar la frmula C1V1 = C2V2 para determinar las concentraciones de las
soluciones, preparadas y construir la curva de calibracin
7.2. Efectuar los clculos necesario de la muestra problema en mg%
7.3. Con los datos obtenidos construir el espectro de absorcin de cada una de las
sustancias estudiadas.

VIII. CONCLUSIONES
8.1. Anotar sus conclusiones de la prctica de acuerdo a los objetivos y resultados.

IX.- CUESTIONARIO
9.1. Qu consideraciones debern tomarse en cuenta para obtener una buena curva de
calibracin?
9.2. Cul de los mtodos: factor de calibracin o curva de calibracin es ms exacto?
Explique.
9.3. Existe otro mtodo de ajuste de curvas?
9.4. Qu desventajas tiene el mtodo de los mnimos cuadrados?
9.5. Aplicaciones de la prctica en el campo de su especialidad?
9.6. Cul crees que es mtodo ms exacto para obtener la concentracin de una muestra
problema, el grfico o el analtico? Por qu?
9.7. Qu factores alteran la ley de LAMBER y BEER?
9.8. El color que exhibe una sustancia est determinada por la luz que transmite o que
absorbe?
9.9. A fin de probar la validez de la ley de BEER en la determinacin de la vitamina A, se
prepararon soluciones de concentracin conocida y se trataron por un procedimiento
normalizado con tricloruro de antimonio en cloroformo para producir una coloracin azul. El
porcentaje de transmisin de la luz incidente filtrada para cada concentracin, expresada
en g ml-1, fue el siguiente:
Concentracin g 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0
ml-1
Transmisin, % 66,8 44,7 29,2 19,9 13,3
Resuelve los problemas
planteados en la pg. 50 y 51 de la referencia 9.3

X. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

10.1. Lehman, Ch. 1980. Geometra analtica. Limusa, Mxico


10.2. Kaplan, L. 1986. Qumica clnica. Edit. Mdica Panamericana. S.A. Buenos Aires,
Argentina.
10.3. Albert, R. y F. Daniela. 1989 Fisicoqumica. 2da. Reimpresin. Continental S.A. de
C.V. Mxico, 1970

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10.4. Ayres, G. 1970. Anlisis Qumico Cuantitativo. 2da. Edicin. Harla. Mxico
10.5. Horna, E. La clula. Mdulo I de Bioqumica. Chimbote. Universidad nacional del
Santa. 1988.

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PRCTICA N 03

DEMOSTRACIN DE LA ACTIVIDAD DE UNA OXIDORREDUCTASA

I.- INTRODUCCION

Las enzimas son protenas altamente especializadas que funcionan como catalizadores
biolgicos de las reacciones celulares. Existen seis clases principales de enzimas de
acuerdo al tipo de reaccin catalizada; una de estas es la clase de las oxidorreductasas.

Como ya se sabe, los organismos obtienen su energa a travs de reacciones de oxidacin


reduccin catalizadas por las oxidorreductasas y su capacidad de realizar una determinada
reaccin depende del potencial redox (Eh). Existen microorganismos que pueden
desarrollarse en ambientes pobres o ricos en oxgeno, la presencia de mayores o menores
concentraciones de oxgeno en un alimento indicarn si ste es un medio oxidante o no, o
lo que es lo mismo si posee valores altos o bajos de E h respectivamente; de acuerdo con
esto, los microorganismos se clasifican en:

1. Aerobios estrictos: Crecen en presencia de oxgeno


Eh : + 350 a 500mv

2. Anaerobios estrictos: Crecen en ausencia de oxgeno


Eh : - 150mv

3. Aerobios facultativos: Crecen en presencia o ausencia de oxgeno


Eh : - 350 a + 500 mv

La determinacin de los potenciales de xido reduccin en alimentos se realiza con


electrodos apropiados y tambin se usan algunas sustancias que se van a colorear o
decolorar a diferentes valores de Eh

En la prctica se usar el azul de metileno, un indicador de xido reduccin, con la finalidad


de estimar en forma aproximada la carga microbiana de leche. El ensayo se denomina
PRUEBA DE LA REDUCTASA, una prueba rpida que se usa para inspeccionar leche
tratada o no por el calor y destinada a los consumidores. El fundamento radica en que por
la actividad microbiana sus nutrientes van a ser oxidados y otras sustancias, entre ellas el
indicador, van a ser reducidas por accin enzimtica.

II.- OBJETIVOS
2.1. Verificar la actividad de una enzima de xido reduccin
2.2. Estimar el nmero de microorganismos presentes en un alimento mediante la
prueba de la reductasa.

III. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS


3.1 EQUIPOS
3.1.1 Balanza analtica
3.1.2 Bao mara

3.2 MATERIALES Y REACTIVOS


3.2.1 50 ml de leche fresca (por sub grupo de prctica)
3.2.2 Solucin diluida de azul de metileno
3.2.3 Termmetro
3.2.4 Agua destilada
3.2.5 Pipetas de 1 10 ml
3.2.6 Tubos de ensayo 15 X 150

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IV.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.1 Mezclar cuidadosamente la muestra por inversin y agitacin y colocar 10 ml en un


tubo de ensayo, cuidando que los lados internos no se mojen de leche.

4.2 Aade 1 ml de la solucin de azul de metileno evitando que la pipeta haga contacto
con la muestra, ni con las paredes del tubo.

4.3 Tapar aspticamente el tubo con tapn de goma, invirtelo 2 veces de tal manera que
toda la columna de aire se eleve por encima de la leche.

4.4 Despus de 5 minutos colocar el tubo de ensayo en el bao de agua a 37.5 0,5 0C,
cuida que el agua se mantenga por encima del nivel de la leche en el tubo y que el
interior del bao sea oscura.

4.5 Preparar 2 tubos control, uno que contenga 1 ml de agua corriente y 10 ml de leche
similar a la que se est probando, y otro que contenga 1 ml del indicador y 10 ml de
leche. Ambos tubos control tienen que introducirse en agua hirviente por lo menos
durante 3 minutos.

4.6 Se considera que la leche est en buen estado cuando no se decolora despus de
haberla incubado 30 minutos. Una leche decolorada es aquella que ha perdido el color
en toda la columna o hasta 5 mm de la superficie. Registra tus resultados.

V.- RESULTADOS Y DISCUSION

5.1. Representar mediante esquemas los resultados obtenidos

VI.- CONCLUSIONES

6.1. Anotar las conclusiones de la prctica de acuerdo a los objetivos propuestos

VII. CUESTIONARIO

7.1. Qu es el potencial redox?


7.2. Qu correlacin existe entre el nmero de microorganismos en una muestra
alimenticia y el tiempo de reduccin del azul de metileno?
7.3. Una muestra de carne tendr los mismos valores de E h en toda su masa?
7.4. Seale dos muestras alimenticias en las que se puede aplicar la prueba de la
reductasa?
7.5. Qu razones hacen difcil la determinacin de E h en alimentos?

VIII.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

8.1. Horna, E.1988. Transformaciones energticas. Mdulo 2 de Bioqumica.


Universidad Nacional del Santa. Chimbote Per
8.2. Morris, J. G. 1976. Fisicoqumica para Bilogos. Revert S.A. Espaa.

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PRCTICA N 04

DEMOSTRACIN DE LA NATURALEZA PROTEICADE LA ENZIMA CATALASA EN


VEGETALES

I.- INTRODUCCION

Las enzimas son la clase ms numerosa y especializada de las protenas que funcionan
como catalizadores biolgicos para las reacciones celulares. Las enzimas tienen enorme
poder cataltico, gran especificidad y actividad regulada, intervienen en la transformacin de
la energa en diversas formas de trabajo. Las reacciones ms simples como son la
autlisis de los tejidos animales, de considerable inters para la industria alimenticia, en lo
que se refiere al ablandamiento de la carne durante el sazonado, son catalizadas por las
catepsinas, las cuales se liberan y activan luego de ocurrida la muerte. El efecto acelerador
es uno de los ms altos que se conocen, multiplica la velocidad de la reaccin hasta en un
milln de veces.

Las enzimas son protenas que contienen los mismos aminocidos que se encuentran en
otras protenas. Al igual que otras protenas tambin tiene una estructura tridimensional,
que representa la conformacin de contenido de energa mnimo, y pueden consistir de una
sola o de varias cadenas polipeptdicas.

El objetivo del presente experimento es evidenciar que las enzimas son protenas que
gozan de las propiedades de stas y que son sensibles a todos los agentes fsico-qumicos
que actan sobre los mismos, haciendo variar su comportamiento y actividad.

II.- OBJETIVOS
2.1. Obtener un extracto crudo de la enzima catalasa
2.2. Demostrar cualitativamente el efecto de cidos, bases y sales sobre la actividad de la
catalasa.

III. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS

3.1 EQUIPOS
3.1.1 Congeladora
3.1.2 Centrfuga
3.1.3 Estufa

3.2 MATERIALES Y REACTIVO

PROPORCIONADO POR EL ALUMNO


3.2.1 Tomates verdes (inmaduras)
3.2.2 Papas verdes (inmaduras)
3.2.3 Manzanas verdes (inmaduras)

PROPORCIONADO POR EL LABORATORIO


3.2.4 Hidrxido de sodio 2N
3.2.5 cido clorhdrico 0.5N
3.2.6 cido tricloroactico 20%
3.2.7 Sulfato de cobre 20%
3.2.8 Buffer fosfato 0.05 M, y 0.1 M pH 6,5
3.2.9 Perxido de hidrgeno 3%
3.2.10 Cloruro de sodio 0.15 M
3.2.11 Tubos de ensayo

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3.2.12 Embudos
3.2.13 Matraces
3.2.14 Pipetas de 5 y 10 ml

IV.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.1 OBTENCION DEL EXTRACTO CRUDO

4.1.1. Pelar los tomates verdes y eliminar la cscara, el pericarpio almacenarlo a -70
0
C
4.1.2. Limar el pericarpio congelado, adicionar 3 ml de Buffer fosfato 0.1 M pH 6,5
4.1.3. Filtrar el extracto crudo a travs de 2 capas de gasa y centrifugar a 10 000 rpm
por 15 minutos y guardar las alcuotas a -18 0C

4.2 DEMOSTRACIN DE LA NATURALEZA PROTEICA

4.2.1 Armar el siguiente sistema:

TUBOS (ml) I II III IV V VI


Enzima 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
NaOH 2N ---- 2.4 ---- ---- ---- ----
HCl 0.5N ---- ---- 2.4 ---- ---- ----
ATCA 20% ---- ---- ---- 2.4 ---- ----
CuSO4 20% ---- ---- ---- ---- 2.4 ----
Buffer Fosfato 0.05 M pH ---- ---- ---- ---- ---- 2.4
6,5
Dejar en reposo los 6 tubos durante 20 minutos a 30 0C

4.2.2 Preparar el siguiente sistema

TUBOS (ml) I II III IV V VI


Buffer fosfato 0.05 M pH 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
6,5
NaCl 0.15 M 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
H2O2 3% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

4.2.3 Preincubar por 2 minutos a 25 0C, luego agregar a cada uno de los tubos 2,0
ml de la enzima tratada en el paso 4.2.1.
4.2.4 Dejar en incubacin durante 5 minutos a 25 0C y determinar la actividad
enzimtica cualitativamente de la siguiente manera:

Presencia de actividad enzimtica (+) = Formacin de gas


Ausencia de actividad enzimtica ( - ) = Ausencia de gas

V.- RESULTADOS Y DISCUSION

TUBOS I II III IV V VI
Tomates
Papas
Manzanas

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VI. CONCLUSIONES

6.1. Anotar sus conclusiones de la prctica.

VII. CUESTIONARIO

7.1. Qu es un extracto crudo?


7.2. A qu clase de enzima corresponde la catalasa? Su nombre y su cdigo EC.
7.3. Qu otros factores pueden considerarse para demostrar que las enzimas son
protenas?
7.4. Indique 4 enzimas que pueden extraerse de vegetales
7.5. Importancia de las enzimas

VIII.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

8.1. Braverman, J.B. 1980. Introduccin a la Bioqumica de los alimentos. El manual


moderno. Mxico.
8.2. Metzler, E.D. 1981. Bioqumica, Omega. Barcelona.

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PRCTICA N 05

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA ALFA AMILASA


VEGETAL

I.- INTRODUCCION

Las enzimas son biocatalizadores de naturaleza proteica cuya funcin es acelerar las
reacciones qumicas llevndolas ms rpidamente a su posicin de equilibrio. Pertenecen
al grupo de las protenas globulares cuyos pesos moleculares oscilan entre 10 4 y 106
daltons; pueden consistir de una sola o de varias cadenas polipeptdicas, y contener
tambin partes no proteicas.

En una reaccin bioqumica catalizada por enzimas, a medida que progresa la reaccin se
incrementa la concentracin de los productos a expensas de la desaparicin de los
correspondientes sustratos, en tanto que pertenece fija la concentracin de la enzima. De
esto podemos deducir que si se desea medir la actividad de una enzima puede hacerse
controlando el sustrato no transformado (sustrato residual) o controlando los productos
liberados. Tambin puede medirse la modificacin de los factores, en el caso de enzimas
que requieren estas sustancias.

La actividad cataltica se expresa en trminos de unidades de actividad, y para ello la


Comisin de Enzimas para la Unin Internacional de Bioqumica sugiri que Una unidad
(u) de cualquier enzima se define como la cantidad que catalizar la transformacin de un
micromol de sustrato por minuto bajo condiciones definidas de pH y temperatura.

En la prctica se estudiar la actividad de una amilasa de origen vegetal, midiendo el


sustrato residual. Asimismo, se medir su actividad especfica, que viene a constituir un
criterio de pureza, y se define como el nmero de unidades de enzima por mg de protena.

II.- OBJETIVOS

2.1. Determinar la actividad enzimtica de una amilasa, extrada de trigo germinado,


dosando almidn residual.
2.2. Determinar la actividad especfica de la amilasa vegetal

III. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS

3.1 EQUIPOS
3.1.1 Estufa
3.1.2 Espectrofotmetro

3.2 MATERIALES Y REACTIVO

PROPORCIONADO POR EL ALUMNO


3.2.1 Semillas germinadas de trigo
3.2.2 Semillas germinadas de cebada

PROPORCIONADO POR EL LABORATORIO


3.2.3 Solucin de almidn 0.1%
3.2.4 cido clorhdrico 0.5N
3.2.5 Lugol
3.2.6 Reactivo de Biuret
3.2.7 Tubos de ensayo

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3.2.8 Embudos
3.2.9 Mortero
3.2.10 Pipetas de 1, 5 y 10 ml

IV.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.1 EXTRACCION DE LA AMILASA

4.1.1. Poner a germinar 3 das, 50 semillas


4.1.2. Triturar las semillas cuando las raicillas tenga 0.5 cm de largo, adicionando 10
ml de buffer + cloruro de calcio.
4.1.3. Filtrar en gasa

4.2 DEMOSTRACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

4.2.1 Armar el siguiente sistema:

Almidn Almidn residual


TUBOS (ml) inicial
I II III IV
Sustrato 1.0 1.0 1.0 1.0
Dejar en incubacin a 30 0C durante 5 minutos
Extracto crudo de enzima --- 0.1 0.2 0.3
0
Mezclar e incubar a 30 C durante15 minutos exactos
cido clorhdrico 0.5 N 1.0 1.0 1.0 1.0
Dejar en reposo por 5 minutos a temperatura ambiente
Agua destilada 9.9 9.8 9.7 9.6
Lugol 0.5 0.5 0.5 0.5

4.2.2 Mezclar, medir las absorbancias despus de 5 minutos a 620 nm


4.2.3 Anotar las absorbancias de los 4 tubos de prueba.

4.3 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ESPECIFICA

4.3.1 Determinar el contenido proteico del extracto crudo de la enzima con el


reactivo de Biuret de acuerdo al siguiente esquema:

TUBOS (ml) I II III IV


Preparado enzimtico --- 0.2 0.1 0.05
Agua destilada 1.0 0.8 0.9 0.95
Reactivo de Biuret 4.0 4.0 4.0 4.0

4.3.2 Mezclar e incubar a 37 0Cdurante 30 minutos


4.3.3 Realizar las lecturas de absorbancia a 540 nm calibrando a cero con el tubo N0
1

V.- DATOS EXPERIMENTALES

5.1. Determinacin de la actividad enzimtica

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N0 TUBO ABSORBANCIA (.. nm)
I
II
III
IV

5.2. Determinacin de la actividad especfica

N0 TUBO ABSORBANCIA (.. nm)


I
II
III
IV

VI. CALCULOS, RESULTADOS Y DISCUSION

6.1. Determinar la concentracin del almidn (mg/ml), multiplicando absorbancia por factor
de calibracin. Obtener el promedio de los tubos II, III, y IV.
6.2. Calcular las unidades de enzima (U) de la siguiente forma:

6.3. Determinar mg de protena/ml = Absorbancia X Factor


6.4. Obtener el promedio de los tubos II, III, IV, y determinar la Actividad Especfica (AE)
de la siguiente manera:

6.5. Realizar un flujograma de la obtencin de la amilasa.

VII. CONCLUSIONES

7.1. Anotar sus conclusiones de la prctica

VIII. CUESTIONARIO

8.1. En la sntesis de arginina a partir de cido glutmico se observaron las siguientes


reacciones:

1 2 3 4
Glu N ac. Glu Orn Cit Arg

Siendo 1, 2, 3, 4 enzimas

Indica cules son los sustratos y productos correspondientes para estas enzimas
mediante un cuadro

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8.2. Por qu se sometieron las raicillas del cereal a un proceso fsico y qumico en el
proceso de extraccin?
8.3. Si se te da una solucin que supuestamente contiene una enzima, Cmo
determinaras en la solucin la presencia de una enzima que cataliza la hidrlisis del
almidn?
8.4. Represente mediante un flujograma el proceso de extraccin de una amilasa de una
fuente diferente a la utilizada en prctica
8.5. Cmo se puede incrementar la actividad especfica de una enzima?

IX.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

9.1. Horna, E. 1988. Enzimas. Mdulo 03 de Bioqumica. Universidad Nacional del Santa.
Chimbote Per.
9.2. Villavicencio, M. 1993. Bioqumica. Tomo I. Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnologa. Lima Per.

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PRCTICA N 07

DETERMINACIN CUALITATIVA DE CARBOHIDRATOS

I.- INTRODUCCION

Los carbohidratos desempean en los organismos vivos diversas funciones. Los animales
los emplean de preferencia como combustible para producir energa, cuando los reciben en
exceso los almacenan en forma de polisacaridos (glucgeno) o los convierten en grasa
para ser utilizadas en el momento oportuno. Las plantas pueden sintetizar o almacenar
grandes cantidades de carbohidratos, especialmente mientras ocurre la fotosntesis, los que
servirn como fuente energtica para ellos mismos o para los animales.

Por otro lado, diversos glcidos o derivados de ellos contribuyen a la formacin a la


formacin de estructuras de sostn, pues son constituyentes de sustancias como la
celulosa en los vegetales, los mucopolisacridos en los animales y diversos glcidos
complejos en la pared bacteriana. Adems, numerosas molculas esenciales para cualquier
clula, como los cidos nucleicos y numerosas coenzimas poseen residuos
hidrocarbonados.

Qumicamente, los carbohidratos son derivados aldehdicos o cetnicos de alcoholes


superiores polivalentes o compuestos que por hidrlisis dan estos derivados. Se clasifican
en cuatro gran des grupos: Monosacridos, disacridos, oligosacridos y polisacridos.
Tiene diferentes propiedades fsicas y qumicas, y en base a ellas existen mtodos que nos
permiten diferenciarlos, lo que constituye el objetivo de esta prctica.

II.- OBJETIVOS

2.1 Reconocer los diferentes tipos de carbohidratos


2.2 Identificar la presencia de azcares reductores provenientes de la hidrlisis cida de
muestras de carbohidratos.

III. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS

3.1 EQUIPOS
3.1.1 Balanza
3.1.2 Bao mara

3.2 MATERIALES Y REACTIVO

PROPORCIONADO POR EL ALUMNO


3.2.1 Una papa
3.2.2 5 gr de almidn por grupo de trabajo

PROPORCIONADO POR EL LABORATORIO


3.2.3 Solucin de glucosa 1 %
3.2.4 Solucin de sacarosa 1 %
3.2.5 Solucin de maltosa 1 %
3.2.6 Solucin de almidn 1 %
3.2.7 Solucin de fructosa %
3.2.8 Solucin alcohlica de Alfa naftol 5 %
3.2.9 cido sulfrico Q.P.
3.2.10 Reactivo de Selivanoff
3.2.11 Reactivo de Bradford
3.2.12 cido clorhdrico 1,5 %

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3.2.13 Solucin de Hidrxido de potasio 1 %
3.2.14 Solucin de Fehling A
3.2.15 Solucin de Fehling B
3.2.16 Tubos de ensayo
3.2.17 Pipetas de 1, 5 y 10 ml

IV.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.1 ACCION DE LOS ACIDOS OXIDANTES

4.1.1. REACCIN DE MOLISH.-


Es una reaccin general de los carbohidratos que sirve para detectar su
presencia en una sustancia problema. Una reaccin negativa es una buena
evidencia de la ausencia de azcares, mientras que una prueba positiva es
simplemente indicadora de la posibilidad de su existencia y requiere una
mayor investigacin.

TUBOS (ml) I II III IV


Sol. Glucosa 1% 2.0 ---- ---- ----
Sol. Sacarosa 1% ---- 2.0 ---- ----
Sol. Maltosa 1% ---- ---- 2.0 ----
Sol. Almidn 1% ---- ---- ---- 2.0
Sol. Alfa naftol 5% (gotas) 02 02 02 02
Mezclar bien agitando el tubo, agregar lentamente por las paredes

cido sulfrico 2.0 2.0 2.0 2.0

Observar en la interfase la aparicin de un anillo rojo violeta oscuro, lo cual


indica una reaccin positiva. Esta reaccin es debida a la condensacin de los
furfurales formados por la accin del cido con el alfanaftol.

4.1.2. REACCION DE SELIVANOFF.-

Esta es una reaccin especfica para azcares con grupo funcional cetnico.

TUBOS (ml) I II III


Sol. Fructosa 1% 1.0 ---- ----
Sol. Glucosa 1% ---- 1.0 ----
Sol. Sacarosa 1% ---- ---- 1.0
Rx. Selivanoff 5.0 5.0 5.0

Mezclar bien y someter a bao mara hirviente. Observar lo que sucede en los
tubos, a intervalos de 3 minutos, durante 15 minutos.

La reaccin es positiva cuando se observa una coloracin rojo cereza.

4.1.3. REACCION DE BARFOED.-

Esta prueba se utilizar para diferenciar monosacridos de disacridos

TUBOS (ml) I II III IV


Sol. Glucosa 1% 1.0 ---- ---- ----
Sol. Fructosa 1% ---- 1.0 ---- ----

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Sol. Sacarosa 1% ---- ---- 1.0 ----
Sol. Maltosa 1% ---- ---- 1.0
Rx Barfoed 5.0 5.0 5.0 5.0

Mezclar bien y someter a bao mara hirviente por espacio de 5 minutos,


controlar el tiempo en que aparecen las reacciones positivas (precipitado rojo
naranja) en los diferentes tubos. Interpretar los resultados.

4.1.4. ACCION DE LOS ALCALIS SOBRE LOS CARBOHIDRATOS

Las aldosas y cetosas, como los carbohidratos compuestos que contienen un


grupo azcar libre, presentan el fenmeno de la tautomerizacin cuando son
sometidos a la accin de los lcalis dando origen a las formas enlicas que se
comportan como cidos dbiles y tiene la capacidad de unirse al lcali dando
lugar a sales enlicas que tienen propiedades reductoras.

De estas propiedades se valen los mtodos para la identificacin y


cuantificacin de muchos azcares (Reaccin de Benedict, Fehling, etc.). En la
prctica se har una hidrlisis cida de un polisacrido y luego se proceder a
identificar el azcar reductor correspondiente.

PROCEDIMIENTO:

Triturar en un mortero una papa sin cscara


Agregar 5 10 ml de agua destilada, mezclar y decantar el
sobrenadante en un vaso de precipitacin.
En un tubo de ensayo medir 2 ml del sobrenadante anterior, y en otro
tubo de ensayo medir 2 ml de solucin de almidn previamente
preparado
Aadir 2 ml de HCl 1,5 % a cada uno de los tubos
Calentar los tubos de ensayo en bao mara hasta que hierva durante
15 minutos; enfriar, adicionar 5 gotas de KOH 1%
Aadir a los tubos anteriores 1 ml de las soluciones de Fehling A y
B, luego someterlos a ebullicin entre 3 y 5 minutos. Observar los que
sucede

V.- RESULTADOS Y DISCUSION

5.1. Los resultados de cada prueba indicarlos en un cuadro como el que sigue:

TUBOS I II III IV

VI. CONCLUSIONES

6.1. Indicar las conclusiones de la prctica.

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VII. CUESTIONARIO

7.1 Cul de las pruebas permite diferenciar aldosas de cetosas? Fundamente su


respuesta.
7.2 El almidn ingerido por el ser humano sufre el mismo tipo de hidrlisis cida
realizada en la prctica? Cmo se hidroliza?
7.3 Cules son las unidades monomricas de:

- Lactosa - Sacarosa
- Maltosa - Celulosa

7.4 Representa la unin de molculas en la formacin del almidn, glucgeno, y celulosa


7.5 De los siguientes azcares, Cul no es reductor? por qu?

- Glucosa - Sacarosa
- Lactosa - Fructosa

VIII.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

8.1. Bohinski, R. 1978. Bioqumica 2da edicin. Fondo Educativo Latinoamericano S.A.
8.2. Morrison, R. y Boyd. 1985. Qumica orgnica. 2da edicin. Fondo Educativo
Latinoamericano S.A. Mxico.
8.3. Villavicencio, M. 1993. Bioqumica. A&B S.A. Editores, Lima Per.

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PRCTICA N 08

FERMENTACION ALCOHOLICA

I.- INTRODUCCION

Las levaduras son organismos anaerbicos facultativos, que significa que pueden vivir sin
oxgeno. Cuando hay oxgeno lo utilizan para la respiracin, es decir para oxidar la glucosa
completamente y as obtener ATP.

En condiciones de anaerobiosis, las cepas de Sacharomyces cerevisae (levaduras de la


panificacin) y otras especies de levaduras transforman la glucosa en cido pirvico,
siguiendo la secuencia de reacciones de la glicolisis. Este proceso es comn a la mayora
de los seres vivientes; pero aqu radica lo especfico de estas levaduras, son capaces de
proseguir la degradacin del pirvico hasta etanol, mediante el siguiente proceso:

Esto es una ventaja adaptativa para las levaduras, que pueden sobrevivir en anaerobiosis.
Pero solamente lo utilizan cuando no hay oxgeno disponible y ello en relacin con el bajo
rendimiento energtico de la fermentacin alcohlica, en comparacin con el de la
degradacin oxidativa de la glucosa

Muchas reacciones metablicas intracelulares no ocurren espontneamente, requieren una


fuente de energa qumica en la forma de ATP. La principal fuente de ATP para la mayora
de las clulas es una serie de reacciones enzimticas que resultan en la descomposicin
de los compuestos carbonados en CO , agua y energa.
2

Los organismos hetertrofos obtienen energa oxidando molculas orgnicas y acoplando


las reacciones de oxidacin a la sntesis de ATP. El ATP es entonces usado para realizar
reacciones metablicas necesarias para mantener la integridad fsica del organismo y
sustentar todas sus otras actividades.

Algunos organismos son capaces de existir en ausencia de oxgeno molecular y pueden ser
perjudicados por la presencia de este elemento.

La oxidacin de la glucosa tiene lugar en dos pasos principales. El primero es la gluclisis,


un proceso anaerobio (puede tener lugar en ausencia de O ). La gluclisis ocurre en el
2
citoplasma de organismos anaerobios y aerobios. El producto final es el cido pirvico.
En algunos organismos anaerobios, el cido pirvico es metabolizado por una segunda
serie de reacciones, el proceso anaerobio de fermentacin, en el cual se producen alcohol
y CO .
2
El cido lctico puede ser tambin formado por el metabolismo anaerobio del cido
pirvico. Por ejemplo, cuando el suministro de O disponible en las clulas musculares es
2
agotado durante un ejercicio extenuante, el lctico es producido.

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Cuando hay O disponible, el segundo paso en la oxidacin de la glucosa es la respiracin
2
celular aerbica, la cual consta del ciclo de Krebs (o ciclo del cido ctrico) y el
transporte de electrones. Estas reacciones tienen lugar en la mitocondria y aumentan
sustancialmente la energa obtenida por la oxidacin de la glucosa.
+
Los transportadores de hidrgeno NAD+ y FAD , son reducidos por las reacciones de la
gliclisis y el ciclo de los cidos tricarboxlicos (ciclo de Krebs). NADH y FADH transfieren
2
luego sus tomos de hidrgeno y electrones a conjunto de enzimas llamadas cadena
transportadora de electrones. El flujo de electrones a travs de este sistema est acoplado
a la sntesis de ATP. La ltima enzima en la cadena transportadora de electrones, la
citocromo oxidasa reacciona directamente con oxgeno molecular para producir agua. Este
paso es el punto donde el oxgeno que el organismo incorpora es usado y donde se
produce agua metablica. El propsito del oxgeno es volver la citocromo oxidasa a una
forma oxidada de modo que pueda aceptar ms electrones desde sus vecinos
transportadores de electrones.
La respiracin aerbica de una molcula de glucosa puede dar una produccin neta de 38
molculas de ATP.

Las levaduras son organismos unicelulares relacionados a los hongos y mohos. Son
llamadas hetertrofas porque no desarrollan fotosntesis, sino que obtienen su alimento de
fuentes externas. Tambin son clasificadas como anaerobias facultativas -pueden vivir en
ambientes aerobio o anaerobios. Bajo condiciones anaerobias, las levaduras desarrollan la
fermentacin para producir etanol y CO .
2

CH O 2 C H OH + 2 CO + energa
6 12 6 2 5 2

Muy poca energa neta es producida durante este proceso -slo 2 ATPs por cada molcula
de glucosa metabolizada- pero esto es suficiente para sustentar la existencia de las clulas
de levadura.

Las levaduras son hongos eucariticos comercialmente muy importantes. Ellas son
necesarias para la produccin de cerveza, vino, pan y productos qumicos industriales. En
este experimento se estudiar la produccin de CO durante la fermentacin de varios
2
carbohidratos por clulas de levadura.

II.- OBJETIVOS
Demostrar la liberacin de CO 2 por los procesos de respiracin y fermentacin en
levaduras.
Describir la estructura de una clula de levadura indicando la localizacin de las
reacciones metablicas involucradas en la gliclisis y fermentacin.
Diferenciar respiracin anaerbica de aerbica.
Definir y comprender la fermentacin, conocer sus materiales de partida y sus productos
finales.
Estudiar la tasa de fermentacin en clulas de levadura midiendo la produccin de CO .
2

III. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS

3.3 EQUIPOS
3.3.1 Balanza
3.3.2 Bao mara
3.3.3 Agitador magntico

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3.3.4 Refractmetro
3.4 MATERIALES Y REACTIVO
PROPORCIONADO POR EL ALUMNO
3.4.1 10 gr de levadura de panificacin

PROPORCIONADO POR EL LABORATORIO


3.4.2 Glucosa 2 g
3.4.3 Sacarosa 2 g
3.4.4 Matraces de 100 ml
3.4.5 Probeta de 50 ml
3.4.6 Bureta de 100 ml
3.4.7 Pipetas de 1 ml

IV.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

A) FERMENTACIN DE LEVADURA:
Debe disponer de una gradilla, una pipeta con agua destilada, tres tubos de ensayo, tres
pipetas graduadas de 2 ml, tres pipetas Pasteur con bulbo y trozos de parafilm.
1.- Marque los tubos 1, 2, 3 y llnelos del siguiente modo:
Tubo 1 = 1 ml de sacarosa (2% p/v)+ 1 ml de suspensin de levadura.
Tubo 2 = 1 ml de glucosa (2% p/v)+ 1 ml de suspensin de levadura.
Tubo 3 = 1 ml de agua + 1 ml de suspensin de levadura.
Mezcle las soluciones.
2.- Selle el extremo inferior de una pipeta graduada con parafilm.
3.- Usando la pipeta Pasteur llene completamente la pipeta graduada con la solucin del
tubo 1 por el extremo superior.
4.- Coloque sobre el extremo sin sellar de la pipeta graduada el tubo 1 invertido.
Invierta luego todo el sistema cuidadosamente manteniendo juntos el tubo de ensayo y la
pipeta. Repita el procedimiento con los tubos 2 y 3
5.- El gas producido se acumular en el extremo cerrado de la pipeta graduada. Registre el
nivel del gas en las pipetas cada un minuto por alrededor de 20 min. Anote los datos una la
tabla.

B) PRODUCCIN DE CO 2 POR FERMENTACIN:


Bajo condiciones anaerbicas, las levaduras degradan azcares, desprendiendo gas. La
evidencia de que est ocurriendo la fermentacin en un cultivo de levaduras puede ser
lograda haciendo burbujear el gas en una solucin indicadora.
1.- Con papel tornasol determinar el pH del azul de bromotimol al iniciar el experimento.
2.- Tomar dos tubos de ensayo. En uno colocar sacarosa al 2% y cultivo de levaduras al
10%; y en el otro Azul de Bromotimol. Sumergir ambos tubos en bao a 37 C.
3.- Hacer burbujear cada tubo que contiene las levaduras hacia el que contiene la solucin
de azul de bromotimol a travs de un tubo (esquema). Si el CO pasa a la solucin, sta
2
se tornar ocre (el indicador vira de azul a ocre en los pH 6 - pH 7,6).
4.- Con papel tornasol determinar el pH del azul de bromotimol al finalizar el experimento.
5.- Realizar el experimento cambiando la sacarosa al 2% por glucosa al 2%.
Nota: Se procurar que la boca del tubo quede sumergida en el indicador. En el tubo se
deber lograr un cierre hermtico para permitir la solubilizacin del gas en el lquido.

C) EXAMINANDO CLULAS DE LEVADURA


1.- Usando una pipeta Pasteur, transferir varias gotas del cultivo de levaduras a un
portaobjetos. Agregar una gota de rojo neutro y colocar el cubreobjetos. Usar aumento
(40 X) para observar la levadura. Para qu que se agreg rojo neutro al preparado?

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2.- Bajo condiciones ptimas, las levaduras se multiplican por gemacin, que involucra un
proceso en el citoplasma con un subsiguiente desprendimiento de una nueva clula.
Busque en su preparado, clulas con yemas.
3.- Las levaduras son procariotas o eucariotas? Cmo lo sabe?
4.- En qu partes de la clula de levadura ocurre la gluclisis?

B) FERMENTACIN:
Instalar el equipo de fermentacin
En el matraz medir 50 ml de agua destilada
Encender el agitador magntico
Adicionar 2 g de glucosa
Adicionar 50 ml de agua destilada, lavando las paredes del matraz
Medir los grados Brix con el refractmetro
Agregar 2 g de levadura de panificacin
Repetir el procedimiento utilizando sacarosa
Observar y anotar sus resultados cada 5 minutos
Medir los grados Brix al finalizar el experimento

V.- RESULTADOS

TIEMPO
LIBERACION
MATRAZ N EN OBSERVACIONES
DE CO2
MINUTOS

VI. CONCLUSIONES

6.1. Indicar las conclusiones de la prctica.

VII. CUESTIONARIO

1. El tipo de carbohidrato fermentado afecta la tasa formacin de gas?


2. Qu tipo de carbohidrato sustent la tasa ms rpida de fermentacin?
3. Qu molcula es desdoblada en la reaccin que produce el CO ?
2
4. Por qu es ventajoso para un organismo realizar fermentacin?

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5. Se sabe que cuando el carbohidrato es fermentado por la levadura, slo un tercio de los
carbonos son liberados en forma de CO El resto del carbono es liberado como
2.
molculas de: .............................( Explique)

VIII.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

8.1. Bohinski, R. 1978. Bioqumica 2da edicin. Fondo Educativo Latinoamericano S.A.
8.2. Morrison, R. y Boyd. 1985. Qumica orgnica. 2da edicin. Fondo Educativo
Latinoamericano S.A. Mxico.
8.3. Villavicencio, M. 1993. Bioqumica. A&B S.A. Editores, Lima Per.

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PRCTICA N 09

RECONOCIMIENTO Y CUANTIFICACION DE GRASAS: INDICE DE PEROXIDOS

I.- INTRODUCCIN

El anlisis de algunas de las caractersticas fsicas y qumicas de las grasas y aceites es


necesario, ya que de l se derivan sus propiedades. Este anlisis permite establecer
adulteraciones en los productos normales e identificar productos nuevos. En anlisis de
rutina las determinaciones de los ndices de yodo, saponificacin, acidez, perxido y la
materia no saponificable, junto con las pruebas cualitativas para adulteraciones son
suficientes para confirmar la identidad y comestibilidad de la mayora de las grasas y
aceites.

Llamamos "ndice de perxidos" a los miliequivalentes de oxgeno activo contenidos en un Kilogramo


de grasa, calculados a partir del yodo liberado del yoduro de potasio, operando en las condiciones
especificadas segn la metdica analtica.

Las substancias que oxidan al yoduro de potasio en las condiciones descritas, las conside ramos
perxidos u otros productos similares provenientes de la oxidacin de las grasa, per lo cual el ndice
obtenido es considerado, con una aproximacin bastante aceptable, como una expresin cuantitativa
de los perxidos de la grasa muestra.

Tanto el ndice de yodo como el de refraccin indican el contenido de cidos grasos no


saturados; en estos, el punto de fusin es ms bajo que en los cidos grasos saturados; el
ndice de perxido es indicador del grado de rancidez oxidativa de las grasas. El ndice de
yodo como algunos de los otros ndices presenta grandes fluctuaciones en las diferentes
pocas del ao. Por ejemplo, la grasa de la leche tiene un 35% de cido oleico (ndice de
yodo 35, aproximadamente); sin embargo, este ndice es ms elevado en verano y ms bajo
en invierno, segn ha sido determinado en pases que poseen estaciones marcadas .

II.- OBJETIVOS

2.1 Determinar la extensin de rancidez oxidativa de dos muestras de aceite comestible

III. EQUIPOS, MATERIALES Y REACTIVOS

3.1. EQUIPOS
3.1.1 Balanza analtica.
3.1.2 Bureta.
3.1.3 Frasco lavador
3.1.4 Matraces Erlenmeyer esmerilados 29/32, con tapn (2).
3.1.5 Probeta de 100 ml.
3.1.6 Probeta de 50 ml
3.1.7 Pipetas de 5 y 10 ml
3.1.8 Propipetas
3.1.9 Tubos de ensayo

3.2 REACTIVOS
3.2.1 Cloroformo p.a.
3.2.2 cido actico 38%
3.2.3 Solucin saturada de yoduro de potasio 20%
3.2.4 Tiosulfato de sdio 0,01 N
3.2.5 Solucin indicadora de Almidn al 1%
3.2.6 Aceite de algodn 10% en cloroformo

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BIOQUIMICA ING. AGROINDUSTRIAL
3.2.7 Aceite de crtamo 10% en cloroformo
3.2.8 Monoesteril glicerol 10% en cloroformo
3.2.9 Reactivo de Hanus
3.2.10 Agua destilada

IV.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Experimento N 01
1. Pesar una cantidad adecuada de grasa en un matraz Erlenmeyer limpio y seco (5 g/ml)
2. Aadir 10 ml de cloroformo (p.a) y disolver rpidamente la grasa por agitacin
3. Aadir 15 ml de cido actico 38%
4. Aadir 1 ml de disolucin saturada de yoduro de potasio.
5. Tapar el matraz y agitar suavemente por rotacin durante 1 minuto
6. Dejar reposar 5 minutos en un lugar oscuro.
7. Aadir 75 ml de agua destilada, sacudir con energa
8. Valorar el yodo liberado con disolucin de tiosulfato de sodio 0,01N, utilizando
disolucin de almidn como indicador.
9. Paralelamente, efectuar un ensayo en blanco.

Experimento N 02
1. Numere 5 tubos de ensayo, limpios y secos, prepare las mezclas que se describe en la
tabla siguiente:
TUBO N
REACTIVO (ml) 1(t-) 2 3 6 5
Cloroformo 6
Aceite de algodn 10% en cloroformo 6
Aceite de crtamo 10% en cloroformo 6
Monoesteril glicerol 10% en cloroformo 6
Lpido problema en cloroformo 6
5 gotas de reactivo de Hanus SI SI SI SI SI
MEZCLAR ENERGICAMENTE
Cubrir con aluminio SI SI SI SI SI

2. Anote en la tabla siguiente, cada 30 min (durante 2 horas) el grado de decoloracin de


cada tubo, con respecto al testigo negativo de cloroformo.
3. Escriba la razn por la que se utiliza como ndice, el grado de decoloracin de la
solucin.
4. Escriba la reaccin qumica que se lleva a cabo.

TIEMPO / minutos
LIPIDO 30 60 90 120
Lpido problema
Aceite de algodn
Aceite de crtamo
Monoesteril glicerol

V.- CLCULOS

Experimento N 01
El ndice de perxidos (IP) se expresa en miliequivalentes de oxgeno activo por kilogramo
de muestra:

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BIOQUIMICA ING. AGROINDUSTRIAL

En donde:
V = volumen de disolucin de tiosulfato de sodio, en ml consumido en el ensayo de la
muestra.
V' = volumen de disolucin de tiosulfato de sodio, en ml consumido en el blanco.
N = normalidad de la disolucin de tiosulfato de sodio.
m = peso, en gramos, de la muestra.

OBSERVACIONES
La cantidad de muestra a pesar ser:
ndice supuesto peso muestra (gramos)
0 - 20 1'2 - 2
20 - 30 0'8 - 1'2
30 - 50 0'5 - 0'8
50 - 100 0'3 - 0'5

VI.- RESULTADOS Y DISCUSIN

6.1. Esquematice un flujograma de la prctica

VII.- CUESTIONARIO
1. Escribir la reaccin entre los perxidos y el yoduro de potasio.
2. Escribir la reaccin de valoracin (sub apartado 4 de la metodologa).
3. Hacer el esquema grfico del procedimiento analtico.
4. Deducir razonadamente la frmula del apartado "clculos". Deducir, adems. otra para
ndices de yodo bajos (utilizando tiosulfato de sodio 0'002N).
5. Confeccionar el correspondiente "boletn de anlisis".

VIII.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

8.1. Horton, H. 1995. Bioqumica. Prentice Hall. Hispanoamericana. S.A. Mxico


8.2. Murray, R. y Col. 1996. Bioqumica de Harper. 13era. Edicin. Manual Moderno.
Mxico D.F.

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BIOQUIMICA ING. AGROINDUSTRIAL
PRCTICA N 10

HIDRLISIS DE LAS GRASAS POR LA LIPASA PANCREATICA

I.- INTRODUCCION

Los lpidos son biomolculas orgnicas que tiene una gran importancia biolgica; los cidos
grasos que contienen, constituyen bloques estructurales para la construccin de los
fosfolpidos y glucolpidos, componentes importantes de las membranas biolgicas; sus
derivados funcionan como hormonas, vitaminas y mensajeros intracelulares. Son la mayor
fuente de energa metablica, cada gramo de grasa proporciona 9 kilocaloras.

En general, la hidrlisis de los lpidos libera cidos grasos de alto peso molecular y un
alcohol que depende del tipo de lpido, siendo el glicerol el ms frecuente. Los triglicridos,
que son los lpidos ms importantes de la dieta, estn constituidos por glicerol esterificado
en sus 3 carbonos por cidos grasos.

La lipasa pancretica es una enzima que acta sobre los triglicridos, hidrolizndolos a
digliceridos, monogliceridos, cidos grasos y glicerol. En la prctica vamos a medir la
actividad de esta enzima, titulando con una base, los cidos grasos liberados. En
consecuencia, a mayor acidez mayor gasto en la titulacin y mayor actividad enzimtica. La
accin de la lipasa es potenciada por las sales biliares, que transforman las grasas en
pequeas micelas.

II.- OBJETIVOS
2.1. Medir la actividad de la lipasa pancretica por titulacin cido base.
2.2. Determinar el efecto de las sales biliares.

III. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS

3.1 EQUIPOS
3.1.1 Bao mara
3.1.2 Estufa

3.2 MATERIALES Y REACTIVO

PROPORCIONADO POR EL ALUMNO


3.2.1 10 ml de aceite comestible por sub grupo de prctica

PROPORCIONADO POR EL LABORATORIO


3.2.2 Buffer fosfato 0.2 M pH 8.0
3.2.3 Sales biliares en buffer fosfato 0,5 %
3.2.4 Fenolftaleina 0,5 %
3.2.5 Hidrxido de sodio 0,1 N y 0,01 N
3.2.6 Solucin de pancreatina 0,1 %
3.2.7 Agua destilda
3.2.8 Tubos de ensayo
3.2.9 Pipetas de 1, 5 y 10 ml
3.2.10 Vasos de precipitacin
3.2.11 Matraces de 100 ml
3.2.12 Buretas de 25 ml

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IV.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.1 PREPARE EL SIGUIENTE ESQUEMA

TUBOS (ml) I II III


Aceite neutralizado 1.0 1.0 ---
Buffer fosfato 2.0 2.0 2.0
Sales biliares 2.0 --- 2.0
Agua destilada --- 2.0 1.0
Fenolftalena (gotas) 02 02 02
Emulsionar bien cada tubo, verificar que el color rosado se mantega. Si no
es as, aadir unas gotas de NaOH 0,1 N hasta que reaparezca.
Solucin de pancreatina 5.0 5.0 5.0
0
Agitar bien e incubar a 37 C por 30 minutos

4.2 TITULACION

4.2.1 Titular cada uno de los tubos con NaOH 0,01 N hasta que el color rosado del
indicador fenolftalena se obtenga nuevamente. Anotar los ml de NaOH gastados
e interpretar los resultados

V.- DATOS EXPERIMENTALES

5.1 Tabla de datos obtenidos (ml de NaOH 0,01 N gastados en la titulacin de cada uno de
los tubos)

VI. CALCULOS, RESULTADOS Y DISCUSION

6.1 Efectuar los clculos necesarios para expresar la concentracin de cidos grasos
liberados en miliequivalentes.

Gasto
Gasto Acido en
TUBOS obtenido en
real en ml mEq.
ml
I
II
III

VII. CONCLUSIONES

7.1 Anotar sus conclusiones de la prctica de acuerdo a los objetivos y resultados

VIII. CUESTIONARIO

8.1. Qu cambio sufren los triglicridos a nivel oral y gstrico?


8.2 Cul es la composicin de la bilis?
8.3 De 5 ejemplos de cidos grasos
8.4 Cules son las condiciones ptimas para la actividad de la lipasa pancretica?
8.5 Qu componentes tiene la pancreatina?
8.7 Cules son los productos que encontraremos en los tubos de reaccin al final de la
prctica?

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BIOQUIMICA ING. AGROINDUSTRIAL
IX.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

9.1 Lehninger, A.L. Bioenergtica. Fondo Educativo Interamericano S.A. Bogot,


Colombia.
9.2 Metzler, E.D. 1981. Bioqumica, Omega S.A. Barcelona, Espaa.
9.3 Murray, R.K. y Col. 1988. Bioqumica de Harper. 12 edicin. El Manual moderno
S.A. Mxico.

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BIOQUIMICA ING. AGROINDUSTRIAL
PRCTICA N 12

RECONOCIMIENTO Y DETERMINACION DE PROTEINAS

I.- INTRODUCCION

Las protenas del plasma son una compleja mezcla de compuestos que difieren de sus
propiedades y funciones. Se dividen en 3 fracciones principales: Albminas, Glubulinas y
Fibringeno.

Son importantes para el organismo por que interviene en una diversidad de actividades
entre las que destacan: Funcin osmtica, accin amortiguadora, transporte de sustancias,
actividad inmunolgica, coagulacin sangunea, etc.

La alteracin en la concentracin de protenas sricas nos genera informacin sobre el


estado nutricional, funcional e inmunolgico del organismo, pudiendo indicar estas
variaciones la presencia de enfermedades especficas: por ejemplo, las gamma globulinas
se incrementan en las enfermedades infecciosas, las globulinas beta incrementan cuando
hay acumulo de lpidos, etc.

Existen diversas tcnicas de estudio de las protenas plasmticas desde el


fraccionamiento con sales neutras (sulfato de sodio, sulfato de amonio) que solo distingue
dos grandes tipos de protenas: albminas y globulinas, hasta las tcnicas ms refinadas de
separacin con la ultra centrifugacin, la electroforesis, la inmunoelectroforesis etc. En la
prctica se har uso del mtodo de Biuret, mtodo colorimtrico de bastante exactitud y
objetividad en la reaccin de color.

Una de las fracciones orgnicas ms importantes de la sangre es la de las protenas,


tanto por su contenido porcentual como por las funciones que realizan. El contenido totoral
de protenas del plasma es normalmente del orden de 5.7 a 8.0 g/dl. Las protenas sricas
constituyen la mayor parte de los slidos del plasma y son una mezcla compleja de
protenas simples y conjugadas como glucoprotenas y lipoprotenas.

Las protenas del plasma estn constituidas en tres grupos principales: Albmina,
globulinas y fibringeno. El fibringeno normalmente constituye del 4 al 6 % de las protenas
plasmticas, es producido por el hgado y tiene importancia fundamental para la coagulacin
de la sangre.

La albmina es la principal protena del suero; se halla tambin en los espacios


extravasculares, linfa y otros lquidos biolgicos como el amnitico, bilis, jugo gstrico, etc.
Se encuentra en la orina de pacientes con enfermedades renales y es uno de los
componentes principales del lquido del edema. Las dos funciones principales de la
albmina plasmtica son: El mantenimiento de la presin colidosmtica y el transporte de
algunos metabolitos tales como bilirrubinas, aminocidos, cidos grasos, enzimas,
medicamentos, etc. La albmina es sintetizada por las clulas hepticas en una cantidad de
12 a 14 g/da.

Las globulinas se dividen en tres grupos principales: globulinas alfa, beta y gamma. Las
globulinas alfa y beta ejercen diversas funciones en la circulacin tales como transporte de
metabolitos y de iones metlicos. Las globulinas gamma actan en la actividad inmunolgica
ya que constituyen las inmunoglobulinas que resisten a la infeccin. La mayor parte de las
globulinas alfa y beta son de origen heptico pero las gamma se pueden sintetizar en
hgado y tejido linftico.

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BIOQUIMICA ING. AGROINDUSTRIAL
El hgado es el centro principal de protenas plasmticas. La formacin de albmina y
fibringeno parece estar limitada al hgado; aproximadamente el 80% de las globulinas se
fabrican en el hgado, incluyendo las lipoprotenas. El principal papel del hgado en la
sntesis protenica del plasma se refleja en la disminucin notable de albmina y fibringeno
que tiene un lugar en tejido heptico daado, como se observa en pacientes con cirrosis o a
consecuencia de una hepatotectoma experimental.

Existen una gran cantidad de compuestos qumicos entre los cuales se incluyen a las
drogas y los frmacos que afectan la integridad metablica de los hepatocitos. Algunos de
ellos afectan la capacidad de sntesis de metabolitos como la albmina y en la mayora de
los casos el efecto es tan drstico que puede llegar a ser letal. Dentro de los compuestos
que han sido catalogados como hepato-txicos estn el cloroformo, el dinitrofenol, la
clorpromazida, el fluoruracilo y la tetraciclina. Esta ltima afecta al hgado de una manera
proporcional a la concentracin que se administra. En pacientes desnutridos la tetraciclina
es hepatotxica a dosis mayores de 3 g/da y su efecto comienza a las 48 hrs. de
administrarse esta dosis.

Si la tetraciclina es un antibitico que a dosis mayores de 3 g/da disminuye el


metabolismo del hepatocito y la albmina se sintetiza nicamente en el hgado, entonces, es
factible encontrar bajos niveles de albmina srica en un individuo que ha sido tratado con
altas dosis de este antibitico.

II.- OBJETIVOS

2.1 Reconocer y determinar las concentraciones de protenas totales de suero sanguneo y


de sueros de leche de soya y leche de vaca.

III.- EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS

3.1 EQUIPOS
3.1.1 Espectrofotmetro
3.1.2 Centrfuga
3.1.3 Bao Mara

3.2 MATERIALES Y REACTIVO


PROPORCIONADO POR EL ALUMNO
3.2.1 01 aguja descartable N0 21
3.2.2 Algodn
3.2.3 Alcohol medicinal
3.2.4 Gasa
3.2.5 Leche de Soya
3.2.6 Leche de Vaca
3.2.7 Suero de Toro
3.2.8 Suero de Pollo
3.2.9 Suero no hemolizado
3.2.10 Solucin Salina Fisiolgica SSF

PROPORCIONADO POR EL LABORATORIO


3.2.11 Reactivo de Biuret
3.2.12 Reactivo verde de bromocresol
3.2.13 Solucin patrn de albumina
3.2.14 HCl 0,5 N
3.2.15 Agua destilada
3.2.16 Pipetas de 1 y 5 ml
3.2.17 Matraz

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3.2.18 Tubos de ensayo

IV.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.1. OBTENCIN DEL SUERO DE LECHE


o En un matraz medir 50 ml de leche de soya
o En un matraz medir 50 ml de leche de vaca
o Adicionar HCl 0,5 N hasta llegar a un pH de 4 (aprox. 1 2 ml)
o Incubar a 37 C por 30 minutos
o Filtrar en gasa
o Medir del filtrado 10 ml y centrifugar a 10 000 rpm por 5 minutos
o Separar el sobrenadante para su evaluacin

4.2. DETERMINACIN DE LAS PROTENAS TOTALES: Armar el siguiente sistema

TUBOS (ml) I II III IV V VI


Plasma o suero sanguneo diluido al 1.0 ---- ---- ---- ---- ----
1/20
Plasma o suero de pollo diluido al ---- 1.0 ---- ---- ---- ----
1/20
Plasma o suero de toro diluido al ---- ---- 1.0 ---- ---- ----
1/20
Suero de leche de soya ---- ---- ---- 1.0 ---- ----
Suero de leche de vaca ---- ---- ---- ---- 1.0
Agua destilada ---- ---- ---- ---- ---- 1.0
Reactivo de Biuret 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0
Mezclar. Dejar en reposo durante 30 min. Leer a 540 nm

CUANTIFICACION DE PROTEINAS TOTALES

Agitar los tubos y dejar reposar durante 15 min. Medir la absorbancia del patrn y
del problema ajustando a cero con el blanco a 550 nm.

Protenas totales = Absorbancia del problema x concentracin del patrn = g/dl


Absorbancia del patrn

CUANTIFICACION DE ALBUMINA
l
REACTIVO BLANCO PATRON PROBLEMA
Reactivo de Biuret 2.5 ml 2.5ml 2.5 m
Suero no hemolizado 0.1 ml
Solucin patrn 0.1 ml
Solucin salina 0.1 ml
Reactivo verde de
3 ml 3 ml 3 ml
bromocresol
Suero no hemolizado 0.01 ml
Solucin patrn 0.01 ml
Solucin salina 0.01 ml

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Mezclar y dejar reposar los tubos durante 10 min. a temperatura ambiente.
Medir la absorbancia del problema y el patrn ajustando a cero con el
blanco a 640 nm

CALCULOS:

REACTIVOS BLANCO PATRON PROBLEMA

ALBMINA = Absorbancia del problema x concentracin del patrn = g/dl


Absorbancia del patrn

PROTEINAS TOTALES ALBMINA = GLOBULINAS

RELACION ALBMINA /GLOBULINAS

V.- CALCULOS.-

5.1. Determinacin de protenas totales:

Restar la lectura del tubo VI (blanco) de la lectura de todos los otros tubo I.
Multiplicar la por el factor de calibracin (15)
El resultado se expresa en g de protena por ciento.

VI.- RESULTADOS Y DISCUSION

6.1. Explicar los resultados en base a la literatura recomendada. Considere los aumentos
o disminuciones en la concentracin de las diferentes fracciones proteicas.

VII.- CONCLUSIONES

7.1. Anotar sus conclusiones de acuerdo a sus resultados y objetivos.


7.2. Anotar sus conclusiones de la prctica.
7.3 Discuta si las pruebas de cuantificacin de albmina y protenas totales son
confiables para analizar este efecto.
7.4 Describa el significado metablico de la relacin albmina / globulinas y
mencione su aplicabilidad a este experimento.
7.5 Describa que efecto podra tener su suero hemolizado en la confiabilidad de
este experimento

VIII.- CUESTIONARIO

1. Cul es el fundamento de la reaccin de Biuret?


2. Qu es un enlace peptdico?
3. Qu es la electroforesis)
4. Explique en trminos fisicoqumicos como se mantiene el equilibrio colidosmtico de la
sangre y qu papel juega la albmina en este efecto.
5. Analice la estructura de la albmina y explique cmo esta protena funciona en el
transporte de diferentes tipos de metabolitos por la circulacin sangunea.
6. Mencione cinco tipos de 1 globulinas diferentes e indique sus funciones.
7. Mencione cinco tipos diferentes de globulinas que funcionen en el transporte de
iones o metabolitos en la sangre.

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8. Explique cmo es el efecto txico del 2,4-dinitrofenol sobre el hepatocito e indique
como afecta a los niveles de protenas totales en sangre.

IX.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

9.1 Casas Sabata. Anlisis Instrumental. 3er.Edicin. Editorial Don Bosco. Barcelona
Espaa.
9.2 Price, J. F. y B. S. Ciencia de la carne y los productos crnicos.
9.3 Braverman, J.B.S. 1976. Introduccin a la Bioqumica de los alimentos. Editorial
Omega S.A. Barcelona, Espaa.
9.4 Fennema, O. 1991. Qumica de los alimentos. Editorial Acribia S.A. Zaragoza,
Espaa.
9.5 Jungermann, K. 1984. Bioqumica. Ediciones Pirmide, S.A. Madrid.
9.6 Villavicencio, M. 1993. Bioqumica. A&BS.A. Editores. Lima, Per.

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PRCTICA N 13

ACCIN DE LA BROMELINA E IDENTIFICACIN DE AMINO CIDOS EN


GELATINA

I.- INTRODUCCION

En la industria de los alimentos crnicos se emplean enzimas proteolticas extradas de


los vegetales, las que van a contribuir a la accin proteoltica de las catepsinas que actan
en forma natural despus de rigor mortis (rigidez cadavrica).

La pia posee una enzima llamada Bromelina (o bromelaina), recordemos que las
enzimas son catalizadores, o sea son capaces de descomponer o cambiar la estructura de
otras sin que estas se vean afectadas. Entonces cuando mezclamos la Bromelina junto con
otras protenas, estas empiezan a actuar y generan reacciones que nos benefician y otras
no.

El colgeno presente en la gelatina u hojas de colapez tiene la propiedad de retener


lquido dentro de sus mallas para luego encapsularlo y formar redes de slidos. Eso es lo
que sucede cuando realizamos algn mousse o jalea, pero la Bromelina inhibe la funcin
del colgeno debido a que rompe todos los enlaces e impide que estas absorban el agua
del producto, y terminamos con una decepcionante preparacin.

Pero tambin podemos hacer un buen uso de la Bromelina, como por ejemplo para las
carnes. Si ponemos jugo de pia natural o trozos de pia sobre un trozo de carne de res,
cerdo o cordero; la Bromelina comenzar a romper las mallas de colgeno y el tejido
conjuntivo. Y una vez que cocinemos el producto nos encontraremos con un trozo mucho
ms tierno y suave.

Bromelina, papana y la ficina, son enzimas proteolticas especficamente


endopeptidasas, extradas de la pia (Anan sativa), papaya (Carica papaya) y del higo
(Ficus carica), respectivamente. Su accin enzimtica permite disminuir el complejo
miosina-actina. Hidrolizan tambin el colgeno y la elastina ablandando el tejido conectivo.

II.- OBJETIVOS
2.1 Demostrar la accin proteoltica de la bromelina
2.2 Identificar los aminocidos liberados por la accin de la bromelina

III. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS

3.1 EQUIPOS
3.1.1 Balanza
3.1.2 Cocina

3.2 MATERIALES Y REACTIVO

PROPORCIONADO POR EL ALUMNO


3.2.1 50 g de gelatina comercial
3.2.2 Vasos descartables chicos
3.2.3 Extracto de pia (obtenido sin utilizar agua)

PROPORCIONADO POR EL LABORATORIO


3.2.4 Vasos de precipitacin
3.2.5 Pipetas de 5 y 10 ml

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IV.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.1. PREPARACION DE LA MUESTRA


Pesar 6 gr de gelatina y disolverlos en 30 ml de agua caliente, dejarlos enfriar en tres
vasos descartables.

4.2. ACCION DE LA BROMELINA SOBRE LA GELATINA

MUESTRA (ml) VASO I VASO II VASO


III
Gelatina 10 10 10
Extracto de pia fresco ---- 2 ----
Extracto de pia hervido ---- ---- 2
Mezclar, dejar en reposo por 30 minuto, luego refrigerar por espacio de 1
hora
V.- RESULTADOS Y DISCUSION

5.1 Llenar el siguiente cuadro

VASOS OBSERVACIONES
I
II
III

VI. CONCLUSIONES

6.1. Anotar sus conclusiones de la prctica.

VII. CUESTIONARIO

7.1 Explique el uso y la accin bioqumica de la papana en la industria crnica


7.2 Mediante un grfico explique la biosntesis de la fenilalanina, triptfano, tirosina
7.3 En qu organelo se encuentran las enzimas proteolticas?
7.4 Cul es el fundamento de la cromatografa en papel?
7.5 Cul son los usos de la bromelina?

VIII.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

8.1. Casas Sabata. Anlisis Instrumental. 3er.Edicin. Editorial Don Bosco. Barcelona
Espaa.
8.2. Price, J. F. y B. S. Ciencia de la carne y los productos crnicos.
8.3. Braverman, J.B.S. 1976. Introduccin a la Bioqumica de los alimentos. Editorial
Omega S.A. Barcelona, Espaa.
8.4. Fennema, O. 1991. Qumica de los alimentos. Editorial Acribia S.A. Zaragoza,
Espaa.

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BIOQUIMICA ING. AGROINDUSTRIAL
PRCTICA N 14

AISLAMIENTO DEL ADN

I.- INTRODUCCION

El cido desoxirribonucleico (ADN), es una macromolcula presente en todos los seres


vivos, incluyendo muchos virus (adenovirus), es la portadora la herencia. Gracias a los
trabajos de Watson y Crack en 1953, propusieron un modelo estructural del ADN
compuesto por dos cadenas antiparalelas en forma de hlice.

La unidad bsica del ADN lo constituye un nucletido (el ADN es un polmero de


polinucletidos), que est compuesto por un monosacrido de 5 carbonos, una
desoxirribosa, un grupo fosfato y una base nitrogenada que puede ser purina: adenina o
guanina o base pirimdica: citosina, timina o uracilo.

La estructura del ADN suele semejarse a una escalera de mano, en la que las barras
estn constituidas por unas series alternantes de molculas de desoxirribosa, cido
fosfrico y los peldaos por pares de bases nitrogenadas complementarias que estn
unidas entre s por puentes de hidrgeno y las molculas de desoxirribosa por puentes de
oxgeno.

El ADN regula la actividad celular, debido a la sntesis de protenas que, en su gran


mayora, son enzimas. La informacin necesaria para la sntesis de protenas se encuentra
en el ADN en forma de clave que est representado por la secuencia de las bases
nitrogenadas.

II.- OBJETIVOS
2.1 Extraer el ADN a partir de una muestra biolgica
2.2 Reconocer microscpicamente el ADN, haciendo uso de un colorante.

III. EQUIPOS MATERIALES Y REACTIVOS

3.1 EQUIPOS
3.1.1 Microscopio
3.1.2 Balanza

3.2 MATERIALES Y REACTIVOS


PROPORCIONADO POR EL ALUMNO
3.2.1 10 g de hgado de pollo (por sub grupo de prctica)
3.2.2 10 g de detergente
3.2.3 03 bolsa de gasa
3.2.4 Alcohol de 96 %
3.2.5 Gotero o palitos mordadientes

PROPORCIONADO POR EL ALUMNO


3.2.6 Solucin salina fisiolgica
3.2.7 Solucin de cloruro de sodio 2 M
3.2.8 Colorante de acridina o safranina
3.2.9 Mortero
3.2.10 Vasos de precipitacin
3.2.11 Varillas de agitacin
3.2.12 Pipetas de 10 ml
3.2.13 Embudo de vidrio

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BIOQUIMICA ING. AGROINDUSTRIAL
3.2.14 Lminas portaobjetos

IV.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.1 EXTRACCIN DEL ADN

4.1.1 En un mortero triturar 10 g de hgado de pollo con 15 ml de SSF.


4.1.2 Filtrar la mezcla en 3 capas de gasa para eliminar restos de tejido.
4.1.3 Agregar una solucin de NaCl 2 M (sol. Hipertnica) en igual volumen del filtrado.
Luego aade 1 g de detergente y agitar con una varilla de vidrio durante 10
minutos aproximadamente.
4.1.4 Verter la solucin anterior en un vaso de precipitacin, agregar lentamente
alcohol por las paredes del vaso hasta que se formen dos capas o fases. En la
interfase se precipita el ADN.
4.1.5 Con la ayuda de una varilla de agitacin ir moviendo en la misma direccin y
observar cmo se va adviniendo una fibra blanquecina transparente a simple
vista (ADN) en la varilla.
4.1.6 Realiza una preparacin en fresco, sacando una fibra de ADN y depositndolo
en una lmina portaobjeto y agregar el colorante.
4.1.7 Dejar actuar el colorante por dos minutos, observar en el microscopio a menor y
mayor aumento y determinar su estructura fibrilar.

V. RESULTADOS Y DISCUSION

5.1. Representar mediante un flujograma el procedimiento de extraccin del ADN.


5.2. Esquematizar las observaciones microscpicas.

VI. CONCLUSIONES

6.1. Anotar sus conclusiones de la prctica.

VII. CUESTIONARIO

7.1 Qu muestras biolgicas podran utilizarse para extraer ADN?


7.2 Cul es el modelo estructural del ADN?
7.3 Cules son las funciones del ADN?
7.4 Qu otros colorantes podrn ser usados para visualizar el ADN?
7.5 Cul es la importancia de la prctica?

VIII.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

8.1. Cortez, L.R. 1991. Manual de prcticas de biologa general. Universidad Nacional
de la Libertad. Departamento de Ciencias Biolgicas. Trujillo, Per.
8.2. Gree, E. y Bobrowsky, K. 1970. Laboratorio de Biologa de Investigaciones.
Publicaciones Cultural S.A. D.F. de Mxico.
8.3. Villee, C. 1981. Biologa. 7ma. Edicin. Nueva Editorial Interamericana S.A. Mxico.

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PRCTICA N 15

APLICACIN DEL CODIGEN: DEMOSTRACIN DE LA REPLICACIN,


TRANSCRIPCIN Y SNTESIS DE PROTENAS

I.- INTRODUCCION

Codigene es un programa diseado para facilitar el aprendizaje de la gentica


molecular. El idioma de ste es el cataln por lo que el docente tendr que guiar la lectura
para facilitar la comprensin de las indicaciones a seguir para su funcionamiento. Contiene
dos subprogramas con actividades y objetivos diferentes.

Uno de ellos es de ejercicios de replicacin, transcripcin y traduccin y el otro permite


a los estudiantes investigar el cdigo gentico y "descubrirlo" de manera similar a como lo
hicieron los cientficos Nirenberg, Khorana y Ochoa en los aos 60.

El programa Codigene sirve para que el alumno se ejercite en la direccin de la


replicacin, transcripcin y traduccin del material hereditario DNA, as como la asignacin
de las bases nitrogenadas que sirven para la sntesis de las cadenas complementarias de
la secuencia molde.

La replicacin del ADN es el proceso por el cual se obtienen copias o rplicas idnticas
de una molcula de ADN. La replicacin es fundamental para la transferencia de la
informacin gentica de una generacin a la siguiente y, por ende, es la base de
la herencia. El mecanismo consiste esencialmente en la separacin de las dos hebras de
la doble hlice, las cuales sirven de molde para la posterior sntesis de cadenas
complementarias a cada una de ellas, que llevar por nombre ARNm. El resultado final son
dos molculas idnticas a la original. Este tipo de replicacin se denomina
semiconservativa debido a que cada una de las dos molculas resultantes de la
duplicacin presenta una cadena procedente de la molcula "madre" y otra recin
sintetizada.

En un gen, la secuencia de nucletidos a lo largo de una hebra de ADN se transcribe a


un ARN mensajero (ARNm) y esta secuencia a su vez se traduce a una protena que un
organismo es capaz de sintetizar o "expresar" en uno o varios momentos de su vida,
usando la informacin de dicha secuencia.

La relacin entre la secuencia de nucletidos y la secuencia de aminocidos de la


protena viene determinada por el cdigo gentico, que se utiliza durante el proceso de
traduccin o sntesis de protenas. La unidad codificadora del cdigo gentico es un
grupo de tres nucletidos (triplete), representado por las tres letras iniciales de las bases
nitrogenadas (por ej., ACT, CAG, TTT). Los tripletes del ADN se transcriben en sus bases
complementarias en el ARN mensajero, y en este caso los tripletes se denominan codones
(para el ejemplo anterior, UGA, GUC, AAA). En el ribosoma cada codn del ARN
mensajero interacciona con una molcula de ARN de transferencia (ARNt o tRNA) que
contenga el triplete complementario, denominado anticodn.

Cada ARNt porta el aminocido correspondiente al codn de acuerdo con el cdigo


gentico, de modo que el ribosoma va uniendo los aminocidos para formar una nueva
protena de acuerdo con las "instrucciones" de la secuencia del ARNm. Existen 64 codones
posibles, por lo cual corresponde ms de uno para cada aminocido (por esta duplicidad
de codones se dice que el cdigo gentico es un cdigo degenerado: no es unvoco);
algunos codones indican la terminacin de la sntesis, el fin de la secuencia codificante;

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estos codones de terminacin o codones de parada son UAA, UGA y UAG (en ingls,
nonsense codons ostop codons).

II.- OBJETIVOS:

2.1 Conocer y diferenciar las principales aplicaciones del Programa CODIGENE en el


estudio de la replicacin y transcripcin del DNA y traduccin de proteinas.

2.2 Adiestrarse en el uso del Programa CODIGENE para el estudio de la gentica


molecular.

III.- MATERIALES

3.1 Programa CODIGENE


3.2 Computadora o Laptop

IV.- PROCEDIMIENTO

Ejercicios de replicacin

El alumno cargara el programa CODIGENE, donde encontrara la barra del men.


Enseguida ingresara a la opcin EXERCISIS y seleccionara REPLICACION. Se empezara
a llenar los cuadros en blanco. Lo primero, es colocar el inicio de la direccin de la
replicacin del DNA, seguido por la adicin bases nitrogenadas complementarias a las
bases presentes en la cadena original haciendo click en unos iconos accesorios hasta
completar la cadena nueva y por ultimo colocar el final de la direccin de la replicacin.

Ejercicios de transcripcin

El alumno cargara el programa CODIGENE, donde encontrara la barra del men.


Enseguida ingresara a la opcin EXERCISIS y seleccionara TRANSCRIPCION. Se
empezara a llenar los cuadros en blanco. Lo primero, es colocar el nmero de inicio de la
direccin de la transcripcin del DNA, seguido por la adicin bases nitrogenadas

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complementarias RNA a las bases presentes en la cadena original del DNA haciendo click
en unos iconos accesorios hasta completar la cadena de RNA y por ultimo colocar el
nmero final de la direccin de la transcripcin.

Ejercicios de traduccin

El alumno cargara el programa CODIGENE, donde encontrara la barra del men.


Enseguida ingresara a la opcin EXERCISIS y seleccionara TRADUCCION. Se empezara
a llenar los cuadros en blanco, en base a tripletes de bases. Se realizara la sntesis de
aminocidos, producto de la adicin bases nitrogenadas complementarias a las bases
presentes en la cadena de RNA haciendo click en unos iconos accesorios hasta completar
la cadena polipeptidica y el termino de la traduccin.

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V.- RESULTADOS Y DISCUSION

5.1. Explicar los resultados en base a la literatura recomendada

VI.- CONCLUSIONES

6.1. Anotar sus conclusiones de la prctica de acuerdo a sus resultados y objetivos.

VII.- CUESTIONARIO

7.1. Por qu la Replicacin del ADN es importante?


7.2. Cul es la diferencia entre la transcripcin y la traduccin?
7.3. Cul es la funcin de las secuencias de Shine Dalgarno?

VIII.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

8.1 Campbell M K y Farrell S. Bioqumica, Mxico: Thompson; 2004


8.2 Cox M y Nelson D. Lehninger Principles of Biochemistry. 4th ed. San Francisco: W. H.
Freeman; 2005

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