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Exame de qualificao
Campinas, 2012
ii
ndice
Pg
Lista de abreviaes.................................................................................................................................. v
Lista de Figuras......................................................................................................................................... vi
Lista de tabelas.......................................................................................................................................... viii
Resumo..................................................................................................................................................... ix
Abstract..................................................................................................................................................... xi
1. INTRODUO........................................................................................................................................ 01
1.1 Veneno de serpentes....................................................................................................................... 01
1.2 O veneno botrpico......................................................................................................................... 02
1.2.1 Atividade hemorrgica........................................................................................................ 02
1.2.2 Atividade coagulante e agregao plaquetria.................................................................... 02
1.2.3 Atividade inflamatria........................................................................................................ 03
1.2.4 Atividade miotxica............................................................................................................ 03
1.2.5 Atividade neurotxica......................................................................................................... 04
1.3 Fosfolipases A2 (PLA2)................................................................................................................... 04
1.4 Estrutura e funo das PLA2........................................................................................................... 06
1.5 Ao biolgica das PLA2................................................................................................................ 10
1.6 Miotoxinas PLA2............................................................................................................................ 11
1.7 Neurotoxinas PLA2......................................................................................................................... 12
1.8 Modificaes qumicas das PLA2................................................................................................... 13
1.9 Ferramentas moleculares................................................................................................................ 14
1.10 Porthidium hyoprora...................................................................................................................... 15
2. OBJETIVOS............................................................................................................................................. 16
2.1 Objetivo geral................................................................................................................................. 16
2.2 Objetivos especficos...................................................................................................................... 16
3. MATERIAIS E MTODOS..................................................................................................................... 17
3.1 Veneno e reagentes......................................................................................................................... 17
3.2 Animais........................................................................................................................................... 17
3.3 Purificao das PLA2 em HPLC de fase reversa............................................................................ 17
3.4 Eletroforese em SDS-PAGE........................................................................................................... 17
3.5 Atividade fosfolipsica A2.............................................................................................................. 18
3.6 Estudos cinticos............................................................................................................................ 18
3.6.1 Efeito do pH na atividade PLA2............................................................................................ 18
3.6.2 Efeito da temperatura na atividade PLA2.............................................................................. 18
3.6.3 Efeito da concentrao do substrato na atividade PLA2...................................................... 19
3.6.4 Efeito de ons divalentes na atividade PLA2......................................................................... 19
3.6.5 Estudos de inibio enzimtica.............................................................................................. 19
3.7 Anlise de aminocidos.................................................................................................................. 19
3.8 Determinao da massa molecular por espectrometria de massas Maldi-tof................................. 19
3.9 Determinao da estrutura primria................................................................................................ 20
3.9.1 Reduo e alquilao............................................................................................................. 20
3.9.2 Hidrlise enzimtica.............................................................................................................. 20
3.9.3 Espectrometria de massas em tandem................................................................................... 20
3.9.4 Sequenciamento de novo dos peptidios trpticos............................................................... 20
5. DISCUSSO............................................................................................................................................ 55
5.1 Purificao e caracterizao bioqumica das PLA 2 PhTX-I e PhTX-II.......................................... 55
5.2 Caracterizao farmacolgica das PLA 2 PhTX-I e PhTX-II.......................................................... 63
iv
5.3Modificaes qumicas na miotoxina PhTX-I e seus efeitos sobre suas atividades enzimtica,
farmacolgicas e estruturais........................................................................................................... 70
6. DISCUSSO GERAL.............................................................................................................................. 79
7. CONCLUSSES...................................................................................................................................... 81
8. BIBLIOGRAFIA...................................................................................................................................... 83
Lista de Abreviaes
Lista de Figuras
Pg
Figura 1 Hiptese sobre o desenvolvimento dos efeitos locais induzidos por venenos botrpicos........ 5
vi
Figura 17. Registros miogrficos da resposta muscular em presena do VT, PhTX-I e PhTX-II.......... 41
Figura 18. Porcentagem de bloqueio da contratura em resposta ACh e K do VT, PhTX-I e PhTX-II 41
Figura 19. Representao grfica da atividade miotxica local do VT, PhTX-I e PhTX-II................... 42
Figura 20. Representao grfica da atividade miotxica sistmica do VT, PhTX-I e PhTX-II............ 43
Figura 21. Atividade edematognica do VT, PhTX-I e PhTX-II............................................................ 43
Figura 22. Nveis de Interleucina (IL-6) plasmtica induzida por VT e PhTX-I.................................... 44
Figura 23. Atividade citotxica do VT e da PhTX-I sobre cultura de mioblastos e miotubos............... 45
Figura 24. Atividade citotxica de PhTX-I e PhTX-II sobre clulas NCIH-3T3 e NG97...................... 45
Figura 25. Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%). SDS-PAGE PLA 2 modificadas.................. 46
Figura 26. Espectros de massa ESI da PhTX-I modificada com BPB, AA, NPSC e NBSF................... 47
Figura 27. Espectros de CD no UV-distante. PhTX-I nativa e as formas modificadas........................... 49
Figura 28. Atividade PLA2 da PhTX-I nativa e das formas modificadas ............................................... 50
Figura 29. Representao grfica do bloqueio neuromuscular dasPhTX-I modificadas......................... 50
Lista de Tabelas
Pg
Tabela 1. Fosfolipases A2 secretrias (sPLA2)........................................................................................ 6
viii
Resumo
No presente trabalho, apartir do veneno de P. hyoprora, foram purificadas duas PLA2
miotxicas, denominadas PhTX-I e PhTX-II, determinadas suas sequencias primrias e
ix
Abstract
In this work, were purified two myotoxics PLA 2, called PhTX-I and PhTX-II, from P.
hyoprora snake venom, determined their primary sequences and characterized their
pharmacological and biochemical activities. Both were purified in a single chromatographic
xi
step (FR-HPLC) and obtained with homogeneous and high purity, which was confirmed by
SDS-PAGE, amino acid analysis and mass spectrometry.
PhTX-I and PhTX-II are constituted of a single chain polipetidica and have molecular
mass of 14.249 and 14.149 Da, respectively. The amino acid sequence was determined by
ESI-MS/MS mass spectrometry; both belong to the family of PLA 2 D49 and show high
identity (44-90%) with other myotoxics PLA2 of snake venoms. The CD spectrum indicates
that the predominant secondary structure of these enzymes consists of -helix. Amino acid
sequences which are part of some common structural domains between the PLA 2, were
conserved by PhTX-I and II, including the catalytic system, the calcium-binding loop and the
interfacial recognition site. This feature was reflected in its high catalytic activity.
Maximum enzyme activity was achieved at pH 8 and between 35-45 oC. Both enzymes
appear to be completely dependent on Ca2+, since in the presence of other cations (Mg2+, Mn2+,
Cd2+ and Zn2+), reduced notably the enzymatic activity, suggesting that the arrangement of the
catalytic site presents an exclusive structure for Ca 2+. The almost complete inhibition of
catalytic activity after incubation with EDTA confirmed the requirement of Ca 2+. Crotapotins
of C.d. collilineatus reduced catalytic activity of these enzymes in over 50%.
Ex vivo, whole venom and PhTX-I PLA2 caused blockade of the neuromuscular
transmission in young chick biventer cervicis preparations similar to other isolated snake
venom toxins from Bothrops genus. In vivo, both induced local myotoxicity and systemic
interleukin-6 response upon intramuscular injection, additionally, induced moderate footpad
edema. In vitro, PhTX-I induced low cytotoxicity in skeletal muscle myoblasts, however was
able to lyse myotubes. PhTX-I was also cytotoxic on fibroblast cell line NIH-3T3 and to a
lesser extent on the cell line NG97 derived from human astrocytoma III.
PhTX-II in turn induce the various pharmacological effects exhibited by PhTX-I, such
as neurotoxicity ex vivo, myotoxicity local and edema in vivo and cytotoxicity in vitro on cell
line fibroblasts NIH-3T3. These pharmacological effects induced by purified PhTX-I and II
toxins, were to a greater magnitude than the whole venom, showing the significant
contribution of these toxins on the overall toxicity of venom. However, other components
such as peptides and proteolytic enzymes may also contribute to the toxic properties of this
venom.
In order to understand the structure-function relationships of PhTX-I, were made
modificaoes chemical specific amino acid residues and evaluated the pharmacological
activities of the toxin after modifications. By determining the molecular mass (ESI mass
spectrometry) and amino acid analysis of modified proteins was determined the modification
xii
of one Hys, four Tyr, seven Lys and one Trp residues by BPB, NBSF, AA and NPSC,
respectively. Analysis by circular dichroism demonstrated that secondary structure of protein
remains practically unchanged.
Our results indicate a critical role of Lys and Tyr amino acid at myotoxicity,
neurotoxicity, and especially cytotoxicity induced by PhTX-I. The His residue of the active
site, and therefore, the catalytic activity of PhTX-I is relevant to the edematogenic effects,
neurotoxic and myotoxic, but not for their cytotoxic activity, since this latter effect is
completely independent of the catalytic activity of PhTX-I, demonstrating the existence of
molecular regions, different from the catalytic site, which may be responsible for at least
some of the pharmacological properties of PhTX-I. We observed that apparently the catalytic
activity of the toxin would be potentiating the neurotoxic and myotoxic effects. We conclude
that both the catalytic site and the hypothetical pharmacological site(s) are apparently relevant
for the pharmacological profile of PhTX-I, although a partial dissociation between these
activities has been demonstrated.
1
1. INTRODUO.
Envenenamento por mordedura de serpente um problema de sade pblica de grande
importncia em muitas regies do mundo, particularmente na frica, sia, Amrica Latina e
Papua Nova Guin. Recentemente a Organizao Mundial da Sade (OMS) tem incorporado
o envenenamento por mordedura de serpente em sua lista de doenas negligenciadas
(Gutirrez et al., 2010).
A estimativa global de acidentes ofdicos de 5,5 milhes de casos por ano, o que
resulta em aproximadamente 400,000 amputaes e entre 20,000 e 125,000 mortes
(Kasturiratne, et al., 2008). Atualmente o nico tratamento especfico nos casos de
envenenamento ocasionados por mordedura de serpente a administrao do soro antiofdico
que, embora tenha reduzido a mortalidade devido neutralizao das toxinas que agem
sistemicamente, muitas vezes ineficiente na reverso dos danos tissulares locais. A eficcia
do soro antiofdico tambm restringida a uma rea geogrfica e biolgica limitadas, devido
ampla diversidade imunoqumica do veneno (Gutirrez et al., 2006).
A fauna ofdica de interesse mdico no Brasil est representada pelos gneros
Bothrops (incluindo Bothriopsis e Porthidium), Crotalus, Lachesis e Micrurus (Cardoso et al.,
2003).
Figura 1 Hiptese sobre o desenvolvimento dos efeitos locais induzidos por venenos botrpicos
(Gutirrez e Lomonte, 2003).
Massa
Grupo Origem molecular Pontes
(kDa) dissulfeto
IA Corais verdadeiros 13-15 7
IB Pncreas humano/porcino 13-15 7
IIA Cascavis, sinovial humano 13-15 7
IIB Vboras Gaboon 13-15 6
IIC Testculo rato/murino 15 8
IID Bao/pncreas humano/murino 14-15 7
IIE tero/corao/crebro humano/murino 14-15 7
IIF Embrio/testculo humano/murino 16-17 6
III Humano/murino/lagartixa/abelha 15-18 8
V Macrfago/pulmo humano/murino 14 6
IX Veneno de aranha (conodipine-M) 14 6
X Leuccito/timo/bao humano 14 8
XII Murino/humano 19 7
XIII Parvovirus <10 0
XIV Bactrias/fungos simbiontes 13-19 2
Tabela 1. Fosfolipases A2 secretrias (sPLA2). Esta tabela tem sido adaptada de Six e Dennis, 2000.
Finalmente est a -hlice 3 (resduos 90 107) que se liga regio ala C-terminal (resduos
108 113), que bastante flexvel. A presena de 7 pontes dissulfeto caracterstica das
PLA2 do grupo IIA (Magro et al., 2009).
-hlice curta
-hlice 1
N-terminal
Ala de
ligao ao
clcio
Ala C-
terminal
Stio
ativo
-hlice 3
-hlice 2
Figura 3: Representao esquemtica da ala de ligao do on clcio. (a) PLA 2 D49 cataliticamente
ativa; o on clcio mostrado com suas sete coordenaes. (b) Regio anloga na PLA 2 K49,
cataliticamente inativa, o tomo N da Lys49 ocupa a posio do on clcio formando duas pontes com
os tomos de oxignio da cadeia principal e uma ponte com uma nica molcula de gua (Ward et.al.,
1998).
Homlogos das PLA2 que ocorrem na natureza onde o resduo Asp49 (D49)
trocado por Lys (K49) (Maraganore et al., 1984; Francis et al., 1991; Ward et al., 1995), Ser
(Krizaj et al., 1991) ou Ala (Liu et al., 1991) no so cataliticamente ativos. A figura 3b
mostra a representao esquemtica do homlogo de PLA2 com Lys49 revelando que o seu
tomo N ocupa a posio do on clcio nas PLA 2 com Asp49 (Holland et al., 1990; Scott et
al., 1992; Arni et al., 1995; Ward et al., 1998).
O stio cataltico das PLA2 compreende os resduos His48, Tyr52, Asp99 e uma
molcula de gua. No mecanismo de catlise proposto (Fig. 4), O tomo N1 do resduo
His48 est estabilizado por uma ligao com o oxignio do resduo Asp99, que por sua vez
est ligada ao oxignio do resduo Tyr52; esta ligao esta totalmente conservada. O tomo
N1 do resduo His48 se comporta como uma base polarizando e retirando um prton da
molcula de gua, estruturalmente conservada, que participa da formao de um intermedirio
tetradrico. A molcula de gua promove o ataque nucleoflico ao carbono do grupo ster do
substrato Subseqentemente hidrlise da ligao acil-ster na posio sn-2 do
9
fosfoglicerdeo (substrato), o prton doado pelo anel imidazlico para o oxignio que forma
ento o grupo lcool do lisofosfolipdeo a ser liberado e trs molculas de gua se deslocam
para dentro do sitio ativo (Verheij et al., 1980).
Figura 4. Representao esquemtica do mecanismo cataltico da PLA 2 (Janssen et. al. 1999).
Resduo de Reagente/reao
aminocido
His p-Bromophenacil bromide (BPB)/alquilao
Metil-p-nitrobenzenosulfonato/metilao
Lys Cianeto de potssio/carbamilao
14
o-Metilisoureia/guanidinao
Acido actico anidro/acetilao
Trinitrobenzenosulfonato (TNBS)/trinitrofenilao
Tyr Nitrobenzeno sulfonil fluoride (NBSF)/sulfonao
Trp Nitrofenil sulfonil cloride (NPSC)/sulfonao
2-Hidroxi-5-nitrobenzil bromide/alquilao
Met Cloramina T/oxidao
Acido iodoactico/carboximetilao
2. OBJETIVOS.
2.1 Objetivo geral.
O objetivo geral deste projeto foi purificar, caracterizar bioqumica e
farmacologicamente as PLA2 PhTX-I e PhTX-II apartir do veneno de P. hyoprora. Entender
16
3. MATERIAIS E MTODOS.
3.1 Veneno e reagentes.
O veneno foi gentilmente cedido pela professora Corina Vera Gonzles, do Instituto de
Biomedicina y Biotecnologia de Arequipa Per. Todos os solventes, produtos qumicos e
17
reagentes utilizados so de grau HPLC, grau seqncia ou de alto grau de pureza, obtidos da
Sigma, Aldrich Chemicals, Merk e Bio Rad.
3.2 Animais.
Para os ensaios biolgicos, foram utilizados camundongos machos Swiss (18 a 20g) e
pintainhos HY-Line W36 de 4 a 8 dias, obtidos do Biotrio Central da Unicamp, mantidos a
24-28oC com alimentos e gua ad libitum. Todos os ensaios biolgicos foram feitos com
autorizao da Comisso de tica para a Experimentao Animal (CEEA-IB-UNICAMP
protocolo no 1860-1).
Os gis foram corados com soluo de Coomassie Blue 0,05% a 37C, o excesso de corante
removido em cido actico 7%.
adquirido um espectro ESI/MS (modo TOF MS) para cada pico obtido do HPLC de fase
reversa na faixa de 4002000 m/z para selecionar os ons de interesse. Posteriormente esses
ons foram fragmentados em uma clula de coliso (modo TOF MS/MS). Diferentes energias
de coliso foram utilizadas dependendo do estado de carga e massa dos ons. Os espectros
resultantes foram adquiridos no analisador TOF e resolvidos usando o software MassLynx-
MaxEnt 3 algorithm. Espectros com uma carga s foram processados manualmente usando o
aplicativo PepSeq includo no MassLynnx.
Para a contratura foi aplicada exogenamente Acetilcolina (ACh; 110 M por 60s) e
KCl (20 mM por 130s), foi obtido na ausncia da estimulao de campo, antes da adio das
toxinas PLA2 nas concentrao finais de 0,7 e 1,4M e do veneno total (20g/ml).
Um eletrodo bipolar de anel de platino foi colocado ao redor do tendo o qual recorre
o msculo inervado. Estimulao indireta realizada com um Estimulador (MAIN BOX LE
12404 Panlab s.l. Powerlab AD Instruments Barcelona, Spain) sob as seguintes condies: 0.1
Hz, 0.2 ms, 3-4 V.
Contraes musculares e contraturas foram registradas isometricamente por
trasductores de fora (Modelo MLT0201 Force transducer 5mg-25g Panlab s.l. AD
Instruments Pty Ltd. Spain) ligado a um PowerLab/4SP (OUAD Bridge AD Instruments,
Barcelona, Spain) Ponce-Soto et al., (2007).
A atividade citotxica tambm foi avaliada nas linhagens celulares NG97 e NCIH-
3T3, as quais foram mantidas em frascos plsticos (25cm2) com meio RPMI 1640 (Cultilab,
Campinas, SP, Brazil), suplementado com L-glutamina 2%, garamicina 120 g/mL e soro
fetal bovino inativado 13% (meio completo). As culturas foram incubadas a 37 oC numa
atmsfera contendo 5% de CO2. O meio foi trocado a cada 48 h e quando a cultura atingiu
confluncia, a subcultura foi realizada por tratamento com tripsina e versene (Adolfo Lutz,
So Paulo, SP, Brazil). Quantidades variveis das toxinas PLA 2 ou seus derivados
modificados quimicamente foram diludos no meio de ensaio e adicionados s clulas em
placas de 96 poos. Os experimentos foram realizados em triplicata.
A viabilidade celular foi avaliada pelo mtodo do vermelho neutro, realizados segundo
a metodologia descrita por Borenfreund e Borrero (1984). Aps uma incubao de 4 h com
meio isento de soro contendo 50 g de vermelho neutro/ml, as clulas foram lavadas
rapidamente com PBS e em seguida 0,1 ml de uma soluo de cido actico 1% (v/v):etanol
50% (v/v), foi adicionado a cada poo para extrair o corante. Aps agitao durante 10
minutos em um agitador de placa de microtitulao a absorvncia foi lida a 540 nm. A
viabilidade celular foi determinada em comparao com a DO obtida a partir de clulas no
tratadas.
4. RESULTADOS.
4.1 Purificao e caracterizao bioqumica das PLA2 PhTX-I e PhTX-II.
4.1.1 Purificao das fraes PhTX-I e PhTX-II a partir do veneno total de P. hyoprora.
O veneno total foi submetido a uma etapa cromatogrfica em HPLC de fase reversa, a
corrida foi realizada em uma coluna analtica -Bondapak C18 (3,9 x 300 mm Waters),
acoplada a um sistema de HPLC de fase reversa, possibilitando o monitoramento do perfil de
28
Figura 6. Perfil cromatogrfico do veneno total de P. hyoprora em HPLC de fase reversa usando uma
coluna -Bondapak C18 (3,9 x 300 mm, Waters). A eluio das amostras foi realizada usando-se uma
gradiente linear contnua (0-100%) de concentrao do tampo B. O fluxo foi mantido constante a
1ml/min e monitorado a 280 nm. Fraes PhTX-I (*) e PhTX-II (**) indicadas pelas reas
sombreadas.
4.1.2 Determinao do grau de pureza, recuperao e atividade especfica das PLA 2
PhTX-I e PhTX-II.
aos 35,5 1,1 minutos, em concentrao de 53,5 0,3% de tampo B (Fig 7A), por outro
lado a frao PhTX-II foi eluda aos 36,8 0,8 minutos e em concentrao do tampo B de
55,3 0,2% (Fig. 7B).
Figura 7. Re-cromatografia das fraes PhTX-I (A) e PhTX-II (B) em HPLC de fase reversa usando
uma coluna -Bondapak C18 (3,9 x 300 mm, Waters). A eluio foi realizada usando-se uma gradiente
linear contnua (0-100%) de concentrao do tampo B. O fluxo foi mantido constante a 1ml/min e
monitorado a 280 nm.
As fraes PhTX-I e II foram purificada 1361,7 e 679,1 vezes, com rendimento de
13,39 e 4,08%, respectivamente, em relao ao veneno total. A Tabela 3 exibe um resumo das
etapas do processo de purificao, assim como o clculo da atividade especfica e a
recuperao.
Tabela 3 Tabela de recuperao e clculo de atividade especfica das fraes PhTX-I e II isoladas a
partir do veneno de P. hyoprora.
A figura 8 mostra os perfis de massa molecular em SDS PAGE, das fraes PhTX-I e
II em condies nativas e reduzidas com DTT. Nas duas condies, tanto a PhTX-I (pistas 2 e
3) como a PhTX-II (pistas 4 e 5) mostram a presena de uma nica banda eletrofortica com
massa molecular relativa em torno de ~15 kDa em relao aos marcadores de massa
molecular (pista 1), alm de confirmar o alto grau de homogeneidade das fraes proteicas.
Figura 8. Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%) SDS-PAGE, corado com comassie blue. Pista
1: marcadores de massa molecular (Mm); Pista 2: PhTX-I nativa; Pista 3: PhTX-I(r) reduzida com
DTT; Pista 4: PhTX-II nativa; Pista 5: PhTX-II(r) reduzida com DTT.
PhTX-I PhTX-II
AA % Massa Nmero % Massa Nmero
Asp 8,99 1266,21 11 9.09 1266,21 11
Glu 8,25 1162,17 9 9.09 1420.43 11
31
Figura 9. Determinao da massa molecular das PLA2 PhTX-I (A) e PhTX-II (B) por
espectrometria de massas MALDI-TOF. Os ons moleculares MH+, MH2++ e 2MH+ so mostrados no
espectro. Inserto na figura A: espectro de massa MALDI-TOF da PLA 2 PhTX-I reduzida e alquilada
mostrando os mltiplos canais de alquilao.
A PLA2 PhTX-I foi digerida com tripsina bovina e os peptdeos trpticos resultantes
foram separados em HPLC de fase reversa. Foram obtidos 18 picos (dados no mostrados),
cada pico foi coletado manualmente e liofilizado. O sequenciamento de novo de cada
peptdeo foi feito por espectrometria de massas em tndem ESI-Q-TOF/MS/MS. Os dados
obtidos foram processados usando o software Mascot MS/MS Ion Search (www.
matrixscience.com). A tabela 5 mostra as massas medidas e a sequencia deduzida de cada um
dos peptdeos obtidos a partir da clivagem trptica da PLA2 PhTX-I.
33
Tabela 5. Massas moleculares e sequencias de aminocidos obtidas por espectrometria de massas ESI-
MS/MS dos peptideos trpticos de PhTX-I. Os peptdeos foram separados por HPLC de fase reversa.
C = cisteina alquilada, Os resduos de lisina mostrados em negrito foram deduzidos da clivagem pela
tripsina. Todas as massas moleculares so reportadas como monoisotpicas.
Figura 10. Espectro ESI-QTOF-MS/MS do peptdeo trptico de 1312.38 Da. Series de ons y do
peptdeo (contendo 9 resduos de aminocidos) eluido no pico 8 do HPLC de fase reversa da PhTX-I
alquilada e contendo um resduo de acido asprtico que corresponde posio 49 na sequencia
completa de aminocidos.
Figura 11. Alinhamento da sequencia de aminocidos deduzida da PLA 2 PhTX-I com outras PLA2
D49 da famlia Viperidae. BbTX-III (Brazilitoxin III) de B. brazili (Huancahuire-Vega et al., 2009);
6_1 e 6_2 de B. jararacussu (Ponce-Soto et al., 2006); BmTX-I de B. moojeni (Calgarotto et al.,
2008); BmjeTX-I e BmjeTX-II de B. marajoensis (Ponce-Soto et al., 2010); LmTX-I de L. m. muta
(Damico et al., 2005).
A protena PhTX-II tambm foi digerida com tripsina bovina e os peptdeos trpticos
resultantes foram sequenciados por espectrometria de massas em tndem ESI-Q-
TOF/MS/MS. A tabela 6 mostra a massa observada dos peptidios trpticos, a massa esperada e
a massa calculada, assim como a sequencia de aminocidos de cada peptidio obtido de PhTX-
II e sua posio na sequencia primria da protena.
Os espectros de massa contendo a serie de ons y do terceiro e quarto peptdeos, e as
sequencias de aminocidos nas posies 16 - 33 e 43 - 53, respectivamente, so mostrados na
figura 12. O quarto peptidio (Fig. 12A) tem a sequencia C C F V H D C C Y G K mostrando
um resduo de Asp na posio 49 da estrutura primria da protena, sugerindo que esta
protena tambm pertence famlia das PLA2 D49, cataliticamente ativas.
Tabela 6. Sequencia de aminocidos dos peptidios obtidos por hidrlise trptica a partir da PLA 2
PhTX-II. aMet foi modificada por oxidao.
36
Figura 13. Alinhamento da sequencia de aminocidos deduzida da PLA 2 PhTX-II com outras PLA2
D49 da famlia Viperidae: Mojave toxin de C. s. scutulatus (Aird et al., 1990); LmTX-I de L. muta
muta (Damico et al., 2005); Piratoxina III de B. pirajai (Rigden et al., 2003); PhTX-I de P. hyoprora
(Huancahuire-Vega et al., 2011); BmTX-I de B. moojeni (Calgarotto et al., 2008); BbTX-III de B.
brazili (Huancahuire-Vega et al., 2009).
Figura 14. Espectros de CD no UV-distante das PLA 2 PhTX-I e PhTX-II. Medidas de CD realizadas a
25C, em tampo fosfato de sdio 10 mM, pH 8.
Figura 15. (A) Atividade enzimtica PLA2 do veneno total de P. hyoprora (VT), e das PLA2 PhTX-I e
PhTX-II, (B) Efeito da concentrao do substrato. Inserto: detalhes em baixas concentraes, (C)
Efeito do pH, (D) Efeito da temperatura, (E e F) Efeito dos ons sobre PhTX-I e PhTX-II. Os
experimentos foram realizados em triplicata e as barras representam o desvio padro (p<0.05).
4.2 Caracterizao farmacolgica das PLA2 PhTX-I e PhTX-II.
4.2.1 Determinao da atividade neurotxica ex vivo do veneno total e das PLA2 PhTX-
I e PhTX-II.
Para este experimento foram testadas, na preparao neuromuscular biventer cervicis
de pintainho, doses de 20g/ml do veneno total de P. hyoprora e concentraes finais de 0,7 e
1,4 M das PLA2 PhTX-I e II. As toxinas produziram bloqueio neuromuscular irreversvel
sob estmulo eltrico indireto, em todas as concentraes testadas, a 37C (Fig. 16). O tempo
necessrio para obter um bloqueio de 50% da resposta contrtil do msculo na dose de 20
g/ml do veneno total foi de 81 5,4 min. As PLA2 PhTX-I e II precisaram de 28 3,9 e 20
3,1 min para 0,7M e 19 2,7 e 18 2,8min para 1,4M, respectivamente.
Neste modelo de preparao muscular as PLA 2 PhTX-I e II se mostram como potentes
bloqueadores da transmisso nervosa na juno neuromuscular, o bloqueio foi irreversvel na
pslavagem em todas as concentraes tal como se mostra no registro miogrfico da figura
40
Figura 17. Registros miogrficos da resposta muscular na preparao de biventer cervicis de pintainho
em presena do controle (A), veneno total 20ug/ml (B), PLA 2 PhTX-I 1,4M (C) e PLA 2 PhTX-II
1,4M (D). A contratura em resposta acetilcolina (ACh 110M; ) e ao KCl (20mM; ) foi obtida
antes e depois da adio da toxina.
As respostas ACh exgena (110 M) e ao KCl (20 mM) foram obtidas antes e aps a
adio das toxinas. Aps 120 min de incubao o veneno (20g/ml) alterou
significativamente as contraturas induzidas pela ACh (110 M) e pelo KCl (20mM), da
mesma forma que as PLA2 PhTX-I e II na concentrao de 1,4M, por outro lado, em
concentraes menores (0,7 M ) ambas PLA2 no tiveram diferena significativa em relao
com o controle (Fig. 18).
Figura 19. Representao grfica da atividade miotxica local do veneno total e das toxinas PhTX-I e
PhTX-II de P. hyoprora inoculados em camundongo. Mostra-se os valores de de creatino quinase (CK)
plasmtico, incrementados ao longo do tempo, aps a administrao intramuscular do veneno e das
toxinas PhTX-I e PhTX-II (20g) (n=5).
4.2.3 Atividade miotxica sistmica in vivo do veneno total e das PLA 2 PhTX-I e PhTX-
II.
In vivo, o veneno total e as PLA2 PhTX-I e PhTX-II de P. hyoprora inoculados por via
intravenosa no induziram efeito miotxico sistmico, j que os nveis de CK plasmtico ao
longo do tempo no tiveram incremento significativo em relao ao controle, que recebeu
PBS (Fig. 20), o mximo valor atingido foi 290U/L de CK pela PhTX-I 3 hors aps a
inoculao da toxina. Por outro lado, na miotoxicidade local, as toxinas induziram elevao
dos nveis de CK acima de 1000U/L.
Figura 20. Representao grfica da atividade miotxica sistmica do veneno e das toxinas PhTX-I e
PhTX-II (5 g) de P. hyoprora inoculados em camundongo. Mostram-se os valores de de CK
plasmtico ao longo do tempo, aps administrao intravenosa (n=5).
43
Figura 21. Atividade edematognica do veneno total e das PLA 2 PhTX-I e PhTX-II de P. hyoprora em
camundongos (18-20g). Cada ponto representa a mdia o desvio-padro de 5 animais.
4.2.5 Determinao dos nveis de interleucina 6 (IL-6) aps injeo intramuscular do
veneno total e PhTX-I.
10g de veneno total e da PLA2 PhTX-I foram injetados no musculo tibial anterior
direito de camundongos e a concentrao de IL-6 no plasma foram medidos. Tanto o veneno
total assim como a PhTX-I causaram incremento significativo nos nveis plasmticos de IL-6,
quando comparadas ao controle, atingindo o incremento mximo 3 horas aps a aplicao
(71,2 5,4pg/ml e 96,4 4,9pg/ml para o veneno total e a PhTX-I respectivamente). Seis
horas aps a injeo a concentrao de IL-6 diminui, alcanando os nveis plasmticos
normais aps 9 horas (Fig. 22).
44
Figura 22. Nveis de concentrao de Interleucina (IL-6) plasmtica induzida por 10g de veneno
total de P. hyoprora e da PLA2 PhTX-I em camundongos. Concentrao de IL-6 plasmtica foi
determinada em diferentes horas aps aplicao das toxinas.
Figura 23. Atividade citotxica in vitro do veneno total de P. hyoprora e PLA2 PhTX-I sobre cultura
celular de mioblastos (A) e miotubos (B). Lise celular foi estimada pela liberao de desidrogenasse
lctica (LDH) no sobrenadante aps 3 horas de exposio toxina em um volume de 150 L/poo.
4.2.7 Atividade citotxica das PLA2 PhTX-I e PhTX-II sobre clulas NIH-3T3 e NG97.
45
Figura 24. Atividade citotxica in vitro das PLA2 PhTX-I e PhTX-II sobre cultura celular de
fibroblastos NCIH-3T3 (A) e astrocitoma humano NG97 (B). A lise celular foi estimada pelo teste de
vermelho neutro. A viabilidade celular foi determinada comparando a DO apartir das clulas controle
(no tratadas). Os ensaios foram feitos em triplicata. *(p<0.05).
4.3 Modificaes qumicas na miotoxina PLA2 PhTX-I.
Uma estratgia utilizada para elucidar a relao entre atividade cataltica e efeitos
farmacolgicos das PLA2 baseia-se na modificao qumica de resduos especficos nestas
enzimas (Soares e Giglio, 2003). A continuao descrevemos as modificaes qumicas na
PhTX-I nos resduos de aminocidos His, Tyr, Trp, Lys e os efeitos de tais modificaes sobre
as suas propriedades enzimticas, farmacolgicas e estruturais.
Figura 25. Eletroforese em gel de poliacrilamida (12,5%). SDS-PAGE, corado com comassie blue.
Pista 1: marcadores de massa molecular (Mm), Pista 2: PhTX-I nativa; Pista 3: PhTX-I + AA, Pista 4:
PhTX-I + NPSC, Pista 5: PhTX-I + NBSF, Pista 6: PhTX-I + BPB. Todas as amostras foram reduzidas
com DTT.
Figura 26. Espectros de massa crus e deconvoluco dos espectros (insertos) da PLA 2 PhTX-I
modificada com BPB (A), AA (B), NPSC (C) e NBSF (D) por espectrometria de massas Electrospray
(ESI)
Trp 3 ND ND ND ND
Figura 27. Espectros de CD no UV-distante. PhTX-I nativa e as formas modificadas (AA, BPB,
NBSF e NPSC). Medidas de CD realizadas a 25C, em tampo fosfato de sdio 10 mM, pH 8.
Figura 28. Atividade PLA2 proveniente da PhTX-I nativa e das formas modificadas (BPB, AA, NBSF,
NPSC), e efeito inibitrio de Heparina (Hep), EDTA, crotapotinas de C. d. collilinetaus (F2 e F3)
sobre a atividade PLA2 da PhTX-I (n=3) *(p<0.05).
Figura 30. Registros miogrficos da resposta muscular na preparao de biventer cervicis de pintainho
em presena de PhTX-I e as suas formas modificadas. a) controle, b) PhTX-I 1,4 M, c) NPSC
1.4M, d) AA 1.4M, e) BPB 1.4M, f) NBSF 1.4M. A contratura em resposta acetilcolina
(ACh 110M; ) e ao KCl (20mM; ) foi obtida antes e depois da adio das protenas.
4.3.7 Atividade miotxica local in vivo.
Os estudos realizados para determinar o efeito miotxico local das formas modificadas
da PhTX-I in vivo foram feitos em camundongos, inoculando as protenas por via
intramuscular. Resultados anteriores mostraram que PhTX-I nativa incrementa os nveis de
CK plasmticos drasticamente nas primeiras 3 a 6 horas do tratamento, atingindo at nveis de
1423.37 52.89 U/L de CK, para posteriormente voltar a nveis normais, aps 9 horas
(Fig.19). A figura 31 mostra o efeito miotxico induzido pela PhTX-I nativa e as formas
modificadas. Comparando os nveis de CK 3 horas aps iniciado o tratamento, a
miotoxicidade local induzida por PhTX-I foi reduzida em 85% por tratamento com anhidrido
actico (acetilao de Lys), 80% por alquilao com BPB, 72% aps modificao de Tyr
(NBSF) e 20% aps modificao de Trp (NPSC).
Foi investigado tambm o efeito de inibidores sobre a atividade miotxica de PhTX-I.
Os resultados evidenciam que a heparina inibe o efeito miotxico da PhTX-I em 47%, j que
o mximo nvel de CK liberado de 725.94 137.25 U/L s 3 horas de exposio toxina em
52
comparao a PhTX-I nativa. O EDTA tem maior efeito inibitrio da atividade miotxica da
PhTX-I, reduzindo em 74% esta atividade 3 horas aps a aplicao da toxina.
Figura 31. Representao grfica da atividade miotxica local da PhTX-I nativa e das suas formas
modificadas (AA, NBSF, BPB e NPSC) e incubadas com Heparina (Hep) e EDTA. Mostra-se os nveis
de creatino quinase (CK), incrementados aps 3 horas da administrao intramuscular das protenas
(20 g), (n=5).
Figura 32 Atividade edematognica da PLA2 PhTX-I, das formas modificadas com NPSC, NBSF, AA
BPB e da inibio com Heparina (Hep) e EDTA em camundongos (18-20g). A medida foi feita 1 hora
aps aplicao das toxinas. Cada ponto representa a mdia o desvio-padro de um grupo de 5
animais.
4.3.9 Determinao da atividade citotxica.
Foi avaliada a atividade citotxica da PhTX-I nativa e as formas modificadas
quimicamente sobre as linhagens celulares NG97 e NCIH-3T3. Foram utilizadas vrias
concentraes da PhTX-I e 200 ou 300g das formas modificadas. A viabilidade celular foi
avaliada pelo mtodo do vermelho neutro, comparando as absorvncias dos tratamentos com
as do controle (clulas no tratadas).
PhTX-I nativa foi citotxica, de maneira dose-dependente, para a linhagem celular de
fibroblastos NIH-3T3 e em menor grau para a linhagem NG97 derivada de astrocitoma
humano grado III (Figs. 33A e B respectivamente). A atividade citotxica da PhTX-I foi
independente da atividade enzimtica devido a que PhTX-I alquilada com BPB (desprovida
de atividade cataltica) induz o efeito citotxico em ambos os tipos celulares. O tratamento
com NPSC no alterou significativamente a atividade citotxica da PhTX-I. Por outro lado,
acetilao e sulfonao dos resduos de Lys e Tyr (PhTX-I tratadas com AA e NBSF,
respectivamente), reduz fortemente a atividade citotxica da PhTX-I em ambos os tipos
celulares.
54
Figura 33. Atividade citotxica in vitro da PhTX-I nativa e seus derivados modificados quimicamente
com BPB, AA, NBSF, NPSC sobre cultura celular de fibroblastos NCIH-3T3 (A) e cultura celular
NG97 de astrocitoma humano (B). A lise celular foi estimada pelo teste de vermelho neutro. A
viabilidade celular foi determinada comparando a DO apartir das clulas controle (no tratadas),
consideradas como 100% viavis. Os ensaios foram feitos em triplicata. *(p<0.05).
5. DISCUSSO.
5.1 Purificao e caracterizao bioqumica das PLA2 PhTX-I e PhTX-II.
No estado da Amazonia (Brasil) os envenenamentos por picada de serpentes ocorrem
por pelo menos sete serpentes da famlia Viperidae: Bothriopsis bilineata, Bothriopsis
taeniata, Bothrops atrox, Bothrops brazili, Crotalus durissus, Lachesis muta muta e
Porthidium hyoprora (Campos et al., 1999; Otero et al., 2002; Campbell et al., 2004).
Numerosas PLA2 tm sido identificadas e caracterizadas apartir desses venenos (Gutirrez et
al., 1995; Damico et al., 2005; Porto et al., 2007; Huancahuire-Vega et al., 2009; Pereaez et
al., 2009), entretanto, informao respeito a atividades txicas de PLA2 apartir do veneno de
P. hyoprora ainda escassa.
De acordo com ngulo e Lomonte (2009) o isolamento e caracterizao de
componentes individuais do veneno constitui o suporte da Toxinologia, como uma estratgia
fundamental para analisar e entender a srie complexa de eventos envolvidos no
envenenamento.
PLA2 so protenas pequenas, amplamente espalhadas na natureza. Sabe-se que o
veneno de serpentes uma fonte rica de PLA2 e estas enzimas exibem atividades txicas e/ou
55
(408333U/mg), ao redor de 1361 vezes mais do que o veneno total (tabela 3), o rendimento
neste processo foi de 13%. PhTX-II uma frao menor, foi purificada 679 vezes com um
rendimento de 4%. Estes valores so maiores do que o obtido por Fuly et al, (2000) (atividade
especfica 1428U/mg, rendimento 1,42%), que purificaram a PLA 2 denominada LM-PLA2-II
em duas etapas (filtrao gel e HPLC-FR), a partir do veneno de Lachesis muta. Esses dados
confirmam a eficincia de utilizar uma etapa de purificao resultando em um melhor
rendimento, alm disso, confirma-se o alto grau de pureza da protena, proporcionando um
grande aumento na atividade especfica em funo da reduo na concentrao de protena,
assim como preservao da seletividade, da capacidade de resoluo e da atividade biolgica.
Vrias PLA2 isoladas a partir de venenos botrpicos so oligmeros contituidos por
duas ou mais subunidades (Magro et al., 2009), entretanto, o perfil eletrofortico em SDS-
PAGE (Fig. 8), revela que a tanto a PhTX-I como a PhTX-II em condies reduzidas e no
reduzidas apresentam uma nica banda eletrofortica com massa molecular relativa em torno
de ~15 kDa, sendo portanto constitudas de uma nica cadeia polipeptdica. Brazilitoxina III
de B. brazili (Huancahuire-Vega et al., 2009), blD-PLA2 de B. leucurus (Higuchi et al., 2007)
e LmTX-I de L. muta muta (Damico et al., 2005) so algumas das PLA2 de veneno de
serpente que tambm possuem estrutura monomrica.
A anlise da composio global de aminocidos das PLA2 PhTX-I e II mostra que as
protenas possuem carter bsico, apresentando um alto contedo de aminocidos tanto de
carter bsico quanto hidrofbico (tabela 4). A presena de 14 Cys sugere a presena de 7
pontes dissulfeto, caracterstica que contribui para a elevada estabilidade da estrutura terciria
das protenas, concordando com descries reportadas para miotoxinas PLA 2 isoladas de
venenos viperideos (Ponce-Soto et al, 2007; Randazzo-Moura et al., 2008; Calgarotto et al.,
2008; Romero-Vargas et al., 2010).
A massa molecular exata de PhTX-I e PhTX-II obtida por espectrometria de massas
Maldi-tof foi de 14249.22 e 14149,08Da, respectivamente (Fig. 9), mostrando que no existe
diferena significativa com os valores de massa molecular relativa (em torno de 15 KDa)
determinada por eletroforese em SDS-PAGE e a massa molecular calculada (14088.57 e
13511.07 Da) obtidas atravs da anlise de composio de aminocidos, confirmando o alto
grau de pureza e homogeneidade das protenas. Os valores de massa molecular das PLA2
PhTX-I e II so similares a outras PLA2 miotxicas isoladas de veneno de serpente (Ponce-
Soto et al., 2007, 2010; Perumal et al., 2008; Garcia et al., 2010).
Maldi (matrix-assisted laser desorption/ionization desoro e ionizao por laser
assistida por matriz) um mtodo de ionizao suave que durante o processo de desoro e
57
1994). Zn2+ conhecido como um forte inibidor de enzimas PLA2, mas a sua atividade
inibitria baseia-se no modelo em que a enzima ativada por dois ons Ca 2+, um essencial e
pode ser deslocado por Ba2+, o outro modula a atividade e pode ser deslocado por Zn 2+
(Mezna et al., 1994).
Os estudos cinticos das PLA2 PhTX-I e PhTX-II esto de acordo com as
caractersticas das PLA2 de veneno de serpente que incluem alta estabilidade, devido grande
quantidade de pontes dissulfeto intracadeia e a necessidade de Ca 2+ como cofator para
manuteno da atividade enzimtica.
ocasionados por proteases presentes no veneno assim como dano s fibras musculares (Prianti
et al., 2003) como acontece com o veneno de Bothrops neuwiedi pauloensis (Rodrigues-
Simioni et al., 2004). Por outro lado o bloqueio neuromuscular produzido pelas PLA 2 PhTX-I
e PhTX-II na concentrao de 0,7M no afetou a resposta ao potssio (KCl) e a acetilcolina
(ACh) (Fig. 19), indicando que a toxina em baixas concentraes no tem ao sobre os
receptores ps-sinpticos colinrgicos e nem causou dano muscular que impedisse a
contratura em resposta ao KCl. Neurotoxinas com atividade pr-sinapticamente so capazes
de abolir a resposta contrtil sem afetar a resposta aos agonistas colinrgicos (Harvey et al.,
1994).
Entretanto concentraes maiores das PLA2 (1,4) aumentaram a linha de base no
registro miogrfico (Figs. 17C e D), com indicio de contratura muscular leve, assim como
inibio em resposta ao KCl e ACh (Fig. 19), sugerindo danos ocasionados na membrana
muscular e nos receptores nicotnicos da membrana subsinptica (Harvey et al., 1994). O fato
das PLA2 PhTX-I e PhTX-II no afetarem significantemente a resposta da ACh e KCl, a no
ser em altas concentraes, sugere sua ao pr-sinptica primordial. Resultados similares
foram encontrados para as PLA2 BmTX-I, BmjeTX-I e II, isoladas de venenos Viperidios
(Calgarotto et al., 2008, Ponce-Soto et al., 2010).
importante apontar uma clara diferena entre o efeito bloqueador neuromuscular ex
vivo de toxinas capazes de bloquear a transmisso neuromuscular em preparaes isoladas,
mas que no exercem neurotoxicidade in vivo como as PLA2 Lys 49 homlogas, e o efeito
neurotxico daquelas toxinas que exercem ao neurotxica in vivo como as tpicas
neurotoxinas pr e ps-sinpticas de serpentes Elapidios. Esta afirmao foi recentemente
remarcada direcionada principalmente s PLA2 K49 homlogas (Lomonte, 2003; Gallacci e
Cavalcante, 2010), mas que pode ser estendida tambm s PLA 2 D49 de veneno de serpentes
da famlia Viperidae, devido a que o envenenamento por estas serpentes no apresenta sinais
de neurotoxicidade ou so clinicamente irrelevantes.
O veneno de serpentes da famlia Viperidae (que inclui gneros Bothrops, Lachesis,
Porthidium, etc), induz predominantemente mionocrose local em animais de experimentao
(Gutirrez e Ownby, 2003), e necrose do tecido muscular ao redor do local da picada, de
acordo com observaes clnicas (Warrell, 2005). Esta mionecrose causada principalmente
pelas PLA2. Alm da mionocrose, as PLA 2 encontram-se consideradas entre os principais
mediadores da desgranulao de mastcitos, edema e inflamao (Texeira et al, 2003) e
miotoxicidade em mioblastos e miotubos (Angulo e Lomonte, 2005).
65
camundongo. Os resultados demonstram que tanto o veneno como as PLA2 PhTX-I e PhTX-II
induzem edema pronunciado em pata de camundongo (Fig. 21). Esta atividade foi tempo-
dependente e atingiu a resposta mxima nos primeiros 30 minutos.
A formao de edema induzido pelo veneno de P. hyoprora de comportamento
similar a outros venenos Viperidios incluindo B. asper (Chaves et al., 2006), B. insularis
(Barbosa et al., 2003), B. moojeni (Calgarotto et al., 2008) e Lachesis muta muta (Ferreira et
al., 2009). As PLA2 PhTX-I e II induziram edema em pata de camundongo na mesma
magnitude que o veneno total, provavelmente pelo menos parte das aes inflamatrias do
veneno total so devidas a estas miotoxinas. Porem, outros componentes do veneno tais como
serinoproteases, metaloproteases ou lectinas podem contribuir tambm para as propriedades
edematognicas do veneno total.
Sabe-se que as PLA2 possuem um papel importante nos processos inflamatrios
devido a que fornecem precursores para substancias lipdicas pro-inflamatrias como
mediadores derivados do cido araquidnico e fatores ativadores de plaquetas (Teixeira et al.,
2003), mas, os mecanismos pelos quais os venenos induzem edema no esto claros, o que
torna necessrios mais estudos para investigar com detalhes se as PLA 2 induzem edema por
produtos da via lipoxigenase ou atravs de produtos da via cicloxigenase.
Mionecrose pode ser o impulso para desencadear a atividade proinflamatoria e a
liberao sistmica da interleucina-6 (IL-6), de acordo com observaes apresentadas pela
miotoxina II (PLA2 K49) do veneno de B. asper (Nuez et al., 2004) e BmTX-I de B. moojeni
(Calgarotto et al., 2008). IL-6 a primeira citocina multifuncional envolvida na regulao da
resposta imune, hematopoese, e inflamao (Akira et al., 1990) e nveis incrementados tm
sido documentados em envenenamentos clnicos por espcies botrpicas (Barraviera et al.,
1995; Avila-Aguero et al., 2001). Foram dosados os nves de IL-6 plasmticos aps injeo
intramuscular do veneno total de P. hyoprora e da miotoxina PhTX-I. Os resultados mostram
que a PLA2 PhTX-I induz elevao sistmica dos nveis de IL-6 em camundongos, na mesma
magnitude que o veneno total (Fig. 22).
Os tecidos lesados pelas miotoxinas PLA2 que exercem ao local so rapidamente
infiltrados por leuccitos. Como em outros processos agudos, no envenenamento em modelos
animais em que se usaram venenos botrpicos, as primeiras clulas do infiltrado inflamatrio
a extravasar so os neutrfilos polimorfonucleares, sendo gradualmente substitudos pelo
aparecimento de clulas mononucleares, moncitos e linfcitos (Farsky et al., 1997). As
clulas do infiltrado so uma fonte importante de mediadores como as citocinas, produzidas
no somente pelos leuccitos do infiltrado, mas tambm pelas clulas residentes nos tecidos
68
lesados. Uma rpida induo de IL-6, detectvel sistemicamente desde a primeira hora foi
observado ao injetar-se uma miotoxina PLA 2 purificada do veneno de B. moojeni em
camundongos, sugerindo que a produo desta citocina dependente do dano tissular, dando
inicio a uma resposta da fase aguda (Calgarotto et al., 2008). Elevao dos nveis sricos de
IL-1, IL-8, interferon-gama (IFN-), fator de necrose tumoral alfa (TNF-) e xido ntrico
(NO) foram observados aps injeo intraperitoneal de veneno de B. asper, B. jararaca, B.
atrox em camundongos (Barros et al., 1998; Petricevich et al., 2000). O papel desempenhado
por estes mediadores na patognese do envenenamento no foi ainda estabelecido.
Em pacientes picados por Bothrops sp. e C. d. terrificus tem sido documentados
elevao de IL-6 srica (Avila-Aguero et al., 2001), esses achados abrem a possibilidade de
interferir na leso tissular local e nos efeitos sistmicos dos venenos, mediante no s a
tradicional soroneutralizao, mas tambm, pela modulao de alguns mediadores
inflamatrios.
Estudos usando uma variedade de linhagens celulares em cultura tem demonstrado que
as PLA2 do grupo II exercem ampla atividade citoltica a qual se correlaciona com sua
atividade miotxica in vivo (Lomonte et al., 1999). O uso de cultura de mioblastos e miotubos
como alvos para as PLA2 do grupo II tem sido proposto como um modelo in vitro til para
estudar os mecanismos miotxicos, assim como sua correlao com a atividade de leso
muscular observada in vivo (Angulo e Lomonte, 2005). Este estudo investigou se a fuso e
diferenciao de mioblastos C2C12 os torna mais susceptveis ao citoltica da miotoxina
PhTX-I do veneno de P. hyoprora.
A miotoxina PhTX-I assim como o veneno total no evidenciaram efeito citoltico em
clulas mioblastos de msculo esqueltico em doses baixas (5 10g/poo) (Fig. 23A).
Entretanto uma maior susceptibilidade de miotubos foi claramente observada usando a
miotoxina PhTX-I com doses a partir de 5g/poo (Fig. 23B). Este resultado devido
provavelmente habilidade desta toxina em desestabilizar a membrana celular que parece
envolver a expresso de um maior nmero de receptores na membrana plasmtica. A
diferenciao de mioblastos em miotubos deve levar a mudanas que favoream
especificamente a ao de miotoxinas PLA2 do grupo II, provvel que essas mudanas
envolvam a expresso de um maior nmero, ou um tipo de afinidade maior, de stios
receptores na membrana plasmtica para as PLA2 miotxicas. No entanto, a possvel
participao de processos intercelulares surgidos aps a fuso de mioblastos, como observado
causando maior dano em miotubos, no pode ser excluido (Angulo e Lomonte, 2005).
69
5.3 Modificaes qumicas na miotoxina PhTX-I e seus efeitos sobre suas atividades
enzimtica, farmacolgicas e estruturais.
As relaes estrutura-funo de vrias PLA 2 provenientes de venenos de serpente tm
sido pesquisadas extensamente. Com objetivo de elucidar estruturalmente os stios
responsveis da toxicidade tem-se utilizado vrias metodologias, tais como modificaes
qumicas, mutaes sitio-dirigidas, tcnicas cristalogrficas, espectrofotomtricas e
fluoromtricas, assim como ressonncia magntica nuclear e estudos da ao de inibidores e
70
substratos naturais ou artificiais (Diaz-Oriero et al., 1997, Romero-Vargas et al., 2010, Soares
e Giglio, 2003).
Com o objetivo de entender as relaes estrutura-funo da PLA 2 PhTX-I,
descrevemos as modificaes qumicas de resduos especficos (His, Lys, Tyr, Trp), e inibio
por heparina e EDTA e os efeitos de tais modificaes sobre as suas propriedades enzimticas,
farmacolgicas e estruturais.
A PhTX-I foi submetida a modificaes qumicas nos resduos de 1) His, pelo brometo
de p-bromofenacila (BPB); 2) Tyr, pelo fluoreto 2-nitrobenzenesulfonil (NBSF); 3) Trp, pelo
cloreto de o-nitrofenilsulfenil (NPSC) e 4) Lys, pelo anidro actico (AA). O tratamento
qumico de protenas pode resultar em modificaes de resduos mltiples devido a que um
aminocido pode encontrar-se em vrias posies na protena ou podem acontecer reaes
qumicas no especficas. Alguns experimentos foram realizados para determinar se hoube
alguma alterao na estrutura da PhTX-I, assim como para avaliar o nmero e a
especificidade de resduos que foram modificados aps cada tratamento qumico.
Para verificar a homogeneidade e a integridade estrutural das protenas modificadas
foi corrido um gel SDS-PAGE, como mostrado na figura 25 tanto a PhTX-I nativa como as
formas modificadas migraram similarmente na eletroforese, evidenciando a presena de uma
nica banda eletrofortica para cada uma das protenas, demonstrando alta homogeneidade
das amostras assim como pequena ou nehuma alterao aparente da massa molecular das
formas protecas modificadas da PhTX-I.
ESI (Electrospray Ionisation) um mtodo de ionizao suave que durante o processo
as amostras so ionizadas pela adio ou remoo de um prton, com muito pouca energia
extra para causar fragmentao dos ons produzidos. Amostras com massas moleculares
superiores a 1200 Da do origem a ons multicarregados (M+nH) n+ no modo de ionizao
positivo. Ionizao positiva usada em geral para anlise de protenas e peptdeos, devido a
que tm vrios locais adequados para protonao, ja que todos os tomos de nitrognio do
esqueleto amida podem ser protonados tericamente, assim como certas cadeias laterais de
aminocidos como lisina e arginina, as quais contem uma amina primria (Karas et al., 2000).
A figuras 26 mostra os espectros de massa molecular das formas modificadas da
PhTX-I, determinadas por espectrometria de massas ESI (ionizao positiva). Cada pico
representa a molcula proteica levando um diferente nmero de cargas (prtons) (Fenn et al.,
1989). Nas figuras insertas em cada espectro, mostra-se a deconvoluo dos espectros obtidas
com ajuda do software Maxium Entropy. A forma modificada nos resduos de Trp com o
reagente NPSC, apresenta uma massa molecular intacta de 14470.61 Da, com um aumento de
71
221.39 Da em relao massa da protena nativa PhTX-I, cuja massa molecular 14249.22
Da (Huancahuire-Vega et al., 2011). Esse valor de aumento na massa indicaria a modificao
de um nico resduo de Trp, j que muito prximo do valor de massa do reagente
incorporado (221.62). A forma modificada com anidro actico (massa molecular 14537.90
Da), evidencia que o reagente estaria acetilando 7 residuos de Lys, devido a que existe um
aumento de 288.60 Da, equivalente com sete vezes o valor da massa do radical acetil
incorporado no grupamento amino das lisinas (42 Da).
NBSF (p-Nitrobenzenesulfonil fluoride) um reagente especfico para modificao de
resduos de Tyr em protenas, como foi evidenciado em outras PLA 2 (Andrio-Escarso et al
2000; Soares et al., 2001b). A forma modificada da PhTX-I com NBSF teve uma massa
molecular de 15068.96 Da, 819.74 Da acima do valor da toxina nativa, evidenciando
modificao de minimamente 4 resduos de Tyr (aumento de 187.16 Da em cada resduo,
correspondentes poro do reagente NBS que estaria sendo incorporado). Alquilao do
resduo de His nas PLA2 com BPB vm sendo uma estrategia usada para entender as relaes
estrutura-funo desta famlia de protenas (Yang, 1997). PhTX-I alquilada com BPB teve
uma massa molecular de 14440.70 Da, o que indica a modificao de um nico resduo de
His.
Comparao da anlise de composio de aminocidos da protena PhTX-I nativa com
as formas modificadas (tabela 7), mostra que sete resduos de lisina foram modificadas,
confirmando os dados obtidos na espectrometria de massas. Acetilao de resduos de lisina
de 3 miotoxinas PLA2 bsicas botrpicas (PrTX-I, PrTX-III e BnSP-7), causaram uma perda
completa da basicidade, sendo demonstrado por anlise eletrofortica (Soares et al., 2000a;
2001a), entretanto a acetilao da PhTX-I estaria modificando menos do 50% de resduos de
lisinas, tendo a protena modificada um comportamento igual protena nativa no gel de
eletroforese.
Na -Btx a anlise de aminocidos revelou que um nico respiduo de Tyr dos catorze,
foi modificado por NBSF. Este resduo foi identificado como Tyr68 na cadeia A da -Btx
(Liao et al., 1982). Nas PLA2 de N. naja e N. nigricollis dos nove resduos de Tyr presentes
somente dois foram modificados por NBSF (Yang et al., 1985), sugerindo que os sete
resduos restantes esto enterrados no interior da molcula. Nessas enzimas a Tyr3 estaria
envolvida na ligao ao fosfolipdio (Meyer et al., 1979) e a Tyr62(63) agiria com o stio de
reconhecimento interfacial (Dam-Mieras et al., 1975). Anlises da sequencia e composio de
aminocidos da notexina de Notechis s. scutatus, revelou que trs resduos de Tyr (Tyr7, 70 e
77) so modificados por NBSF (Yang e Chang, 1991). PhTX-I modificada com NBSF mostra
72
que quatro resduos de Tyr foram modificados, como evidenciado pela comparao da
composio de aminocidos (tabela 7), estando em concordncia com a os dados obtidos
apartir da anlise por espectrometria de massas.
His 48 um resduo de aminocido altamente conservado nas PLA 2, o qual possui um
rol relevante na catlise (Scott et al., 1992). Vrios estdios sobre modificaes das PLA2 de
veneno de serpente usando o BPB foram realizados durante os ltimos anos (Diaz-Oreiro e
Gutirrez, 1997; Andrio-Escarso et al., 2000; Bazaa et al., 2009; Romero-Vargas et al.,
2010). A composio de aminocidos (tabela 7) revela que PhTX-I modificada com BPB teria
um resduo de histina modificado, esse resduo corresponderia a His48, j que a atividade
enzimtica da protena foi quase completamente abolida aps a modificao, e sendo que a
His48 faz parte da triada cataltica desta famlia de protenas. Resultado similares foram
encontrados para as PLA2 D49 PrTX-III de B. pirajai (Soares et al., 2001a) e BthTX-II de B.
jararacussu (Andrio-Escarso et al., 2000).
A nitrofenilsulfonao dos resduos de Trp com NPSC da PLA 2 Pa-11 do veneno de P.
australis resultou na modificao de dois resduos nas posies 31 e 69. Da mesma maneira, o
tratamento de vrias PLA2 K49 com NPSC resultou na modificao de 50% dos resduos de
Trp, provavelmente afetando Trp77. Este resduo altamente conservado nas PLA 2 K49 e
geralmente ausente nas PLA2 D49 (Soares et al., 2000b, 2001a). A metodologia empregada na
anlise de composio de aminocidos no permite determinar os resduos de Trp, porem, a
sequencia de aminocidos da PhTX-I nativa mostrou que possui 3 resduos de Trp, nas
posies 3, 31 e 69 (Huancahuire-Vega et al., 2009), segundo a anlise de massas um resduo
de Trp estaria sendo modificado, o qual corresponderia ao Trp69 j que o mais exposto na
superfcie da molcula, e portanto seria mais facilmente atacado pelo NPSC (Soares e Giglio,
2003).
Com a finalidade de determinar se as modificaes qumicas realizadas na PhTX-I tm
causado mudanas na estrutura secundria da protena, foi utilizada a tcnica de
espectropolarimetria de dicrosmo circular (CD). Esta tcnica utilizada para estimar a
quantidade de estrutura secundria de protenas e avaliar as mudanas conformacionais
ocasionadas por diversos fatores como agentes desnaturantes, temperatura, etc (Kely et al.,
2005).
O espectro de CD da protena PhTX-I nativa indica que a estrutura secundria
predominante desta PLA2 consiste de -hlices (Fig. 27), fato que concorda com resultados
obtidos para outras PLA2 como as da cobra Taiwan (Kao et al., 2008), PLA2A de C. d.
ruruima (Diz Filho et al., 2009), e BnIV de B. newidii (Toyama et al., 2011). A estrutura
73
cascavella (Bonfim et al., 2001). Esses resultados sugerem que as crotapotinas podem ligar-se
s PLA2 botrpicas de maneira similar que s PLA 2 crotlicas e aumentam a possibilidade de
que os venenos botrpicos podem conter crotapotionas-like as quais inibem a atividade
cataltica das PLA2 (Bonfim et al., 2001).
J se tem demonstrado que PhTX-I uma miotoxina, capaz de induzir miotoxicidade
local in vivo, assim como edema de pata em camundongos e apresenta efeito neurotxico
causando bloqueio da resposta neuromuscular ex vivo na preparao neuromuscular biventer
cervicis de pintainho (Huancahuire-Vega et al., 2011). As formas modificadas da PhTX-I nos
resduos de His, Tyr, Lys e Trp foram avaliadas atravs da comparao dos seus efeitos na
miotoxicidade local, formao de edema, neurotoxicidade e citotoxicidade, atividades
farmacolgicas apresentadas pela PhTX-I nativa. A modificao seletiva desses aminocidos
tem sido escolhida para entender a funo biolgica, j que estes resduos de aminocidos tem
participao importante na atividade cataltica e na ligao ao substrato (Verheij, 1980).
Acetilao dos resduos de Lys reduziu significantemente a atividade enzimtica de
PhTX-I, entretanto foi detectada atividade residual ao redor de 27% (Fig. 28), similarmente a
MT-III (B. asper) e MT-I (B. godmani) (Daz-Oreiro and Gutirrez, 1997). O modo especfico
de acetilao no claro, mas existem evidencias de reduo da capacidade da enzima em
ligar-se ao clcio e por tanto reduo da atividade enzimtica (Yang, 1997). Contrariamente,
os efeitos miotxico (Fig. 31) e citotxico (Fig. 33) foram completamente anulados, j o
efeito edematogico foi diminudo em menor grau (Fig. 32). Estos resultados concordam com
observaes apresentadas previamente em estudos nos quais resduos de Lys de PrTX-I,
PrTX-III e BnSP-7 PLA2, foram modificados por acetilao diminuindo drasticamente suas
atividades miotxica, edematognica e bactericida (Soares et al., 2000a, 2000b, 2001a).
Acetilao de Lys na PhTX-I diminuiu tambm seu efeito neurotxico em maior grau do que
foi afetada a atividade enzimtica (Fig. 29). Estes efeitos maiores sobre as propriedades
farmacolgicas do que sobre a atividade cataltica demonstra que existe dissociao entre as
atividades enzimtica e farmacolgicas evidenciando a existncia de regies moleculares
diferentes ao sitio cataltico, as quais seriam responsveis por pelo menos alguma atividade
farmacolgica desta toxina em concordncia com estdios prvios com outras PLA 2
(Rosenberg et al., 1989; Andrio-Escarso et al., 2000; Soares e Giglio, 2003).
Soares et al., (2001a) sugeriu que o efeito bactericida de PrTX-III e da miotoxina III
de B. pirajai e B. asper, respectivamente, pode ser relacionado basicidade da protena,
presena da hlice N-terminal, e aos resduos 115 125 da regio C-terminal, esta ltima rica
em aminocidos bsicos e aromticos, os quais tem sido identificados como determinante
75
estrutural deste efeito (Lomonte et al., 2003). Peptidios sintticos representando a regio C-
terminal de PLA2 miotxicas mostraram atividades citotxicas e miotxicas similares s
protenas parentais embora exibam menor potencia (Lomonte et al., 2003; Angulo e Lomonte,
2005; Gebrim et al., 2009). Diminuio significativa da atividade miotxica aps incubao
com heparina confirma o envolvimento da regio C-terminal de PhTX-I no efeito miotxico,
este polinion estaria interagindo eletrostaticamente com a regio C-terminal rica em resduos
Lys (Huancahuire-Vega et al., 2011).
Nossos resultados tambem concordam com estudos prvios no qual as lisinas de vrias
PLA2 dos venenos de Naja naja atra e Naja nigricollis foram modificadas atravs de
carbamilao (Condrea et al., 1981), metilao (Ho et al. 1986), etoxiformilao e
guanidinao (Condrea et al., 1983). Estes estudos mostraram que tais modificaes tiveram
um maior efeito em algumas propriedades farmacolgicas do que na atividade enzimtica das
toxinas, uma concluso tambm alcanada por Babu e Gowda (1994) depois da guanidinao
de resduos de lisina de uma PLA 2 bsica de Vipera russelli. Assim, as lisinas parecem
desempenhar um papel crtico na toxicidade de PLA2 de veneno de cobra (Diaz-Oreiro e
Gutirrez, 1997).
His48 um aminocido altamente conservado nas PLA2, que faz parte do sistema
cataltico nestas enzimas (Scott et al., 1992). Alquilao da His por BPB vem sendo usado
amplamente para avaliar o rol da atividade enzimtica nas atividades farmacolgicas das
PLA2. Alquilao de His de PhTX-I anulou sua atividade enzimtica (Fig. 28), atividades
miotxica, neurotxica e edematognica foram drasticamente reduzidas por esta modificao
(Figs. 29, 31, 32), tratamento com EDTA tambm diminuiu a atividade miotxica e
edematognica, suportando a hiptese que a hidrlise enzimtica de fosfolipdios est
envolvido neste efeitos. Similarmente as atividades neurotxica e miotxica foram inibidas
quase completamente aps alquilao de His48 de Basp-III (B. asper), BthTX-II (B.
jararacussu), PrTX-III (B. pirajai), Cdc-9 e Cdc-10 (C d. cumanensis) (Daz-Oreiro e
Gutirrez, 1997; Andrio-Escarso et al., 2000, Soares et al., 2001a; Romero-Vargas et al.,
2010), mostrando que estes efeitos so dependentes da atividade cataltica. Soares et al.,
(2001a) sugeriu que a atividade enzimtica das PLA 2 potencializa estas atividades
farmacolgicas induzidas pelas miotoxinas botrpicas e crotlicas.
Em contraste, a atividade citotxica da PhTX-I sobre as linhagens celulares NG97 e
NCIH-3T3 no foi afetado pela modificao de His (Fig. 33), indicando que a atividade
enzimtica no requerida para a PhTX-I induzir este efeito e que outras regies da molcula
estariam envolvidas na perturbao da membrana celular. Nossos resultados esto de acordo
76
com a atividade da MTX-I e II PLA2 de B. brazili as quais exibiram atividade citotxica sobre
clulas Jurkat independentemente da atividade cataltica (Costa et al., 2008). Alguns autores
propem que a atividade citotxica sobre linhagens celulares tumorais esto associados com
induo de apoptose, considerando que as enzimas PLA2 tem sido consideradas possuir um
rol importante na apoptose em vrios modelos incluindo linhagens celulares (Cummings et
al., 2008). A atividade fosfolipsica acelera o turnover dos fosfolipdios, o qual pode
influenciar mudanas na membrana que ocorrem durante a apoptose (Panini et al., 2001).
Sugerimos maior importancia dos resduos Lys no desenvolvimento do efeito citotxico da
PhTX-I, devido a que a PhTX-I modificada com AA anulou quase completamente esta
atividade (Fig. 33).
Vrios estudios foram direcionados tentando entender os mecanimos envolvidos na
resposta inflamatria induzida pos PLA2 miotxicas de vrios venenos de serpentes (Teixeira
et al., 2003, 2009; Zuliani et al., 2005). Entretanto, a relao entre as atividades enzimtica e
edematognica so contraditrias (Vishwanath et al., 1987). Assume-se que as atividade
edematognica e miotxica podem ser induzidas por diferentes domnios estruturais nestas
toxinas, ou que ocorre uma sobreposio destes domnios (Soares et al., 2004; Zuliani et al.,
2005).
Atividade enzimtica residual da PhTX-I aps sulfonilao dos residuos de Tyr foi
38% (Fig. 28). Os resduos Tyr52 e Tyr73 fazem parte do stio cataltico das PLA2, sendo um
suporte estrutural para estabilizar o sistema cataltico, alterao nesse sistema estaria afetando
a atividade cataltica da PhTX-I (Scott et al., 1992). PhTX-I modificada nos residuos de Tyr
diminuiu os efeitos miotxico e neurotxico mais do que a asua atividade cataltica, uma vez
mais indicando a possvel dissociao dos efeitos farmacolgicos e enzimtico. Por outro lado
a atividade citotxica de PhTX-I foi drasticamente reduzida aps modificao por NBSF (Fig.
33) sugerindo que os resduos de Tyr tambm poderiam estar envolivods neste efeito. Zhao et
al., (1998) observou que as PLA2 miotxicas de veneno de serpente apresentam alguns
resduos de Tyr localizados na regio C-terminal da molcula. Estas tirosinas podem
contribuir combinao catinica-hidrofbica proposta por ter um rol importante na
miotoxicidade e citotoxicidade (Lomonte et al., 2003; Araya e Lomonte, 2007; Cintra-
Francichinelli et al., 2010). PhTX-I apresenta um resduos de Tyr na sua regio C-terminal, a
possvel alterao deste aminocido estaria causando a reduo da sua toxicidade. Entretanto,
a influncia da alterao da estrutura secundaria induzida pelo tratamento com NBSF no
pode ser descartada.
77
6. DISCUSSO GERAL.
Diferentes enfoques foram utilizados para investigar as atividades das PLA 2 PhTX-I e
PhTX-II. Os mtodos e experimentos realizados durante o trabalho permitiram isolar estas
miotoxinas e estud-las nas suas caractersticas estruturais e propriedades farmacolgicas.
78
pode ser redundante, com muitas molculas semelhantes e com a mesma funo, de modo a
compensar as variaes dos mecanismos de defesa das presas.
Estudo prvios tm demonstrado que a capacidade comum compartilhada de hidrolisar
na posio sn-2 de fosfolipdios e a falta de correlao entre a atividade enzimtica e a
toxicidade letal ou potncia farmacolgica, faz intrigante os mecanismos pelos quais as PLA 2
de veneno de serpente induzem um amplo espectro de efeitos farmacolgicos (Soares et al.,
2001a). Usando a estratgia de modificao qumica de resduos especficos foi observada na
PhTX-I, uma completa dissociao dos efeitos citotxico e enzimtico. Nos efeitos
neurotxico e miotxico, a atividade cataltica da toxina estaria potencializando ambos os
efeitos. Nossos dados revelam que aminocidos bsicos como Lys e hidrofbicos como a Tyr
parecem ter maior importncia no desenvolvimento dos efeitos farmacolgicos induzidos pela
PhTX-I.
Apesar de que a modificao de aminocidos especficos, no nos ajuda a identificar a
regio da molcula da PhTX-I responsvel pelas diversas atividades farmacolgicas, os
resultados obtidos so consistentes com o conceito de regies moleculares separadas as quais
determinam as atividades catalticas e farmacolgicas. Apesar de ser demonstrada uma
dissociao parcial, tanto o stio cataltico como os stios farmacolgicos hipotticos so
relevantes para o perfil farmacolgico de PhTX-I. Como ambas as regies moleculares,
cataltica e farmacolgica, contribuem com o desenvolvimento da toxicidade desta protena,
ainda precissa ser estudado em maior detalhe.
7. CONCLUSSES.
Os resultados obtidos nos permitem afirmar que PhTX-I e PhTX-II, duas miotoxinas
bsicas isoladas do veneno de P. hyoprora, so PLA2 D49 monomricas, as quais exibem as
principais aes txicas reportadas para esta famlia de protenas, incluindo miotoxicidade
local in vivo, neurotoxicidade ex vivo, efeitos citolticos in vitro, atividades pro-inflamatrias
in vivo, possuindo provavelmente um rol principal no envenenamento por esta espcie de
80
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