Abstracto

Cromatografa de filtracin en gel (GFC) separa las molculas segn el

tamao y es uno de los mtodos ms utilizados para la purificacin de
protenas. Aqu, protena fluorescente roja (RFP), protena fluorescente verde
(GFP), amarillo fluorescente protenas (YFP), protena fluorescente cian
(CFP), y / o su protenas de fusin se prokaryotically expresado, purificados,
y se utiliza en un ejercicio de laboratorio para demostrar intuitivamente
GFC. Las diferentes bandas, correspondiente a solicitud de propuesta, RFP-
PPC (RC), YFP-RFP-YFP (YRY), y piruvato quinasa II-GFP (PKG) eran bien
separados en una columna Superdex 200 de un 0,5 mL muestra. El aumento
de volumen de la muestra y el cambio de la resina cromatogrfica de
Sephadex G-100 dio lugar menor separacin resolucin. Los estudiantes
disfrutaron de identificacin combinaciones de protenas de colores y
encontrado este ejercicio tiles para la comprensin de los factores que
afectan a la resolucin de GFC. VC 2014 por la Unin Internacional de
Bioqumica y Biologa Molecular, 43 (1): 33-38, 2015.
Introduccin
Como una de las macromolculas biolgicas ms abundantes, las protenas
se producen en todos los organismos en una gran diversidad de tamaos y
funciones. Las protenas se pueden separar en base a su tamao relativo,
carga, y / o afinidad de resinas utilizadas en la columna cromatografa.
cromatografa de filtracin en gel (GFC),tambin conocida como
cromatografa de exclusin por tamao, se separa protenas en su estado
nativo de acuerdo con su relativa tamao. medios de filtracin en gel
consisten en perlas en forma precisamente con cavidades de un tamao
particular. La probabilidad de una protena difundirse en estas cavidades
aumenta con la disminucin de tamao de la protena, de tal manera que
las protenas ms pequeas son retenidas ms larga[1]. Por lo tanto, una
mezcla de protenas se eluyen de la columna en orden decreciente de
tamao. La resolucin de GFC depende de muchos factores, incluyendo la
naturaleza de la separacin(Tamao de partcula medio, la uniformidad, el
mismo tamao entre las cavidades, y analito), factores de columna (altura
de la cama, calidad relleno de la columna) y varios factores experimentales,
tales como velocidad de flujo, volumen de la muestra, y la viscosidad
eluyente. Muchas protenas fluorescentes, tales como verde (GFP), amarillo
(YFP), cian (CFP), y las protenas fluorescentes rojas (RFP), son visibles a
simple vista y son de colores brillantes en solucin [2-6]. Varias de estas
protenas se han utilizado en la enseanza lecciones sobre la expresin y
purificacin de protenas [7-9] y relaciones estructura-funcin [10, 11].
Tambin tienen ha utilizado para demostrar varias tcnicas de purificacin
de protenas [7, 9], incluyendo GFC con RFP marcada con polihistidina y
etiquetada con MBP EGFP [9]. Con el fin de facilitar el uso de protenas
fluorescentes de colores y visiblemente en la educacin,
BioRad(Http://www.bio-rad.com) suministra la bacteriana p GLOTMKit de
transformacin (166-0003EDU) para expresar GFP en E. coli y un kit de
cromatografa GFP (166-0005EDU) para purificar GFP en columnas de
cromatografa hidrfobos. En la corriente ejercicio, varias protenas
fluorescentes se fusionaron a protenas de color rendimiento que luego se
utilizaron para evaluar la efectos de volumen de la muestra y el dimetro de
la cavidad de resina sobre GFC resolucin. protenas de fusin marcada con
polihistidina de RFP (26,9kD), RFP-PPC (RC, 54,9 kD), YFP-RFP-YFP (YRY, 84,3
kD) y piruvato quinasa II-GFP (PKG, monmero de 84 kD, dmero168,0 kD)
se expresaron, se purificaron, y se separacon xito en una columna
Superdex 200 (protena globulargama de 10 a 600 kD fraccionamiento). Los
estudiantes encontraron que GFC resolucin podra reducirse drsticamente
mediante el aumento el volumen de muestra o conmutando el
cromatogrficaresina Sephadex G-100.
Materiales y mtodos
Materiales y reactivos
Primer ESTRELLA de la polimerasa, endonucleasas de restriccin, dNTP
mezcla, marcadores de ADN, y ADN ligasa de T4 se adquirieron
de Takara (Japn). Lisozima, TDT, IPTG, PMSF, y
pepstatina A fueron adquiridos de Amresco (EE.UU.). Ni-NTA
HisBind Superflow Resin era de Novagen (Alemania).
Se obtuvieron Superdex 200 y Sephadex G-100 resinas
de GE Healthcare (EE.UU.). La ampicilina se adquiri de
Oxford LTD (Hampshire, Inglaterra). Todos los otros productos qumicos
fueron de grado analtico y se obtuvieron a partir domstica
compaas. pDsRed-N1, pEGFP-Cl, pEYFP-N1, y
pETCFP-Cl se adquirieron de RYgene (www.yrbio.com,
Changsha, China). pMD18-T simple vector fue comprado
de Takara (Shiga, Japn). vectores de expresin procariticos
pHIS9 (un vector derivado de pGEX-6P-1, en la que el
se sustituyeron las regiones de codificacin de la proteasa de GST y
PreScission
por una secuencia de codificacin para nueve residuos de histidina), pGEX-
PK
(Vector de expresin pGEX-6P-1 portadoras de piruvato quinasa II
a partir de Escherichia coli), E. coli DH5a, y BL21 (DE3) fueron
obtenido a partir de la coleccin de laboratorio.
Construccin de pRFP para la expresin de RFP
Se utiliz PCR para amplificar secuencias de nucletidos. Lo tipico
mezcla de PCR consista en 2 tampn lL PCR, 2 solucin lL dNTP
(2,5 mM), 1 lL de una solucin que contiene hacia adelante y
atrs primers (100 ng / ll), 1 solucin de ADN molde lL
(100 ng / LL), y 0,2 lL ADN polimerasa (1,0 unidades). la
Las condiciones de PCR comprendan un arranque en caliente de 5 minutos
a 95C, seguido
de 30 ciclos de desnaturalizacin (30 s a 95C), hibridacin
(30 s a 58C), y se extiende (60 s a 72C). RFP fue
amplificado utilizando cebadores RFPf y RFPr con pDsRed-N1, segn se
la plantilla. Despus de la digestin posterior con la correspondiente
enzimas de restriccin (BamH I y EcoR I), la RFP
fragmento se purific mediante cromatografa en gel y se inserta
en el vector de expresin para producir pHIS9 pRFP. clonado
secuencias fueron validados mediante secuenciacin (Sangon Biotech,
Shanghai, China). Los cebadores y los genes amplificados se enumeran en
Tabla 1.
Construccin de pRC para la expresin de Fusin
protena RC
La unin de PP y PPC se realiz mediante la superposicin
PCR. Las secuencias complementarias a PP y PPC se encuentran
en los extremos de cebadores RYir y RYif, respectivamente. Dos
fragmentos de ADN RFPI (derivado usando cebadores RFPf y RYir)
y CFPI (derivado usando cebadores RYif y YFPrEcoRI) eran
amplificado a partir de plantillas pDsRed-N1 y pETCFP-Cl,
respectivamente. RC se amplific adicionalmente utilizando los cebadores
RFPf
y YFPrEcoRI con plantillas mixtos de RFPI (50 ng) y
CFPI (50 ng), y el producto entonces se insert en pHIS9
para producir el vector de expresin pRC despus de la digestin con
BamH I y EcoR I.
Construccin de Pyry para la expresin de Fusin
YRY de protenas
YFP se amplific utilizando cebadores YFPf y YFPrBamHI
junto con pEYFP-N1 como la plantilla. Siguiendo
Los cebadores usados para la amplificacin de fragmento de ADN
Cebador
nombre (5'-3 ') de secuencias de nucletidos Secuencia
RFPf GGATCCATGGACAACACCGAGGACGTCATCAAGGAG (BamHI) RFP
RFPr GGAATTCTCACTTGTACAGCTCGTCCAT (EcoR I)
YFPf GGGAATTCCATATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG (Nde I) YFP
YFPrBamHI CGCGGATCCCTTGTACAGCTCGTCCAT (BamH I)
YFPrEcoRI
GAATTCTCAATGATGATGATGATGATGCTTGTACAGCTCGTCCATGCCGAGAGTGAT
CCC (EcoR I)
GFP-F CGGGATCCGTGAGCAAGGGCGAGGAG (BamHI) GFP
GFP-R GGAATTCTCACTTGTACAGCTCGTCCATG (EcoRI)
PKF GGGAATTCCATATGATGTCCAGAAGGCTTCGCAGAAC (Nde I) PK
PKR CGCGGATCCCTCTACCGTTAAAATACGCGTGGTATTAG (BamH I)
RYir CGGTGAACAGCTCCTCGCCCTTGCTCACCATCTGGGAGCCGGAGTGGCGGG
YRY
RYif CCCGCCACTCCGGCTCCCAGATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCG
Los sitios de restriccin estn subrayados.
TABLA 1
bioqumica y
Biologa Molecular Educacin
34 Visible Filtracin en gel La cromatografa utilizando protenas
fluorescentes
la digestin con Nde I y BamH I, se lig en YFP
pHIS9 para dar pYFP vectorial. Despus de la amplificacin mediante la
superposicin de
PCR como se describe anteriormente, se digiri RY (RFP-YFP)
usando BamH I y EcoR I y se lig en pYFP para crear
Pyry el vector de expresin.
Construccin de pPKG para la expresin de Fusin
La protena PKG
Piruvato quinasa II (PK) se amplific usando cebadores PKF
y PKR y la plantilla pGEX-PK. Despus de la doble digestin
usando Nde I y BamH I, PK se insert en pHIS9 a
pPK rendimiento. GFP se amplific utilizando cebadores GFPf y GFPr
y la plantilla de pEGFP-Cl. Despus de la digestin con BamH I
y EcoR I, GFP se insert en pPK para producir pPKG.
Expresin y Purificacin de Protenas
expresin y purificacin de protenas se realizaron como se
descrito anteriormente [12]. Brevemente, los vectores de expresin eran
transformado en E. coli BL21 (DE3). la transformada
cepa se cultiv en medio LB suplementado con
0,1 mg / ml durante la noche a la ampicilina a 37C. Una vez que la OD600
alcanzado 0,6-0,8, los cultivos se enfriaron a 16C, y
Se aadi isopropil-b-D-1-thiogalactopy-ranoside (IPTG)
a una concentracin final de 0,5 mM para inducir la expresin de protenas
por 16 h. Las clulas se recogieron por centrifugacin (5000
3 g) a 4C durante 10 min. Las clulas se resuspendieron en la lisis
tampn (mM KPO4 50, 0,4 M KCl, 290 lM PMSF, 1,5 pepstatina lM
A, 0,1 mg / ml de lisozima, pH 8,0) y se incubaron a 4C
durante 1 h. Las clulas se rompieron an ms mediante ultrasonidos (450
W,
10 min a 0C) y se removieron los residuos por centrifugacin
(18.000 g) a 4C durante 40 min. El sobrenadante se
se carg en una columna de afinidad Ni-NTA (10 3 30 mm) previamente
equilibrada
con tampn A (mM KPO4 50, 0,4 M KCl, pH
8.0). A continuacin, la columna se lav con un volumen de lecho de cinco
veces
de tampn B (mM KPO4 50, 0,4 M KCl, imidazol 75 mM,
pH 7,3) y se eluy con tampn C (mM KPO4 50, 0,4 M
KCl, 5 mM de b-ME e imidazol 250 mM, pH 7,3). Despus
dilisis utilizando tampn D (50 mM de KCl, DTT 1,5 mM, 5% de glicerol
y HEPES 50 mM, pH 8,0), las protenas finales se
se analizaron por SDS-PAGE y se almacen a 280C. Las concentraciones de
protenas
se determinaron utilizando el mtodo de Bradford
[13] con albmina de suero bovino (BSA) como estndar.
Filtracin en gel La cromatografa
Cualquiera de 500 ml o 2 ml de una mezcla de protenas que contiene RFP,
RC, YRF, y PKG (0,3-0,5 mg cada una) se cargaron en preequilibrada
(50 KCl mM, HEPES 50 mM, pH 8,0) Superdex
200 (S200) o Sephadex G-100 (PP100) columnas (1 3
30 cm) con el primer AKTA (GE Ciencias de la Salud). la separacin de GFC
se realiz a una velocidad de flujo de 0,4 mL / min.
Resultados y discusin
Laboratorio de Diseo Ejercicio
Este ejercicio de laboratorio fue diseado para una avanzada
curso de bioqumica que comprende los estudiantes que ya han
completado Bioqumica, Biologa Molecular, y
cursos de ingeniera gentica. Despus de una charla inicial delineando
los objetivos de este ejercicio, un calendario (Tabla 2) se distribuy
a los estudiantes. Los estudiantes trabajaron en grupos de dos
para recoger un gen para clonar, expresar la correspondiente
protenas, y establecer un experimento GFC al compartir el
protenas que se purificaron.
Expresin y Purificacin de Protenas
Se seleccionaron las protenas fluorescentes altamente estables para este
ejercicio de laboratorio. Las protenas fluorescentes y combinaciones
los mismos se usaron para obtener varias protenas de colores.
genes de protenas fluorescentes se clonaron y se unen en
Los vectores de expresin por parte de los estudiantes (Fig. 1).
Considerando el
requisitos previos de Biologa Molecular e Ingeniera Gentica,
y en particular, los cursos de laboratorio correspondientes
Calendario de un curso prctico sobre GFC
Mtodos das
1. Introduccin
Construccin de plsmidos
transformacin de clulas competentes (DH5a de E. coli)
2 seleccin de colonias individuales y el crecimiento en medios lquidos
Purificacin de ADN plsmido
transformacin de clulas competentes (E. coli BL21)
3 seleccin de colonias individuales y el crecimiento en medios lquidos
induccin con IPTG
la purificacin de protenas por 4 resina Ni
SDS-PAGE
Medicin de la concentracin de las protenas
5 cromatografa de filtracin en gel
Ilustracin de las estructuras de genes para la RFP, RC,
YRY, y PKG y sus correspondientes molecular
pesos. H representa los polyhistidines.
TABLA 2
FIGURA 1
Zhang et al. 35
los estudiantes ya estaban bien versados y experimentados en
clonacin de genes y la construccin del vector. Marcada con polihistidina
protenas fluorescentes se sobreexpresa prokaryotically
y despus se purific utilizando una columna de afinidad Ni-NTA. Tpico
resultados se muestran en la Fig. 2a. RFP, RC, YRY, y la pantalla PKG
colores distintos (Fig. 2b). La mayora de los estudiantes eran
sorprendido por las nuevas protenas de colores que resultaron de la
varias combinaciones. PKII se encontr a existir como un dmero
sobre la base de filtracin en gel (H. Li y M. Sun, indito
datos). Por lo tanto, la PKG (monmero de 84 kDa) sera un 168-
protena kD en su estado nativo.
Filtracin en gel La cromatografa
Despus de la purificacin, cada grupo determin la concentracin
de su solucin de protena y compartido estos datos con la
otros grupos para producir un conjunto de muestras de cuatro protenas
fluorescentes.
Tres juegos fueron designados para evaluar los efectos de
tipo de resina y el volumen de muestra en la resolucin de separacin
de GFC. Una serie se utiliza con una columna Superdex 200 con
un volumen de muestra de 0,5 ml (S200a), se us un segundo conjunto
con una columna Superdex 200 con un volumen de muestra de 2 mL
(S200B), y el tercer conjunto se utiliz con una columna de Sephadex G-100
con un volumen de muestra de 0,5 ml (SG100). Las velocidades de flujo
fueron
0,4 ml / min. Una columna tpica GFC cargado con el S200a
resina se muestra en la Fig. 3a. Las cuatro protenas se separaron bien
en la columna con RFP en la parte superior, seguido de RC,
YRY, y PKG. El cromatograma en la figura UV280. 3b es consistente
con las bandas de color de forma visible en la columna. Uno
pico menor que corresponde a? 22 ml ms probable debido
a los contaminantes de protenas. PKG fue el primero en eluir, lo que sugiere
la oligomerizacin de PKII. La columna que contiene GFC
la resina de S200B se muestra en la Fig. 4. Las cuatro protenas
No fueron separados tambin, y la cromatogrfico
picos solapan significativamente, lo que demuestra que el aumento de
el volumen de muestra de 0,5 a 2 ml disminuy la
purificacin de la protena fluorescente tpica y la purificada
protenas. (A) Expresin y purificacin
de la Solicitud de Propuestas; Carril M: marcador molecular de protenas
(kDa),
Carril 1: antes de la induccin con IPTG, Carril 2: despus de IPTG
induccin, Lane 3: el sobrenadante de lisado celular,
Carril 4: el flujo a travs cargado a la columna de Ni21,
Carril 5: una muestra de lavado de la columna de Ni21,
Carril 6: la protena objetivo final RFP. (B) Purificado
protenas fluorescentes. De izquierda a derecha, las protenas
son RFP, RC, YRY, y PKG.
(A) Una imagen de una columna Superdex 200 tpico
durante la separacin de protenas utilizando un volumen de muestra
de 0,5 ml. De arriba a abajo, los cuatro fluorescente
bandas son RFP, RC, YRY, y PKG. (B) La
correspondiente cromatograma contena DO280
cuatro picos principales que representan PKG, YRY, RC,
y la solicitud de propuesta (de izquierda a derecha).
(A) Una imagen de una columna Superdex 200 tpico
durante la separacin de protenas utilizando una muestra de 2 ml
volumen. De arriba a abajo, los cuatro fluorescente
bandas son RFP, RC, YRY, y PKG. (B) El correspondiente
DO280 cromatograma contena cuatro
principales picos que representan PKG, YRY, RC, y RFP
(de izquierda a derecha).
FIGURA 2
la figura 3
la figura 4
bioqumica y
Biologa Molecular Educacin
36 Visible Filtracin en gel La cromatografa utilizando protenas
fluorescentes
resolucin. Realizacin de la separacin usando una columna de Sephadex
G-
100 columna dio lugar a una resolucin an ms pobres (Fig. 5). la
cuatro protenas no se separaron de forma visible (Fig. 5a), y slo
un pico principal se observ en el cromatograma (Fig.
5b). Esto mostr que, o bien la resina no era adecuado para
estas protenas particulares o que la columna estaba lleno
mal.
Discusin
Este ejercicio de laboratorio se llev a cabo en el Colegio de
Qumica y Ciencias de la Vida, Universidad Normal de Zhejiang.
Los estudiantes realizaron la clonacin de genes, expresin de la protena,
y la separacin GFC. Despus del ejercicio, los estudiantes eran
provista de preguntas para llevar a casa para reforzar la fundamental
conceptos y ampliar sus conocimientos sobre las protenas en
general:
1. Los cuatro protenas fluorescentes en tndem fusionados tenan aparente
pesos moleculares nativos de 26,9, 54,9, 84,3 y
168 kD. Cul fue el orden de las protenas que se eluye de la
columna de filtracin en gel? Por qu?
2. La mayora de las protenas exhiben fluorescencia visible? Explique
Por qu las protenas elegidas son fluorescentes.
3. Si PKII eran un monmero en su estado nativo, cmo
esto afecta al orden de elucin? Por qu?
4. Puede cualquier tipo de resina de cromatografa de filtracin en gel estar
utilizado en este ejercicio de laboratorio? Por qu?
Despus de clase evaluacin consisti en preguntas tales como,
"Qu opinas de este ejercicio?"; "Qu tan til
Estaba en la consecucin de los objetivos del curso? "; "Hay alguna
mejoras que podran introducirse en el experimento? "
Ms del 80% de los estudiantes ha dejado su opinin positiva en este
ejercicio. Algunos de sus comentarios se enumeran a continuacin:
"Las protenas fluorescentes de colores son preciosos. ellos
son realmente impresionantes. Nunca olvidar este experimento ".
"Esta demostracin definitivamente me ayud a recordar
que cuando se utiliza cromatografa de filtracin en gel, los grandes
salir en primer lugar, no como en un tamiz en el que los grandes son
retenido ".
Un estudiante tambin dej un mensaje relativo a una limitacin en
el experimento: "Cuando se utiliza la cromatografa de filtracin en gel,
las molculas se separan basan tanto en peso molecular (tamao)
y su forma tridimensional. Aqu, hemos visto la separacin
Resultados basados en tamao, pero no la forma. Hay alguna manera de
mostrar los efectos de tamao y forma en un ejercicio? "
Esta es una mejora que podemos hacer en el futuro.
Tambin podemos poner en prctica experimentos adicionales para hacer
frente a
algunas de las otras variables que afectan a la resolucin y GFC
proporcionar opciones adicionales para los estudiantes en la construccin
de genes de fusin. Todas las construcciones realizadas en este laboratorio
ejercicio estn disponibles bajo peticin.
Errores comunes y cuestiones de seguridad
Varios errores comunes y problemas de seguridad se enumeran a
continuacin:
1. El bromuro de etidio, un potente mutgeno, es un componente
del gel de agarosa utilizado en la electroforesis durante plsmido
construccin. Se debe utilizar en un rea designada.
Se deben usar guantes para evitar el contacto directo con la piel.
Los materiales de desecho deben eliminarse como residuo especial
a travs de un Programa de Residuos Peligrosos.
2. azida de sodio se utiliza a veces para prevenir bacteriana
crecimiento en columnas de filtracin en gel. Se deben usar guantes
durante la manipulacin de azida de sodio. desechos relacionados debera
ser
inactiv con cido nitroso antes de su eliminacin.
3. La impureza de las protenas marcada con polihistidina puede complicar
resultados. La elucin usando un gradiente lineal de 10
imidazol 250 mM resolvera este problema.
4. La calidad de relleno de la columna es esencial para la eficiencia
la separacin de protenas ciente. Las resinas se deben desgasificar
antes de su envasado. Si la columna se seca, tiene que ser
embalados de nuevo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Expresiones de gratitud
Este trabajo fue apoyado por el Alto Educacin y
Ensear el Proyecto Reforma de la Oficina de Educacin
de la provincia de Zhejiang (kg2013080).