INSTITUTO TECNOLGICO DE CD.
ALTAMIRANO
LICENCIATURA EN BIOLOGA
DETERMINACIN DE AMINOCIDOS TERMINALES CON GRUPO ALFA AMINO
LIBRE. MTODO DE SANGER.
ALUMNO: EMMANUEL A.
GUTIRREZ RENTERA GRUPO:
43
RESUMEN.
La determinacin de la estructura
primaria de una protena suele
denominarse secuenciacin. Existen
varias maneras de determinar la
secuencia de aminocidos. El
primero en lograr esto fue Frederick
Sanger, quin diseo un mtodo, el
cual consiste en el marcaje del
amino terminal a travs del uso de
DNFB.
El presente trabajo tiene por
objetivo como se determinan los
aminocidos terminales con mtodo
sanger, para ello se utlizaron 30 mg
de hemoglobina disueltos con
bicarbonato de sodio en un tubo,
posteriormente este se agit y se
agreg cido clorhdrico.
Posteriormente se evaporaron los
residuos de ter y procedi a
centrifugar y se coloca el tubo en el
autoclave. Finalmente se coloca el
cromatograma en una cmara
previamente saturada con solvente
de cido ctrico y citrato de sodio.
INTRODUCCIN.
La determinacin de la estructura
primaria de una protena suele
denominarse secuenciacin. Existen
varias maneras de determinar la
secuencia de aminocidos. El
primero en lograr esto fue Frederick
Sanger, quin diseo un mtodo, el
cual consiste en el marcaje del
amino terminal a travs del uso de
DNFB. Este compuesto qumico
color amarillo reacciona con los
grupos amino libres en condiciones
ligeramente bsicas formando los
dinitrofenil derivados (DNP-aa),
tambin reaccionar con los grupos
imidazol, fenlicos y epsilonamino,
por lo que se dar una
dinitrofenilacin en la cadena lateral
de la tirosina, histidina y lisina. Al
hidrolizar el pptido o la protena ya
dinitrofenilada, se da una ruptura
total de los enlaces peptdicos lo
que nos da como resultado un
hidrolizado que contendr
aminocidos libres y DNP derivados
que se conservan intactos, ya que
su enlace es ms difcil de romper.
Los DNP de aminocidos terminales,
a diferencia de los dems DNP y de
los aas libres, son no polares por lo
que se pueden extraer muy
fcilmente con un disolvente no
polar. Estos DNP son sometidos a
cromatografa, y se determina al
aminocido amino terminal de la
protena en comparacin con otros
DNP derivados. Edman utiliz una
tcnica similar a la de Sanger,
utilizando el fenilisotiocianato para
marcar al grupo amino del aa
terminal, a diferencia de Sanger, al
hidrolizar la protena nicamente
rompa el enlace entre el aa
terminal y el resto de la de la
cadena, la cual permaneca intacta,
por lo que la secuenciacin se
facilita.
OBJETIVOS.
Identificar el aminocido alfa-amino
terminal de las cadenas de la
molcula de hemoglobina mediante
el mtodo de Sanger.
MATERIALES Y MTODOS.
Se colocaron 30 mg de hemoglobina
en un tubo y se disolvi con
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bicarbonato de sodio al 4.2%, esto
debido a que la reaccin con el
DNFB se lleva a cabo en condiciones
ligeramente bsicas. Despus de
esto se agreg al tubo DNFB al 1% y
se agit, procurando mantener el pH
entre 8 y 9. Se agreg HCL 3N, con
la finalidad de detener la reaccin
de dinitrofenilacion, despus se
realizaron 3 extracciones con ter y
solucin acuosa de FeSO4,
posteriormente se evaporaron los
residuos de ter. Se centrifug a
3000 rpm durante 15 minutos, se
elimina el sobrenadante y
posteriormente se agrega HCL 6N y
se coloca el tubo en la autoclave a
15lb/in^2 durante 3 horas, con esto
se logra la ruptura de los enlaces
peptdicos de la hemoglobina,
obtenindose un caldo de
Imagen 1. Cromatograma. Se
aminocidos que contiene al amino
colocaron DNP-Ala, DNP-Val, DNP-
cido n-terminal, mismo que se
Phe, DNFB y mi muestra problema
extrae con ter, se pasa a una
de izquierda a derecha.
parrilla y se evapora casi a
sequedad , el residuo se disuelve en
5 ml de etanol y se aplica en una
tira de papel Whatman junto con MUEST dm (cm) dsoluto(c Rf
otros DNP derivados. RA m)
DNP-Ala 24.2 39.8 .608
Posteriormente se coloca el DNP-Val 27 39.7 .
cromatograma en una cmara 680
previamente saturada con solvente 1
de cido ctrico y citrato de sodio, DNP- 22.5 39.7 .
saturar durante dos horas y Phe 566
desarrollar la cromatografa en 7
forma ascendente durante 4 o 5 DNFB 17.5 39.5 .
horas. Medir las distancias 443
correspondientes y calcular los 0
valores de RF. P1 15.5 39.1 .
396
4
RESULTADOS. P2 24.3 39.1 .
621
4
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P3 27.8 39.1 . El aminocido N-terminal de la
710 hemoglobina es la Valina. La tcnica
9 de Sanger permiti extraer dicho aa.
TABLA 1. Cromatografa en papel.
BIBLIOGRAFA.
Valores de Rf.
Fonaguera J. y G. Gmez (2004),
DISCUSIN.
BIOQUIMICA: LACIENCIA DE LA
Despus de obtener los valores de VIDA, Editorial de la Universidad
Rf correspondientes, se observa Estatal a Distancia (2004).
similitud entre la marca 3 de la
Nelson, D.L. y Cox, M.M. (2005).
muestra problema con el valor de la
Lehninger Principios de
muestra de DNP-Val, por lo que se
Bioqumica 4 Edicin. Ed. Omega.
puede decir que la Valina es el
aminocido N-terminal de la Lpez, A. (2014, enero 15). Mtodo
hemoglobina, mismo que es de Sanger: Secuenciacin
reportado en la bibliografa. Las tradicional. El guardian de los
otras dos marcas obtenidas en la cristales. Recuperado mayo 19,
muestra problema presentan un 2017 de
valor de Rf similares a los de las http://elguardiandeloscristales.com/
muestras de DNFB (Similar a P1) y wordpress/metodo-de-sanger-
DNP-Ala (Similar a P2), esto puede secuenciacion-tradicional/
deberse a que existi contaminacin
de ambas muestras a la hora de (Lpez, 2014).
extraer el aminocido N-terminal.
CONCLUSIN.