UNIVERSIDAD NACIONAL DE JAEN

ESCUELA DE TECNOLOGIA MDICA

V CICLO

PRCTICA 01

ANLISIS BACTERIOLGICO

DOCENTE: CHRISTIAN ALEXANDER RIVERA SALAZAR (MBLGO)

ALUMNO:

MTODO DIRECTO DE DETERMINACIN DE MICROORGANISMOS MESFILOS

AEROBIOS VIABLES

1. OBJETIVOS

Determinar el nmero de microorganismos presentes en muestras de alimento mediante la tcnica de

recuento en placa.

Interpretar de acuerdo a las normas vigentes de alimentos los resultados obtenidos del alimento analizado.

2. FUNDAMENTO TERICO

El anlisis de los alimentos y piensos para determinar la existencia, tipo y nmero de microorganismos es
bsico para la microbiologa de alimentos. Sin embargo ninguno de los mtodos utilizados habitualmente
permite determinar el nmero exacto de microorganismos que existe en un determinado alimento. Son
cuatro los mtodos bsicos utilizados para investigar el nmero total de microorganismos:1)
Recuento en placa para la determinacin del nmero de clulas viables, 2) Mtodo del nmero ms
probable (NMP) de grmenes como clculo estadstico del nmero de clulas viables, 3) Tcnicas de
reduccin de colorantes para el clculo del nmero de clulas viables con capacidad reductora y 4)
Recuento microscpico directo, tanto para clulas viables como para las no viables. El recuento en
placa es el mtodo ms utilizado para la determinacin del nmero de clulas viables o unidades
formadoras de colonias (U.F.C.) en un alimento. Los recuentos totales deben hacerse en funcin de
uno de los siguientes factores: a) Mtodo de muestreo utilizado, b) Distribucin de los
microorganismos en la muestra, c) Naturaleza de la microflora del alimento, d) Naturaleza del
alimento, e) Antecedentes del alimento, f) Adecuacin nutricional del medio de cultivo, g) Temperatura
y medio de incubacin, h) pH, i) a w , j) Potencial de oxidacin reduccin del medio, k) Tipo de
diluyente utilizado y l) Nmero relativo de microorganismos en la muestra.

Los recuentos de microorganismos viables se basan en el nmero de colonias que se desarrollan en

placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de alimento

e incubadas en unas condiciones ambientales determinadas. Estos recuentos no pueden considerarse

como recuentos totales ya que solo son susceptibles del contaje aquellos microorganismos capaces de
crecer en las condiciones establecidas. Se puede conseguir una amplia gama de condiciones variando
la temperatura, la atmsfera, la composicin del medio y el tiempo de incubacin. El intervalo de
temperaturas en el que crecen los microorganismos es muy amplio: de 34 C a > 90 C. En
funcin de esto se encuadra a los microorganismos en tres grupos: a) los que crecen bien a 7 C o
por debajo de esta temperatura cuya temperatura: psicrtofos, b) los que crecen entre 20 30 C, con
una temperatura ptima de crecimiento est entre 30 40 C: mesfilos y c) los que crecen por
encima de los 45 C: termfilos.

El mtodo de recuento en placa para determinar el nmero de microorganimos de una muestra se basa en la
presuncin de que cada clula bacteriana puede crecer en un medio de cultivo slido formando colonias. De
acuerdo a este criterio el nmero de colonias desarrolladas en un medio de cultivo slido puede corresponder
al nmero de clulas bacterianas viables presentes en una cantidad determinada de muestra que haya sido
inoculada.

El nmero de bacterias aerobias mesfilas encontrado en los alimentos, superficies vivas e inertes, es uno de
los indicadores microbianos de calidad de los mismos (este ndice no es vlido para alimentos fermentados:
Queso, leches fermentadas, yogurt, mantequilla)

Este recuento se utiliza para: a) Verificar la eficacia de los sistemas de limpieza y desinfeccin y, averiguar la
temperatura a que fueron mantenidos los alimentos durante los procesos de tratamiento industrial, transporte y
almacenamiento. b) tener una idea sobre la alteracin incipiente de los alimentos, de su probable vida til, de
la descongelacin no controlada de los alimentos congelados o de las fallas en el mantenimiento de la
temperatura de refrigeracin en los alimentos refrigerados y c) Poner de manifiesto las fuentes de
contaminacin durante el proceso de elaboracin de los alimentos.

3. MATERIALES Y MTODOS

MATERIALES

- Requisitos necesarios para la preparacin y dilucin de las muestras de alimentos.

- Placas petri (100x150mm). - Pipetas bacteriolgicas de 1.5 y 10 ml.

- Baos de agua regulada a 44-46 C para mantener el agar licuado.

- Incubadora regulada a 29-31 C. - Contador de colonias.

- Agar Plate Count o Agar Cuenta Grmenes (PCA) - Alimento para su anlisis microbiolgico.

MTODOS

Preparar y diluir la muestra del alimento por la tcnica adecuada.

Pipetear por duplicado a las placas estriles alcuotas de 1 ml a partir de la dilucin 10 -1

, 10 -2, 10 -3, 10 -4 ,10 -.

Se sugiere esta serie de diluciones si no se conoce el rango aproximado del nmero de bacterias.

Agregar rpidamente a las placas petri 15 ml de agar licuado y temperado.

Entre la preparacin y la adicin del agar no debe transcurrir ms de 10 minutos.

Mezclar inmediatamente las alcuotas con el agar mediante movimientos de vaivn y rotacin de las
placas petri se pueden seguir los siguientes pasos:

a) Mover la placa de arriba abajo cinco veces en una direccin.

b) Rotar cinco veces la placa en sentido de las agujas del reloj.

c) Mover la placa cinco veces en la direccin que haga ngulo recto al usado en el primer tiempo.

d) Rotar cinco veces la placa en sentido inverso al de las agujas del reloj.

Como control de esterilidad, adicionar a placas petri, agar sin inocular y agar inoculado con el diluyente.

Una vez solidificado el agar, invertir las placas e incubarlas a 29-31C durante 48 +/- 3 horas.

Cmputo del recuento estndar en placa:

a) Seleccionar 2 placas correspondientes a una dilucin que contenga entre 30 y 300 colonias utilizando un
contador de colonias.

b) Tomar la media aritmtica de los recuentos y multiplicar por el factor de la dilucin (reciproco de la
dilucin usada). Reportar el resultado como nmero de microorganismos aerobios mesfilos por gramo o
mililitro segn sea el caso.

c) Si las placas de dos diluciones consecutivas presentan recuentos menores que 30 y mayores que 300,
tomar el promedio de los dos recuentos.

d) Si el nmero de colonias de las placas de dos diluciones consecutivas estn dentro del rango de 30-300,
computar el recuento para cada una de las diluciones y establecer la relacin de los dos recuentos.

e) Si el cociente es menor que 2, reportar el promedio de los dos valores; pero si el recuento mayor contiene
2 veces o ms al menor, en este caso se reportar el recuento menor.

Computo del estimado del Recuento Standard en Placa.

a) Si las placas de todas las diluciones muestran ms de 300 colonias, dividir cada duplicado de placas de la
dilacin ms alta en secciones radiales convenientes (2, 4, 8) y contar todas las colonias en una o ms
secciones. Multiplicar el total en cada caso por el factor apropiado para obtener el nmero de colonias por
toda la placa. Promediar los estimados de las 2 placas duplicadas y multiplicar por la dilucin
correspondiente.

Reportar el resultado como un estimado del nmero.

b) Si hubiese ms de 200 colonias por 1/8 de seccin de la placa, multiplicar 1,600 (200x8) por la dilucin
y expresar el estimado como mayor que () el nmero resultante. Ejemplo 1600 x 10 = 1600,000/g o ml.

c) Si no hubiese colonias en placa de la mayor concentracin, reportar el estimado como menor que () una
vez la dilucin.

d) Ejemplo: 10-1 = 0 colonias. Se reporta como 10/g.

e) Si se hubiese sembrado 0.1 ml en este mismo caso se reporta 100/g o ml.

Expresin de Resultados

a) Se deber reportar nicamente 2 dgitos significativos, ellos son el primero y el segundo (comenzando
por la izquierda) del promedio de los recuentos. Los dems dgitos se reemplazarn por ceros. Ejemplo:
523,000 se reportar como 520,000= 52x10 4 g o ml de alimento segn sea el caso. Si el tercer digito de la
izquierda es 5 mayor que 5, adicionar una unidad al segundo digito (redondear). Ejemplo 83,600 se
reportar como 84,000=84x10 3 g o ml de alimento.
b) Si el recuento en placa se utiliza para determinar la aceptacin o rechazo de un lote de alimentos,
nicamente se considerar el recuento Standard en placa, nunca el estimado del recuento, este es til
solamente como una aproximacin primaria en la determinacin de la calidad microbiolgica.

4. RESULTADOS

Caractersticas de las colonias y clculo de los resultados

5. DISCUSIN

6. CONCLUSIONES

7. SUGERENCIAS

8. CUESTIONARIO

Qu significa la presencia de colonias bacterianas en Agar Plate Count?

Por qu es importante realizar el recuento bacteriano?

Para qu se realizan diluciones de la muestra problema?

Ud. Podra realizar el recuento bacteriano utilizando como medio de cultivo un caldo?

Cul sera el recuento estndar en placa si ud. tuviera una placa con cuarenta y cinco microorganismos
aerobios mesfilos viables por mililitro y otra placa con doscientos cincuenta, cuya dilucin en ambos casos
fue 10 -2 ?
 PRACTICA N2

NUMERACIN DE BACTERIAS COLIFORMES

COLIFORMES TOTALES Y FECALES POR LA TCNICA DEL NMERO MS PROBABLE

(NMP)

1. OBJETIVOS DE LA PRCTICA

Determinar el nmero de bacterias presentes en helados y leche fresca, mediante la Tcnica del Numero
Ms Probable.

Analizar la naturaleza de la contaminacin del helado y la leche fresca analizadas.

Interpretar los resultados de acuerdo a las normas de control microbiolgico vigente a nivel nacional e
internacional.

2. FUNDAMENTO TERICO

La presencia de coliformes fecales y Escherichia coli, se utiliza para indicar una contaminacin
potencialmente peligrosa por el hecho de que el hbitat natural de estos microorganismos son las heces
humanas y de animales de sangre caliente. Una poblacin de coliformes fecales es posible que contenga una
alta proporcin de E. coli o sus variantes, aceptndose a E. coli como el indicador ms positivo de
contaminacin fecal reciente. Esta contaminacin se produce, de modo general, por deficiencias en la
limpieza y desinfeccin en las industrias y por falta de higiene de los manipuladores.

La contaminacin de un alimento por E. coli, lleva implcito el riesgo de que tambin hayan podido llegar al
alimento microorganismos entricos patgenos, haciendo su consumo peligroso. Esta tcnica se basa en la
presuncin de que las bacterias se hallan normalmente distribuidas en un medio lquido, esto es, que las
muestras repetidas del mismo tamao de un mismo producto, debe esperarse contengan el mismo nmero de
grmenes como promedio, naturalmente algunas de las muestras pueden contener algunos grmenes ms o
menos. La cifra media es el nmero ms probable. Si el nmero de grmenes es grande, la diferencia entre
las muestras sern pequeas; todos los resultados individuales estarn prximos a la media. Si el nmero
de grmenes es pequeo, las diferencias, hablando relativamente sern mayores.

Es posible calcular el nmero ms probable de grmenes/100ml. con cualquier combinacin de resultados

obtenidos de tales muestras. Se han hecho tablas para muestras de 10 ml, 1 ml y 0,1 ml, utilizando cinco o
tres tubos para cada tamao de la muestra y, para determinaciones en agua, utilizando una muestra de 50 ml.

La presencia de coliformes fecales y Escherichia coli se usa para indicar una contaminacin
potencialmente peligrosa por el hecho de que el habitad natural de estos microorganismos son las heces
humanas y de animales de sangre caliente.

3. MATERIALES Y MTODOS

MATERIALES

a) Los requeridos para la preparacin y dilucin de muestra de alimentos.

b) Incubadora a 35-37C. c) Pipetas bacteriolgicas de 1 ml.

d) Asa de Siembra.
e) Medios de Cultivo:

Caldo Verde Brillante (Caldo BRILA), volmenes de 10 ml. en tubos de 150x15mm., conteniendo tubos de
fermentacin invertidos (75x10mm.).

Caldo Laurilsulfato (LST), volmenes de 10 ml. en tubos de 150x15mm., conteniendo tubos de

fermentacin invertidos.

Caldo EC, volmenes de 10 ml. en tubos de 150x15mm., conteniendo tubos de fermentacin invertidos.

Agar Mac Conkey.

f) Material Biolgico:

jugos, ensaladas.

MTODOS

1. Preparar las muestras de alimentos segn la tcnica ya descrita para su preparacin y dilucin.

2. Pipetear 1ml. de cada una de las diluciones del homogenizado de alimento en tubos de caldo LTS,
utilizando tres tubos por dilucin.

3. Incubar los tubos a 35-37C por 24 horas.

NUMERACIN DE COLIFORMES TOTALES

1. Anotar los tubos que muestren produccin de gas (prueba presuntiva).

2. De cada tubo que contiene gas, transferir una azada a tubos conteniendo caldo BRILA o aislar sobre
placas con agar MC

3. Incubar a 35-37C por 24-48 horas.

4. Confirmar la presencia de bacterias coliformes por:

a) La formacin de gas en el caldo BRILA.

b) La formacin de colonias rojas o rosadas

5. Anotar el nmero de tubos confirmados. Referirse a la tabla del NMP para expresar el resultado.

NUMERACIN DE COLIFORMES FECALES

1. Seleccionar los tubos de caldo LTS que muestren formacin de gas en la prueba presuntiva.

2. Inocular una azada de cada tubo gas positivo en tubos con caldo E.C.

3. Inocular los tubos de caldo E.C. a 44.5 +/- 0.2 C por 24-48 horas.

4. Los tubos de caldo E.C. que muestren formacin de gas son positivos para coliformes fecales.

5. Anotar el nmero de tubos gas positivo y referirse a la tabla del NMP.

RESULTADOS
DISCUSION

CONCLUSION

REFERENCIA BIBLIOGRAFICA

CUESTIONARIO:

1. Qu significa la presencia de gas en los tubos con Caldo Lauril Sulfato?

2. Por qu utiliza Caldo Lauril Sulfato y no un medio slido?
3. Qu indica la presencia de gas en los tubos con Caldo BRILLA?
4. Explique a que se debi la contaminacin de la muestra con Coliformes totales y
Coliformes fecales?
5. Cmo explicara la ausencia de gas en los tubos de prueba?