Universidad Industrial de Santander

Metabolismo (25369)- D2

Ciclo de Krebs

Brayan Fahir Castillo Caldern (2141465)

Juan Sebastian Navarro Gonzlez (2161805)

Giovanni Alexander Lineros Franco

Bucaramanga29/05/2017

Objetivos:
 Apreciar la actividad de la enzima Succinato Deshidrogenasa por medio de
la reaccin colorimtrica del azul de Metileno.
Comprobar el funcionamiento del Ciclo de Krebs mediante la actividad del
Succinato Deshidrogenasa.

Marco terico
En los organismos aerobios como el humano, la energa es obtenida a partir de la
conversin oxidativa de nutrientes y metabolitos en dixido de carbono y agua.
Este proceso es llamado ciclo de Krebs, en el que actan diferentes enzimas
catalticas que se encuentran en la matriz de la mitocondria, (STARR, C. &
TAGGART, R. 2005) libres o unidas a la membrana mitocondrial interna, que
tambin contiene a las enzimas de la cadena respiratoria (MURRAY & ROBERT,
K. 2004).
El ciclo de Krebs o ciclo del cido ctrico, es la ruta aerobia final para la oxidacin
de carbohidratos, lpidos y protenas porque la glucosa, los acidos grasos y la
mayora de los aminocidos se metabolizan a acetil-CoA o a intermediarios del
ciclo. As como este ciclo sirve para la descomposicin de compuestos orgnicos,
se suele decir que es una ruta anfiblica, ya que participa en procesos tanto
catablicos como anablicos (gluconeognesis, lipognesis e interconversin de
aminocidos). Muchos de estos procesos ocurren en la mayor parte de los tejidos,
pero el hgado es el nico tejido en el que ocurren en un grado importante. Por
tanto las repercusiones son profundas cuando, por ejemplo, se daan cantidades
grandes de clulas hepticas como en la hepatitis aguda, o son remplazadas por
tejido conectivo como en la cirrosis. Se sabe que, si las hay, son muy pocas las
anormalidades genticas de las enzimas del ciclo de Krebs; tales anormalidades
sern incompatibles con el desarrollo normal; incluso hasta con la vida del
organismo (MURRAY & ROBERT, K. 2004).
El ciclo de Krebs es una parte del proceso por el cual queda disponible gran parte
de la energa liberada durante la oxidacin de nutrientes. Durante la oxidacin de
la acetil-CoA, las coenzimas se reducen y luego se oxidan de nuevo en la cadena
respiratoria, para producir ATP. Este proceso ya que es aerbico, requiere de
oxigeno como oxidante final de las coenzimas reducidas. (MURRAY & ROBERT,
K. 2004).
La regulacin del ciclo de Krebs se lleva a cabo por vario mecanismos que
intervienen en el control de la velocidad del ciclo de los cidos tricarboxilicos.
Estos son la disponibilidad de sustrato y la inhibicin feedback por intermediarios
del ciclo (Gsdl.bvs.sld.cu, 2017). Esta regulacin depende mucho del control
respiratorio por medio de la cadena respiratoria y de la fosforilacin oxidativa. Por
consiguiente, la actividad depende en forma inmediata del abastecimiento de
NAD, que a su vez, debido al estrecho acoplamiento entre la oxidacin y la
fosforilacin, depende de la disponibilidad de ADP y, por tanto, de la tasa de
utilizacin de ATP en el trabajo qumico y fsico. Adems algunas enzimas del ciclo
se regulan as mismas. Los sitios ms probables para la regulacin son las
reacciones catalizadas por la piruvato deshidrogenasa y cetoglutarato
deshidrogenasa. El Ca activa a las deshidrogenasas; la concentracin de este
catin aumenta durante la contraccin muscular y la secrecin, cuando hay una
mayor demanda de energa (MURRAY & ROBERT, K. 2004).
Esta prctica se desarroll para comprobar el funcionamiento del ciclo de Krebs
por medio de una enzima llamada succinato deshidrogenasa, que acta como una
oxidorreductasa catalizando la trasferencia de electrones o hidrgenos desde una
molcula donante a otra aceptora (Jenner Us Martin, 2014); cabiendo decir que
esta enzima se encuentra enlazada con la superficie interna de la membrana
mitocondrial interna, para reducir directamente a la ubiquinona en la cadena
respiratoria (MURRAY & ROBERT, K. 2004).

Metodologa y Resultados:
En la prctica, se utiliz 1 gramo de carne de pollo, para luego machacarlo con
ayuda de un mortero aadiendo de 3 a 4 mL de cido Succnico y algo de arena
de vidrio, con el fin de hacer ms fcil la extraccin de los residuos luego de hacer
la respectiva filtracin. Despus de mezclar el pollo con cido succnico,
obtuvimos una masa que fue repartida por partes iguales en dos tubos de ensayo.

Se agreg 1 mL de cido tricloroactico en el tubo 2 y as inhibir la actividad de la

enzima ya que ocurre una desnaturalizacin; Posteriormente, se agreg azul de
metileno a los dos tubos, haciendo que el tubo 1 se tornara de un color grisceo y
el tubo 2 el cual contena cido tricloroactico se evidenciara la desnaturalizacin
de la enzima formando una franja incolora y otra un poco blancuzca.
Fig 1. Separacin por partes iguales luego de agregar el cido tricloroactico, Se habla de que el
azul de metileno es el aceptor de electrones del complejo succinato-FADH 2.

Despus, se agreg de 0,5 a 1 mL de aceite, ya que este nos permite este aislar
los dos tubos de ensayo del aire del ambiente y as prevenir la oxidacin temprana
del FADH2. (Alberto, 2012)

Finalmente, se calent a bao Mara por 10 minutos a 50C, una vez pasaron los
10 minutos se detall la decoloracin del azul de metileno esto puede darse
debido a que la enzima fue liberada de la mitocondria de las clulas que se
encontraban en la carne de pollo.

Fig 2. Tubos de ensayo despus de haber pasado 10 minutos al bao mara, no es evidente la
separacin de agua-aceite; ya que fue agregado en poca cantidad y se agit por error al terminar
el proceso.

Cada uno de los reactivos desempe una funcin importante en la prctica, como
resultado final se obtuvieron dos tubos uno de color grisceo; pero con una
pequea franja blanca en el sedimento (tubo 1) y en el otro se form una franja
transparente y se hace evidente la separacin de la carne con el reactivo y la
desnaturalizacin de la enzima (tubo 2).

En ambos la enzima Succinato Deshidrogenasa actu como una

Oxidorreductasa; ya que cataliza la oxidacin del Succinato para as obtener
Fumarato siendo la coenzima el FAD. El Succinato cedi un H 2 que es transferido
del FADH2 al azul de metileno, por lo que este cambio su estado redox de
coloreado a incoloro o viceversa. (Alvarado & et. Al. 2008).

Conclusiones:
Se Cumpli con los objetivos ya que se obtuvo una decoloracin en el tubo 2; esto
se debe a que hay una reduccin del azul de metileno el cual fue cedido desde el
FADH2, para as obtener FAD oxidado. El azul de metileno se redujo, en el tubo 1
y no se evidenci decoloracin alguna debido a que contena cido tricloroactico,
este cido produjo la desnaturalizacin de la enzima, al finalizar esta prctica se
comprob la actividad de la enzima Succinato Deshidrogenasa por medio de la
reaccin colorimtrica del azul de Metileno y el funcionamiento del Ciclo de Krebs
a travs de la enzima mencionada anteriormente.

Bibliografa
1. MURRAY & ROBERT, K. Harper Bioqumica Ilustrada. Mxico. Editorial
manual moderno, 16 ed. 2004
2. STARR, C. & TAGGART, R. BIOLOGIA la unidad y diversidad de la vida.
Mxico. Editorial THOMSON, 10 ed. 2005.
3. Gsdl.bvs.sld.cu. (2017). Bioqumica Humana: Captulo 7. Respiracin
celular: Ciclo de Krebs. [online] Available at: http://gsdl.bvs.sld.cu/cgi-
bin/library?e=d-00000-00---off-0prelicin--00-0----0-10-0---0---0direct-10---
4-------0-1l--11-es-50---20-about---00-0-1-00-0-0-11-1-0utfZz-8-
00&cl=CL1&d=HASHf1ddc478da370019f97bea.10.13&hl=0&gc=0&gt=0
[Accessed 29 May 2017].
4. Jenner Us Martin. (12 de marzo de 2014).
Oxidorreductasa.Obteido de:
http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz13.htm#c1
5. [Alvarado & et.al. (2008). BIOQUIMICA II. Revisado el da 28/05/2017.
Sacado de
http://quimicosfarmacobiologos.bligoo.com.mx/media/users/10/523320/files/
51871/Ma.]

6. [Alberto.(04 de marzo de 2012).Determinacin de la actividad de succinato

deshidrogenasa. Revisado el da 28/05/2017. Sacado de
http://www.buenastareas.com/ensayos/Determinaci%C3%B3n-De-La-
Actividad-De-Succinato/3600966.html.]

Anexos
1. Por qu se utiliza musculo como material biolgico de experimentacin?
 Ya que es un tejido que necesita mucha energa para su buen funcionamiento;
por consiguiente va a tener muchas mitocondrias que van a realizar el ciclo de
Krebs.
2. Nombra las enzimas del ciclo de Krebs e indica el tipo de reaccin que
cataliza cada una. Indica cules actan como oxido-reductasas y cul es
su cofactor?

Aconitasa: isomeriza al citrato a isocitrato (aconitato hidratasa)

Isocitrato hidrogenasa: el isocitrato experimenta una deshidrogenacion por esta
enzima para formar, primero, oxalosuccinato, que permanece ligado a esta y que
experimenta una escarboxilacin a cetoglutarato.
cetoglutarato deshidrogenasa: este complejo requiere los mismos cofactores
que el complejo de la piruvato deshidrogenasa: lipoato, difosfato de tiamina,
NAD,FAD y CoA, y da como resultado una molcula de succinil-CoA.
Succinato tiocinasa: convierte la molcula de succinil-CoA en una de succinato,
produciendo GTP (ATP) por la fosforilacion de un GDP.
Succinato deshidrogenasa: esta enzima contiene FAD y centros hierro-azufre, y
reduce directamente a la ubiquinona en la cadena respiratoria para producir
fumarato.
Fumarasa o fumarato hidratasa: cataliza la adicin de agua sobre el doble enlace
del fumarato para producir malato
Malato deshidrogenasa: convierte el malato en oxaloacetato, una reaccin que
requiere NAD.
El segundo punto fue desarrollado segn los autores MURRAY & ROBERT.

3. Como puedes explicar esto considerando los siguientes cambios de

reaccion? GTP+ADP = GDP+ATP

Ya que tanto el GTP como el ATP, va a tener la misma energa porque tiene los
mismos tres grupos fosfato; como se sabe la energa la produce es el rompimiento
de los enlaces del fosfato mas no la base nitrogenada.

4. Que es la succinato deshidrogenasa y en que va metablica ejerce su

accin?

Es una protena compleja (la protena se encuentra unida a un grupo prosttico),

es una flavo protena que contiene un grupo prosttico FAD. Se encuentra en la
membrana interna de la mitocondria. Participa en 2 procesos, en el ciclo de Krebs
y lo relaciona con la cadena respiratoria. Cataliza la oxidacin del succinato en
fumarato, mientras que se forma el 3er cofactor reducido, el FADH 2. La reaccin
es reversible (Gsdl.bvs.sld.cu, 2017).

5. Cules son los productos de su actividad?

Produce una molcula de fumarato y un FADH2