2017-6-8 Espectrofotmetro Wikipdia, a enciclopdia livre

Espectrofotmetro
Origem: Wikipdia, a enciclopdia livre.

O Espectrofotmetro um instrumento de anlise,

amplamente utilizado em laboratrios de pesquisa, capaz de
medir e comparar a quantidade de luz (radiao
eletromagntica) absorvida, transmitida ou refletida por uma
determinada amostra, seja ela soluo, slido transparente ou
slido opaco.[1] Existem duas classes de espectrofotmetros: o
de feixe simples e o de duplo feixe e eles so constitudos,
essencialmente, por cinco componentes principais: as fontes
de radiao, o monocromador, o porta-amostras, os detectores
e o indicador de sinal.[2]

O resultado da espectrofotometria dado por um grfico que

conhecido como espectro e fornece informaes de
intensidade por comprimento de onda da fonte de luz. Essa
faixa de comprimentos de onda desejados pode ser
selecionada antes da realizao das medidas, o que torna a
medida mais especfica e eficaz j que no ser necessrio um Espectrofotmetro
nmero excessivo de dados para obter o resultado esperado.
Os espectrofotmetros mais sofisticados cobrem uma gama de
luz entre 200 nm e 2500 nm (ultravioleta a infravermelho).[3] A faixa de comprimentos de onda da radiao eletromagntica
mais utilizada est, aproximadamente, entre 350 nm e 750 nm, ou seja, no espectro de luz visvel. Para que os resultados
obtidos pelas medidas realizadas no espectrofotmetro sejam precisos, necessrio sempre fazer a calibrao do instrumento
utilizando padres conhecidos.

ndice
1 Histria
2 Princpios fsicos
2.1 Lei de Bragg
2.2 Lei de Snell
3 Funcionamento e partes do espectrofotmetro
3.1 Fontes de radiao
3.2 Monocromadores
3.3 Compartimentos para amostras
3.4 Detectores
3.5 Indicador de sinal
4 Tipos de espectrofotmetros
4.1 Espectrofotmetro de feixe simples
4.2 Espectrofotmetro de duplo feixe
5 Medidas no espectrofotmetro
5.1 Calibrao
5.2 Transmitncia
5.2.1 Lei de Beer-Lambert
5.2.2 Curva de absoro
5.3 Refletncia
5.3.1 Difusa
5.3.1.1 Modelo de Kubelka Munk
5.3.2 Especular
5.3.3 Total
6 Aplicaes
7 Ver tambm
8 Referncias

Histria
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O primeiro espectrofotmetro foi inventado em 1940, pelo qumico americano Arnold O.
Beckman (1900 - 2004) e seus colegas dos Laboratrios de Tecnologias Nacionais, na
empresa Beckman Coulter Inc., fundada em 1935. O lder do projeto foi o engenheiro
americano Howard Cary (1908 - 1991). O espectrofotmetro foi a maior descoberta da
empresa.

Antes de 1940, o processo de anlise qumica era muito longo e trabalhoso levando
semanas para ser concludo, com uma preciso de apenas 25%, de acordo com o MIT. Em
1940, quando o Espectrofotmetro DU foi introduzido, o processo ficou bem mais
simples e rpido, necessitando de apenas alguns minutos para a anlise. De acordo com a
mesma fonte, a preciso desse instrumento era de 99,99%. A partir de ento, esse
espectrofotmetro se tornou o instrumento padro para anlises qumicas.

No incio, existiam problemas de desempenho do espectrofotmetro. Esses problemas

levaram a mudanas no projeto. O espectrofotmetro modelo B usava um prisma de
quartzo ao invs de um prisma de vidro, melhorando as capacidades UV do dispositivo. O
modelo C, logo em seguida, trouxe mudanas que aumentaram a resoluo de
comprimentos de onda no UV e dessa forma trs espectrofotmetros modelo C foram
construdos. Em 1941, o modelo D, tambm conhecido como modelo DU, foi produzido
com uma lmpada de hidrognio e outros tipos de melhorias. Esse projeto permaneceu Arnold Beckman, 1921
essencialmente inalterado entre 1941 e 1976, quando foi interrompido. At 1976, mais de
30.000 modelos DU e DU-2 tinham sido vendidos. Esses instrumentos foram
utilizados em clnicas, laboratrios industriais e na qumica e bioqumica.

Em 1981, a empresa Cecil Instruments produziu um espectrofotmetro controlado

por um microprocessador, tornando-o um dispositivo automatizado e mais rpido.
Entre 1984 e 1985, foram desenvolvidas verses de espectrofotmetros de duplo
feixe. Com a dcada de 1990, veio a adio de softwares externos, controlados
pelo computador, que exibiam na tela os espectros resultantes. Hoje, o
aperfeioamento dos espectrofotmetros continua e suas aplicaes vo desde a
cincia e a medicina at a investigao de cenas de crime. [4]
Espectrofotmetro DU, 1941
Embora novos modelos tenham sido introduzidos ao longo dos anos, ainda existem
muitos espectrofotmetros modelo DU em uso ao redor do mundo. As
contribuies extraordinrias de Beckman levaram o presidente George H. W. Bush a dar-lhe a Medalha Nacional de Cincia,
em 1989, por sua liderana em desenvolvimento de instrumentao analtica e por sua profunda preocupao com a vitalidade
das empresas cientficas do pas. [5]

Princpios fsicos
Alguns princpios fsicos so importantes para entender o funcionamento dos espectrofotmetros.

Lei de Bragg

A Lei de Bragg ou Lei de Difrao foi explicada pelo fsico australiano William Lawrence Bragg, em 1912. Embora simples, a
lei confirmou que existem partculas reais na escala atmica e forneceu uma nova ferramenta para o estudo de cristais
utilizando difrao de raios X.

A difrao depende de dois fatores: da estrutura do material e do

comprimento de onda utilizado. Ento, supe-se que as ondas incidentes
sofrem reflexo especular em planos paralelos de tomos de um cristal,
onde cada plano reflete apenas uma porcentagem da radiao. Na reflexo
especular, o ngulo de reflexo igual ao ngulo de incidncia (Lei da
Reflexo). Embora a reflexo de cada plano seja especular, existem apenas
alguns valores para o ngulo de incidncia em que as reflexes se somam
em fase resultando em um feixe difratado intenso. Nas direes em que as
reflexes de planos paralelos de tomos interferem construtivamente, ou
seja, nos mximos de intensidade, so observados os feixes difratados. Modelo de Bragg em duas dimenses: A diferena de
Devemos considerar que o espalhamento elstico, caso em que a energia caminho ptico entre os dois raios , onde
inicial conservada.[6] a distncia entre os planos considerados e , o
ngulo de incidncia.
Tomando uma famlia de planos paralelos separados por uma distncia ,
a diferena de caminho entre os raios refletidos por planos vizinhos
, onde o ngulo de incidncia. Essa diferena a mesma para qualquer par de planos vizinhos pertencentes quela
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famlia.[7] Assim, para que a intensidade da difrao seja mxima, a diferena de percurso deve ser igual a um nmero inteiro
de comprimentos de onda , ou seja, quando:

Esta a definio da lei de Bragg e satisfeita apenas quando .

Lei de Snell

A Lei de Snell ou Segunda Lei da Refrao foi formulada pelo matemtico holands Willebrord
Snellius, em 1621. Ela fornece o desvio angular sofrido por um raio de luz aps passar de um meio
para outro que tenha um ndice de refrao diferente. Nesta mudana de meios, a frequncia da onda
no alterada, embora a velocidade e o comprimento de onda sejam.[8] A lei dada pela seguinte
expresso:

onde o ndice de refrao expresso por: .

= velocidade da luz no vcuo;

= velocidade no meio escolhido;
= ndice de refrao no meio escolhido. Refrao da luz na
interface entre dois
A lei de Snell tambm pode ser escrita como:
diferentes ndices de
refrao, com
.

j que .[9]

Funcionamento e partes do espectrofotmetro

O funcionamento dos espectrofotmetros muito simples. A fonte de radiao emite luz (UV, visvel ou IR) e essa luz
fracionada pelo monocromador (prisma ou rede de difrao) nos comprimentos de onda que a compem, ou seja, ela sofre
refrao. A faixa de comprimentos de onda, inicialmente selecionada, dirigida para a amostra (solues, filmes finos, ps).
Parte dessa luz absorvida e parte transmitida. A luz que transmitida chega ao detector e l transformada em um sinal
eltrico. Finalmente, o sinal eltrico recebido pelo computador que transmite esses dados em forma de espectro (absoro x
comprimento de onda). [10]

Como citado anteriormente, os espectrofotmetros so compostos basicamente por cinco partes: a fonte de radiao, o
monocromador, o porta-amostras, os detectores e o indicador de sinal. Existem diversos tipos de cada componente de um
espectrofotmetro. Abaixo esto listados alguns deles.

Fontes de radiao

Lmpada de filamento de Tungstnio: uma fonte de radiao que emite no visvel e no infravermelho prximo, ou seja,
produz uma radiao til para o funcionamento do espectrofotmetro na faixa de 320 a 2500 nm. A lmpada opera em
uma temperatura de 3000 K.

Lmpada de descarga de Deutrio: uma fonte de radiao que emite no ultravioleta (UV), ou seja, produz radiao
til para o espectrofotmetro na faixa de 200 a 400 nm. Nessa lmpada os eltrons so excitados por uma descarga e
quando voltam para seus estados fundamentais, emitem a radiao.

Lmpada de vapor de Mercrio: uma fonte de radiao que emite no visvel e no ultravioleta, ou seja, produz uma
radiao til para o espectrofotmetro na faixa de 300 a 600 nm.[11]

Monocromadores

Prisma: um elemento ptico transparente com superfcies lisas e polidas capaz de refratar a luz incidente. Os prismas
podem ser usados para refletir a luz ou para dividir a luz branca policromtica em sete componentes monocromticas do
espectro visvel.
Redes de Difrao: um componente ptico
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Redes de Difrao: um componente ptico com uma estrutura peridica que divide e difrata a luz em vrios feixes
que viajam em diferentes direes. As redes de difrao possuem uma resoluo melhor do que os prismas e podem ser
utilizadas em todas as regies espectrais.[11]

Compartimentos para amostras

Cubetas: Para amostras lquidas, o recipiente utilizado a cubeta retangular de vidro ou de quartzo. A cubeta ideal para
medidas, realizadas em espectrofotmetros, aquela cuja aresta da base tem um tamanho de 1 cm. Esses recipientes
devem ser de materiais diferentes dependendo da regio de anlise. Caso a medida seja feita na regio do visvel, ento a
cubeta deve ser de vidro. Porm, se a regio de anlise for a do ultravioleta, ento a cubeta deve ser de quartzo, j que o
vidro absorve a radiao ultravioleta.

Detectores

Tubo Fotomultiplicador: um dispositivo eltrico que converte a luz em sinal eltrico. So detectores extremamente
sensveis nas regies do ultravioleta, visvel e infravermelho prximo. Esse detector multiplica a corrente produzida pela
incidncia de luz em at 100 milhes de vezes.[11]
CCD (Dispositivo de carga acoplada): So detectores baseados em silcio e consistem em uma matriz densa de
fotodiodos que convertem a energia dos ftons incidentes em eltrons.

Indicador de sinal

Computador: o dispositivo de processamento de dados utilizado. Nele so instalados softwares apropriados que
fornecem o resultado das medidas realizadas no espectrofotmetro.

Tipos de espectrofotmetros
Existem duas classes de espectrofotmetros: o de feixe simples e o de duplo feixe. [12]

Espectrofotmetro de feixe simples

O espectrofotmetro de feixe simples foi o primeiro tipo de

espectrofotmetro inventado, em 1940. Essa classe do instrumento consiste
em que toda a radiao fornecida pela fonte de emisso atravesse a amostra,
ou seja, a intensidade relativa de luz medida antes e depois da amostra de
teste ser inserida. Assim, para a realizao das medidas basta colocar a
amostra no compartimento adequado, previamente determinado pelo
fabricante, e fazer com que a radiao passe por essa amostra. Esse tipo de
equipamento tem um custo acessvel, j que formado por um sistema no
muito complexo. Espectrofotmetro de feixe simples

Espectrofotmetro de duplo feixe

Mais tarde, por volta de 1985, o espectrofotmetro de duplo feixe

foi inventado. Nesse tipo de instrumento, a luz dividida em dois
feixes antes de atingir a amostra. Deve-se ter o cuidado para no
confundir um feixe que j sai duplicado da fonte de radiao com
um feixe que duplicado somente aps atravessar o monocromador.
No caso do espectrofotmetro de duplo feixe, a fonte de luz emite
somente um feixe, que chega ao prisma ou rede de difrao, como
no espectrofotmetro de feixe simples, e somente depois de passar
pelo monocromador que o feixe dividido em dois. Um dos
caminhos do feixe utilizado para a referncia e o outro para a
amostra. Isto bem vantajoso, pois a leitura de referncia e a leitura
da amostra podem ser feitas ao mesmo tempo, comparando a
Espectrofotmetro de duplo feixe.
intensidade de luz entre os dois trajetos. Embora as medies de
comparao de instrumentos de feixe duplo sejam mais fceis e mais
estveis, os instrumentos de feixe nico podem ter um alcance dinmico maior e so opticamente mais simples e mais
compactos.

Medidas no espectrofotmetro
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Dois tipos de medidas so possveis nos espectrofotmetros: medida de transmitncia e medida de refletncia.

Antes de qualquer tipo de medida necessrio fazer a calibrao do instrumento, garantindo a preciso das medies.

Calibrao

A calibrao de um espectrofotmetro um processo utilizado para confirmar que o aparelho est funcionando corretamente.
Esse procedimento importante, pois garante que as medidas realizadas com o instrumento forneam resultados precisos. A
maneira como deve ser feita essa calibrao varia um pouco dependendo do modelo do espectrofotmetro, mas os fabricantes
fornecem um manual que explica como a calibrao deve ser feita. [13]

Geralmente, para medidas de transmitncia de amostras em forma de lquido, o procedimento para a calibrao o seguinte:[14]

1. Primeiramente deve-se ajustar o 100% T do aparelho com a cubeta contendo somente o solvente utilizado (normalmente
gua).
2. Logo aps, deve-se ajustar o 0% T com o feixe de luz totalmente obstrudo por um padro preto.
3. Agora, o espectrofotmetro j est apto para realizar as medidas.

Para amostras que no sejam lquidas, o procedimento o mesmo, porm o padro utilizado para realizar o 100% T no ser
um lquido.

As medidas de refletncia tambm devem ser precedidas de calibrao. O procedimento deve ser o mesmo realizado para as
medidas de transmitncia, s que agora utilizando uma esfera integradora.

Transmitncia

Transmitncia a frao da luz incidente, com comprimento de onda especfico, que

passa por uma amostra seja nanopartculas em soluo, filmes finos, ps, entre outras.
As medidas de transmitncia podem ser, facilmente, realizadas em qualquer tipo de
espectrofotmetro. A amostra colocada no suporte e a fonte emite luz que passa pela
fenda chegando ao monocromador e, ento, chega na amostra. A amostra absorve uma
determinada quantidade de luz e transmite o restante. Essa luz transmitida chega ao
detector e direcionada ao computador que fornece os dados.

As medidas de transmitncia podem fornecer diferentes informaes como: a

concentrao de soluto presente na soluo (via lei de Beer-Lambert) e elementos
presentes na amostra (via pico de absoro).

Lei de Beer-Lambert Transmisso

A lei de Beer-Lambert ou lei de Beer-Lambert-Bouguer foi descoberta pelo matemtico, geofsico e astrnomo Pierre Bouguer
(1698 - 1758). Em 1729, Bourguer publicou "Essai d'optique sur la gradation de la lumire" (Ensaio de ptica sobre a gradao
da luz), cujo assunto era a determinao da quantidade de luz perdida quando ela atravessava uma dada distncia na atmosfera
terrestre.[15]

A Lei de Beer-Lambert frequentemente atribuda a Johann Heinrich Lambert (1728 - 1777) que publicou um livro de
fotometria em 1760. [16]

Mais tarde, em 1852, August Beer (1825 - 1863) expandiu a lei exponencial de absoro, incluindo a concentrao das solues
no coeficiente de absoro. [17]

A lei indica que existe uma dependncia logartmica entre a transmitncia, , de luz por meio de uma substncia e o produto
do coeficiente de absoro da substncia, , e a distncia que a luz viaja atravs do material (ou seja, o comprimento do
caminho), . O coeficiente de absoro pode, por sua vez, ser escrito como o produto de qualquer absortividade molar do
absorvedor, , e a concentrao molar da amostra. Estas relaes so geralmente escritas como:[18]

onde

= intensidade de luz transmitida

= intensidade de luz incidente

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= intensidade de luz incidente

A transmitncia expressa em termos de uma absorbncia que, para os lquidos, definida como:

Assim, se o comprimento do caminho e a absortividade molar so conhecidos e a absorbncia medida, a concentrao da

substncia pode ser encontrada atravs da lei de Beer-Lambert.

Curva de absoro

Absoro toda radiao que incide na amostra e no nem transmitida e nem refletida. Cada elemento possui um pico de
absoro especfico, isto , dado um determinado elemento a intensidade de luz maior para um determinado comprimento de
onda. Esse pico saliente no espectro chamado de pico de absoro, ou seja, naquele comprimento de onda que o material
absorve radiao.

Refletncia

Refletncia a frao do fluxo de radiao eletromagntica que refletida por uma interface.

onde

= fluxo de radiao eletromagntica refletido

= fluxo de radiao eletromagntica incidente

Ento, a relao entre a luz absorvida, a luz refletida e a luz transmitida :

Difusa

A reflexo difusa a reflexo da luz a partir de uma superfcie de tal modo que um raio incidente refletido em vrios ngulos,
ao invs de ser refletido em apenas um ngulo, como no caso da reflexo especular. Uma superfcie refletora difusa ideal,
quando iluminada, ter igual luminncia em todas as direes. A refletncia difusa , ento, o fluxo de radiao eletromagntica
que sofre reflexo difusa em relao ao fluxo de radiao eletromagntica incidente.

Uma superfcie constituda de um p no absorvente, tal como gesso, ou de fibras, tal como o papel, ou de um material
policristalino, como mrmore branco, reflete a luz, difusamente, com uma grande eficincia. Geralmente, o instrumento
utilizado em espectrofotmetros para a medida de refletncia total e difusa a esfera integradora.

A visibilidade de objetos, excluindo aqueles emissores de luz, causada principalmente pela reflexo difusa da luz, ou seja, so
os vrios feixes resultantes de reflexo difusa que formam a imagem do objeto no olho do observador.

Este mecanismo muito comum, pois quase todos os materiais apresentam interfaces irregulares entre as suas pequenas
partculas em uma escala comparvel ao comprimento de onda da luz. Como h essa irregularidade na estrutura do material, a
luz refletida de forma difusa, ao invs de a luz ser refletida em um nico raio, isto , cada interface est orientada de uma
maneira diferente, gerando uma orientao diferente para cada feixe refletido (lei da reflexo).[19]

Modelo de Kubelka Munk

A tcnica de medio de refletncia difusa muito utilizada para obter a estrutura das bandas (nveis de energia) nos materiais,
o band gap. O Modelo de Kubelka Munk o mais utilizado para a interpretao dos dados obtidos no espectro de refletncia
difusa. A partir desse modelo, possvel obter a funo de remisso de Kubelka Munk, dada pela expresso abaixo.

onde
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= absoro

= refletncia

= constante de absoro

= coeficiente de espalhamento

O valor de band gap pode ser estimado, ento, fazendo um grfico da raiz quadrada da funo remisso pela energia. Ao traar
uma reta no grfico , o valor que intercepta o eixo das ordenadas o valor estimado de band gap.[20]

Especular

A reflexo especular a reflexo da luz a partir de uma superfcie de tal modo que um raio incidente refletido em uma nica
direo (um s ngulo). Tal comportamento descrito pela lei da reflexo, que afirma que a direo da luz de entrada (o raio
incidente) e a direo da luz de sada (o raio refletido) fazem o mesmo ngulo em relao superfcie normal. A refletncia
especular , ento, o fluxo de radiao eletromagntica que sofre reflexo especular em relao ao fluxo de radiao
eletromagntica incidente.

Praticamente todos os materiais podem refletir, especularmente, desde que a superfcie seja polida para eliminar as
irregularidades comparveis com o comprimento de onda da luz. Alguns materiais, como lquidos e vidros, no possuem as
subdivises internas que do o mecanismo de espalhamento do feixe refletido, portanto eles podem ser analisados pelo mtodo
de reflexo especular. Os espelhos, por exemplo, so superfcies lisas, mesmo nos nveis microscpicos, logo, eles geram feixes
na mesma direo.[19]

Total

A refletncia total a soma das outras duas refletncias: especular e difusa.

Um feixe de luz pode ser pensado como um feixe de raios de luz individuais que
viajam paralelas umas s outras. Cada raio de luz individual do pacote segue a lei da
reflexo. Se o feixe de raios de luz incidente sobre uma superfcie lisa, ento os
raios de luz refletem e permanecem concentrados em um nico feixe ao sair da
superfcie. Por outro lado, se a superfcie microscopicamente spera, os raios de
luz vo refletir e difundir em muitas direes diferentes. [19] Alguns materiais
possuem pouca rugosidade, fazendo com que a luz refletida seja difusa e especular
ao mesmo tempo. Nesses casos, necessrio medir a refletncia total, pois nela esto Reflexo Especular e Difusa
contidas a reflexo especular e a reflexo difusa.

Aplicaes
A espectrofotometria amplamente utilizada para anlise quantitativa em vrias reas como qumica, fsica, biologia,
bioqumica, engenharia de materiais e produtos qumicos, aplicaes clnicas, aplicaes industriais, ente outras. Qualquer
aplicao que envolva substncias qumicas ou materiais pode usar esta tcnica e, consequentemente, o espectrofotmetro.[21]

Em bioqumica: usado para determinar reaes catalisadas por enzimas.

Em aplicaes clnicas: utilizado para examinar o sangue ou tecidos para diagnstico clnico.

Em biologia: usado na realizao do teste MTT. E em biologia molecular utilizado para quantificar o DNA e
determinar sua pureza depois de extrado.

Em medicina: utilizado na anlise cintica de diferentes enzimas sanguneas e na dosagem da fosfatagem alcalina.

Ver tambm
Colormetro
Espectrofotometria
Espectroscopia
Espectroscopia UV/visvel
Espectroscopia de infravermelho
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