UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE

SAN MARCOS

FACULTAD DE CIENCIAS BOLGICAS

Escuela de Gentica y Biotecnologa
PRCTICA DE INGENIERA BIOQUMICA

DETERMINACIN DE PARMETROS
FERMENTATIVOS
CURSO: Ingeniera Bioqumica

PROFESOR: Mg Mario Alcarraz

HORARIO: Martes 8-10pm

Viernes 6-8 pm

ESTUDIANTE:

2016
RESULTADOS Y ANLISIS
Se analizaron 3 temperaturas y 3 condiciones de pH repartidos entre 4
mesas.

TEMPERATURA pH
Mesa 1 25C
Mesa 2 30C
6.5 7 7.5
Mesa 3 40C
Mesa 4 50C

RESULTADOS MESA 1:

Figura 2: Placas de Petri con Agar con pocillos. La placa en la izquierda contiene el medio con pH 6.5, el del
medio, 7 y el de la derecha 7.5. Los halos de hidrolisis de observaron luego de aplicarle al medio una solucin
de Lugol.
 Tabla.1: Datos de las condiciones de experimentacin y las actividades enzimticas.

TEMPERATURA: 25C DURACION:24 HORAS

pH 6.5 7 7.5
H=Altura 6mm 8mm 8mm
Radio del halo de lisis No No No No No No No No No
(R)(mm) presento presento presento presento presento presento presento presento presento
Radio del pocillo (r) 2mm 2mm 2mm 2mm 2mm 2mm 2mm 2mm 2mm

Actividad Enzimtica 0 0 0 0 0 0 0 0 0
(mg sustrato/ mg de
sustrato enzimtico))
Biomasa inicial de 0.003 0.002 0.003
inoculo(g)

Biomasa final (g) 0.001 0.004 0.001

RESULTADOS MESA 2:

Figura 3: Placas de Petri con Agar con pocillos. La placa en la izquierda contiene el medio con pH 6.5, el del
medio, 7 y el de la derecha 7.5. Los halos de hidrolisis de observaron luego de aplicarle al medio una solucin de
Lugol.

Tabla 3: Datos de las condiciones de experimentacin y las actividades enzimticas.

Temperatura: 30C Duracion:24 horas

pH 6.5 7 7.5
H=Altura 5mm 8mm 6mm

Dimetro del halo de lisis (R)(mm) 11 11 12 11 8 9 6 7 8

Actividad Enzimtica (mg sustrato/ mg de 14.14 14.14 19.24 22.62 5.65 10.05 0.47 1.88 4.2
sustrato enzimtico)) 4
Biomasa inicial de inoculo(g) 0.004 0.017 -0.001
Biomasa final (g) 0.003 0.003 0.001

RESULTADOS MESA 3:

Tabla 4: Datos de las condiciones de experimentacin y las actividades enzimticas.

Temperatura: 40C Duracion:24 horas
pH 6.5 7 7.5
H=Altura 6mm 7mm 7mm

Radio del halo de 9m 8.75m 13.25m 10mm 5.75m 8.5m 4.75m 9.5m 6.5m
lisis (R)(mm) m m m m m m m m
Radio del pocillo 3m 3mm 3mm 3mm 3mm 3mm 3mm 3mm 3mm
(r) m
Actividad 84. 79.60 196.23 105.33 27.85 73.21 15.70 94.04 38.48
Enzimtica (mg 82
sustrato/ mg de
sustrato
enzimtico))
Biomasa inicial de 0.002 0.003 0.003
inoculo(g)

Biomasa final (g) 0.004 0.004 0.001

RESULTADOS MESA 4:

Figura 5: Placas de Petri con Agar con pocillos. La placa en la izquierda contiene el medio con pH 6.5, el del
medio, 7 y el de la derecha 7.5. Los halos de hidrolisis de observaron luego de aplicarle al medio una solucin
de Lugol.
 Tabla 5: Datos de las condiciones de experimentacin y las actividades enzimticas.
Temperatura: 50C Duracion:24 horas

pH 6.5 7 7.5

H=Altura(mm) 8 7 6.75

Radio del halo de lisis (R)(mm) 5.55 5 4.5 3 3 2.5 3.25 3.25 3.5

Radio del pocillo (r) (mm) 3 3 3 3 3 2.5 3 3 3

Actividad Enzimtica (mg sustrato/ 54.8 40.2 28.3 0 0 0 3.3 3.3 6.9
mg de sustrato enzimtico))
Biomasa inicial de inoculo(g/ml) 0.003 0.004 0,005

Biomasa final 0.004 0.002 0.003

Reuniendo los datos de las 4 mesas en una tabla para correlacionar los parmetros
evaluados tenemos

Tabla 6: Datos de BIOMASA (g) para los parmetros Ph y Temperatura (C)

pH/T 25 30 40 50
6.5 -0.002 0.001 0.002 0.001
7 0.002 -0.002 0.001 -0.002
7.5 -0.002 -0.002 -0.002 -0.002
 GRFICO 1: BIOMASA vs TEMPERATURA
0
0 0
0
0
0 0 0
0
0 6
Biomasa

0 6.5
25 30 40 50 7
0
0
0
0
0 0 0 0 0 0 0
0
Temperatura TC
 GRAFICO 2: BIOMASA VS pH
0
0 0
0
0
0 0 0
0
25
BIOMASA (g)

0
30
0 40
6.5 7 7.5
0 50
0
0
0
0 0 0 0 0 0 0
0
pH

Tabla 7: Datos de ACTIVIDAD ENZIMATICA (mg sustrato/ mg de sustrato enzimtico) para los
parmetros Ph y Temperatura (C)
pH/T 25 30 40 50
C
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

6.5 0 0 0 14.1 14.1 19.24 84.8 79.6 196.23 54. 40.2 28.
4 4 2 8 3
7 0 0 0 22.6 5.65 10.05 105. 27.8 73.21 0 0 0
2 33 5
7.5 0 0 0 0.47 1.88 4.24 15.7 94.0 38.48 3.3 3.3 6.9
4

GR F ICO 3 : ACTIVIDA D EN ZIM ATICA vs TEM PER ATUR A (T C)

6 6.5 7

196.23
Activi dad enzimatica

105.33

94.04
84.82

73.21
79.6

54.8
38.48

40.2
27.85
22.62

19.24
14.14
14.14

10.05

15.7
5.65

4.24
1.88
0.47

3.3

3.3
25 30 40 50
0
0
0

0
0
0

0
0
0

0
temperatura
 GRFICO 4: ACTIVIDAD ENZIMATICA vs TEMPERATURA (TC)
250

200
Activi dad Enzi matica

150

100

50

0
6.5 7 7.5
pH

25 25 25 30 30 30 40 40 40 50 50 50
ANLISIS DE RESULTADOS

La cepa Bacillus utilizada, fue seleccionada para esta prctica, debido a que en pruebas anteriores
demostr una alta actividad amiloltica, sin embargo, para realizar un proceso a mayor escala, a nivel
industrial, es necesario determinar las condiciones ptimas en las que la bacteria se desarrolla y en la
que realiza mayor produccin del metabolito de inters. Se evaluaron dos factores que afectan el
desarrollo de la bacteria, la temperatura y el pH, evaluando cuatro parmetros de temperatura: 25 C,
30 C, 40 C, 50 C ; y tres parmetros de pH : 6.5 ; 7; 7.5 .

En la tabla 1 se describen los resultados obtenidos al evaluar el crecimiento de las bacterias a 25 C

mediante la diferencia de biomasa luego de la incubacin por un da, observando que a esta
temperatura, la bacteria aumenta su biomasa a pH 7, y disminuye a pH 6.5 y pH 7.5 esto indicara que a
25C la bacteria encuentra a pH 7, un entorno que facilita su crecimiento a comparacin de las otras
dos medidas. Aunque a pesar de observar aumento de biomasa, a la temperatura de 25C, las bacterias
no presentaron actividad amiloltica detectable mediante la observacin de halos de hidrlisis, lo que
indica que las bacterias utilizaron como fuente de carbono para su crecimiento principalmente a los
residuos de glucosa presentes en el medio inductor, y que bajo estas condiciones la produccin de
amilasas es nula o casi indetectable.

En la tabla 2, se puede encontrar de la misma manera, a descripcin de los resultados obtenidos al

evaluar el potencial de hidrgeno a una temperatura de 30 C, observando que existe crecimiento y hay
actividad enzimtica amiloltica en las tres condiciones de cultivo, observando que la actividad
enzimtica promedio ms alta, es encontrada a pH 6.5, sin embargo la mayor actividad enzimtica
obtenida de un pocillo es registrada a pH 7.

En la tabla 3, de la misma manera se observa la descripcin de los resultados obtenidos del cultivo
bacteriano a la temperatura de 40 C observando mayor incremento de la biomasa y mayor actividad
enzimtica a pH 6.5, se registra tambin a esta temperatura y pH , la mayor actividad enzimtica
registrada en esta prctica.

En la tabla 4 se observan los resultados obtenidos a 50 C , observndose una actividad enzimtica alta,
sin embargo, esta es menor a las registradas a 40 C y mayor a las de 30 C. Se observa crecimiento de
la biomasa a pH 6.5 y tambin es bajo este parmetro que se obtiene la mayor actividad enzimtica a
esta temperatura.

Con todo lo descrito anteriormente, se realizaron grficas que ayuden a mejorar la interpretacin de los
datos obtenidos. Observando al comparar la biomasa con la temperatura y el pH, que es a 40 C que las
bacterias generan mayor biomasa, y es a pH 6.5 y 6 que tienen incremento de biomasa , mientras que a
los otros valores se observa una disminucin de la biomasa (valores negativos). De la misma manera la
actividad enzimtica al ser comparada en base a los factores temperatura y pH, es posible observas que
es a 40 C que existe mayor actividad enzimtica, y a pH 6.5 que se registran los mejores niveles de
actividad enzimtica. Cabe resaltar que 50 C presenta mejor nivel de actividad enzimtica que 30 C.

Es a partir de los datos obtenidos que podemos concluir de que la bacteria presenta, de entre los
factores probados, un mejor desarrollo, crecimiento de la biomasa y actividad enzimtica amiloltica a
la temperatura de 40C y pH 6.5; observando que es una bacteria que presenta mejor actividad y
crecimiento a temperaturas mayores a 30 C y menor a 50 C, siendo posiblemente su temperatura
ptima de crecimiento y produccin de enzimas amilolticas, cercana o igual a los 40 C.
DISCUSIN
Uso de Bacillus sp. como productor de enzimas amilolticas
El gnero Bacillus se emplea para la produccin de enzimas amilolticas, ya que presenta una alta
capacidad de esporulacin en condiciones desfavorables, adems, tambin presenta una resistencia al
shock trmico gracias a genes que presenta, como son protenas chaperonas, canales inicos y enzimas
oxidasas (Petersonh et al, 2001). Adems, tambin se reportan especies de este gnero que resisten
temperaturas de 50C, como Bacillus thermoamylovorans (Combet-Blanc et al, 1995). Ya que no se
conoce la especie de Bacillus a emplearse, es de entender que se usen temperaturas de entre 25C a
50C para establecer sus parmetros fermentativos, ya que este gnero puede tolerar estas
temperaturas sin perder sus caractersticas. Adems, tambin existe evidencia de que un miembro de
este gnero, Bacillus subtilis, puede crecer en medios cidos, en un pH de aproximadamente 4.5 a 5.5,
vindose que presenta un mayor rendimiento a un pH de 5.5 (Calvo y Ziga, 2010). El mejor
rendimiento posible se da a pH ligeramente cido, por lo que los parmetros fermentativos en base a
pH pudieron establecerse a partir de 5.5 para un mejor rendimiento.

Observacin de biomasa
El mayor rendimiento obtenido en esta experimentacin es a una temperatura de 40C y pH de 6.5. El
crecimiento en Bacillus est en parte influenciado por la temperatura y el pH inicial del cultivo, as como
la esporulacin, que como ya se dijo, es una respuesta al estrs. Estudios como el de Warth (1978) y
Martinez et al (2007), nos hablan de que, de acuerdo a la especie, pueden soportar temperaturas de
hasta 67C, en algunos casos siendo la temperatura ptima de crecimiento. Tambin es posible
observar que, a pH cidos (4.5), y tambin a una determinada concentracin de sales, el crecimiento de
Bacillus subtilis se inhibe (Martinez et al, 2007). Estos estudios se realizaron en medio de carne, adems
de previamente hacer un shock trmico a 90C y tambin se dej crecer durante varios das. Podramos
decir que, en el caso de esta cepa, el hecho de que est en medio NRRL fomenta su crecimiento, pero al
parecer las altas temperaturas (50C) no las ayudan, y por el contrario, inhibe su crecimiento. Tambin,
como existieron problemas al momento de colocar la muestra inicial para su posterior pesado, esto
pudo influir de alguna manera en los resultados. Tambin es posible determinar que el pH ligeramente
cido es el ideal para su crecimiento en este medio de cultivo, pero este valor podra modificarse ya que
generalmente este gnero crece en pH un poco ms cidos (de 5.5 a 6.0).

Actividad enzimtica
La mejor actividad enzimtica observada es a una temperatura de 40C y a pH de 6.5. En un estudio de
Konsula (2004), se observa que Bacillus subtilis presenta una alta actividad de alfa-amilasas de acuerdo
al sustrato que se emplee. En ese trabajo, se emple medio enriquecido y tambin se ajust a un pH de
7.0 y a una temperatura de 40C. Tambin se sabe de un estudio de I. Haq et al (2003), en el que
tambin se observa una buena actividad de alfa-amilasas a la misma temperatura, pero no reportaron
el pH empleado. Se puede decir que, de acuerdo a los resultados obtenidos, la mejor temperatura para
la obtencin de alfa-amilasa concuerda con estos dos trabajos, pero el pH podra ajustarse a un poco
ms para observar una mejor produccin.
CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos para temperatura y pH de cultivos de Bacillus nos indica que el mejor
parmetro para trabajar en fermentacin es a una temperatura de 40C y a un pH de 6.5, de acuerdo al
crecimiento de biomasa y la produccin enzimtica que presenta.

BIBLIOGRAFA
Calvo, P., Ziga, D. Caracterizacin fisiolgica de cepas de Bacillus spp. aisladas de la rizsfera
de papa (Solanum tuberosum). Ecologa Aplicada, 2010, 9(1): 31-39
Combet-Blanc, Y., Kalamba, K., Kergoat, P. Effect of pH on Bacillus thermoamylovorans growth
and glucose fermentation. Applied and Environmental Microbiology, 1995, 61(2): 656-659
Haq, I., Ashraf, H., Iqbal, J., Qadeer, M. Production of alpha amylase by Bacillus licheniformis
using an economical medium. Bioresource Technology, 2003, 87: 57-61
Konsula, Z., Liakopoulou-Kyriakides, M. Hydrolysis of starches by the action of an alpha-amylase
from Bacillus subtilis. Process Biochemistry, 2004, 39: 1745-1749
Martnez, S., Borrajo, R., Franco, I., Carballo, J. Effect of environmental parameters on growth
kinetics of Bacillus cereus (ATCC 7004) after mild heat treatment. International Journal of Food
Microbiology, 2007, 117: 223-227
Petersohn, A., Brigulla, M., Haas, S., Hoheisel, J., Vlker, U., Hecker, M. Global analysis of the
general stress response of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology, 2001, 183(19): 5617-5631
Warth, A. Relationship between the heat resistance of spores and the optimum and maximum
growth temperatures of Bacillus species. Journal of Bacteriology, 1978, 134(3): 699-705