A. Endonucleasas de restriccién Los bacteri6fagos que, se propagan eficientemente en una cepa bacteriana, como E. coli K12, poseen una tasa de infeccion muy baja (~ 0,001%) en una cepa bacteriana relacionada, tal como E, coli B, Sin embar- go, la reducida progenie viral de esta iltima infeccién se propaga eficientemente en el nuevo huésped pero pobremente en el huésped original. {Cual es la base molecular de este sistema de modificacion especifica del huésped? Wermer Arber mostro que es el resulta- do de un sistema de restriccién-modificacién en el huésped bacteriano, constituido por una endonuclea- sa de restriccién y su pareja, una metilasa de modi- ficacién, La endonucleasa de restriccién reconoce una secuencia de bases especifica, de cyairo a ocho bases, en el DNA de doble hebra y corta ambas hebras del diplex. La metilasa de modificacién metila una base especifi- ca (normalmente en el grupo amino de un residuo de adenina o la posicién 5 de una citosina) en la misma secuencia de bases que reconoce el enzima de restric- cién. El enzima de restriccién no corta el DNA modi- ficado de esta forma, Una hebra de DNA bacteriano recién replicada, que es protegida de la degradacion por la hebra paterna modificada y con la cual forma un duplex, es modificada antes del siguiente ciclo de replicacion, EI sistema de restriccién-modificacion esta diSefiado, por tanto, para proteger a la bacteria frente a la invasion por DNAs ajenos (normalmente, viricos), los cuales, una vez han sido cortados por una endonu- cleasa de restriccién, acaban siendo degradados por las exonucleasas bacterianas. Los DNAs invasores son modificados muy raramente antes de ser atacados por los enzimas de restriccién. Sin embargo, una vez que el genoma virico es modificado, es capaz de reproducirse en el nuevo huésped. Sin embargo, su progenie ya no se encuentra modificada en la forma que permite propagarse en el huésped original.Existen tres pos conacidos de endonucleasas de restricion, Los enzimas de restriccon del Tipo Ty del Tipo IIT contienen las actividades endonucleasa y metilasa en una sola molécula proteica, Los enzimas de esticeién del Tipo | cortan el DNA, probablemen. te al azar, en un punto situado como minimo a 1000 bp de la secuencia de reconocimiento, mientras {que los enzimas del Tipo IIT lo hacen a una distancia cde 24 a 26 bp de la secuencia de reconocimiento, Sin ‘embargo, los enzimas de restriccion del Tipo Tl, que fueron descubiertos y earacterizados por Hamilton ‘Smith y Daniel Nathans hacia el final de los anos 1960, son entidades separadas de sus metlasas de rmodificacin corespondientes. Cortan los DNAs em puntos espectficos dentro de la secuencia de reconoci- ‘miento, propiedad gue hace de los enzimas de restrccion del Tipo I herramientas bioguimicas indispensibles ara Ia manipulacién del DNA. En lo que resta de esta seccion, comentaremos solamente los enzimas de res ‘riccion del Tipo UL Se han caracterizado alrededor de 500 especies de cenzimas de restriccién del Tipo Il con > 100 especii- dades diferentes y obtenidas a partir de una gran Variedad de bactenas. Algunas de las especies mis Ulilizadas se enumeran en la Tabla 28-5. Una endo- ‘ucleasa de restriceign se nombra con la primera letra Sitios de reconocimiento y de corte de algunos enzimas de reatriceon del Tipo I Miccoorganismo Sat AGICT Arba ew emit GIGATCC “alr malian el GCCNNNN} ‘acu i Nace be ALGATCT.—_ basta tai Bot CHMATrIC ‘ahr sol W3 enn 4ce-(GG shri co ass Dl GC\CC_—_Fasbctriam meu D Hue PUGLGCAFy—Heoopt wy fect GCC Haoophi apt Hint SSIACCTT Harm nfm R fp! C\CGG Heap prose Pat CRGCAIG Pode srt od Sil GHTCCAC——_Srupomys aur Tot CGA" Theme Mol CHICGAG Ketones ci el genero de la bacteria que la produce y con las dos primeras leiras de su especie, seguido de su serotipo 0 hombre de la cepa, silo hay, y un ndmero romano si la bacteria contiene mas de un tipo de enzima de restriccién. Por ejemplo, EzoRl se produce en E.coli, cepa RYIB. La mayor parte de las endonucleasas de restriccion reconocen secuencias de DNA palindrémico La mayoria de los sitios de reconcimiento de los ‘enzimas de restriccion poseen simetria rotacional bi ‘aria, como se muestra en el diagrama de la Fig. 28-43, Estas secuencias se conacen como palindro- Un patindroma es una palabra verso o fase que puede ser Ieido indistintamentehaca la deecha o facia In tequirda sin cambiar su significado, Por ejemplo, “Dabalearoz a la zona el abad” ‘Muchos enzimas de restricion, como EcoRI (Fig. 25- 450), catalizan la ruptura de las dos hebras de DNA. fen posiciones que estan situadas simétricamente con respecto al centro de la secuencia de reconocimiento ppalindsémica. Elo produce fragmentos de restriccion Eon extremos monohebra complementarios, de longi ‘ud comprendida entre uno y cuatro nuclectidos. Los Tragmentos de testriccign con estos extremos conesi- vos o pegajosos pueden asociarse, mediante el reamiento de bases complementarias, con otros frag ‘mentos de restriccion generados con el mismo enzima de restricién. Algunos de los cortes de restriccdn, ‘como los de Alul (Fig. 28-456), siguen el eje binario del palindroma, dando lugar a fragmentos de restric- ‘cion con extremos romos y bases completamente apareadas, Dado que tuna determinada base tiene una probabi- lidad de encontrarse en una posicion ncleotdica determinada igual a un cuarto (euponiendo que el DNA posee todas las bases en igual proporcién), un fenzima de restriccion con un sitio de reconocimiento @) BeoRt © atat | \ a-ote—tis[amu eos tinea SOTA cn Sa V store © cee amet sre cetacean ney ta ee Somos aatacna ye ur 248 EsiiSiees n'y ingore mm anictie pots, Stina reconomane de ws enomceasss ce Srumisus pnd’ y colqie’ sess mpettamene._fecbn 9) CORy (Aa nosedndnns so cmos Hiner amedE) Mees ede ta eat Sapa hdcandos ss ee do are de n pares de bases produce fragmentos de restriccion que tienen, en promedio, 4" pares de bases de longi- tud. Asi pues, los fragmentos de restriccian de Alul (secuencia de reconocimiento de 4 bp) y EcoRI (se- cuencia de reconocimiento de 6 bp) deberian tener una media de 4‘ = 256 y 4° = 4096 bp de longitud, respectivamente. La estructura de rayos-X del complejo EcoRI DNA revela la base molecular de su especificidad de reconocimiento La estructura de rayos-X de la endonucleasa EcoRI en complejo con un segmento de B-DNA que conte- nia el sitio de reconocimiento del enzima fue determi nada por John Rosenberg. El DNA se une a la hendi dura con simetria binaria situada entre las dos subunidades identicas de 276 residuos del enzima dimérico (Fig. 28-46), explicandose, asi, la secuencia de reconocimiento palindromica del DNA. La protei- na induce al DNA a dobiarse en tres puntos de forma que se desenrolla parcialmente, ensanchandose el surco mayor en el sitio de reconocimiento. La especi- ficidad de reconocimiento viene dada por la fuerte asociacién complementaria de la proteina con el surco mayor del DNA, en la que participan 12 enlaces de hidrogeno entre las cadenas laterales de Glu 144, ‘Arg 145 y Arg 200 de ambas subunidades proteicas y las bases purinicas del sitio de reconocimiento pa- lindromico.